Taller del curso: Introducción al diseño de...

InstitutodeGenéticaBarbaraMcClintockwww.igbmgenetica.com

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Tallerdelcurso:Introducciónaldiseñodeprimers

Clase7:ejerciciosdediseñodeprimers

Caso1:PrimersparaelgenK-RASdelexón2(humanos)A.-DiseñodeprimersusandoPrimer3Plus:1.-Entrara labasededatosdelNCBIwww.ncbi.nlm.nih.gov/ybuscarelgendeinterés, ennuestro caso buscaremos la secuencia del genK-RASque tiene comoreferenciaenelGenBankelnúmeroNM_033360.3 Solo es necesario tipear el nombre y darle click en “search”

2.- Aparecerá la siguiente pantalla, de ella trabajaremos con “Nucleotide” por ello le damos click (que ofrece secuencias de ADN o ARN)


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3.-AparecerálasiguientepantalladondepuedesobservarsiloquetienesesunasecuenciadeADNoARN,estoesmuyimportante.Clickenfastaparatrabajarconlasecuenciaeneseformato.

4.-Copiamoslasecuenciaenunblockdenotas.Siobservanelladoderechoveránque en la pantalla aparece “PickPrimers”. Esa es otra formadediseñarprimersquepuedenusarparacompararlosobtenidosconPrimer3Plus.

5.-EmpezaremosatrabajarconPickPrimersdelNCBI,paraellodarclickenPickPrimersyluegotrabajaremosconPrimer3Plus.


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6.-RecordamosnuestrosconceptosdediseñodeprimersparaPCRentiemporealy seleccionamos50 a200bp como largodel amplicón. Cerciórate la especie (enestecasohumana)yclickenGetPrimers

7.-Luegodeesperaruntiempo(notepreocupesqueavecesdemora)obtendrásuna serie de datos, no solo un par de primers, recuerda que puedes elegir unforwarddeunodelosprimerspropuestosyunreversodeotro.LoimportanteesqueseanlosmejoresyquetenganunabuenaTmaprox.60,GC%50,muysimilaroigual Ta y considera el largo del primer (tal como está en las diapositivas y seexplicoenclase)

8.- Para cerciorarte de los Ta puedes hallarlo con el siguiente linkhttp://tmcalculator.neb.com/#!/recuerdaqueestoesunaaproximaciónelTasedeterminaexperimentalmente.9.-Porotro lado,podemos trabajar conPrimer3Plusdisponible enel siguientelinkhttp://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgiycopiarlasecuenciaenformatofastaqueguardamoscomoindicamosenel ítem4.Enestecasoestamosdiseñandoalgogeneral,siqueremosamplificarsoloelcodón12y13tenemosqueindicarlocomoeltarget,osiqueremosexcluirciertasecuenciapodemoscolocarlacomoexcludedregions.


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Obtendremoslasiguientepantalla:

10.-ClickenAdvancedsettings,dondeusaremoslosmismosconceptosdelargodeamplicón,Tm,etcqueaprendimosenlasclasesteóricasyestánenlasdiapositivas.

11.-ClickenPickPrimers

12.-SeobservarálasiguientepantallaquecontienelosprimerspropuestosporelSoftware, nosotros debemos elegir los mejores de acuerdo a su Tm, Ta similar,contenidodeGC,quetengaGoCenel3’OH,etc.Igual que con el otro software, también se puede elegir el Forward de uno y elreversodeotro.PerodebendesercompatiblesencuantoaTmyTa.


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Lamentablementenoesposibleasegurarconun100%decertezaqueunprimerdiseñadomedianteunaherramientadesoftwarevaasercompletamenteefectivo,perosindudaleayudaráaaproximarsea lasoluciónmásóptimadeunamaneramuyrápida.

13.-Elegiralosmejoresprimersparaelsiguientepasoque,esversiformanonohomodímeros,heterodímerosyhorquillas.B.- Formación de estructuras secundarias que pueden formar los primersescogidos.ParaestecasousaremoslosprimersdeKristensenetal.(2010).F:5’-gaatataaacttgtggtagttggagct-3’R:5’-atcgtcaaggcactcttgcctac-3’1.- Ir al software OligoAnalyzer disponible en el siguiente linkhttps://www.idtdna.com/calc/analyzerycopiar lasecuenciadelprimerForwardenlapantallainput,delasiguienteformaysiempreenladirección5’a3’Colocarlaconcentraciónidealdelprimerolaquesiempreseusa.Enestecasodejaremostodopordefault(asícomoestá).DarclickenAnalyze.


