PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES STOCK MÁS COMUNES. SOLUCIÓN PREPARACIÓN COMENTARIOS 30% ACRILAMIDA (29:1) 30% ACRILAMIDA (37,5:1)

Disuelve 29 g de acrilamida y 1 g de N,N’-metilenbisacrilamida en 60 ml de H2O. Usa la mosca roja. Calienta a 37ºC para favorecer la disolución. Ajusta el volumen a 100 ml y filtra la solución a través de un papel de filtro o, mejor, de un filtro de nylon de 45 μm de poro (Nalgene). Disuelve 29,22 g de acrilamida y 0,78 g de bisacrilamida en 60 ml H2O a 37ºC. Usa la mosca roja. Ajusta el volumen a 100 ml y filtra.

! La acrilamida es un neurotóxico que se absorbe por la piel y cuyos efectos son acumulativos. Acrilamida y bisacrilamida deben ser pesados en una campana de humos usando guantes y mascarilla. La balanza se podrá sobre papel de filtro y tras la pesada el papel se desecha y la balanza se cepilla y limpia meticulosamente. Se usarán guantes siempre que se manejen soluciones con acrilamida. Aunque la poliacrilamida no se considera tóxica, ha de manejarse con cuidado debido a la posibilidad de que contenga pequeñas cantidades de acrilamida no polimerizada. Los grados inferiores (más baratos) de acrilamida y bisacrilamida suelen estar contaminados con iones metálicos. En estos casos, las soluciones stock de acrilamida se purifican mediante agitación ON con 5 g de Amberilite MB-1 (SIGMA # MB-14) por cada 100 ml de solución y posterior filtrado a través de papel Whatman Nº 1. Durante su almacenamiento, acrilamida y bisacrilamida se van trasformando lentamente en ácidos acrílico y bisacrílico, por lo que es mejor guardar las soluciones de acrilamida a 4ºC.

10 M AMONIO, ACETATO 1 M AMONIO, ACETATO

Disuelve 770 g de NH4OAc en 800 ml de H2O. Ajusta el volumen a 1 litro. Esterilizar por filtración. Disuelve 77 g de NH4OAc en 800 ml de H2O. Ajusta el volumen a 1 litro. Esterilizar por filtración.

NH4OAc No es necesario siempre que las soluciones de acetato amónico sean estériles, pero en caso de que así se necesite no han de autoclavarse.

10% AMONIO, PERSULFATO Pesa 1 g de persulfato amónico en un tubo Falcon de 15 ml y enrasa a 10 ml con H2O. Disulve agitando. La solución es estable a 4ºC durante uno a dos meses.

Se pueden hacer alícuotas del volumen de APS a añadir por gel y guardarlas a –20ºC.

BSA

1 M CALCIO, CLORURO (CaCl2)

Disuelve 11,0 g CaCl2 (anhidro, MW = 110,0) en H2O hasta un vol de 100 ml. Autoclavar.

10 mM dATP Disuelve 10 mg en 1697 μl de OLB TE-7 (disuelve directamente en el bote original). Almacena en alícuotas de 50 μl a –20ºC.

MW = 589,2 Roche 103 977

10 mM dCTP Disuelve 10 mg en 1956μl de OLB TE-7 (disuelve directamente en el bote original). Almacena en alícuotas de 50 μl a –20ºC.

MW = 511,1 Roche 104 035

10 mM dGTP Disuelve 10 mg en 1804μl de OLB TE-7 (disuelve directamente en el bote original). Almacena en alícuotas de 50 μl a –20ºC.

MW = 551,2 Roche 104 094

10 mM dTTP Disuelve 10 mg en 1753 μl de OLB TE-7 (disuelve directamente en el bote original). Almacena en alícuotas de 50 μl a –20ºC.

MW = 570,2 Roche 104 264

1 M DTT Disuelve 1,55 g de dithiothreitol en 10 ml de

0,01 M NaOAc pH = 5,2. Esteriliza por filtración, dispensa en alícuotas de 1 ml y guarda a –20ºC.

No autoclaves el DDT ni las soluciones que lo contengan.

0,5 M EDTA pH = 8,0 Disuelve en agitación rápida 186,1 g de disodium ethylenediaminetetra- acetate*2H2O en 750 ml H2O. Ajusta el pH a 8,0 con NaOH (≈ 20 g de lentejas de sosa). Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava.

