Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica...

Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica Fitosanitaria

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PROTOCOLOS DE DIAGNÓSTICO

Introducción

Los protocolos de diagnóstico brindan información pertinente para el diagnóstico sobre la plaga reglamentada especificada, su posición taxonómica y los métodos para detectarla e identificarla. Los métodos incluidos en los protocolos de diagnóstico se seleccionan basándose en su sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, además, la información relacionada con estos factores se proporciona para cada uno de ellos.

Estos protocolos brindan información y orientación detallada para la detección de plagas, por ejemplo, en los signos y/o síntomas asociados con la plaga, las ilustraciones (cuando sean apropiadas), las etapas de desarrollo de la plaga, los métodos para detectar la plaga, así como los métodos para extraer, recuperar y recolectar la plaga de las plantas. La información y orientación para la identificación de plagas incluye información detallada sobre métodos morfológicos y morfométricos, métodos basados en propiedades biológicas y en propiedades bioquímicas y moleculares de la plaga.

Los protocolos de diagnóstico están destinados a ser utilizados por los laboratorios que realizan diagnósticos de plagas como parte de las medidas fitosanitarias. Ellos están sujetos a revisión y enmienda para tomar en cuenta descubrimientos nuevos en el diagnóstico de plagas.

La detección e identificación correcta de plagas son decisivas para la aplicación adecuada de las medidas fitosanitarias En particular, las partes contratantes necesitan procedimientos de diagnóstico apropiados para la determinación del estatus y la notificación de una plaga.

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Procedimiento para realizar el diagnostico fitosanitario

1. Propósito del procedimiento.

Describir las etapas que se llevan a cabo para realizar el Diagnóstico Fitosanitario en muestras de vegetales, sus productos y subproductos, y la emisión del dictamen correspondiente. 2. Alcance.

Este procedimiento aplica al Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF). 3. Referencias.

o Manual de la Calidad del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria Sección 7,

Realización del Servicio. o Procedimiento para Elaboración y Control de los Documentos PR-RPD-01.

4. Productos del proceso.

Producto

Etapas

Características a medir Seguimiento a

la medición.

Dictamen

o Se indiquen en el resultado. o Estén correctos los datos del solicitante

Cada vez que se

emita un dictamen

Evidencia: Dictamen

5. Seguimiento y medición del proceso.

Medición del proceso Seguimiento del proceso

Objetivo: Mayo del 2009 a Mayo del 2010

Máximo 3 dictamen con inconformidad del usuario por emisión de un resultado erróneo. Modo de medición del proceso: Numero de dictámenes

Mensual

Evidencia del seguimiento y medición del proceso: Reporte Mensual


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6. Definiciones. o CNRF: Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria.

o Diagnóstico fitosanitario: Análisis de laboratorio, que consiste en realizar una o varios análisis

sobre muestras de vegetales, sus productos y subproductos con el fin de detectar la presencia o ausencia de plagas de importancia cuarentenaria.

o Dictamen positivo: Resultado del análisis de laboratorio que indica detección de una plaga

cuarentenaria para México.

o Dictamen negativo: Resultado del análisis del laboratorio que indica la no detección de una plaga cuarentenaria para México.

o Plaga cuarentenaria: Forma de vida vegetal o animal o agente patogénico, dañino o potencialmente dañino a los vegetales; el cual no está presente en territorio nacional o, si lo está, se encuentra restringido o bajo control oficial.

o Documentos: Para fines de este procedimiento, este término se utiliza indistintamente si es oficio, dictamen, ficha positiva, memorando y hoja de remisión.

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7. Método de trabajo.

7.1 Descripción del procedimiento.

De No. Descripción

Recepción de Muestras.

1

Recibe muestra y revisa que venga acompañada de la Hoja de remisión.

Registra la muestra en formato de Registro General (FO-DFI-

01) y por Laboratorio (FO-DFI-02).

Envía la muestra conforme a la solicitud de análisis o Listado de Plagas de Interés (LI-DFI-01). Etiqueta con los siguientes datos: No. de dictamen, No. de remisión, producto, origen y laboratorio

correspondiente.

Captura en base de datos información. Entrega la muestra al laboratorio correspondiente.

Registro General (FO-DFI-01)

Registro por Laboratorio (FO-DFI-02)

Listado de Plagas

de Interés (LI-DFI-01)

Laboratorio 2 Recibe muestra y registra en “Bitácora de Registro de Muestras del Laboratorio” correspondiente.

Bitácora de Registro de

Muestras del Laboratorio

Laboratorio.

3

Realiza análisis conforme a lo establecido en las Instrucciones de Trabajo indicadas en el siguiente cuadro Reporta resultado en base de datos.

Laboratorio Instrucción de trabajo para Clave

Bacterias Diagnóstico Fitosanitario de Bacterias.

IT-BAC-01

Biología

Molecular

Diagnóstico Fitosanitario de Biología Molecular.

IT-BIM-01

Entomología Diagnóstico Fitosanitario de Entomología.

IT-ENT-01

Micología Diagnóstico Fitosanitario de Micología.

IT-MIC-01

Nematología Diagnóstico Fitosanitario de Nematología.

IT-NEM-01

Virus Diagnóstico Fitosanitario de Virus.

