STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE.

1. Fisiología y estructura

El neumococo es un coco Gram positivo encapsulado, alargados o en forma de ¨lanceta¨ que se disponen en pares ( diplococos) y en cadenas cortas anaerobios facultativos exigentes desde el punto de vista nutricional, la mayoría de las cepas poseen una capsula externa, las células tienen un diámetro de 0,5 a 1,2 um, con forma ovalada. Las células más viejas se decoloran fácilmente y aparecen cono Gram negativas, la morfología de las colonias es variable. Las colonias de las cepas encapsuladas suelen ser grandes (de 1 a 3 mm en Agar Sangre, mas pequeñas en medios de chocolate o Agar Sangre calentada), redondas y muciodes; las colonias de las cepas no encapsuladas son más pequeñas y aplanadas. Todas las colonias experimentan un proceso de autolisis con el paso del tiempo, el cual consiste en la disolución de la porción central de la colonia, que origina un aspecto de hoyuelo. Las colonias aparecen con α- Hemolíticas en Agar Sangre cuando se incuban en una atmosfera aerobia y pueden ser β- Hemolítica cuando crecen en condiciones Anaerobias, el aspecto α- Hemolítico deriva de la producción de neumolisina, una enzima que degrada la hemoglobina y genera un producto verde.

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S. pneumoniae puede fermentar varios hidratos de carbono, siendo el acido láctico el principal derivado metabólico. Como todos los streptococcus, s. pneumoniae carece de actividad catalasa.

Pared celular: La capa de péptidoglucano de la pared celular del neumococo es la característica de un coco Gram positivo. Las cadenas de oligopeptidos se encuentran unidas a las subunidades alternantes de N-acetilglucosamina y acido N-acetilmuramico, los cuales se entre cruzan mediantes puentes de pentaglicina, el otro componente fundamental de la pared celular es el acido teicoico el cual es rico en galactosamina, Fosfato y Colina. La colina es exclusiva de la pared de S. pneumoniae, y desempeña una importante función en la regulación de la hidrolisis de la pared celular. La colina debe estar presenta para que se active la autolisina neumococica, la amidasa durante el proceso de división celular.

En la pared celular del neumococo hay dos formas de acido teicoico, una de las cuales se haya expuesta en la superficie celular y otra esta unida de forma covalente a los lípidos de la membrana plasmica. El acido teicoico expuesto esta unido a la capa de péptido glucano y se extiende a través de la capsula que lo rodea.

2. Patogenia:

Las manifestaciones de la enfermedad se deben fundamentalmente a la respuesta del organismo anfitrión, frente a la infección en mayor medida que a la producción de factores tóxicos específicos del microorganismo. Sin embargo, resulta crucial comprender el modo de colonización bucofarínge por S. pneumoniae, su diseminación a tejidos normalmente estériles, estimulación a una respuesta inflamatoria local, y los mecanismos para evitar ser destruidos por las células fagociticas.

2.1 Colonización y migración: S. pneumoniae es un patógeno humano que coloniza la bucofaringe y en situaciones especificas es capaz de diseminarse a los pulmones, los senos paranasales y el oído medio, también puede ser trasportados a través de la sangre a regiones tan distales como el cerebro. La colonización inicial de la bucofareinge esta mediada por la unión de las bacterias a las células epiteliales por medio de adhesinas de superficie.

La migración posterior del microorganismo de las vías respiratorias inferiores se puede impedir cuando las bacterias están rodeadas de mucosidad y son eliminadas del aparato respiratorio mediante la acción de las células del epitelio ciliar. Las bacterias neutralizan este envoltorio a través de la producción de una proteasa de IgA secretora (IgAs) y una neumolisina. La IgA secretora atrapa a las bacterias en la mucina al unirse a ellas en el sitio de unión de antígenos y a la mucina en la región Fc. La proteasa bacteriana evita esta interacción.

