Talasemi ve Orak Hücreli Anemide Hematolojik Tanı

Dr. Zümrüt Uysal

19 Kasım 2011

Anemik Çocuğa Yaklaşım

• Öykü

• Fizik muayene

• Laboratuar

1.Tam Kan Sayımı Hb,Hkt, KK, OEV, OEH, OEHK, BK, Trombosit 2. RDW 3.Retikülosit 4.Periferik Yayma • Demir rezervi - Serum demiri, UDBK, TS - Ferritin -Serum eritrosit protoporfini • Coombs test Eksiklik testleri - Folik asit, B12 düzeyi • Hemoglobin elektroforezi • Kemik iliği • Osmotik frajilite • Eritrosit enzimleri • Radioizotopik araştırmalar

LABORATUVAR

Yaşlara Göre Eritrosit İndekslerinin Değişimi

YAŞ MCV (fl)

Mean -2SD

MCH (pg)

Mean -2SD

MCHC (g/dL)

Mean -2SD

1-3 gün 108 95 34 31 33 29

2 hafta 105 86 34 28 33 28

1 ay 104 85 34 28 33 29

2 ay 96 77 30 26 33 29

3-6 ay 91 74 30 25 33 30

0.5-2 yaş 78 70 27 23 33 30

2-4 yaş 80 72 27 24 34 31

4-10 yaş 83 77 28 25 34 31

10-15 yaş 86 78 29 25 34 31

Hb (g/dl) MCV (µ3)

Yaş(yıl) Ortalama

Alt sınır Ortalama

Alt sınır

YD 16.8 13 110 100

0.5-1.9 12.5 11.0 77 70

2-4 12.5 11.0 79 73

5-7 13.0 11.5 81 75

8-11 13.5 12.0 83 76

12-14 13.5

14.0

12.0

12.5

85

84

78

77

15-17 14.0

15.0

12.0

13.0

87

86

79

79

NORMAL Hb ve MCV Değerleri

Hb alt sınır

g / dl

MCV alt sınır

3

YD

13 110

3 ay

9.5 70

6ay - 6yaş

10.5 70-74

7-12 yaş 11

76-80

Erişkin 12-14 80

Anemi ve Mikrositoz

Tam Kan İncelemesi

MCV

ANEMİ

Mikrositer Normositer Makrositer

-Demir eksikliği anemisi

-Kronik enflamasyon anemileri

(normositik te)

-α ve β talasemi sendromları

-Kurşun zehirlenmesi

-Sideroblastik anemiler

-Bakır, pridoksin ve Zn eksikliği

Megaloblastosis olmaksızın makrositoz -yenidoğan dönemi -retikülostoz -karaciğer hastalıkları -hipotroidi -aplastik anemiler -Pure red cell anemi -MDS

Megaloblastosisle makrositoz -B12 eksikliği -folik asit eksikliği -konjenital ve akkiz pürin ve pirimidin metabo. bozuklukları

Beta talasemi taşıyıcılarında ayırıcı tanı

Demir eksikliği RBC↓, RDW ↑

Mikrositoz + eritrositoz RDW normal

MCV / RBC olan Mentzer İndeks <13

MCV<61fl MCHC<28g/dl MCV/MCHC> 1

Enflamasyon anemisi Sed, CRP, Ferritin

Alfa talasemi : mikrositoz, hipokromi, eritrositoz DE değil, Hb A2 Hb F artmamış ise düşünülür Alfa ve beta talasemi birlikte ise beta talasemideki değişiklikler (A2 artışı) görülmeyebilir. Aile çalışmaları, moleküler çalışmalar gerekir Kurşun entoksikasyonu (FEP↑)

Demir eksikliği

Talasemi minör

Normal erişkin insan hemoglobinleri

• Hb A : α2β2 %96- 98

• Hb F : α2 γ2 %0.5- 2

• HbA2 : α2 δ2 %1.5- 3.5

• Αlfa talasemi

• Beta talasemi

Periferik yayma

Metilen mavisi ile retikülosit boyama

1/1 metil viole ile karıştırıp, 370C ½ sa

parafinle kapatıp

Hemoglobin Elektroforezi

Metot:

Bir tüpün içine 50l venöz kan ve 300l hemolizat solüsyonu konur ve karıştırılır. En az beş dakika

bekletilir. Selüloz asetat plağı dikkatlice ve hava kabarcığı olmaksızın alkali (Ph 8.2-8.6) Supre

Heme tampon içine yavaşça daldırılır. Beş dakika sonra plak tampondan çıkarılıp, kurutma kâğıtları

arasında tek bir hareketle kurutulduktan sonra örnekler aplikatör ile plağa basılır. Örnekler selüloz

plak üzerinde katot ile anot arasındaki bir başlama noktasına yüklenir. Plak elektroforez tankına

örnek tatbik edilen ucu katot kutba gelecek şekilde yerleştirilir. Elektroforez cihazı 3,1amper ve 20

dakika olacak şekilde çalıştırılır. Bu süre sonrası plaklar çıkarılarak sırayla aşağıdaki çözeltilerde ve

sürelerde tutulur.

•Poncuez boyası 5 dakika

•%5’lik Asetik Asit 5 dakika

•%5’lik Asetik Asit 5 dakika

•%5’lik Asetik Asit 5 dakika

•Metanol 5 dakika

•% 80 Metanol + % 20 Asetik Asit 5 dakika

Bu işlemlerden sonra plak tankın içinde kurutulup, tam şeffaflaştıktan sonra dansitometrede 520 nm

dalga boyunda okunur. Hemoglobin varyantlarının yüzdeleri tespit edilir. Hemoglobinler kırmızı

bantlar halinde görülür.

Ap

lik

asy

on

n

ok

tası

Pro

tein

ler

HbA

2 -

H

b E

, H

b,C

, O

Ara

p(

>%

10

)

Hb

S v

ey

a H

b D

Hb

Lep

ore

Hb

F

Hb

A1

Hb

A1C

Hb

J İ

ran

Hb

Ba

rts

Hb

H

Elektroforezde hemoglobinler taşıdıkları elektrik yüklerine göre selüloz plak üzerinde hareket

ederler. Bütün hemoglobinlerin anoda doğru hareket etmesi, onların toplam olarak negatif yük

taşıdıklarını göstermektedir. Ancak her bir hemoglobin molekülü farklı yol alır. Dolayısıyla her

birinin taşıdığı toplam negatif yük miktarı farklıdır.

Ör: Hb A1’in toplam negatif yükü HbA2’den daha fazla olduğu için daha uzakta bir noktaya

yürümüştür.

Talasemide Sınıflandırma

1. Sessiz taşıyıcı Hematolojik olarak normal

2. Talasemi minör (taşıyıcı, heterozigot ) Hafif hipokrom mikrositer anemi

3. Talasemi intermedia (hasta, homozigot) orta derecede anemi, transfüzyon ihtiyacı az

4. Talasemi major (hasta, homozigot) Ağır anemi, transfüzyona bağımlı

Sessiz Taşıyıcı

Sessiz taşıyıcılık - Farklı klinik ve biyokimyasal bir durum - Hb A2 düzeyleri ve periferik yaymaları normal - Taşıyıcılar klinik olarak tamamen normal, mikrositoz - Globin sentezinde orta derecede azalma (-101 promotor mut ve + 1 cap

site ınr mut) Hastalar -Sessiz taşıyıcı talasemi geni için homozigot olanlar -Orta derecede bir anemi (Hb 6-7g/dl) nadiren transf gereksinimi -Önemli derecede hepatosplenomegali olabilir. -Hemoglobin elektroforezinde HbF %10-15 , HbA2 ise klasik talasemi

taşıyıcılarında olduğu gibi (% 3,5 ).

Beta talasemi minor (beta talasemi trait, beta talasemi taşıyıcılığı)

Beta tal majörlü hastaların anne ve babaları, taşıyıcılığın farkında değiller Bir geni tamamen normal, diğer geninde mutasyon HbA2: Mutant geni ve karşı taraftaki kromozomdaki sağlam genine bitişik

geninden yapılan globin zincirlerinin, eksik geni yüzünden zincirleri ile birleşmesi nedeniyle 2 2 A2 düzeyi artar

HbA2, HbF veya her ikisi de, nadiren normal , globülinin %2,5’u Eğer globulin ekspresyonunu etkileyen bir mutasyon varsa

daha da az HbA2 Demir eksikliğinde A2 düzeyi azalır. Bu nedenle beta talasemi taşıyıcılarının tanısı

maskelenebilir. Demir tedavisinden sonra HbA2 de

Hipokrom mikrositik hafif bir anemileri olabilir

Demir, folik asit eksikliği, gebelik, enfeksiyonlar gibi stres durumları anemilerini artırabilir.

Beta talasemi minor

۞ Yüksek A2 ile olan talasemi taşıyıcılığı En fazla görülen tip, tek baz mutasyonu sonucu HbA2: %3,5-8, HbF %1-5 + veya o mutasyonlarla olan heterozigotlar farklıdır. Klinik fenotipi mutasyonun tabiatı belirler. + taşıyıcılarda MCV ve MCH daha yüksektir. Homozigot çocuklarında

transfüzyona bağımlı anemi, fakat bazen de talasemia intermedia fenotipi olur. ۞ Yüksek A2, yüksek F ile olan talasemi taşıyıcılığı Farklı bir varyant. Hem A2 hem %5-20 gibi Hb F yüksektir. geni delesyonu

ve genleri sağlam. ۞ Normal A2 ile olan talasemi taşıyıcılığı Sessiz taşıyıcılardan ayrılmalıdır. Farkı hipokrom mikrositer anemi oluşu Hem hem geni azalmış (aynı kromozom veya karşı sağlam kromozomda) Ebeveynlerden biri bu tip, diğeri klasik taşıyıcı ise ağır klinik tablo

Talasemi İntermedia

Homozigot talasemi fakat klinik olarak ağır değil transfüzyon ihtiyacı yok veya çok az

Enfeksiyon, cerrahi ve bazı özel stres durumları dışında Hb’leri 6-10g/dl düzeyinde

İlerleyen yaşla kemik iliği genişlemesine bağlı kemik değişiklikleri

Ekstramedüller hematopoez kitleleri

Artmış demir emilimi sonucu demir birikim bulguları

Talasemide hastalığın ağırlığı α ve non α globin sentezi arasındaki dengesizliğin derecesine bağlıdır

β mutasyonunun tipi β+ β0

α globinin artması veya azalması

genetik olarak Hb F yapma kapasitesi)

Talasemik hastada veya aile taramalarında

klasik olmayan elektroforez sonuçları varsa

• α veya γ genlerinin eksikliği veya fazlalığı düşünülmelidir

• α talasemi de varsa talasemi kliniği hafifler, Hb daha yüksektir, Hb F düzeyi düşüktür

• α gen fazlalığında klinik daha ağırdır, Hb F artar.

• β gen delesyonlarında taşıyıcılarda A2 belirgin yüksek, klinik ağırdır. Promotor delesyonlarda Hb F belirgin yüksektir

• δβ talasemide taşıyıcılarda HbA2 yükselmez, Hb F %5-15 gibidir

• Homozigot β tal gibi olan hastanın anne veya babasının veya her ikisinin Hb A2 leri normal ise o taşıyıcılarda:

- Beraberinde demir eksikliği

– δβ talasemi taşıyıcılığı

– β taşıyıcılığı + δ talasemi varlığı

– -101 mutasyonu gibi sessiz taşıyıcılık

– Başka anormal Hb varlığı

• Dominant talasemi : globin genleri kodlama bölgesi mutasyonu, β sentezi çok az, inkülizyon cisimcikleri, Hb elektroforezinde bant görmek çok zor

• Yakınma: Kulak ağrısı

• Öykü : Beslenme: İnek sütü : 400 ml/gün

Jeofaji : Yok

• Soygeçmiş: Anne: 36 yaş, sağlıklı

Baba: 36 yaş, DM

• Fizik Muayene:

VA: 21.5 kg (%50-75) Boy: 116 cm (%25-50)

Cilt soluk Hb: 10.3 g/dl

Diğer sistem bulguları doğal

B.Ö., 5 yaş, Ankara

Tam kan sayımı: Hb : 10.6 g/dl Htc : % 32.3 MCV : 62.3 fl MCH : 20.5 pg MCHC: 32.8 g/dl RDW : %13 BK : 7600/mm3

Plt : 326000/mm3

PY : Hipokromi, target hücreleri

Demir profili:

SD: 90 mcg/ml

TDBK: 290 mcg/dl

TS : % 31

Ferritin: 28.83 ng/ml

Hb elektroforezi:

HbA2 : % 4.8

Hb F : 4 Anormal Hb: Yok

Anne: Normal bulgular

Baba:

Hb: 14.0 g/dl

MCV: 64.8 µ3 MCH: 21.0 pg

HbA2: % 6.7 HbF: %2

Talasemi ve Orak Hücreli Anemide Hematolojik Tanı

Dr. Zümrüt Uysal

• ÖYKÜ:

2 ve 3 aylık Halsizlik , kusma, sarılık

Anemi Eritrosit transfüzyonu (2 kere)

6 aylık Hastaneye başvuru

Tam kan sayımı:

Hb : 5.3 g/dl

MCV : 66.9 fl

BK : 9400/mm3

Plt : 245000/mm3

O.K., 4 yaş, Gaziantep

Ferritin: 42.4 ng/ml (N)

Mikrositer

anemi

4 yaş kız KLİNİĞİMİZE BAŞVURU

• Solukluk dışında yakınması yok

• Soygeçmiş: Anne: 26 yaş Sağlıklı, teyze çocukları

Baba: 33 yaş

• Fizik Muayene:

VA: 16 kg (%25-50) Boy: 95 cm (%3)

Cilt ve mukozalar soluk

Karaciğer kot altı MKH’ da 4 cm, dalak 6 cm ele geliyor

Diğer sistem bulguları doğal

O.K., 4 yaş, Gaziantep

Hb : 5.3 g/dl

MCV: 66.9 fl

RDW: 26

6/100 normoblast

Ferritin: 3556 ng/ml

Hemoglobin Elektroforezi Hb A2 : %2.1 Hb F : %13.7

Anormal Hb: YOK

Talasemi majorde laboratuar

• Hipokromik mikrositik anemi (5g/dl↓), RDW↑

• Normoblastlar (stoplazmaları bozuk)

• Eritrosit içi inkülüzyonlar

• Retikülosit artmamış

• SD ↑, UDBK ↓(0), Transferrin satüre (%100)

• İndirek bilirübin artmış ama fazla değil, idrar rengi koyu

• Hb F yüksek

• Anne ve babalarında HbA2 >3.5

O.K., LABORATUVAR İNCELEMELERİ

HASTA BABA ANNE

Hb : 5.3 g/dl

MCV : 66.9 fl

RDW: 20

Hb : 11.5 g/dl

Htc : %36.8

MCV : 62.5 fl

RDW: 13.8

Hb : 12.1 g/dl

Htc : %40.5

MCV: 71.8 fl

RDW: %14.5

Hipokromi,

anizopoikilositoz

Normoblast 2/100

Hipokromi Hipokromi

Ferritin: 3556 ng/ml Ferritin: 48.6 ng/ml Ferritin: 89.2 ng/ml

Hb A2: %2.1

Hb F : %13.7

Anormal Hb: YOK

Hb A2: %6.6

Hb F : %2

Anormal Hb: YOK

Hb A2: %6.2

Hb F : %2

Anormal Hb: YOK

Beta Talasemi Majör

Talasemide Patofizyoloji

1. İnefektif eritropoez

2. Hemoliz : İntrasellüler inkülüzyonlar, hemikrom oluşumu

3. Membran hasarı: Membranda rijidite artışı, stabilite azalması

4. Hücre dehidratasyonu

5. Eritrositlerin RES’ te yıkılışı

6. Demir birikimi ve oksidatif stres

Talasemi majorde hemoliz

• Talasemik kemik iliğinde

Eritrosit öncü hücreler sağlıklı kontrollere göre 5-6 kat fazla, ondan sonraki eritroid gelişim basamaklarında da apopitotik hücreler 15 kat fazla

• 1- İntrameduller hemoliz kemik iliğinde hemoliz ve bunun neden olduğu inefektif eritropoez

• 2- Ekstrameduller hemoliz RES ve başlıca dalakta olan hemoliz

Ekstrameduller hemoliz fizyopatolojisi:

– Membran hasarı sonucunda membran rijiditesinde artış ve stabilitesinde azalma

– İntraselüler inkülüzyonlar, hemikrom oluşumu

– Hücre dehidratasyonu

– Demir birikimi ve oksidatif stres

ß globulinde azalma, fazla α globulinzincirleri

Kemik iliğinde eritroid maturasyon boyunca intrameduller yıkım sürer.

Eritroid oncülerin yaşam süresi kısalır. Apopitosis, posfotidil serinin membrana hareketi - makrofaja sinyal - fagositoz

apopitosis

ß Talassemide İnefektif eritropoez

A B 15y E

L4 L5 Kontüzyon/ Beyin cerrahiden konsültasyon

• Hb : 8.9 g/dl

• KK : 2.87 mil/mm3

• MCV : 89 fl

• MCH :30.9pg

• MCHC : 34.6g/dl

• BK : 13 500/ mm3

• Tr : 590 000/ mm3

• Ret : %8.6

• CRP 20

• İnd Bil :2.35

• LDH :783

Hb S :%98.5

AB

BK ve Tr. Normal Pure red cell anemi İlaçlar Enfeksiyonlar Geçici eritroblastopeni

BK ve Tr. Anormal Lösemi, Kİ İnfiltrasyonu Hipersplenizm

Düşük Yüksek

RETİKÜLOSİT SAYIMI

Coombs

Normositik Anemi

NEGATİF

POZİTİF

Coombs

Korpüsküler

•Membran defektleri Morfoloji,osmotik frajilite

•Hemoglobinopatiler Hemoglobin elektroforezi

•Enzim eksiklikleri

Ekstrakorpüsküler •İdiopatik •Sekonder: İlaçlar Enfeksiyon Mikroanjiopatik HA

(DİC, HÜS, mekanik)

Otoimmün hemolitik anemi Primer Sekonder (konnektif doku hast., ilaçlar, vb)

İzoimmün hemolitik anemi Rh ABO subgrup uygunsuz kan trans.

Ap

lik

asy

on

n

ok

tası

Pro

tein

ler

HbA

2 -

H

b E

, H

b,C

, O

Ara

p(

>%

10

)

Hb

S v

eya

Hb

D

Hb

Lep

ore

Hb

F

Hb

A1

Hb

A1C

Hb

J İ

ran

Hb

Ba

rts

Hb

H

HbA2 < % 3,5

Hb F < % 2

HbA2 bandı % 3,5 ise

HbA2 bandı % 3,5 – 8 talasemi taşıyıcılığı

HbA2 bandı % 10 ise Hb E, Hb C ve O

Arap ?

Elektroforezde hemoglobinler taşıdıkları elektrik yüklerine göre selüloz plak üzerinde hareket

ederler. Bütün hemoglobinlerin anoda doğru hareket etmesi, onların toplam olarak negatif yük

taşıdıklarını göstermektedir. Ancak her bir hemoglobin molekülü farklı yol alır. Dolayısıyla her

birinin taşıdığı toplam negatif yük miktarı farklıdır.

Ör: Hb A1’in toplam negatif yükü HbA2’den daha fazla olduğu için daha uzakta bir noktaya

yürümüştür.

Hb S HbD ayırımı

Solubilite Testi

• 4,5 ml’lik EDTA’lı kan serum fizyolojik ile iki kez

yıkanır.

• 1 ml yıkanmış eritrosit + 1,5 ml distile su + 0,4 ml

CCI4 karıştırılıp(vortex), 15 dakika 3000 rpm’de

santrifüj edilir.

• Hemolizat (üstteki kısım) başka bir tüpe alınır. +40

C’ de uzun süre saklanabilir.

• Başka bir tüp içinde 5 mgr Na2S2O4 (Sodyum

hiposülfit), 0,9 ml solubilite solüsyonu (pH 6,8,

KH2PO4) ile karıştırılır. Bu karışıma 0,1ml hemolizat

ilave edilir.

• Birkaç dakika beklenir. Bulanıklık varsa HbS, yoksa

Hb D, vb diyoruz. Mutlaka negatif ve pozitif kontrol

kullanılmalı. HbS olduğunu ikinci kez ispatlamak için

Sickling Testi yapılır.

Hb D, vb‘lerinin tayini için moleküler inceleme

yapılır.

Sickling Testi

A Solüsyonu (0,114 M Na2 S2 O4, pH 6,8) : 0,2

ml

B Solüsyonu (0,114 M Na2H PO4, pH 6,8) : 0,3

ml

Venöz kan (EDTA’lı)

: 0,1 ml karıştırılır. Bu karışımdan bir damla

lam üzerine alınır, lamel ile kapatılır. Kenarları

vazelinle kaplanır. Hava girmesi önlenir. Düşük

oksijenli ortamda hemoglobinin polimerazyonu

nedeni ile uzar ve bükülür. Bir saat 37 0C ‘de en

az bir saat bekletilir. Bu süre sonunda

mikroskopta oraklaşmaya bakılır.

Hb S :%98.5

Hb S :% 20.3

AB