IT-VIR-01

IT-BAC-01 IT-BIM-01 IT-ENT-01 IT-MIC-01 IT-NEM-01 IT-VIR-01


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Responsable Actividades Documento de

referencia o registros No. Descripción

Laboratorio. 4

Imprime el dictamen.

Rubrica el dictamen y lo entrega a Jefe de Departamento

Nota: Si el cliente es personal oficial de la DGSV la entrega de resultados es mediante oficio y/o memorando, al cual se le adjunta el dictamen.

Dictamen

Jefe de Departamento

5

Recibe dictamen, firma dictamen negativo y rubrica dictamen positivo,

Turna dictamen a Recepción de Muestras. Dictamen


6

Revisa el tipo de dictamen (positivo o negativo).

Nota: Si el dictamen es negativo se manda vía fax, únicamente, en producto retenido en punto de ingreso (OISA).

Dictamen


7

Si el dictamen es positivo, continua según lo establecido en la actividad 10.

Si el dictamen es negativo, se continúa de acuerdo a lo que se describe en la siguiente actividad.


8

Fotocopia y entrega al cliente dictamen negativo original.

Dictamen


9

Elabora oficio, anexa dictamen original o fotocopia y lo entrega a Oficialía de Partes.

Con esta actividad se concluye el procedimiento.

Oficio Dictamen


10

Envía a Subdirector de Diagnóstico Fitosanitario. Dictamen

Subdirector de Diagnóstico Fitosanitario

11 Firma dictamen positivo y turna Director del CNRF Dictamen

Director del CNRF. 12

Firma ficha positiva.

Entrega a Subdirector de Diagnóstico Fitosanitario Dictamen

Subdirector de Diagnóstico Fitosanitario

13 Entrega a Recepción de Muestras Dictamen

Recepción de Muestras. 14

Obtiene dos fotocopias. La documentación original la envía al área de Regulación Fitosanitaria.

Con esta actividad se concluye el procedimiento

Dictamen

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7.2 Mapa del procedimiento.


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1. Registros:

No. Documento (clave) Responsable de

custodia Tiempo de retención

disposición

1. Registro General (FO-DFI-01) Recepción de

Muestras. 1 año / Archivo muerto

2. Registro por Laboratorio (FO-DFI-02) Recepción de

Muestras. 1 año / Archivo muerto

3. Bitácora de Registro de Muestras del Laboratorio Laboratorio 1 año / Archivo muerto

4. Dictamen


1 año / Archivo muerto

2. Anexos:

No. Documento Clave

1 Registro General (FO – DFI – 01)

2 Registro por Laboratorio (FO – DFI – 02)

3 Protocolo Listado de Plagas de Interés (LI – DFI – 01)

10. Historial de Cambios:

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afectadas Motivo y breve descripción del cambio


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Instrucción de trabajo para diagnóstico fitosanitario de bacterias

1. Propósito.

Describir las actividades que debe seguir el laboratorio para el detección de bacterias fitopatógenas.

2. Alcance.

Aplica a toda aquella muestra vegetal que ingresen al laboratorio de bacterias; tomando en cuenta la normatividad oficial mexicana.

3. Referencias. - Procedimiento para el diagnóstico fitosanitario (PR-DFI-01). - Procedimiento para la elaboración y control de documentos (PR-RPD-01).

4. Contenido.

4.1 Personal técnico de laboratorio.

1. Si la muestra se recibe después de las 13:00 p.m. la analiza hasta el siguiente día y entonces la almacena a 4° ± 1°C en refrigerador.

2. Revisa que la muestra esté en buen estado. Si la encuentra en buen estado continua con el paso 3.

Si la muestra está en mal estado, la registra en bitácora y continúa conforme a lo establecido en el Procedimiento para Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

3. Revisar los siguientes datos: nombre, tipo de órgano enviado (hojas, tallos, plántulas, semillas, raíces) y origen. En base a esto confronta con la NOM-MX- FITO correspondiente (ver el siguiente cuadro) y decide que bacteria busca. Revisa la muestra con el objeto de encontrar cualquier tipo de sintomatología sospechosa.

NOM Nombre

NORMA Oficial Mexicana NOM-007-FITO-1995

Por la que se establecen los requisitos fitosanitarios y especificaciones para la importación de material vegetal propagativo.


Por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas de los cítricos.

Norma Oficial Mexicana NOM-012-FITO-1996

Por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas de la papa.

Norma Oficial Mexicana NOM-012-FITO-2000

Para el establecimiento de zonas bajo protección y zonas libres de plagas cuarentenarias de la papa.


Por la que se establecen los requisitos fitosanitarios y especificaciones para la importación de granos y semillas, excepto para siembra.


Requisitos y especificaciones para la producción y movilización nacional de papa comercial.


Requisitos y especificaciones fitosanitarios para la producción de material propagativo asexual de papa.

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4. Revisa su lista de Kits de anticuerpos ver listado de Kist Comerciales disponibles (FO- BAC-01). En

caso de que de que existan los anticuerpos para la bacterias(s) sugeridas en la norma se realiza la prueba de ELISA (Ver Instrucción de trabajo para el diagnóstico de bacterias mediante la Técnica ELISA -IT-BAC-02). En el caso contrario continua con el paso No. 10.

5. Obtiene resultado. Si el resultado es negativo, lo registra en bitácora y continúa conforme a lo establecido en el Procedimiento para Diagnóstico Fitosanitario. Si el resultado de la muestra es positivo, vuelve a correr la prueba.

6. Dependiendo de estos segundos resultados toma una decisión: es positiva continua con el paso 7. si resulta negativa, corre la muestra una vez más y dependiendo de los resultados toma la decisión de positivo (paso 7) o negativo en base a duplicidad. Si el resultado es negativo, registra en bitacora y continúa conforme a lo establecido en el Procedimiento para Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

7. Si el resultado es positivo: Revisa su relación de primers disponibles -ver lista de primers disponibles (FO -BAC -02)-. Si los tiene continua con el paso No. 8. Si no los tiene, continúa conforme a lo establecido en el Procedimiento para Diagnóstico Fitosanitario.

8. Si tiene los primers específicos contra la bacteria sospechosa; realiza la prueba de la Reacción en Cadena de la Polimerasa; Ver instrucción de trabajo para diagnóstico de bacterias mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) - IT-BAC-03-.

9. Obtiene un resultado, registra en bitácora y continúa conforme a lo establecido en el Procedimiento para Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

10. Revisa la muestra para localizar algún tipo de daño en cualquiera de los órganos disponibles de la planta. Toma una muestra, la cual es procesada mediante aislamiento e identificación taxonómica Ver instrucción de trabajo para diagnostico de bacterias mediante aislamiento e identificación taxonómica (IT-BAC-04).

11. Toma resultados. Si la muestra es positiva continua en el paso 12. Si es negativa, registra en bitácora, continúa conforme a lo establecido en el Procedimiento para diagnóstico fitosanitario (PR-DFI-01).

12. Realiza diagnóstico en base a claves taxonómicas (Schaad, et al., 2001). Registra en bitácora y continúa conforme a lo establecido en el Procedimiento para Diagnóstico Fitosanitario /PR-DFI-01).

4.2. Lista de Instrucciones de trabajo relacionadas.

1. Instrucción de trabajo para diagnostico de bacterias mediante la técnica ELISA (IT-BAC-02).

2. Instrucción de trabajo para diagnostico de bacterias mediante PCR (IT-BAC-03).

3. Instrucción de trabajo para diagnostico de bacterias mediante aislamiento e identificación taxonómica (IT-BAC-04).


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5. Registros:

No. Documento (clave) Responsable de custodia

Tiempo de retención / disposición

1 Bitácora de registro de muestras del laboratorio de bacterias fitopatógenas (s/clave)

Técnico de laboratorio 5 años/destrucción

2 Lista de Kits de anticuerpos utilizados en el laboratorio de bacterias fitopatogenas (FO -BAC - 01)


3 Lista de primers utilizados en el laboratorio de

bacterias fitopatógenas (FO - BAC - 02) Técnico de laboratorio 5 años/destrucción

6. Anexos:

No. Documento Clave


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Instrucción de trabajo para el diagnóstico de biología molecular

1. Propósito.

Describir el procedimiento que debe seguir el laboratorio para la detección de fitoplasmas, virus y viróides mediante técnicas de biología molecular.

2. Alcance.

Aplica a toda aquella muestra vegetal que entran al laboratorio de Biología molecular; en que se solicite el servicio tomando en cuenta las órdenes de remisión de la insectoría, la orden de servicio establecida por el cliente y/o las normas fitosanitarias.

3. Referencias.

Procedimiento para el Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

Procedimiento de Elaboración y Control de los Documentos (PR-RPD-01).

J. Sambrook, E.F. Fritschi T. Maniatis. Molecular Cloning, a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Lab. Press. (1989).

Chomczynski P. et al., (1997) DNAzol: A reagent for rapid isolation of genomic DNA. BioTechniques 22:550-553.

4. Contenido.

4.1 Descripción Técnica: El personal técnico.

4.1.1 Revisa que la muestra esté en buen estado. Si la muestra se encuentra en mal estado, la reporta inmediatamente en base de datos general, imprime el dictamen y lo entrega al responsable de recepción de muestras terminando ahí el proceso. Si la muestra está en buen estado continua el proceso normal de diagnóstico.

4.1.2 Revisa los siguientes datos: nombre, tipo de órgano enviado (hoja, tallos, plántulas, semillas, raíces) y origen. En base a esto confronta con la NOM-MX-FITO correspondiente, que aparece a continuación:

No. Norma Requisito

1 NOM-007-FITO-1995 Por la que se establecen los requisitos fitosanitarios y especificaciones para la importación de material vegetal propagativo.

2 NOM-011-FITO-1995 Por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas de los cítricos.

3 NOM-012-FITO-1996 Por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas de papa.

4 NOM-041-FITO-2002 Requisitos y especificaciones fitosanitarios para la producción de material propagativo asexual de papa.

5 NOM-025-FITO-2000

Para el establecimiento de zonas bajo protección y zonas libres de plagas cuarentenarias de la papa.

6 NOM-079-FITO-2002

Requisitos fitosanitarios para la producción y movilización de material propagativo libre de Virus Tristeza y otros patógenos asociados a cítricos.