2.2 Destrucción tisular: una característica de las instrucciones neumococicas es la movilización de las células inflamatorias hacia el foco de la infección. El proceso esta mediado por el acido teicoico neumococico, fragmentos de peptidoglucano y neumolisina. El acido teicoico y los fragmentos de peptidoglucano activan la ruta alternativa del complemento, produciendo C5a, el cual interviene en el proceso inflamatorio. Esta actividad se ve potenciada por la amidasa bacteriana, la cual favorece la liberación de los componentes de la pared celular. La neumolisina activa la ruta clásica del complemento, dando lugar a la producción de los componentes C3a Y C5a.como consecuencia de lo anterior, los leucocitos activados fabrican citocinas como IL-1 O TNF-a, lo que provoca la migración de las células inflamatorias a las zonas de infección, fiebre, daño tisular y otros signos caracteristicos de la infección estreptocócica. La producción de peróxido de hidrogeno por S. pneumoniae puede ocasionar, igualmente, daño tisular causado por los intermediarios reactivos del oxigeno.

Por último, la fosforilcolina de la pared de la célula bacteriana se puede unir a los receptores del factor activador de plaquetas que se expresan en la superficie de las células endoteliales, los leucocitos, las plaquetas y algunas células de tejidos como los pulmones y las meninges. Mediante su unión a estos receptores, las bacterias logran entrar en las células, donde se encuentran protegidas de la opsonizacion y la fagocitosis, y desde ellas se diseminan a zonas restringidas, como la sangre y el sistema nervioso central. Esta actividad facilita la diseminación de la enfermedad.

2.3Supervivencia fagocitica: S. pneumoniae sobrevive a la fagocitosis como consecuencia de la protección antifagocitica que le proporcionan su capsula y la inhibición de la actividad oxidativa fagocitica de la célula mediada por neumolisina, la cual es necesaria para producir la destrucción intracelular. La virulencia de S. pneumoniae representa una consecuencia directa de la presencia de dicha capsula. Las cepas encapsulada (lisas) pueden producir enfermedad en el ser humano y en animales de experimentación, mientras que las cepas carentes de capsula (rugosas) no son virulentas. Los anticuerpos dirigidos frente a los polisacáridos capsulares específicos de tipo confieren protección frente a la enfermedad provocada por cepas inmunológicamente relacionadas. Los polisacáridos capsulares son solubles y se conocen como sustancias solubles específicas. Los polisacáridos libres pueden proteger a los microorganismos viables de la fagocitosis al unirse con los anticuerpos opsonizantes.

3. Epidemiologia.

S. pneumoniae habita con frecuencia en la faringe y la naso faringe de personas sanas. Se ha descrito una incidencia de portadores comprendida entre el 5% y el 75%, ya que la incidencia depende de forma significativa tanto de los métodos empleados para detectar el microorganismo como de la población estudiada. La colonización es más frecuente en niños que en adultos que conviven con niños. La colonización por S. pneumoniae tiene lugar inicialmente alrededor de los 6 meses de edad. Posteriormente, el niño es colonizado de manera transitoria por otros serotipos del microorganismo. La duración del estado de portador disminuye con cada serotipo sucesivo que coloniza, en parte debido al desarrollo de inmunidad especifica de serotipo. Aunque los nuevos serotipos se adquieren a lo largo de todo el año, la incidencia de portadores y de enfermedad asociada es más elevada durante los meses fríos. Las cepas neumococicas capaces de producir enfermedad son las mismas que se asocian al estado de portador. Cuando tiene lugar, la

infección se debe a la adquisición de un nuevo serotipo, y no a uno asociado con un prolongado estado del portador por parte del paciente.

La enfermedad neumococica aparece cuando los microorganismos que colonizan la nasofaringe y la bucofaringe se diseminan hasta localizaciones alejadas, como los pulmones (neumonia), los senos paranasales (sinusitis), los oídos (otitis media) y las meninges (meningitis). La bacteriemia, con ulterior diseminación de la enfermedad a otras partes del organismo, puede asociarse a cualquiera de estos procesos infecciosos.

S. pneumoniae es causa frecuente de neumonia bacteriana (se estima unos 500.000 casos anuales en EE.UU.), meningitis (6000 casos anuales), otitis media y sinusitis (más de 7 millones de casos anuales) y bacteriemia (55.000 casos anuales). La incidencia de la enfermedad es más alta en niños y ancianos, ya que ambas poblaciones presentan concentraciones bajas de anticuerpos protectores dirigidos frente a los polisacáridos capsulares neumococicos.

La neumonia tiene lugar cuando los microorganismos endógenos bucales son aspirados hacia las vías respiratorias inferiores. Aunque las cepas se pueden propagar de una persona a otra en una población cerrada a través de gotitas respiratorias presentes en el aire, las epidemias son pocos frecuentes. La enfermedad aparece cuando se aluden los mecanismos de defensa (reflejo de la epiglotis, inmovilización de las bacterias por las células productoras de mucosidad que tapizan el bronquio, eliminación de los microorganismos por las células del epitelio ciliado y el reflejo de la tos), permitiendo que los microorganismos colonizadores de la bucofaringe tengan acceso a los pulmones. La enfermedad neumococica se asocia, a menudo, con antecedentes de una infección respiratoria de origen vírico, como la gripe o el sarampión, u otras entidades que interfieren con la eliminación de las bacterias, como son la enfermedad pulmonar crónica, el alcoholismo, la insuficiencia cardiaca congestiva, la diabetes mellitus y la enfermedad renal crónica.

4. Enfermedades clínicas.

4.1 Neumonía: la neumonia neumococica se produce cuando las bacterias se multiplican en los alveolos. Después de ser aspiradas, las bacterias proliferan con rapidez en el líquido rico en nutrientes de edema. Los hematíes, los cuales se extravasan de los capilares congestivos, se acumulan en los alveolos, seguidos de los neutrofilos y, posteriormente, de los macrófagos alveolares. La curación tiene lugar cuando se desarrollan anticuerpos específicos frente a la

capsula, lo que facilita la fagocitosis del microorganismo y la destrucción microbiana.

El inicio de las manifestaciones clínicas de la neumonia neumococica es brusco, y consiste en un cuadro de escalofríos intensos y fiebre mantenida de 39 C a 41 C. con frecuencia el paciente presenta síntomas de infección respiratoria vírica entre 1 y 3 días antes del inicio de la entidad. La mayoría de los pacientes tiene tos productiva con esputo hemoptísico, y generalmente presenta dolor torácico (pleurítico). La enfermedad suele localizarse en los lóbulos pulmonares inferiores como consecuencia de su asociación a la aspiración (de ahí el nombre de neumonía lobular), sin embargo, los niños y los ancianos pueden padecer una bronconeumonía más generalizada. Los pacientes generalmente se recuperan con rapidez tras la instauración de tratamiento antimicrobiano adecuado y logran la curación radiológica completa con un plazo de 2 a 3 semanas.

La tasa de mortalidad global es del 5%, aunque la probabilidad de fallecimiento se ve influida por el serotipo del microorganismo y por la edad y las enfermedades subyacentes del paciente. La tasa de mortalidad es considerablemente más elevada en pacientes con enfermedad producida por S. pneumoniae de tipo 3, así como en los ancianos o los aquejados de una bacteriemia documentada. Los pacientes con disfunción esplénica o esplenectomía pueden presentar, igualmente, enfermedad neumococica grave debido a la disminución de la eliminación de las bacterias de la sangre y a la producción defectuosa de anticuerpos precoces. En este subgrupo la enfermedad se asocia a evolución fulminante y tasa de mortalidad elevada.

En los pacientes aquejados de neumonia neumococica no se forman normalmente absceso, excepto en los infectados por algunos serotipos específicos. Los derrames pleurales se observan en aproximadamente el 25% de los pacientes con neumonia neumococica, y el emplea (derrame purulento) constituye una complicación infrecuente.

4.2 Sinusitis y otitis media .

S. pneimoniae es causa frecuente de infecciones agudas de los senos paranasales y el oído. La enfermedad suele precederse de una infección vírica de las vías respiratorias inferiores, después de la cual los leucocitos polimorfonuclares (PMN) infiltran y obstruyen los senos y el conducto auditivo. La infección del oído medio (otitis media) afecta fundamentalmente a niños pequeños, pero la sinusitis bacteriana puede registrarse en pacientes de todas las edades.

4.3 Meningitis.

S. pneumoniae se puede diseminar al sistema nervioso central después de una bacteriemia, infecciones del oído o los senos o un traumatismo craneoencefálico que origine una comunicación del espacio subaracnoideo con la naso faringe. La meningitis bacteriana puede aparecer en pacientes de todas las edades, si bien se trata en esencia de una enfermedad pediátrica. Aunque la meningitis bacteriana se relativamente infrecuente en neonatos, S. pneumoniae constituye actualmente una causa destacada de la enfermedad tanto en niños como en adultos. La mortalidad y las secuelas neurológicas graves son entre 4 y 20 veces más frecuentes en los pacientes con meningitis por S. pneumoniae que en aquellos aquejados de meningitis producida por otros microorganismos.