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2.-Dentrodelosresultadospodemosverlasecuencia,sureversocomplementario,el largo,elcontenidodeGC%queparaestecasonoesbuenoyaquesolo llegaa37%ydeberíaestarpor50%.

3.-ClickenHairpinparaverlaformacióndehorquillas.RecuerdenqueundeltadeGnegativosignificaquelareacciónocurreespontáneamente.LosTmtambiénsonimportantespuesmientrasmáspequeño,serequieremenorenergíapararomperesospuentesdehidrógeno,portantosonmejores.1

4.-Otropuntoaconsideraresdondeseproducelahorquilla,entrelosextremosoentre las zonasdelmedio.Además si sonvarios lospuntosdeuniónopocos.El


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mejorescenarioesqueseproduzcanentrelaszonasmediasyconpocospuntosdeunión.DemosclickenlafiguraqueestáenlacolumnadeImage

EnestecasovemosquesolotienedospuntosdeuniónyquesuTmesbajo.Ademásqueseproducenenelmediopor lo que es buena señal. Asidebemos evaluar para cada primerescogido.

5.- Click en Self-dimer para ver los homodímeros que se pueden formar. De lamismamanerasiseproducenmenoshomodímerosyestostienenmenosunionesserá mejor. Para ello debemos fijarnos en el delta de G y en cada uno de losresultados.

6.- Click enHeteroDimerpara calcular lasposiblesdímeros entre el primery sureverso complementario y entre el primer Forward con el reverso. Click en


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Calculate. Para analizar tener el mismo criterio que para el ítem anterior.

C.-EspecificidaddelosprimersSitrabajamosconsecuenciasconocidascomoesenelcasohumano,podemosusarsoftwaresquenospermitanversielprimerquehemoselegidoseanclaenotrasregionesdelgenoma.RecuerdenquelosprimersdebenserespecíficosparaquenoseproduzcaunfalsopositivoporamplificacióndeproductosqueNOsonnuestroamplicón.ParaellopodemosusarsoftwarecomoMFEprimer2.0paraverificar laespecificidadenelADNgenómicoyARNmensajero/ADNcopiaeinclusohacerunaelectroforesisvirtual.1.-Entrarahttp://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/MFEprimer-2.0/


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2.-Colocarelorganismoqueseestáestudiando(ennuestrocasohumano),colocarlasecuenciadeambosprimers.ClickenRun.3.-Encontraráslosresultadosdelasecuenciadelosprimers,ellargo,elcontenidodeGC,Tm,quetuyaconocesporlosresultadospreviosyquepodráscorroborar.Por otro lado, los amplicones potenciales. Recuerda que los primers deben serespecíficos.Puedescolocarmultialignsideseasrealizarunalineamientomúltiple.También puedes ver el detalle de los amplicones, en que posición se estánanclando losprimers,algunosparámetrosadicionalesycomodebescitarloentupaper.Acontinuaciónlafiguraqueseobtiene:


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RecuerdaquetambiénpuedeshacerunBLASTparaalineartusprimersconelgenomadeinterésparasabersiseanclaaotrossitiosypuedagenerarproductosinespecíficos.


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Caso2:PrimersparaplantasquenotienenelgenomacompletosecuenciadoperosedisponedesecuenciasparcialesdeparientescercanosMuchas de las organismos están parcialmente secuenciados o no estánsecuenciados, por lo que, nos cuesta más su estudio y en muchos casos no esposible. Una de las estrategias que se propone si nos encontramos con estosproblemas es realizar un BLAST (alineamiento de secuencias con secuencias deotrasplantasmuyrelacionadas)ousarlassecuenciasPopSet(sequencesetsfromphylogeneticandpopulationstudies)Loqueconvieneesusarsecuenciasdeorganismosdelmismogéneroyenelpeordeloscasosdelamismafamilia.Elpeligrodeusarestatécnica,sinodisponemossiquieradesecuenciasparcialesdenuestroorganismodeinterésesquelosprimersNOanclen.ParaesteejemplousaremosalgéneroLupinus.1.-EntraralNCBI,colocarelgénerodeinterésenestecasoLupinusybuscarenlassecuenciasPOPSET