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4.1.3 Determina el patógeno a detectar, Fitoplasmas, Virus o Viroides. Si es Fitoplasma y tiene en existencia el reactivo PLant DNAzol (Invitrogen), extrae DNA como indica el paso 4.1.5, si no continua en el paso 4.1.6.

4.1.4 Si es virus o viroide, continua en el paso 4.1.7, si tiene en existencia el reactivo Trizol Reagent (Invitogen), si no continúa con el paso 4.1.8.

4.1.5 Extracción de DNA por método Plant DNAzol (Invitrogen®)

1. En el área gris del laboratorio, pesa en una balanza analítica la muestra vegetal (50-100mg), y la coloca en un mortero previamente estéril y congelado, triturar la muestra hasta dejarla en una consistencia de polvo.

2. Deposita todo el polvo a un tubo de microcentrifuga estéril de 1.5 mL, con 300μL de Plant DNAzol (Invitrogen®) agita en vortex por 30 seg. e incuba por 5 min.

3. Adiciona 300μL de cloroformo y mezcla en vortex por 1 min. e incuba en agitación a temperatura

ambiente (TA) por 5 min.

4. Centrifuga por 10 minutos a 12000g y transfiere cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL limpio y estéril.

5. Precipita el DNA del sobrenadante con etanol absoluto y mezcla por inversión de 6 a 8 veces

cuidadosamente e incuba por 5 minutos a TA.

6. Centrifuga por 4 minutos a 5000g, después de la centrifugación tira el sobrenadante y escurre el exceso de la pastilla sobre papel absorbente.

7. Lava la pastilla con 300 μL de etanol al 70% y centrifuga a 5000g por 4 minutos, escurre los excesos

de la pastilla sobre papel absorbente y espera a que seque

8. Resuspende la pastilla en 50μL de agua estéril libre de nucleasas y procede a la verificación de la integridad, calidad y cantidad del DNA.

4.1.6 Extracción de DNA, método CTAB 1. En el área gris del laboratorio, pesa en una balanza analítica la muestra vegetal 0.2 gr de material

vegetal y tritura con 1mL de buffer CTAB, en un mortero congelado y estéril. 2. Vacía en tubo de microcentrífuga de 2mL limpio y estéril y coloca en un termo baño a 60°C

durante 30 minutos, con agitación ocasional. 3. Aplica 1 volúmen de fenol-cloroformo y centrifuga a 10, 000g durante 10 minutos. 4. Toma el sobrenadante y coloca en un tubo de microcentrífuga limpio y estéril. Aplica 1 volumen

de cloroformo-alcohol isoamílico (24: l) y centrifuga a 10, 000g durante 10 minutos Repetir una vez más.

5. Toma el sobrenadante y coloca en otro tubo de microcentrífuga limpio y estéril. 6. Aplica 0.8 volúmenes de isopropanól almacenado con anterioridad a –20° C, y deja toda la noche

a 4°C ó a –20° C. 7. Centrifuga a 10, 000g durante 20-30 minutos. y decanta el isopropanól. 8. Agrega etanol al 70% almacenado con anterioridad a –20° C, y centrifuga a 10, 000g durante 10

minutos. 9. Decanta el etanol y seca la pastilla a temperatura ambiente (10 a 15 minutos)

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10. Seca la pastilla y disuelve con 20-200uL de agua estéril libre de nucleasas y procede a la verificación de la integridad, calidad y cantidad del DNA.

4.1.7 Método de extracción de RNA total mediante el TRIZOL Reagent (Invitrogene®).

1. Pesa de 50 a 100mg y tritura el tejido en 1mL de Trizol Reagent (Invitrogene®). 2. Incuba el homogenizado por 5 minutos a temperatura ambiente o sobre hielo. 3. Adiciona 0.2 mL de cloroformo y agitar vigorosamente. 4. Centrifuga a 12000g/15 minutos a 4° C. y separa la fase acuosa (superior). 5. Adiciona 0.5 mL de isopropanol e incuba las muestras por 10 minutos a temperatura ambiente. 6. Centrifugar a 12000g/10 minutos a 4°C y tira el sobrenadante. 7. Lava la pastilla con Etanol al 70% y repite una vez el paso 6 8. Disuelve la pastilla en 50uL de agua estéril libre de nucleasas y procede a la verificación de la

integridad, calidad y cantidad del RNA. 4.1.8 Método de extracción de RNA mediante fenol-cloroformo

1. En un mortero estéril y congelado tritura 0.5 g de tejido con 1 mL de buffer de extracción SOLAM. 2. Transfiere 0.5 mL del extracto a un tubo de micro centrífuga limpio y estéril e incuba por 15 min. a

temperatura ambiente. 3. Centrífuga a 12, 000 g por 5 minutos a 4°C. 4. Trasfiere la fase acuosa (superior) a otro tubo de micro centrífuga limpio y estéril y adiciona 50 uL

de acetato de sodio 3M y 1 mL de etanol absoluto. 5. Deja a -20°C toda la noche o 2h a -70°C. 6. Centrifuga a 12, 000 g por 5 minutos a 4°C. y deshecha el sobrenadante. 7. Seca la pastilla y resuspende en 50 uL de agua estéril libre de nucleasas y procede a la

verificación de la integridad, calidad y cantidad del RNA.

4.1.9 Verificación de la integridad del DNA o RNA en electroforesis

1. Prepara 30 mL. de agarosa al 0.8%, en buffer TAE o TBE al 1X con 1μL de Bromuro de etidio en cámara de electroforesis.

2. Coloca 2 μL de DNA o RNA mezclados con 1 μL de buffer de carga (Solución Halt) en los pozos del gel previamente sumergido en buffer TAE o TBE al 1X y corre la electroforesis a 80 volts por 30 minutos.

3. Observa el gel en un transiluminador de luz Ultra Violeta (UV) y toma la foto con un analizador de imágenes.

4 Analiza la imagen y verifica la integridad y cualitativamente la cantidad del DNA.

4.1.10 Verificación de la calidad y cantidad del DNA o RNA por espectrofotometría

1. Lee la calidad y cantidad de DNA en espectrofotómetro. 2. Hace la dilución pertinente llevando la concentración del DNA a 1 ± 0.5 μg/mL en agua estéril

libre de nucleasas.

4.1.11 Determina, de acuerdo al tipo de muestra y patógeno la prueba a realizar

1. en el caso de organismos con genoma de DNA (Fitoplasmas) realiza la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), paso 4.1.12. Si el patógeno tiene como genoma RNA (Virus Psorosis, y los


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(Viroides Exocortis y Cacexia de los Cítricos) realiza la Trascripción Reversa – Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR), paso. 4.1.14

4.1.12 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de fitoplasmas

1. Descongela sobre hielo los reactivos para PCR y calcula las cantidades necesarias por tubo de reacción, de acuerdo a la siguiente tabla:

Reactivo Concentración inicial

Volumen 1 tubo

1 Buffer 10X 5.0 μL 1

2 MgCl2 50mM 1.5 μL 2

3 dNTP’s 10mM 1.0 μL 3

4 P1 10pmoles/μL 2.0 μL 4

5 P7 10pmoles/μL 2.0 μL 5

6 Taq pol 5U/μL 0.5 μL 6

7 DNA 1μg/mL 2.0 μL 7

8 Agua grado PCR 36.0 μL 8

Volumen Final 50.0 μL

Nota: Primers universales usados para Fitoplasmas, amplifican un producto de aprox. 1800 pb. y las

secuencias son:

Sentido Nombre del primer

Secuencia

Sense P1 5’- AAg AgT TTg ATC CTg gCT CAg gAT T -3’

Antisense P7 5’- CgT CCT TCA TCg gCT TT -3’

2. Hace la master mix de PCR, (paso 1) sobre hielo en la campana de seguridad (área blanca) y alícuota 48 μL de la mezcla de reactivos en tubos de PCR limpios, previamente etiquetados.

3. Coloca 2 μL del DNA de la muestra en el área gris (previamente diluido a 1μg/mL ± 0.5 μg/mL) y los controles de la reacción PCR (control positivo y negativo).

4. Coloca la muestra en el termociclador el cual programa de acuerdo a la siguiente:

Temperatura Tiempo Ciclos

94 oC 4 min 1

94 oC 45 seg

54 oC 1 min 35

72 oC 1 min y 30 seg

72 oC 5 min 1

5. Saca los tubos de la reacción de PCR, toma 10 μL del producto de PCR (PPCR) y mezcla con 3 μL de buffer de carga (Solución Halt) sobre papel parafilm, y deposita en los pozos del gel de agarosa al 0.8%. teñido con 1 μL de bromuro de etidio (0.5mg/mL) en buffer TAE o TBE 1X.

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6. Coloca las muestras de la siguiente manera:

1. Marcador molecular (adecuado al fragmento

amplificado, ejemplo, Ladder 50, 100pb, etc.).

2. Control Positivo (PPCR amplificado a partir de un DNA enfermo).

3. Control negativo (PPCR) amplificado a partir de un DNA sano o agua).

4. Muestra.

5. Muestra.

7. Corre la electroforesis a 80 Volts hasta que el azul de bromofenol se encuentre a 3/4 partes del gel, apaga la fuente de poder y observa sobre un transiluminador de luz UV un fragmento de 1800 pb y toma la fotografía con un analizador de imágenes.

8. De los productos amplificados, independientemente si se observan bandas o no, se reamplifican para aumentar la sensibilidad, utilizando el siguiente procedimiento:

4.1.13 PCR- anidado

9. Descongela sobre hielo los reactivos para PCR y calcula las cantidades necesarias para un tubo de acuerdo a la siguiente tabla:

Reactivo Concentración

inicial Volumen

1 tubo Concentración

final

1 Buffer 10X 5.0 μL 1X

2 MgCl2 50mM 1.5 μL 1.5mM

3 dNTP’s 10mM 1.0 μL 200 μM

4 R16R2 10pmoles/μL 2.0 μL 20 pmoles/ μL

5 R16F2 10pmoles/μL 2.0 μL 20 pmoles/ μL

6 Taq pol 5U/μL 0.5 μL 2.5U/ μL

7 PPCR (P1/P7) Dilución 1:30 2.0 μL 20 ng/ μL

8 Agua grado PCR 36.0 μL

Volumen Final 50.0 μL

Nota: El DNA es el producto del PCR P1/P7 diluido 1:30. Obtiene un producto de aprox. 1200 pb.