4.4 Bacteriemia.

La bacteriemia aparece en una proporción comprendida entre el 25% y el 35% de los sujetos con neumonia neumococica, y en más del 80% de los pacientes con meningitis, por el contrario las bacterias no suelen estar presentes en la sangre de los pacientes con sinusitis u otitis media. La endocarditis puede aparecer en individuos con válvulas cardiacas normales o previamente dañadas. Es frecuente la destrucción del tejido valvular.

5. Diagnostico de laboratorio.

5.1 Detección de antígenos: el polisacárido C del neumococo se excreta en la orina y se puede detectar por medio de un inmunoanalisis comercializado. La orina debe concentrarse mediante ultrafiltración con anterioridad a la realización de la prueba con el fin de optimizar su sensibilidad. Se ha referido una sensibilidad del 70% en pacientes aquejados de neumonia neumococica; no obstante, la especificidad puede ser baja, en especial en la población pediátrica. Por este motivo no se recomienda la utilización de esta prueba en sujetos con neumonia. No se han determinado la sensibilidad ni la especificidad del análisis en pacientes con infecciones diseminadas, como la meningitis.

5.2 Microscopia: la tinción de Gram de las muestras de esputo constituye un método rápido para diagnosticar la enfermedad estreptocócica. Estos microorganismos aparecen de manera característica como diplococos grampositivos en forma de lanceta rodeados de una capsula que no se tiñe; sin embargo, también pueden adoptar un aspecto gramnegativo debido a su tendencia a teñirse inadecuadamente (especialmente los cultivos antiguos). Además, su morfología puede distorsionarse cuando el paciente ha recibido tratamiento antibiótico. La tinción de Gram compatible con S. pneumoniae se puede confirmar con la reacción de quellung (del alemán hinchazón). En esta

prueba se mezclan anticuerpos anticapsulares polivalentes con las bacterias para después examinar la mezcla al microscopio. La presencia de mayor refringencia alrededor de las bacterias se interpreta como una reacción positiva para S. pneumoniae.

5.3 Cultivo: las muestras de esputo se deben sembrar en un medio enriquecido con nutrientes y complementado con sangre. S. pneumoniae se aísla en los cultivos de esputo de un 50% de los pacientes con neumonía, ya que es exigente desde el punto de vista nutricional y su proliferación se ve afectada por el crecimiento de las bacterias bucales contaminantes. La utilización de un medio selectivo como el agar sangre con 5 ug/ml de gentamicina ha obtenido resultados relativamente satisfactorios en el aislamiento del microorganismo a partir de muestras de esputo, pero se necesita una cierta habilidad técnica para distinguir S. pneumoniae de otros estreptococos a-hemolíticos que acostumbran a estar presentes en la muestra.

La elaboración de un diagnostico de certeza del microorganismo etiológico de la sinusitis o la otitis implica la obtención de un aspirado del seno o el oído medio. No se deben llevar acabo cultivos de muestras obtenidas a partir de la nasofaringe o del oído externo. No es difícil aislar s. pneumoniae de las muestras de liquido cefalorraquídeo, a no ser que se haya iniciado tratamiento antibiótico con anterioridad a la recogida de la muestra. Los cultivos son negativos hasta en la mitad de los pacientes que han recibido una única dosis de antibióticos.

5.4 Identificación: las cepas de S. pneumoniae se lisan con rapidez cuando se activan las autolisinas como consecuencia de su exposición a la bilis(prueba de solubilidad de la bilis). Por tanto, el microorganismo se puede identificar dejando caer una gota de bilis en una colonia aislada. Casi todas las colonias de S. pneumoniae se disuelven en el plazo de unos minutos, mientras que otros estreptococos a-hemolíticos permanecen inalterados. S. pneumoniae se puede identificar también por su sensibilidad a la optoquina (etilhidrocupreina dihidrocloruro). El microorganismo se siembra en una placa de agar sangre y se coloca un disco saturado con optoquina en el centro del inoculo. Después de incubar las placas durante una noche, alrededor del disco se observa una zona de inhibición del crecimiento bacteriano. Se puede llevar a cabo pruebas diagnosticas bioquímicas, serológicas y moleculares adicionales con el fin de lograr la identificación definitiva.

6. Tratamiento, prevención y control.

Antes de la introducción del tratamiento antibiótico, el tratamiento especifico de la infección por S. pneumoniae se realizaba mediante una inyección pasiva de

anticuerpos capsulares específicos de tipo. Estos anticuerpos opsonizantes potenciaban la fagocitosis mediada por los PMN y la capacidad bactericida. Sin embargo, la inmunoterapia se abandono en cuanto se dispuso el tratamiento antimicrobiano.

La penicilina se convirtió rápidamente en el tratamiento de elección de la enfermedad neumococica. Las cefalosporinas, la eritromicina y el cloranfenicol (para la meningitis) son fármacos alternativos eficaces en los individuos alérgicos a penicilina. Se ha demostrado fehacientemente la resistencia a la tetraciclina. En el año 1997 se descubrieron en Sudáfrica algunas cepas de S. pneumoniae resistentes a varios antibióticos entre los que figuraba la penicilina. Hasta 1990 fueron relativamente pocos frecuentes los valores altos de resistencia a la penicilina (CMI de al menos 2 ug/ml) y, tan solo el 5% de todas las cepas de S. pneumoniae aisladas en EE.UU. se consideraban moderadamente resistentes (CMI de 0,1 a 1 ug/ml). Sin embargo, esta situación se ha modificado de forma drástica. La resistencia a la penicilina se observa ahora en hasta el 30% de las cepas aisladas en EE.UU., y en una proporción aun mayor de las aisladas en otros países. El aumento de la resistencia a la penicilina se asocia a la menor afinidad de los antibióticos por las proteínas de unión a la penicilina incluidas en la pared de la célula bacteriana. Los pacientes infectados por bacterias resistentes presentan mayor riesgo de pronóstico desfavorable.

La investigación dedicada a prevenir o controlar la enfermedad se ha centrado en el desarrollo de vacunas anticapsulares eficaces. Anteriormente se recomendaba la administración de una vacuna polisacaridica antineumococica de 23 serotipos( formada por 23 polisacáridos capsulares diferentes) en niños mayores de 2 años de edad y en adultos. En febrero del año 2000 se autorizo la utilización de una nueva vacuna conjugada de 7 serotipos en niños menores de 2 años. Los polisacáridos son antígenos independientes de los linfocitos T y estimulan a los linfocitos B maduros, pero no a los linfocitos T. los niños de corta edad muestran escasa respuesta a los antígenos independientes de los linfocitos T, por lo que las vacunas polisacaridicas carecen de eficacia en esta población. Por el contrario, la conjugación de los polisacáridos con proteínas estimula la respuesta mediada por los linfocitos T cooperadores, la cual provoca una potente respuesta primaria en estos niños y una eficaz respuesta de memoria al ser vacunados de nuevo. Este abordaje basado en el uso de vacunas conjugadas se ha aplicado también a otros patógenos neonatales, como haemophylus influenzae. La vacunación con la vacuna antineumococica de 7 serotipos se recomienda actualmente en niños menores de 2 años, mientras que la vacuna de 23 serotipos está indicada en adultos con mayor riesgo de adquirir la enfermedad por S. pneumoniae. Alrededor de 94% de todas las cepas aisladas de los pacientes infectados están incluidas en

la vacuna o están relacionadas serológicamente con los serotipos de la vacuna de 23 serotipos. Los estudios longitudinales han puesto de manifiesto que los serotipos de S. pneumoniae asociados a la enfermedad no dependen del uso de la vacuna. La vacuna es inmunogenica en adultos sanos, y la inmunidad por ella conferida se prolonga durante toda la vida. Sin embargo, la vacuna de 23 serotipos no es tan eficaz en algunos pacientes con riesgo elevado de enfermedad neumococica, como los siguientes: 1) pacientes con asplenia, anemia drepanocitica, neoplasias hematológicas e infección por VIH; 2) pacientes sometidos a trasplante renal, y 3) ancianos.

Procedimientos para la identificaciónde Streptococcus pneumoniaeI. ALCANCE:Laboratorios de la red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.5 con respecto a la identificación.CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.6 con respecto a la identificación.II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS:Streptococcus pneumoniae pertenece al género Streptococcus de la familia Streptococcaceae. El género Streptococcus está conformado por cocos grampositivos, aneaerobios facultativos, catalasa negativa y citocromo-oxidasa negativa. Los neumococos son bacterias grampositivas, encapsuladas, con morfología de diplococos lanceolados, con 0.5 a 1.25 mm de diámetro, agrupados en pares o en cadenas cortas(división en un plano), inmóviles, no formadores de esporas; típicamente crecen de modo difuso en caldo con suero y requieren medios complejos para su desarrollo.

El cultivo en agar sangre bovina presenta colonias lisas, pequeñas, brillantes circundadas por halo verde de alfahemólisis. Son anaerobios facultativos y algunos aislamientos clínicos son exigentes en CO2. El neumococo pierde su viabilidad a 60oC por 30 minutos, se lisa fácilmente, es soluble en bilis y sensible a la optoquina. Las colonias de S. pneumoniae en medio de cultivo sólido, exhiben una zona de depresión central causada por una autolisis parcial. Con el envejecimiento del cultivo, ocurre una rápida perdida de viabilidad de estas bacterias cuando crecen en ausencia de catalasa y peroxidasa, debido a la acumulación de peróxido de hidrógeno.

La pared celular consiste de un esqueleto de péptido-glucano, típico de las bacterias grampositivas. En este esqueleto se anclan el polisacárido capsular, el polisacárido C de la pared celular y las proteínas.

Polisacárido capsular:El polisacárido capsular (PS) es un determinante esencial para la antigenicidad del neumococo y todo el sistema de la clasificación en serotipos se basa en su

diversidad antigénetica. Es el responsable de la diferenciación de ésta única especie en 90 serotipos.

El PS fue descrito como el primer antígeno, no proteico, inductor de anticuerpos en humanos. La cápsula se sintetiza rápida y extensivamente durante la fase logarítmica del crecimiento bacteriano. En casos de enfermedad neumocócica, el antígeno PS puede ser detectado en el suero y orina de los pacientes afectados.

La cápsula consiste en polímeros de alto peso molecular conformados por unidades repetitivas de oligosacáridos, ligados por enlaces covalentes a la pared celular. El polisacárido se denomina substancia soluble específica (soluble specific substance, SSS). La cápsula es considerada el principal factor de virulencia de esta bacteria, debido a su resistencia a la fagocitosis.

Polisacárido de la Pared Celular:El polisacárido de la pared bacteriana, denominado también polisacárido C (C'PS) es un complejo de ácido teicoico, principal componente de la pared celular del neumococo. Está ligado covalentemente al péptidoglucano a través de residuos de ácido murámico. La cantidad de éste antígeno varía de cepa a cepa, pero es igual en casi todos los tipos de neumococo (antígeno común).

Antígeno De Forssman:Está formado de ácido lipoteicóico y ácido teicóico, similar al polisacárido C de la pared celular y está ligado covalentemente a lípidos. El antígeno de Forssman (F) se encuentra uniformemente distribuido en la membrana plasmática y también está localizado en las moléculas de LPS expuestas en la superficie. Las partes lipídicas de este antígeno están ancladas en la doble capa de lípidos de la membrana plasmáticadel neumococo.

La presencia de este antígeno inhibe fuertemente a la autolisina neumocócica y también regula la actividad de la enzima mureína hidrolasa, que tiene actividad en la lisis bacteriana. Todos los neumococos son susceptibles a la lísis, durante la fase estacionaria del crecimiento y es durante esta fase que el antígeno regulador resulta en la degradación de la pared celular bacteriana. Los estudios de inmunización de ratones con el antígeno de Forssman no han demostrado protección contra la infecciónneumocócica.

La principal enzima autolítica es la N-acetil-murámico-alanina-amidasa (autolisina), la cual rompe la unión entre el ácido murámico y la alanina del mucopéptido de la pared celular, durante la fase estacionaria del crecimiento de la bacteria. La lísis del neumococo por sales biliares ocurre a través de la activación de ésta enzima.

