STAPHYLOCOCCUS

AUREUS

Docente: M.Sc. Lic. Flores Rios AbrahamAuxiliar: Univ. Vargas Gonzales J. MaricelaEstudiante: Bonilla Herbas Laura AngelicaGrupo: miércoles G-5Fecha: 11 – diciembre – 2013

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

OBJETIVOS

Objetivo General

Determinar la presencia de staphylococcus aureus en una muestra.

Objetivos Específicos

Determinar la presencia de staphylococcus aureus en la carne molida por el método recuento en placa.

Comparar los resultados obtenidos con una norma específica.

MARCO TEORICO

Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas cocaceas de 0,8-1.0μm de diámetro, que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmóviles y carecen de esporas. Son grampositivas.

Es una especie muy sensible a la acción del calor y de los desinfectantes. Su presencia o la de sus toxinas en los alimentos es signo evidente de falta de higiene.

Una característica muy importante de este germen es que sus toxinas pueden ser causa de intoxicación cuando se ingieren con los alimentos.

En general, la presencia de un número elevado de Staphylococcus aureus en un alimento refleja higiene defectuosa por mala manipulación. Si, además, los St. Aureus aislados son cepas enterotoxigenicas, suponen un riesgo para la salud.

Método de recuento en placas

Se utiliza cuando se sospecha que el alimento por analizar contiene más de 100 St. aureus por gramo. Se lo hace a partir de la siembra en el medio agar Baird-Parker.

Se selecciona placas que contengan 20 y 200 colonias típicas. Una vez contadas estas colonias en las placas elegidas, la cifra obtenida se multiplica por el factor de dilución de la placa, lo que da el recuento total de St. aureus. Después de esto se realiza las pruebas confirmativas

Pruebas confirmativas

Se selecciona como mínimo, dos colonias típicas para su confirmación. Con este fin, se investiga la capacidad de la cepa en estudio de producir:

- Coagulasa- Desoxirribonucleasa

Investigación de coagulasa: las colonias típicas se siembran en caldo cerebro corazón a los cuales después de un tiempo de incubación se añade plasma de conejo EDTA. La reacción es positiva cuando el coagulo formado es firme.

Investigación de desoxirribonucleasa: la desoxirribonucleasa es una poderosa enzima elaborada por las cepas patógenas de St. aureus. Se caracteriza por depolimerizar el ADN y por su termo resistencia, razón por la que se denomina termonucleasa.

MATERIALES Y MEDIOS

Materiales Medios 2 botes 1 bolsa estomacher 1 mechero Pipetas de 2,5 y 10ml 3 placas Petri con agar Baird-

Parker 1 encendedor 1 gradilla 4 tubos de ensayo para las

diluciones Balanza Cuchara Muestra : carne molida Alcohol 70% Desinfectante 15% tubos para el caldo BHI tubos para la mezcla de BHI con

plasma de conejo.

Baird-Parker Caldo cerebro corazón BHI Plasma de conejo EDTA

PROCEDIMIENTO

Preparar la serie de diluciones poniendo 9ml de solución fisiológica a los 4 tubos de ensayo.

Preparar la solución madre con 25g de carne molida y 225 de solución fisiológica (dilución -1)

De la dilución -1 trasvasar 0,2ml a la primera placa Petri (-1) que tiene el agar solidificado Baird-Parker y 1ml mas al primer tubo de ensayo (dilución-2), homogeneizar bien la dilución -2.

De la dilución -2 trasvasar 1ml al segundo tubo de ensayo (dilución-3) y homogeneizar.

De la dilución -3 trasvasar 0,2ml a la segunda placa Petri (-3) que tiene el agar solidificado Baird-Parker y 1ml al tercer tubo de ensayo (dilución -4) hogeneizar.

De la dilución -4 trasvasar 1ml al cuarto tubo de ensayo (dilución-5) y homogeneizar.

De la dilución -5 trasvasar 0,2ml a la segunda placa Petri (-5) que tiene el agar solidificado Baird-Parker.

