PREGUNTAS DE BIOLOGA MOLECULAR 2011 Prof. Alejandra Sandoval A.

1. Cules son los elementos principales de un vector de clonacin? - Origen de replicacin - Marcador gentico de seleccin - Sitio/s de clonacin simple o mltiple (MCS o polilinker) - Promotor - Operador - Gen/es de la/s protena/s reguladora/s - Secuencias de inicio y fin de la transcripcin (terminador) - RBS (Ribosome Binding Site) o sencuencia Shine - Codones de inicio de la traducin (ATG, en el vector) y codn de paro de la traduccin 2. En relacin a las normas de orden y bioseguridad, cuales considera usted son las necesarias en un laboratorio de Biologa Molecular? 3. En lo prctico, Cules son las principales caractersticas que distinguen al ADN y al ARN? 4. En una electroforesis, Cmo distingue entre una molcula de ADN y ARN de planta? Dibuje si es necesario. 5. Cmo puede distinguir la presencia de ARN mensajero en la muestra de ARN total? 6. Qu porcentaje del ARN total corresponde a ARN mensajero? Se asume que el porcentaje de RNA mensajero es de 1-2% del RNA total. 7. Indique la funcin aplicada a la extraccin de cidos nucleicos de los siguientes reactivos: a) Etanol 75% b) Alcohol isopropanol: En la extraccin de ARN lo utilizamos para deshidratar la molcula de ARN y hacerla insoluble en agua logrando de este modo que esta precipite o decante. c) Etanol Absoluto d) Cloroformo: Desnaturalizador activo de protenas y supresor de su solubilidad en la preparacin, haciendo que estas precipiten. Tambin cumple una funcin de limpieza al eliminar restos de membrana y lpidos. e) Agua con Dietilpirocarbonato: Agua sin Ribonucleasas (enzima que degradan el ARN). Se utiliza para re suspender y guardar las muestras de ARN. f) Guanidino Tiocianato en solucin: Se utiliza para purificar los cidos nucleicos a partir de clulas o tejido de origen animal, vegetal, o de bacterias o levaduras. La solucin de

Chomczynski actua a nivel de membrana nuclear con el objetivo de romperla y liberar los acidos nucleicos ejerciendo tambin una funcin de detergente. g) Formamida desionizada h) Formaldehdo i) Nitrgeno Lquido: Se utiliza para manterer la cadena de frio durante el proceso de extraccin de ADN/ARN y se utiliza tambin en el proceso de pulverizacin de la muestra en el mortero. j) ADESI k) Glicerol/azul de bromofenol l) GelRed: Es una tincin fluorescente de cidos nucleicos diseada para reemplazar al Bomuro de Etidio (BE) en la tincin de dsDNA, ssDNA o RNA en geles de agarosa, poliacrilamida y geles prefabricados. m) Buffer TAE1x: Se utiliza en gel de agarosa de electroforesis general para la separacin de los cidos nucleicos como el ADN y ARN n) Buffer MOPSIX, MOPS10X o) Agarosa

Referente a los reactives anteriores: 8. A qu temperatura se deben almacenar, cada uno? 9. Cul es su nivel de peligrosidad? 10. Qu consideraciones debe tener antes de usarlos (cada uno)? 11. A qu temperatura se deben almacenar el ADN y el ARN? El ADN se guarda a -20C y el ARN se guarda a -80C. 12. Por qu debe utilizar hielo en los procedimientos de biologa molecular? R: Porque mucho de los reactivos pierden su funcionamiento optimo a una temperatura baja (por ejemplo 4C) por lo que se utiliza el hielo para llegar a esa temperatura. Tambin cuando se trabaja con molculas biolgicas como el ARN se utiliza el hielo ya que esta molcula se degrada con la temperatura por ende en hielo la probabilidad de degradacin es menor. 13. Si desea tomar los siguientes volmenes de un reactivo, que pipeta utilizara? Alternativas: p0.5, p10, p20, p200, p1000.a.

0,5 ul - p0,5

b. c. d. e. f. g. h. i. j.

1 ul - p10 1000 ul - p1000 990 ul - p1000 55 ul - p200 20 ul - p20 200 ul - p200 2 ul - p20----------------------------------tengo duda xD 6 ul - p10 o p20 ----12 ul - p20

k. 23 ul - p200 14. Cules son las diferencias entre un gel natural y un gel denaturante?

15. Cmo se visualizan en un gel las molculas de ADN plasmidial, ADN genmico y ARN total, y en qu tipo de gel se observan cada uno? 16. Se puede observar molculas de ADN plasmidial, ADN genmico y ARN total en un mismo gel? En cul? Fundamente. 17. Las muestras de ADN y ARN, requieren el mismo procedimiento para su anlisis?

18. Qu tipo de estudios puede realizar con molculas de ADN? 19. Qu tipo de estudios puede realizar con molculas de ARN? 20. Qu es una construccin pGemTeasy--gal?

21. Existen diversos tipos de vectores de clonacin, entre ellos los plasmidiales. Cuntos tipos de molculas se pueden clonar en estos vectores? Nmbrelas. Secciones de ADN que confieran resistencia a la bacteria

22. Identifique cada figura:

a.

Carriles 2, 3 y 4

1

2

3

4

5

6

b.

Carriles 1,2 y 3

A

B d. Carriles 1 y 2; Flecha

e.

Carriles 1 y 6 1 2 3 4 5 6

f.

Carriles 1 y 4; Flecha 1 2 3 4

23. Qu es una PCR?

R: Es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. 24. Cuntos tipos de PCR existen? R: PCR anidada; PCR in situ; PCR mltiplex; PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR); PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR). Adems existen otros tipos de PCR pero estos se consideran variantes de la PCR bsica como lo son la PCR asimtrica o la PCR "assembly" por nombrar algunas. 25. Mencione 8 posibles aplicaciones de la PCR.

26. Cules son los ingredientes (reactivos) de una reaccin de PCR?, cul es la funcin de cada uno? Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2 que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la funcin de la polimerasadNTPs (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP. sustratos para polimerizar el nuevo ADN. Cebadores primers: Son secuencias cortas de nucletidos 20-24 nucletidos de longitud, complementarias a una regin del DNA que se quiere amplificar. DNA molde: Que contiene la regin de ADN que se va a amplificar. Polimerasa: Enzima capaz de transcribir o replicar cidos nucleicos. ADYUVANTES DE LA PCR (Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR.) Se usa DMSO, glicerol o BSA. El adyuvante ms utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 g/l el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya acta como una protena captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa