Mtodos de obtencin y purificacin de sueros

Sueros, Vacunas y Hemoderivados: Mtodos de Obtencin y PurificacinAntecedentesEn 1890 Von Behring y Kitasato demostraron que el suero de animales previamente inmunizados a la difteria podan transferir su estado de inmunidad a animales sin inmunizar. Los investigadores de la siguiente dcada demostraron que un componente activo del suero inmune poda neutralizar toxinas, precipitar toxinas y aglutinar bacterias. En la dcada de 1930 y gracias a los esfuerzos de Elvin Kabat, una fraccin del suero llamada gamma globulina (hoy en da inmunoglobulina) era la responsable de estas actividades. La fraccin de molculas activas de las inmunoglobulinas son llamadas anticuerpos.IntroduccinLa denominacin de sueros incluye los preparados biolgicos que contienen anticuerpos y cuya administracin por va parenteral produce una inmunidad adquirida pasiva frente a determinadas enfermedades infecciosas.Se obtiene a partir de un hombre o un animal que ha adquirido la inmunidad, ya sea espontneamente por infecciones o artificialmente por inmunizacin.

La inmunizacin de sueros se caracteriza en que, a diferencia de la vacunacin, la inmunidad provocada es de aparicin inmediata, pero menos intensa y poco duradera. Por estas caractersticas los sueros se emplean en la prevencin a corto plazo y, adems, en el tratamiento de las enfermedades infecciosas en situaciones de emergencia.Se pueden dividir en sueros de origen animal o heterlogos o sueros de origen humano u homlogos.

Sueros heterlogos

Antimicrobianos: Son sueros de animales inmunizados frente a bacterias o virus por la administracin de vacunas atenuadas, inactivadas o antgenos purificados. Antitxicos: Son sueros de animales inmunizados frente a exotoxinas por inoculacin del toxoide correspondiente.

Sueros homlogos e inmunoglobulinas

Son sueros humanos o sus fracciones obtenidos de personas cuyo suero contiene anticuerpos por inmunizacin o por haber sufrido la infeccin clnica. Presentan la ventaja de no producir reacciones de hipersensibilidad y conferir una inmunidad pasiva de mayor duracin, pues se administran protenas de la misma especie.

Algunos mtodos de obtencin de inmunoglobulinas

Inmunoabsorcin: Remocin de anticuerpos por su antgeno o de antgenos por su anticuerpo por interaccin especfica.

Los distintos tipos de cromatografa

Precipitacin por sulfato de amonio.

Obtencin de VacunasComposicin:Lquido de suspensinAntgeno o inmungenoConservadores y estabilizadoresAdyuvantes

Clasificacin Segn su ObtencinSegn el mtodo de obtencin puede haber vacunas de grmenes vivos, atenuados, emparentados, inactivados o muertos.Tambin hay con toda la clula o algunas de sus estructuras

En los ltimos aos se han obtenido inmungenos gracias a procedimientos de biologa molecular, vacunas sintticas y vacunas recombinantes.A las tcnicas de ingeniera gentica utilizadas para obtener vacunas se les llama procedimientos especiales

Algunas vacunas se preparan a partir de un anticuerpo contra un antgeno determinado, que se le inocula a un animal, de ste se obtiene un segundo anticuerpo que se inocula en otro animal para extraer un tercer anticuerpo que est destinado a inmunizar contra el antgeno primario.

La atenuacin de microorganismos o agentes infectantes puede lograrse con una serie de pasajes en medios de cultivo o por inoculaciones en animales de laboratorio.La inactivacin o muerte del microorganismo se consigue con mtodos que recurren calentamiento o por la accin de desinfectantes.