III. IDENTIFICACIÓN:

1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

Equipos:Incubadora de CO2Microscopio con objetivo de 100x y ocular de 10xMechero tipo BunsenReloj de mesa

Materiales y Reactivos:Guantes descartables no estérilesHisopos estérilesLáminas portaobjetosAsas bacteriológicas con punta redonda y rectaContenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales no reusablesJarra de vidrio y velas de cera blanca (si no cuenta con incubadora de CO2)Marcadores indeleblesTubos 12 x 75Cristal violetaLugolAlcohol al 70o o alcohol acetona (1:1)Fucsina acuosa o safranina.Solución salina 0.85%Discos de otoquina (hidrocloruro de etilhidrocupreína)Desoxicolato de sodio al 10%.Sueros para tipificar.Azul de metileno acuoso al 1%Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en procesamiento del LCR.

Pruebas para la identificación:Observar alfa hemolisis y morfología macroscópica.GramCatalasaSusceptibilidad a la optoquina.Solubilidad en bilis.Serotipificación.

Cepas para control de calidad:Staphylococcus aureus ATCC 25923Enterococcus faecalis ATCC 29212Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS:Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: ver capítulo 16.Antimicrobianos a utilizar para la Concentración Mínima inhibitoria:Antimicrobianos en polvo (de preferencia altamente purificados):PenicilinaCeftriaxona2. CARACTERÍSTICAS DE LAS UFCS EN ASC:

El cultivo en agar sangre de carnero presenta colonias lisas, pequeñas, redondas, brillantes, al principiocupuliformes, que desarrollan más tarde una meseta central con bordes elevados, circundadaspor un halo verde de alfahemólisis.

3. COLORACIÓN DE GRAM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS APARTIR DEL AGAR SANGRE.Permite observar la tinción, agrupación y morfología, microscópica característica.Procedimiento para la preparación del frotis.Procedimiento para la tinción de Gram.

Resultado:Diplococos lanceolados grampositivos formando cadenas cortas.Control de Calidad para la prueba de GramStreptococcus pneumoniae ATCC 49619Resultado: Se observa diplococos lanceolados grampositivos formando cadenas cortas.Escherichia coli ATCC 25922Resultado: Se observa bacilos cortos gramnegativos.NOTA: La coloración de Gram a partir de cultivos de más de 48 horas es difícil de interpretar.4. PRUEBA DE CATALASA:

Fundamento de la prueba: ver capítulo 17.Procedimiento: ver capítulo 17.

Fundamento bioquímico de la bacteria:Streptococcus pneumoniae no posee la enzima catalasa, por lo tanto la prueba es negativa y no seformarán burbujas.

Resultado:Catalasa negativa: no se observa producción de burbujas.

Control de calidad:Streptococcus pneumoniae ATCC 49619Resultado: No hay producción de burbujas.Staphylococcus aureus. ATCC 25923Resultado: Producción inmediata e intensa de burbujas.

5. PRUEBA DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LA OPTOQUINA:

Fundamento de la prueba: ver capítulo 17.Procedimiento: ver capítulo 17.Fundamentos bioquímicos de la bacteria:Streptococcus pneumoniae es susceptible a optoquina en bajas concentraciones.

Resultado:Optoquina positiva: zonas de inhibición mayores o iguales a 14mm son interpretadas como susceptibles.Optoquina negativa: zonas de inhibición menores de 14mm son interpretados como no susceptibles.

Control de calidad:Streptococcus pneumoniae ATCC 49619Resultado: Zonas de inhibición mayores o iguales a 14 mm son interpretadas como susceptibles.Enterococcus faecalis ATCC 29212Resultado: Zonas de inhibición menores de 14mm son interpretados como no susceptibles.

6. PRUEBA DE SOLUBILIDAD EN BILIS:

Fundamento de la prueba: ver capítulo 17.

Procedimiento: ver capítulo 17.