Esparcir la muestra en el agar Baird-Parker con un asa driglaski previamente esterilizada, empezar por la dilución más pequeñas (-5) hasta llegar a la menos diluida (-1).

Todas las placas Petri llevar a incubar a 37ºC por 24 horas. Después de la incubación hacer el conteo y escoger la placa de conde se hara la

confirmación. Escoger 3 colonias típicas de la dilución seleccionada. Sembrar con un asa aguja previamente esterilizada la primera colonia

seleccionada en el caldo BHI, hacer lo mismo con las otras dos colonias siempre esterilizando el asa.

Llevar a incubar a una temperatura de 37ºC por 24 horas. De los tubos que salieron positivo (turbidez) realizar la prueba de coagulasa. En un tubo añadir 0,1 ml del cultivo positivo obtenido en caldo BHI y 0,3ml de

plasma de conejo EDTA, hacer lo mismo con los que salieron positivos. Incubar a 37ºC por 24 horas y ver si da coagulasa positiva

DATOS, CALCULOS Y RESULTADOS

Datos:

Dilución 1x10-1 1x10-3 1x10-5

#de colonias

24 horas 11 0 048 horas 143 2 0

Prueba coagulasa: de 3 colonias seleccionadas nos dio 3 coagulasa (-)

Cálculos:

St . aureus=143× 0

3×0,255

×101

St. aureus= 0

Reporte de resultados:

St. aureus= 0 UFC/g

OBSERVACIONES

El hecho que no nos haya dado coagulasa positiva es que las colonias seleccionadas tal vez no eran colonias típicas pero las que escogimos tenían ese aspecto característico que es una colonia negra con un halo transparente aunque el halo no era muy notorio.

El halo de estas colonias no se pudo distinguir por el tiempo que paso ya que suele perderse después de mucho tiempo.

Otra posibilidad de que no nos haya dado coagulasa positiva es que podrimos haberlo quemado la muestra al instante de hacer la siembra en el caldo BHI

CONCLUSIONES

La presencia de St. aureus nos dio 0 UFC/g, ya que de las colonias supuestamente típicas la confirmación de coagulasa nos dio negativo.

Para los Límites establecidos por el Código Alimentario Argentino en los art. 255, 302 y 286 bis para carne picada se tiene el siguiente rango: m=100/g M=1000/g, pero para coagulas positivo/g, esto nos demostraría que la muestra de carne que tenemos está libre de St, aureus.

BIBLIOGRAFIA

Libro Microbiología Alimentaria – Vicente Calderon y Pascual 2ª edición. Tema: investigación y recuento de Staphylococcus aureus pag: 77 a 83

CUESTIONARIO

1. Detalle en forma esquemática el método de recuento en placa para análisis de S. aureus en alimentos (incluyendo la prueba de confirmacion)

2. ¿Cuál es la diferencia entre intoxicación alimentaria e infección alimentaria?

R. En una infección, la enfermedad está causada por los microorganismos patógenos que se reproducen en el interior del organismo, como virus, bacterias o parásitos, mientras que la intoxicación está provocada por la ingesta de toxinas presentes de forma natural en el alimento o añadidas de manera artificial. Si el trastorno lo origina un alimento contaminado con microorganismos, se habla de infección. Si, en cambio, se debe a las toxinas producidas por los gérmenes presentes en el alimento, entonces se entiende que ocurre una intoxicación.

3. ¿S. aureus produce intoxicaciones o infecciones alimentarias?

R. El S. aureus produce intoxicaciones alimentarias ya que los St. Aureus aislados son cepas enterotoxigenicas.

4. ¿Cuál es el fundamento de los diferentes medios empleados en la práctica indicando cuales son los componentes inhibidores y como es el desarrollo típico de S. aureus en cada medio de cultivo?

R. Baird-Parker: Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo sólido, el cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus, pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado. En estos da colonias con actividad lecitinasa, son colonias circulares, brillantes, convexas, de 2-3 mm de diámetro, de color negro azabache o gris oscuro, con margen claro (blanco), rodeado por zona opaca y fuera de ella una zona clara, de consistencia cremosa

Caldo cerebro corazón BHI: Recuperación de la cepa, este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus aureus. El tubo debe presentar turbidez.