AdyuvantesEs posible alcanzar una mayor inmunogenicidad (respuesta de anticuerpos) si a la vacuna se le agregan sustancias conocidas como adyuvantes.Son agentes o sustancias que permiten la liberacin lenta del antgeno, con lo que el efecto es mayor.Generalmente son sustancias minerales transportadoras como hidrxido o sulfato de aluminio y ciertos lpidosTipos de VacunasPara llevar a cabo la purificacin de una vacuna, primero debe saberse que tipo de vacuna ser:Microorganismo completos.Subunidades antignicas.Recombinantes.

Microorganismo completosLa vacuna consta del microorganismo que causa la enfermedad, pero este se encuentra desactivado por mtodos qumicos u otros proceso que atenuen su efecto sobre el animal a aplicar la vacuna.Centrifugacin.

Subunidades antignicasConllevan un proceso de purificacin ms laborioso. Ciertos componentes del microorganismo.Extraccin del antgeno, y posterior purificacin.Lisis celular para extraer el antgenoProtenas extracelulares o polisacridos.Cromatografa de afinidad.Solventes orgnicos.

RecombinantesUtilizan tecnologa gentica para transferir un gen que produzca un antgeno a una bacteria de fcil crecimiento.Al manipular expresin del gen se puede hacer que la protena buscada sea sobre expresada.Gen que de la orden a la clula de expulsar la protena que se busca, volvindola as extracelularPurificacin por solventes orgnicos de vacuna antirrbica.Mtodo de purificacin mediante el uso de solventes orgnicos por Filippo 1998.Extraer los lpidos que permanecen en la vacuna una vez extrada.Se trata la vacuna con n-hexano n-heptano en relacin 30:1, 3 veces para extraer los lpidos.Se homogeneza y se centrifuga a 4C obteniendo 2 fases, una orgnica y una acuosaSe retira la fase orgnica y permanece la fase acuosa parecida a la vacuna original pero ms clarificada. Hemoderivados

De modo genrico denominamos hemoderivado a todo producto obtenido por diversas tecnologas a partir de la donacin de una unidad de sangre.Existen diversos componentes sanguneos y derivados plasmticos relacionados a su proceso de fraccionamiento y posterior utilizacin.

El fraccionamiento consiste en someter al fluido sanguneo a una serie de procesos de purificacin y concentracin que permiten obtener un producto teraputico en un vehculo seguro y eficazSeleccin de donantes. Deteccin de agentes infecciosos.Extraccin de 450-500 ml sangre total. Bolsas con 50 ml de CPDA SAG-MANITOL (solucin para preservar).Sangre total Centrifugacin Derivados sanguneosObtencin de componentes sanguneos

Componentes sanguneosEntre los hemoderivados podemos encontrar:Concentrados de hemates (CH): Unidad que ha sido extrada con un anticoagulante, con o sin conservante y que por sedimentacin o centrifugacin se separa y extrae el plasma, quedando un precipitado que son las clulas de la serie roja, blanca y plaquetas

Una unidad de concentrado de hemates (CH) contiene aproximadamenteunos 180 ml (rango entre 150-210 ml) de eritrocitos, 100 ml desolucin preservativa-aditiva del tipo: AS-5 (Optisol), CPDA-1 oSAG-MANITOL y aproximadamente 30 ml (rango entre 10-50 ml) deplasma, en el que pueden encontrarse entre un 0.9-2.5 x1010 de linfocitosy granulocitosse obtiene de la donacin de una unidad de sangre,que es sometida a centrifugacin y/o sedimentacin, posterior separacindel anticoagulante, de la capa lecuo-plaquetaria y plasmtica, yresuspendida en soluciones aditivas como AS-1 (Adsol), AS-3(Nutricel) o AS-5 (Optisol), que contienen sodio, dextrosa, adeninay manitol,

25Concentrados de plaquetas (CP)Se obtiene tras centrifugacin suave, se separan los hemates del plasma rico en plaquetas; una segunda centrifugacin a mayor nmero de revoluciones se utiliza para concentrar las plaquetas y resuspenderlas en 60 mL de plasmaContiene entre 0.1 y 0.4x109 linfocitos, y cantidades pequeas de hemates y granulocitoscontiene aproximadamente 5.5x1010 plaquetas,Una unidad de concentrado de plaquetas de afresis (CPQA) es uncomponente obtenido de un solo donante, a travs de un proceso dedos a tres horas de duracin, mediante un separador de clulas auto-mtico, en el que se separan las plaquetas del resto de los componentescelulares sanguneos por centrifugacin, siendo recogidas en unabolsa con plasma del donante y devolviendo al mismo los dems componentessanguneos.Una unidad de CPQA contiene normalmente mas de 3x1011 plaquetas,en un volumen que vara entre 200-400 mL; con aproximadamenteentre 1-3x1099 linfocitos y escasos hemates.concentrado de granulocitos de afresis (CGA)26 PlasmasEs el sobrenadante obtenido por centrifugacin de una unidad de sangre entera, en un periodo dentro de las 6 h posteriores a la donacin y se usa como mximo en las 24 h siguientes. Carece de los factores V y VIII de la cadena de coagulacin.

Tipos de plasmasFresco (PF): Separado por centrifugacin en menos de 6 h postdonacin y se administra antes de 24 hFresco congelado (PFC) : Separado por centrifugacin , retirando los hemates y posteriormente una nueva centrifugacin separa las plaquetas del plasma. Se congela en menos de 6 h con duracin de 1 aoCongelado (PC): plasma fresco congelado con ms de un ao de refrigeracin

PFC contiene todos los factores de la coagulacin establesy lbiles a razn de 1 UI por cada mL y protenas presentes en el plasmaoriginal. No contiene ni hemates, ni plaquetas ni leucocitos. 28Factores de coagulacin y protenas obtenidas a partir del PFCFibringenoFactor IIFactor VFactor VIIFactor VIIIFactor IXFactor X

Factor XIFactor XIIFactor XIIIAntitrombina IIIProtena SProtena CFibronectina

Rico en plaquetas: Plasma obtenido despus de una centrifugacin de sangre entera, con duracin de 5 a 7 das Concentrado en plaquetas: Sedimento obtenido por una segunda centrifugacin (aprox. 6x1010 plaquetas en 50-70 ml plasma)

Crioprecipitado (CRI)Concentrado de protenas plasmticas de alto peso molecular obtenido al descongelar PFC,centrifugarlo y obtener el sobrenadante,volvindose a congelar. Rico en factor VIII, fibringeno, factor XIII, fibronectina y factor von Willebrand.

Distintos mtodos para extraccin y purificacin de la protena. Precipitacin diferencial con agentes qumicos.Fraccionamiento de Cohn (etanol fro).Cromatografa en gel de afinidad e inmunoafinidad.

Derivados plasmticosAlbmina.Fraccin proteica del plasma (FPP).Concentrado de factor VIII .Concentrado de complejo de factor VIII-factor Von Willebrand.Concentrado de factor IX .Concentrado de complejo de factor IX (concentrado de complejo protrombnico).Concentrado de factor XIII.Fibringeno.Complejo coagulante anti-inhibidor (CCAI).Antitrombina.Protena C.Inmunoglobulinas.Derivados plasmticos

La albmina humana (ALBH) es una protena plasmtica obtenida por fraccionamiento de Cohncromatografa por intercambio inico, cromatografa porafinidad por heparina, purificacin por anticuerpos monoclonales,etc.)33Procesos de fraccionamiento y purificacin de la sangre entera (SE) para la obtencin de hemoderivados

http://www.youtube.com/watch?v=6_MH6Pz41ow&feature=related

Referencias Correa, T. L. (2008). Medicina Transfucional. Espaa.Ligorit, E. (2004). Administracin de Sangre y Hemoderivados. Compendio de Medicina Transfucional. Espaa: Escuela Valenciana de Estudios de la Salud.

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