Sentido Nombre del primer Secuencia

Sense R16R2 5’ TgA Cgg gCg gTg TgT ACA AAC CCC g 3’

Antisense R16F2 5’ ACg ACT gCT gCT AAg ACT gg 3’

10. Hace la master mix de PCR (paso 9) sobre hielo en la campana de seguridad (área blanca) y alícuota 48 μL de la mezcla de reactivos en tubos de PCR limpios, previamente etiquetados.

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11. Coloca el producto de PCR en el área gris (previamente diluido a 1:30) y los controles de la reacción PCR (control positivo y negativo).


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94 oC 45 seg

54 oC 1 min 35

72 oC 1 min y 30 seg

72 oC 5 min 1

12. Observa el producto amplificado de PCR como lo indica el paso 5, 6 y 7. 13. El resultado del análisis lo registra en bitácora y concluye el análisis para Fitoplasmas y procede

conforme lo establecido en el Procedimiento para el Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

4.1.14 Trascripción inversa- PCR, para la amplificación del virus psorosis de los cítricos (CPsV).

1. Adiciona los siguientes reactivos en un tubo de PCR, teniendo un volumen final de 25 L.

Reactivo Concentración inicial

Volumen Concentración final

Buffer de PCR 10 X 2.5 L 1 X

DTT 0.1 M 2.5 L 10 mM

MgCl2 50 mM 1.25 L 2.5 mM

Mezcla de nucleótidos 10 mM 0.625 L 250 M

Sense 10 pmoles/ L 2.5 L 25 pmoles

Antisense 10 pmoles/ L 2.5 L 25 pmoles

Taq DNA polimerasa 5u/ L 0.5 L 2.5 unidades

Reverso transcriptasa 200U/ L 0.5 L 100 unidades

RNAsin 40U/ lL 0.5 L 20 unidades

Agua estéril 8.62 L

Volumen final 25 L

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Nota. Utiliza los primers de la proteína de la cápside del CPsV, produciendo un fragmento de 500

pb, cuyas secuencias son:


Sense PsA 5’ CAgCAgAACCCgCgCCTgATCCAg 3’

Antisense PsB 5’ ATCggACTTgATgCgCAggCCgTT 3’

1. Coloca las muestras en el termociclador de acuerdo al siguiente programa: Programa de RT-PCR:


42 oC 45 min 1

RT

94 oC 5 min 1

PC

R

94 oC 1 min 45

55°C 1 min

72°C 1 min.

72 oC 10 min 1

2. Después de concluir el programa térmico del termociclador procede como en el paso 5, 6 y 7 del punto 4.1.12.

3. El resultado del análisis lo registra en bitácora y concluye el análisis para Psorosis y procede conforme lo establecido en el Procedimiento para el Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01)


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4.1.15. RT-PCR en un solo paso, para la amplificación de los viroides exocortis y cachexia de los cítricos (CEVd y CCaVd).

1. Adiciona los siguientes reactivos en un tubo de PCR, teniendo un volumen final de 25 L.

Nota: Utiliza los primers específicos para CEVd y CCaVd que amplifican bandas de 370 y 300 pb,

respectivamente y cuyas secuencias son:


Sense CEVd1 5’ – CCC TgA Agg ACT TCT TCC CC – 3’

Antisense CEVd2 5’- ATC CCC ggg gAA ACC Tgg AggAA – 3

Sense CCaVdA 5’- CgC ggC AgA ggC TCA gAT Ag-3’

Antisense CCaVdB 5’- gAT CCT CTC TTg AgC CCC TC-3’

1. A partir de la mezcla, toma 22 L y deposita a cada tubo de PCR estéril de 0.250 mL.

2. Por otro lado Incuba 3 L de RNA a 70 C por 5 min. Para el control negativo, en lugar de RNA agrega

3 L de agua.

3. Agrega 25 l de aceite mineral a cada tubo. 4. Coloca las muestras en el termociclador de acuerdo al siguiente programa:

Reactivo Concentración inicial Volumen Concentración final

Buffer de PCR 10 X 2.5 L 1 X

DTT 0.1 M 2.5 L 10 mM

MgCl2 50 mM 1.25 L 2.5 mM

Mezcla de nucleótidos 10 mM 0.625 L 250 M

Sense 10 pmoles/ L 2.5 L 25 pmoles

Antisense 10 pmoles/ L 2.5 L 25 pmoles

Taq DNA polimerasa 5u/ L 0.5 L 2.5 unidades

Reverso transcriptasa 200U/ L 0.5 L 100 unidades

RNAsin 40U/ lL 0.5 L 20 unidades

Agua estéril 8.62 L

Volumen final 25 L

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Programa de RT-PCR:

Temperatura Tiempo Ciclos 42

oC 45 min 1

RT

94 oC 5 min 1

PC

R

94 oC 1 min

45 50°C 1 min

72°C 1 min.