2.- Supongamos que el gen que deseo estudiar es LEGCYC1B disponible enhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/popset/342325892Debo cerciorarme que la secuencia (no importa parcial) este en el conjunto desecuenciasPOPSET.En la parte de abajo de la ventana mostrada podemos ver los alineamientosmúltiplesyenelladoderechodiceRUNBLAST,alcualledamosclick


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3.-Clickenrunblastaligment(puededemorarunpoco)

4.-Obtendremoselalineamientodelassecuencias


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ComoencualquierBLAST,seobservaelporcentajedeidentidad,elE-value,etc.Seespera un E-value mucho menor, pero en este caso lo usaremos, ya que esmeramenteunejemplo.Enlapartedeabajodenuestrosresultadosestálaventanadealineamientosysemuestranquetansimilaressonlassecuencias.Comoloquequieroesbuscargenesqueamplifiquenparaestegenenmiorganismodeinterés(alguna especie del género Lupinus) puedo diseñar primers para las regionesconservadas.

Sisedancuentalospuntosindicanquesonlamismabase(coincidenysealinean),porotrolado,podemosverqueparalasecuenciaHM562674difiereconrespectoala query (original que tomaron de referencia) en dos Y donde había citosina(revisar nomenclatura IUPAC descrita en clases) y en una T. Lo quemuestro es


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solounapartedelalineamiento,comoveránsemuestraporsegmentos.Portanto,meconvienediseñarprimersparalasregionesconservadas.EstapodríaserlaregiónparamiForwarddelabase32ala52(recuadrorojo)

Yestaregióndondeseunirámireversedelabase391ala415(recuadrorojo)


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Paraello,podemosusarlasecuenciaQuery,yaquesesuponequelaespecieparalacualelegimosdiseñarestosprimersNOtienelasecuenciadisponibleenlabasededatos, pero está emparentada a las que se muestran, es decir son del mismogénero.ParahacerlodeboiraPrimer3Plusyespecificarlossegmentosquedeseo.La secuencia Query está disponible enhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/HM562673.1?report=fasta que este casoperteneceaunaespeciedelamismafamiliaperonodelmismogénero,peroesunaregión que se ha conservado y nos puede servir para amplificar el segmento deinterés.

Porotrolado,sinosfijamosbienenlossegmentosquetenemosdisponibles,estosson muy limitados para el diseño de primers, por ejemplo la región para elForwardessolode21bases(lomismoqueellargodeunprimer)yladelreversees de 25 bases, por lo que, no hay mucho de que escoger, para ello nosotrospodemos ir tomando regiones de 18 a 25 pb probarlas en Primer3 y luegoanalizarlasenOligoanalizerparaelegiralasmejores.Enestoscasosesmuchomáscomplicadopoderobtenerprimersquenoformensubproductos,peroseeligenalosmejores.Por ejemplo elijamos para el forward la región de la 32 a la 49(CTTAACCCTGAAAATGCT : 18bp) y para el reverse las 18bp empezando por labase391(CAAAGCAAGCAACACCCT:18bp).Recuerdaquepodemos ir cambiandoy colocarpor ejemploun largodiferenteotomandoenelrangoestablecidolasdiferentesbases,contaldeelegiralmejorparposible.5.-EntraraPrimer3Plushttps://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgiycolocarenlapartedeabajolosprimersqueestamosproponiendo.ElForwardseráCTTAACCCTGAAAATGCTMientras que el reverse será el reverso complementario de la secuencia quereconoceesdecirAGGGTGTTGCTTGCTTTG


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DamosclickaPickPrimersyobtenemoslosiguiente:

Donde se muestran las características del primer F y R en este caso podemosdescartarestacombinación,yaqueambostienenunTmquedifiereenmásde5ºC.Porotrolado,semuestralaposiciónquereconocenlosprimers.

DeestaformavamoseligiendoalparcorrectoyluegoprocedemosalanálisisconOligoanalyzer.