Fundamentos fisiológicos de la bacteria:Streptococcu pneumoniae produce enzimas autolíticas que son las responsables de la característica umbilicada de la colonia en cultivos viejos. La principal enzima autolítica es la N-acetil-murámicoalanina amidasa (autolisina), la cual rompe la unión entre el ácido murámico y la alanina del mucopéptido de la pared celular, durante la fase estacionaria del crecimiento. La lisis del neumococo por sales biliares ocurre a través de la activación de ésta enzima. La adición de la solución de sales de bilis a la suspensión de Streptococcus pneumoniae, acelera el proceso de lisis, proceso asociado con la disminución de la tensión superficial entre el medio y la membrana celular bacteriana.

Resultado:Solubilidad en bilis positiva: se observa claridad o transparencia en el tubo. Compare con el controlpositivo. El control negativo deberá permanecer turbio.

Control de calidad para la prueba de solubilidad en Bilis:Streptococcus pneumoniae ATCC 49619Resultado: Solubilidad en bilis positiva: se observa claridad o transparencia en el tubo.Enterococcus faecalis ATCC 29212Resultado: Solubilidad en bilis negativa: se observa turbidez en el tubo.

7. SEROLOGÍA:

Fundamento de la prueba:La presencia de antígenos específicos en la cápsula o pared celular es utilizada como base para la caracterización serológica de algunos géneros y especies bacterianas. En algunos casos el antígeno está ubicado en el LPS de la pared y están conformados por carbohidratos. Pequeñas variaciones de losazúcares dan como resultado variaciones en la especificidad del antígeno. En algunos casos el antígeno está ubicado en la cápsula. En ambos casos y cuando la naturaleza del antígeno es altamente específica, es utilizada para clasificar a la bacteria en serogrupos, serotipos o tipos.

Procedimiento: Rotule un tubo de 12 x 75 mm con el número del aislamiento y coloque 0.5

mL de solución salina estéril. Con un hisopo estéril, tome de 3 a 5 colonias aisladas y realice una

emulsión en el tubo consolución salina. La suspensión debe tener una apariencia ligeramente turbia, es decir, debe

ser menor que el estándar 0.5 de la escala de MacFarland . Marque una lámina portaobjetos con el número del aislamiento. Tome el hisopo húmedo y frótelo firmemente contra la lámina portaobjetos. Realice dos extendidos de forma circular a cada extremo de la lámina (el

diámetro del extendido debe ser de aproximadamente 1 cm). Deje secar los extendidos al aire. No los fije. Con un asa pequeña estéril remueva y tome una asada del antisuero,

colóquela sobre el extendido y mezcle bien. Con una asa pequeña estéril tome una gota de solución acuosa de azul de

metileno al 1%, y colóquela sobre el antisuero en la lámina portaobjetos. Coloque un cubreobjetos y presione suavemente para permitir que el

colorante se extienda. Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos. Examine con el objetivo de 100x .

NOTA: El orden en el cual los antisueros son probados se basa en la frecuencia con que aparecen los diferentes serotipos de Streptococcus pneumoniae.

Fundamentos antigénicos de la bacteria:

La pared celular consiste de un esqueleto de péptido-glucano, típico de las bacterias grampositivas. En este esqueleto se anclan el polisacárido capsular, el polisacárido C de la pared celular y las proteínas.

El polisacárido capsular (PS) es un determinante esencial para la antigenicidad del neumococo y todo el sistema de la clasificación en serotipos se basa en su diversidad antigénica. Es la responsable de la diferenciación de ésta única especie en 90 serotipos.

La determinación del serotipo es fundamental para estudios epidemiológicos que permiten contribuir a los esfuerzos por lograr una vacuna polivalente única que cubra el continente americano.

Resultado:Positiva: se observa hinchazón de la cápsula (reacción de qellung) y aglutinación de las células.Negativa: no se observa hinchazón de la cápsula, ni aglutinación de las células.

Control de calidad de la prueba de Serología:Streptococcus pneumoniae ATCC 49619Resultado: Se observa hinchazón de la cápsula y aglutinación de las células.Enterococcus faecalis ATCC 29212Resultado: No se observa hinchazón de la cápsula, ni aglutinación de las células.

INFORME DE LOS RESULTADOS FINALES:Positivo: Se aisló Streptococcus pneumoniae.Negativo: No se aisló Streptococcus pneumoniae.Nota: Todos los neumococos aislados de casos invasivos (LCR, hemocultivo, derrame pleural) debenser enviados al CNDR para confirmación bioquímica, pruebas especiales de sensibilidad y determinacióndel serotipo.