Plasma de conejo EDTA: presencia de la enzima coagulasa

5. ¿Qué tipo de alimentos son susceptibles a la contaminación de S. aureus?

R. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelería, como pasteles rellenos con crema, pies de crema, coberturas de chocolate, leche y sus derivados, rellenos para sándwiches y papas, son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas.

6. ¿Cuál es el rango de recuento de colonias según la norma ISO?

R. Rango según la ISO es: de 15 a 150 colonias.

7. Hacer un reporte de resultados con los siguientes datos obtenidos al procesar una muestra solida:

Dilución -1 -2 -3# de colonias típicas en medio de cultivo VRBL 350 32 3

De la dilución (-2) se realizó las pruebas confirmativas a 5 colonias de las cuales 3 colonias dieron coagulasa (+). El volumen de muestra sembrado es 0,2 ml.

St . aureus=32× 3

5×0,255

×102

St . aureus=9,6×103 UFC/g

COLIFORMES TOTALES

Y FECALES

Docente: M.Sc. Lic. Flores Rios AbrahamAuxiliar: Univ. Vargas Gonzales J. MaricelaEstudiante: Bonilla Herbas Laura AngelicaGrupo: miércoles G-5Fecha: 11 – diciembre – 2013

COLIFORMES TOTALES Y FECALES

OBJETIVOS

Objetivo general

Determinar la presencia de coliformes totales y fecales de una muestra

Objetivos específicos

Determinar la presencia de coliformes totales y fecales de la carne molida por el método del número más probable (NMP).

Determinar la presencia de coliformes totales y fecales de la carne molida por el método de recuento en placa.

Comparar los resultados obtenidos con una norma de sanidad.

MARCO TEORICO

Las Enterobacteriaceae lactosa-positivas o grupo coli-aerogenes constituyen un grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas por aislamiento que por criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia enterobacteriaceae se caracterizan por la capacidad de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas en un periodo de 48 horas a una temperatura de incubación de 37ºC.

Son bacilos gramnegativos, aerobios facultativos, no esporulados. Del grupo coliformes forman parte varios géneros:

- Escherichia- Enterobacter- Klebsiella- Citrobacter

Se encuentran en el intestino, del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: suelo, plantas, cascara de huevo, etc.

Dentro de este grupo, son los coliformes fecales los que tienen significado sanitario y por consiguiente, los que más interesan en el análisis microbiológico de alimentos.

Se considera a los coliformes fecales como presuntos escherichia coli. Sus principales características son:

- Aptitud para desarrollarse entre 43,5-45,5ºC.- Capacidad para crecer en presencia de sales biliares.- Facultad para producir indol en agua de peptona.

INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE LACTOSA-POSITIVAS (COLIFORMES)

Investigación y recuento en medio líquido (NMP)

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h.

Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.

Investigación y recuento en medio solido

Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en ABRV, el ácido producido por la fermentación de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitación de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente están rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa.

La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersión y separación, como se explicó en la técnica de preparación de diluciones.

NOTAS

Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en placa de coliformes, debe considerarse lo siguiente:

Si el alimento contiene mono o disacáridos en altas concentraciones, éstos pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias semejantes a las de coliformes.

El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes de 3 h. a partir de su preparación; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar en baño de agua a 45 °C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo.

Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, más adecuadas para los coliformes.

El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de incubación, especialmente la incubación prolongada, pueden ocasionar la formación de colonias rojas de cocos Gram positivos.

El rango estadístico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de sensibilidad del método) es de 15 a 150 UFC por placa.

El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.