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Caso3:PrimersSSRparagramíneasLos microsatélites son marcadores moleculares codominantes, secuenciasrepetidasentándemmuyusadosenestudiosdevariabilidadydiversidadgenéticatantoenplantascomoenanimalesyhumanos.Para poder diseñar primers que amplifiquen microsatélites de interés primerodebemosencontrarelmicrosatélitequebuscamosenlasecuenciadeinterés.

1.- Eliges la secuencia en la cual deseas testear si haymicrosatélites, para luegorealizar tuestudiosdevariabilidadodiversidadgenética.Recuerdaque tambiénpuedesusarestaherramientaparaotrasespecies,yaqueelalgoritmotepermiteencontrar cualquier SSR en el formato fasta de acuerdo a las características queindicaste.Enestaoportunidad trabajaremoscon la secuenciademaíz (Zeamayscultivar B73 chromosome 7, B73 RefGen_v4, whole genome shotgun sequence)disponibleenelsiguientelinkhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_024465.2?report=fasta&from=113218229&to=1132285632.- Entrar a SSRTools de Gramene, esta es una página especializada de estasplantas,si larevisanpodránencontrarqueyahayunalistadeprimersprobadosparaellasperosinuestroobjetodeinterésfueraunaplantaquenosehaestudiadomucho, podemos usar esta herramienta disponible enhttp://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool

3.- Colocar los parámetros que estamos buscando como “seleccionar el máximolargodelmotivo”.Porejemplo,sipongodímeroesporquequieroqueelsoftwareelijaunasecuenciadedosnucleótidosqueserepitannveces.Enlaletrabcolocoporejemplo3queseríaelmínimodevecesquequieroqueserepitaestedímero.Talcomoapareceenlasiguientefigura:


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4.-Copioypegomi secuencia fastade interés enel recuadrodel software,de lasiguienteformayledoyclickaFINDSSRs:

5.- Obtendré una lista de los microsatélites que estarían presentes, según losparámetros indicados. Por ejm el primer resultado nos indica que la secuenciatieneunmotivodímerodeCA(citosinayadenina)queserepite3vecesyteindicaque inicia en la base 2261 y termina en la base 2266 (hay otro similar en laposición4568al4573).


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6.-AhoravamosasuponerquemeinteresasoloesedímerodeCArepetido3vecesy voyadiseñarprimerparaque solo se amplifiqueesa región,paraver si entrecultivarespuedoobservarunadiferenciaenellargoderepeticiones(máscortoamás largo). Para ello entro a Primer 3 Plus https://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi y colocaré mi secuencia FASTA con algunasrestricciones. Primero como quiero que amplifique la región que va de la base2261yterminaenlabase2266,colocoenTARGETS2261,6Puedomodificarlosajustes según lo explicado en clase o puedo dejar todo por defecto y darle pickprimers(dependerádelobjetodeestudio).

7.-Obtengolosiguiente:

Dondesemuestraelresultadodevariosparesdeprimers.Talcomoseexplicoenclase, ver que se cumplan las reglas de diseño de primers. Además se muestradondeanclanambosprimersylaregiónquedelimité.


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Si nos damos cuenta se subrayó otra región (muy cercana pero no es elmicrosatélite que buscamos) es la regiónAGTTCT queNO corresponde a lo queindicamos. Sin embargo, subrayé la región que correspondería al motivoestudiado.EsteerrorsepuededeberalalgoritmoqueusaelprogramaSSRToolsparacontarlasbases.Ahora solo faltaría usar Oligoanalyzer para ver si los primers elegidos generanhorquillas, homodímeros o heterodímeros y elegir a los mejores. Recuerda queesteessolounejemplo,trabajandoconalgunosplantascomomaízqueyacuentaconunabaseespecializadaesmás fácilencontrarSRRyaprobadosyadquirirlospara nuestro estudio. Por otro lado, si trabajaremos con plantas no estudiadaspreviamentepodemosusarestaherramientaybuscargenesqueanteriormentesehayan reportado que presenten microsatélites y usarlo en nuestra especie deinterés. Este software detecta cualquier tipo de microsatélites sin importar laespecieenestudio.

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