La sal disódica de EDTA no empezará a disolverse hasta que el pH no se acerque a 8.

0,1 M ESPERMIDINA Disuelve 1 g de espermidina (MW = 145,2, SIGMA # S2626) en H2O y lleva el volumen a 69 ml. Esteriliza por filtración, dispensa en alícuotas y almacena a –20ºC.

La solución de trabajo se debe guardar a 4ºC.

10 mg/ml EtBr (Bromuro de Etidio)

Añade 0,1 g de EtBr a 10 ml de H2O estéril. Agita con la mosca roja durante varias horas o con el vórtex (en un Falcon de 15 ml) hasta que te canses. Cubre con papel de aluminio y almacena a 4ºC.

! El bromuro de etidio es un mutágeno. Usa guantes cuando lo manejes y, además, una máscara al pesarlo.

IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside (MW = 238,3). Disuelve 2 g de IPTG en 8 ml de H2O. Ajusta el volumen a 10 ml y esteriliza la solución pasádola por un filtro de 0,22 μm. Dispensa en alícuotas y almacena a –20ºC.

LIMPIADOR DE VIDRIO Disuelve 120 g de NaOH (o KOH) en 120 ml de H2O. Deja enfriar lentamente a RT y entonces diluye a 1 litro con EtOH. Esta solución funciona como un limpia-todo y no hace falta usar sosa de calidad (la del Mercadona vale) ni EtOH del caro (alcohol de quemar es suficiente).

Referencia: Gordon and Ford.1972. The Chemists’ Companion: A Handbook of Practical Data, Techniques and References, pp 428-429. John Wiley & Sons. Rev. 04/97

20% LSS Disuelve 20 g de N-Laurylsarcosine (sal sódica, MW = 293,4, SIGMA #L5125) en 80 ml de H2O. Ajusta el volumen a 100 ml. Esterilizar por filtración.

1M MAGNESIO, ACETATO Disuelve 214,46 g de acetato magnésico*4H2O en 800 ml de H2O. Ajusta el volumen a 1 litro y esteriliza por filtración.

1 M MgCl2 Disuelve 20,33 g de MgCl2*6H2O en 80 ml de H2O. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava.

El cloruro magnésico es muy higroscópico. Compra cantidades pequeñas (100 g) y procura no abrir el bote más de lo necesario.

OLB TE-7 300 μl de 1 M Tris-HCl pH 7,5

40 μl de 0,5 M EDTA pH = 8,0 H2O hasta 90 ml.

Comprueba el pH añadiendo 1 μl a un indicador de pH de papel. Si es necesario, lleva el pH a 7,0 con HCl y ajusta el volumen a 100 ml. Autoclavar.

3 mM Tris-HCl 0,2 mM EDTA pH = 7,0

PBS Disuelve 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 y 0,24 g de KH2PO4 en 800 ml de H2O. Ajusta el pH a 7,4 con HCl. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava.

PBS = Phosphate-Buffered-Saline.

20% PEG-2,5 M NaCl Pesa 7,3 g NaCl y 10,0 g PEG 8000 (6000-8000 va bien) en un tubo Falcon de 50 ml. Añade H2O hasta enrasar 45 ml. Agita y trata de disolver el PEG. Se puede intentar incubando con agitación en el horno de hibridación a 37ºC durante 30’. Cuando esté disuelto, ajusta el volumen a 50 ml.

1 M POTASIO, ACETATO (pH = 7,5)

Disuelve 9,82 g de acetato potásico e 90 ml de H2O. Ajusta el pH a 7,5 con 2 M ácido acético. Ajusta el volumen a 100 ml. Esteriliza por filtración, dispensa en alícuotas y guarda a –20ºC.

KOAc

POTASIO, ACETATO (para la lisis alcalina en miniprep)

60 ml 5 M acetato potásico11,5 ml ácido acético glacial

28,5 ml H2OLa solución resultante es 3 M con respecto al potasio y 5 M respecto al acetato.

20 mg/ml PROTEINASA K Añade 0,2 g de proteinasa K a 10 ml de tampón de almacenamiento de PK:

• 5 ml glicerol • 0,1 ml 1 M Tris-HCl pH = 7,5 • 0,5 ml 1 M Cl2Ca ó 0,055 g de Cl2Ca • H2O hasta 10 ml

Esterilizar por filtraciónDispensar la PK en alícuotas y almacenar a –20ºC.