MATERIALES Y MEDIOS

Materiales Medios 2 botes 1 bolsa estomacher 1 mechero Pipetas de 2,5 y 10ml 3 placas Petri 1 encendedor 1 gradilla 4 tubos de ensayo para las

diluciones Balanza Cuchara Muestra : carne molida Alcohol 70% Desinfectante 15%

NMP 9 tubos de ensayo con tubo

dulham (caldo lauril) 9 tubos de ensayo con tubo

dulham (caldo VBB) 9 tubos de ensayo con tubo

dulham (caldo EC)

Recuento en placa

caldo lauril sulfato de sodio agar VRBL caldo VBB caldo EC

3 tubos de ensayo con tubo dulham (caldo VBB)

3 tubos de ensayo con tubo dulham (caldo EC)

PROCEDIMIENTO

Preparar la serie de diluciones poniendo 9ml de solución fisiológica a los 4 tubos de ensayo.

Preparar la solución madre con 25g de carne molida y 225 de solución fisiológica (dilución -1)

De la dilución -1 trasvasar 1ml a la primera placa Petri (-1) y 1ml mas al primer tubo de ensayo (dilución-2), homogeneizar bien la dilución -2.

De la dilución -2 trasvasar 1ml al segundo tubo de ensayo (dilución-3) y homogeneizar.

De la dilución -3 trasvasar 1ml a la segunda placa Petri (-3), 1ml a cada uno de los 3 tubos de ensayo con tubo dulham de caldo lauril (-3) y por ultimo 1ml al tercer tubo de ensayo (dilución -4).

De la dilución -4 trasvasar 1ml al cuarto tubo de ensayo (dilución-5) y homogeneizar, 1ml a cada uno de los 3 tubos de ensayo con tubo dulham de caldo lauril (-4).

De la dilución -5 trasvasar 1ml a la tercera placa Petri (-5), 1ml a cada uno de los 3 tubos de ensayo con tubo dulham de caldo lauril (-5).

Todas las placas Petri llevar a incubar a 37ºC por 24 horas y los tubos con caldo lauril incubar a 30ºC durante 24-48 horas.

Recuento en placa

Después de la incubación realizar el conteo en cada placa y escoger de que placa se sacaran las colonias para su confirmación.

Escoger tres colonias típicas de la placa seleccionada. Con un asa aguja previamente esterilizada picar la primera colonia y

sembrar en el tubo con el EC, luego volver a cargar el asa y sembrar en el tubo de caldo VBB, repetir el proceso para las otras dos colonias restantes sin olvidarse de esterilizar el asa antes de cargar una nueva colonia.

Llevar los 3 tubos de caldo EC a incubar a 44,5ºC por 24-48 horas y los 3 tubos de caldo VBB incubar a 37ºC por 24-48 horas.

Observar si se produce gas en todos los tubos durante ese periodo de tiempo y hacer la toma de datos.

Número más probable

Después del tiempo de incubación observar que tubos de caldo lauril dieron positivos (producción de gas).

Sembrar de los tubos lauril positivos a los caldos EC y VBB. Con un asa volumétrica previamente esterilizada sacar una muestra del

caldo lauril y sembrar al caldo EC, volver a cargar el asa con la muestra d caldo lauril y sembrar al caldo VBB. Realizar este proceso para todos los tubos de caldo lauril que dieron positivos no se olvide de esterilizar el asa cada vez que vaya a sembrar de un nuevo tubo.

Llevar los tubos de caldo EC a incubar a 44,5ºC por 24-48 horas y los tubos de caldo VBB incubar a 37ºC por 24-48 horas.

Observar si se produce gas en todos los tubos durante ese periodo de tiempo y hacer la toma de datos.

DATOS, CALCULOS Y RESULTADOS

Recuento en placa

Datos: Dilución 1x10-1 1x10-3 1x10-5

#de colonias Incontables Incontables 10Selección de colonias: 3 colonias de la dilución -5Colonias 1 2 3VBB Gas (-) Gas (-) Gas (-)EC Gas (-) Gas (+) Gas (-)

Cálculos:

CT=10O3×105 EC=10 1

3×105

CT= 0 EC = 3,3 x105 UFC/g

Reporte de resultadosNo se hará un reporte de resultados ya que los datos obtenidos son totalmente incoherentes.