72 oC 10 min 1

4. Después de concluir el programa térmico del termociclador procede como en el paso 5, 6 y 7 del punto 4.1.12.

5. El resultado del análisis lo registra en bitácora y concluye el análisis para Psorosis y procede conforme lo establecido en el Procedimiento para el Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

4.2 Preparación de soluciones.

Acetato Sódico 2 M Procedimiento.

a) Pesar 27.22 g de acetato sódico con 3 moléculas de agua (NaAcO.3H20). b) Disolver el (NaAcO.3H20) con aproximadamente 80 mL de agua bidestilada en un vaso de

precipitado de 200mL. c) Verter la solución en un matraz aforado de 100 mL y completar con agua hasta la marca de

aforo. d) Esterilizar por autoclave y conservar a temperatura ambiente.

Bromuro de Etdio 0.5 mg/hl Procedimiento.

a) Pesar 50 mg de bromuro de etidio. b) Disolver el bromuro de etidio en 80 mL de agua ultrapura. c) Aforar a 100 mL y almacenar a 4 °C protegido de la luz en recipiente de vidrio ámbar.

Nota: De esta solución se hará una dilución 1:1000 para teñir geles. Importante: Tener mucho cuidado con el manipuleo del gel, dado que el bromuro de etidio es

cancerigeno. (Usar guantes)

Buffer de carga 6X (Solucion Halt)

Procedimiento.

a) Pesar 0.025 gr. de azul de bromofenol , 0.025 gr de Xilen cianol FF en un vaso de precipitados de 20 mL.

b) Disolver los colorantes en 4 mL de sacarosa en agua al 40 % o 3 mL de glicerol c) Aforar a 10 mL con agua ultrapura y almacenar a 4 °C .


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Buffer de extracción (SOLAM) 50ml

Procedimiento.

a) Mezclar 2.5 mL de una solución stock de 1M de Tris HCl pH 8.5, 1mL, de NaCl 5M, 1mL de EDTA 0.5M y 5 mL de SDS 20 %.

b) Mezclar y aforar a 50 mL. Con agua bidestilada estéril.

Cloroformo-Isoamilico 24:1 (solución SEVAG)

Procedimiento.

a) Mezclar 40 mL de alcohol isoamílico y 960 mL de cloroformo. b) Guardar la solución en un frasco para reactivo bien cerrado. c) Almacenar a 4 °C.

Cloruro de Sodio (NaCl) 5 M Procedimiento.

a) Pesar 292.2g de NaCl y agregar en matraz aforado. b) Disolverlo en 800mL y aforar a 1000 mL con agua ultrapura c) Esterilizar por autoclave. d) Conservar a temperatura ambiente.

Duodecilsulfatosodico (SDS) al 10 % pH 7.2

Procedimiento.

a) Pesar y disolver 10 g de duodecilsulfato sódico en 90 mL de agua bidestilada estéril, en un vaso de precipitados.

b) Calentar a 68 °C en baño María para ayudar la disolución. c) Ajustar el pH a 7.2 con unas gotas de HCL concentrado. d) Aforar a 100 mL con agua ultrapura e) Guardar la solución en un frasco para reactivo bien cerrado a Temperatura ambiente

Buffer CTAB

Procedimiento.

a) Mezclar 28 mL de NaCl, 4 mL de EDTA, 10 mL de Tris HCl y 20 mL de CTAB, en un matraz aforado.

b) Aforar a 100 mL con agua ultrapura. c) Esterilizar por filtración.

a) Guardar la solución en un frasco para reactivo bien cerrado.

EDTA 0.5 M (Etilendiaminotetraacetatosodico)

Procedimiento.

a) Añadir a 700 mL de agua destilada 186.1 g de EDTANa2.2H2O y agitar intensamente. b) Ajustar el pH a 8 con NaOH 10 M. Llevar a un litro con agua destilada c) Alicuotar y esterilizar en autoclave. Conservar a temperatura ambiente.

Nota: La sal sódica de EDTA no es soluble en agua hasta que la solución alcanza un pH de aproximadamente 8 por adición de NaOH.

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Fenol – Cloroformo. Procedimiento.

a) Añadir 48 mL de cloroformo, 2 mL de alcohol isoamílico (49:1; v/v). a un vaso de precipitados. b) Añadir 50 mL de fenol saturado, añadir una “mosca” y agitar hasta que se mezclen c) Para evitar su cristalización, adicionar 125 mL de Tris-HCl 1M pH 7.4

TAE 50X.

Procedimiento.

a) Disolver 242.2 g de base trizma en 400 mL de agua ultrapura. b) agregar 200 mL de EDTA 500 mM y 57.1 mL de ácido acético glacial. c) Ajustar en pH 8.0 y aforar a 1L. d) Esterilizar en autoclave.

TBE 10X.

Procedimiento.

a) Mezclar 540.0 g de base trizma y 275.0 g de ácido bórico en 1L de solución EDTA 0.5 M pH 8.0.

b) Disolverlo y aforar a 1000 mL con agua ultrapura c) Esterilizar en autoclave

d) Guardar la solución en un frasco para reactivo bien cerrado.

Tris HCl 1 M.