La PK consigue su actividad óptima en 2 mM Ca+2. Si añadimos 400 μg PK/ml tampón de lisis a partir de este tampón de almacenamieto coseguiremos una solución de lisis que es al menos 1 mM Ca+2 (un tejido en digestión es otra fuente de Ca+2).

10 mg/ml RNAsa A Disuelve 100 mg de RNAsa (SIGMA # R4875) en 10 ml de tampón de RNAsa:

• 0,1 ml Tris-HCl pH = 7,5 • 30 μl 5 M NaCl • H2O hasta 10 ml

Usa un Falcon de 15 ml y ponlo en agua hirviendo durante 15’. Deja enfriar lentamete a temperatura ambiente, dispensa e alicuotas y almacena a –20ºC.

ssDNA (10 mg/ml ADN de esperma de salmón)

Usa un Falcon de 15 ml. Disuelve 100 mg de ADN de esperma de salmón (SIGMA # D1626) en TE pH = 8,0 y lleva el volumen a 10 ml. Resuspende agitando ON a 4ºC. Rompe el ADN pasándolo con una jeringa 4-5 veces por una aguja del calibre 22. Desaturaliza el ADN poniendo el Falcon en agua hirviendo durante 10’ y enfríalo rápidamente en hielo. Dispensa en alícuotas y congélalo a –20ºC.

3 M SODIO, ACETATO (pH 5,2 y pH 7,0)

Disuelve 408,1 g de acetato sódico*3H2O en 800 ml de H2O. Ajusta el pH a 5,2 con ácido acético glacial o a 7,0 con ácido acético diluido. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava.

NaOAc

5 M NaCl Disuelve 292,2 g de NaCl en 800 ml de H2O. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava.

20% SDS Disuelve 200 g de dodecil sulfato sódico en 800 ml de H2O. Calienta a 50ºC para favorecer la disolución. Ajustar el volumen a 1 litro.

! El SDS forma cristales minúsculos que se dispersan muy fácilmente, hasta los pulmones. Pésalo en una campana de humos y usa máscara y guantes al pesarlo. Limpia bien el área de pesada y la balanza. No es ni necesario ni conveniente

esterilizarlo.

1 M NaPO4 pH = 6,5 (Tampón fosfato de transferencia Southern)

184 g NaH2PO4*H2O (MW = 137,99)180 g Na2HPO4*7H2O (MW = 268,07)

800 ml H2OAjusta el pH a 6,5 con lentejas de NaOH y el volumen a 1 litro con H2O. Autoclava.

1 M SODIO, HIDRÓXIDO Disuelve 40 g de NaOH en 800 ml H2O. Ajusta el volumen a 1 litro.

20 X SSC Disuelve 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato sódico*2H2O en 800 ml de H2O. Ajusta el pH a 7,0 con unas pocas gotas de 10 N NaOH. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava.

3 M NaCl 0,3 M Citrato sódico

50X TAE 242 g Tris base 57,1 ml ácido acético glacial 100 ml 0,5 M EDTA pH = 8,0 H2O hasta 1 litro.

No se esteriliza.

5X TBE 54 g Tris base 27,5 g ácido bórico 20 ml o,5 M EDTA pH = 8,0

No se esteriliza.

TE 1 ml de 1 M Tris-HCl pH = 8,0 200 μl de 0,5 M EDTA pH = 8,0 H2O hasta 100 ml Autoclavar

10 mM Tris-HCl pH = 8,0 1 mM EDTA pH = 8,0

1 M Tris-HCl Disuelve 121,1 g de Tris base en 800 ml de H2O. Ajusta el pH con HCl concentrado. Deja enfriar la solución a temperatura ambiente antes de ajustar el pH definitivamente. Ajusta el volumen a 1 litro y autoclava.

El pH del Tris depende de la temperatura y disminuye unas 0,03 unidades de pH por cada 1ºC de aumento en la temperatura.

20 mg/ml X-gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase. Disuelve 0,2 g de X-gal en 10 ml de dimetil-formamida. Usa tubos de vidrio o de polipropileno. Dispensa e alicuotas y cubre con papel de aluminio los tubos para proteger el X-gal de la luz. Almacena a –20ºC. No es necesario esterilizar.