Número más probable

Datos: Diluciones 1x10-3 1x10-4 1x10-5

Tubos Gas(-) Gas(-) Gas(-) Gas(-) Gas(-) Gas(-) Gas(-) Gas(-) Gas(-)

Reporte de resultadosCT= 0 UFc/g CF= 0 UFc/g

OBSERVACIONES

Coliformes totales nos dio cero y sin embargo si hay coliformes fecales esto fue por un mal desarrollo de la práctica ya que se pudo haber contaminado o la siembra lo hicimos mal es por eso que no hay un reporte de resultados.

En el caso de CT y CF por recuento en placa las colonias contadas no se veían colonias típicas y si lo fueron la confirmación es lo que hicimos mal.

En el proceso de número más probable todos los tubos de caldo lauril nos dio gas negativo esto pudo pasar porque las diluciones eran muy bajas tal vez si se lo hubiera hecho las diluciones -1 y -2 nos hubieran dado una presencia.

Si lo hubiéramos realizado correctamente el procedimiento lo más probable es que los resultados no hubieran congeniado ya que las carnes usadas para ambos procedimientos fue distinta.

CONCLUSIONES

Los datos obtenidos en el número más probable fueron:CT=0 UFc/g y CF=0 UFc/g

Esto fue porque en ningún tubo de caldo lauril salió gas positivo por tanto no se hizo confirmación eso sería que no hay presencia de ni uno de los dos.

No se obtuvo resultados de presencia de coliformes totales y fecales por un mal desarrollo de la práctica.

A partir de los resultados obtenidos del método número más probable se lo puede comparar con alguna norma:

- CT=0 UFc/g: según los límites establecidos por el Código Alimentario Argentino en los art. 255, 302 y 286 bis para carne picada la cantidad de coliformes totales debe ser menor a 1x102 UFC/g y según la carne molida que tenemos esta entra en el rango establecido por tanto es una carne apta para su comercialización y consumo.

- CF=0 UFc/g: según la norma boliviana “NB 32020” la cantidad de coliformes fecales (escherichia coli) en la carne molida es de m=1x102 M=1x103 por tanto nuestra muestra de carne molida entra en el rango establecido por tanto es una carne apta para su comercialización y consumo.

BIBLIOGRAFIA

Libro Microbiología Alimentaria – Vicente Calderon y Pascual 2ª edición. Tema: investigación y recuento de Staphylococcus aureus pag: 77 a 83

2. Si se desea determinar la presencia de Escherichia coli ¿Qué pasos debe seguirse y cuál es la prueba de confirmación que se realiza?

R. – A partir de toda la serie de dilución, siembra e incubación. Se debe escoger las colonias típicas de alguna de las placas.

- Con un asa aguja previamente esterilizada picar la primera colonia y sembrar en el tubo con el caldo EC que es una fuente de nutriente más que todo para la Escherichia coli

- hacer lo mismo con todas las colonias que se seleccionó, luego llevar a incubar a 44,5ºC por 24-48 horas.

- observar en cuál de los tubos con el caldo EC hay presencia de gas

3. ¿Cuál es el rango de colonias según las normas ISO?

R. Rango según la ISO es: de 15 a 150 colonias.

4. ¿Cuál es el fundamento de los diferentes medios empleados en la práctica de recuento e placa; indicando cuales son los componentes inhibidores y como es el desarrollo típico de colonias totales y fecales?

5. ¿Cuál es la importancia que tiene este parámetro en la industria y en la salud del consumidor?

6. Hacer un reporte de resultados con los siguientes datos obtenidos al procesar una muestra liquida:

Dilución -1 -2 -3# de colonias típicas en medio de cultivo VRBL INC 48 5

De la dilución (-2) se realizó las pruebas confirmativas a 4 colonias de las cuales:

Caldo VBB= 4 tubos dieron gas (+) y presentaron turbidez

Caldo EC=2 tubos dieron gas (+) y presentaron turbidez

8. ¿En qué tipo de muestras se aplica generalmente este método de análisis?

9. De acuerdo a las 2 practicas realizadas ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de método al otro?