Procedimiento.

a) Disolver 121.1 g de Tris en 800 mL de agua b) Ajustar el pH agregando HCl concentrado. Considerar de manera orientativa.

pH HCI

7.4 70 mL

7.6 60 mL

8.6 42mL

4.3. Listado de Instrucciones de equipo y/o referencias.

1. Instrucción de Trabajo para la Balanza Analítica (IT-BIM-02) 2. Instrucción de Trabajo para Micropipetas (IT-BIM-03) 3. Instrucción de Trabajo para la Centrífuga refrigerada (IT-BIM-04). 4. Instrucción de Trabajo para aparato de electroforesis (IT-BIM-05). 5. Instrucción de Trabajo para el Analizador de Imágenes (IT-BIM-06). 6. Instrucción de Trabajo para el Espectrofotómetro (IT-BIM-07). 7. Instrucción de Trabajo para el Termociclador (IT-BIM-08) 8. Instrucción de Trabajo para el refrigerador (-4°C), congelador (-20°C) y Ultracongelador

(-70°C) (IT-BIM-09) 9. Instrucción de Trabajo para el autoclave y esterilización (IT-BIM-10) 10. Instrucción de Trabajo para los Termómetros (IT-BIM-11) 11. Instrucción de Trabajo para el potenciómetro (IT-BIM-12).


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5. Registros:



1 Bitácora de laboratorio Técnico de laboratorio 5 años

2 Registro de verificación y calibración Técnico de laboratorio 5 años

6. Anexos:

No. Documento Clave

7. Historial de cambios

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Instrucción de trabajo diagnostico fitosanitario de entomología

1. Propósito.

Describir el procedimiento que debe seguir una muestra a su ingreso al Laboratorio de Entomología y

Acarología para su diagnóstico fitosanitario.

2. Alcance.

Aplica a toda aquella muestra vegetal, derivado vegetal o muestra conservada en alcohol que ingresa al área de muestras del Laboratorio de Entomología y Acarología.

3. Referencias.

- Borror, D. J., C.A. Triplehorn and N. F. Johnson. 1989. An Introduction to the -Study of Insects.

Saunders Collage Publishing. 6th Edition. USA. 875 pp.

- Gorham, J. R. (Edit). 1991. Insects and Mite Pests in Food. An Illustrated Key -Agriculture Handbook No. 655. United States Department of Agriculture.Washington, D. C. Volume 1 y 2. 767 pp.

- Procedimiento para Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

- Procedimiento para Elaboración y Control de Documentos (PR-RPD-01).

4. Contenido.

Personal Técnico de Laboratorio

4.1. Descripción.

1. Las muestras que ingresan al Laboratorio de Entomología y Acarología (LEA) del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF) se reciben en el área de recepción de muestras del laboratorio entre 9:00 a. m. y 13:00 p. m. para aplicar las instrucciones que se detallan a continuación. Después de este horario, las muestras frescas (plantas, esquejes, bulbos, etc.) se almacenan en refrigeración hasta el día siguiente, muestras secas (semillas, frutos secos, etc.) o conservadas (en alcohol) permanecen en la citada área de recepción, hasta el día siguiente.

2. De la muestra, revisa su estado, si este no es adecuado, registra en la Bitácora de registro de muestras del Laboratorio de Entomología y Acarología, con la leyenda "En mal estado", y se sigue conforme a lo establecido en el Procedimiento para Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

3. Si el estado de conservación de la muestra es adecuado, registra en Bitácora y revisa bajo lampara de luz blanca fría, ver Instrucción de Trabajo Aislamiento en Entomología (IT-ENT-02).

4. Una vez aislados los organismos (insectos y/o ácaros), los observa bajo microscopio estereoscópico.

5. Conforme al tipo de insecto o ácaro, realiza el diagnóstico observando las características en los ejemplares aislados en seco o inmersos en alcohol o bien procesado en micromontajes, ver ordenes taxonómicos de identificación directa (microscopio estereoscópico) y de identificación por medio de micromontajes (microscopio compuesto) (Anexo 1).


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6. Ubica el orden taxonómico del artrópodo (Borror et al. 1989, Gorham 1991) y sigue claves taxonómicas específicas, ver Instrucción de Trabajo Aplicación de Claves Taxonómicas en Entomología (IT-ENT-03).

7. Cuando se trata de muestras que es necesario procesar a montajes para su observación e identificación, aplica alguna de las técnicas descritas en la Instrucción de Trabajo Elaboración de Montajes en Entomología (IT-ENT-04).

8. Una vez identificado el insecto o ácaro (estados adultos y/o inmaduros), captura en base de datos general, genera el dictamen, rubrica y procede conforme a lo establecido en el Procedimiento para Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

4.2. Preparación de soluciones.

La preparación de soluciones (reactivos) utilizados para sacrificar, preservar, aclarar, transparentar, teñir, deshidratar, montar, etc., son descritos en la Instrucción de Trabajo Elaboración de Montajes en Entomología (IT-ENT-04).

4.3 Listado de Instrucciones de trabajo.

Instrucción de Trabajo para Microscopio Estereoscópico (IT-ENT-05).

Instrucción de Trabajo para Microscopio Compuesto (IT-ENT-06)

5. Registros.



1 Bitácora de Registro de Muestras del Laboratorio de Entomología y Acarología.

Responsable técnico y personal de apoyo.

1 años/Destrucción

6. Anexos: Se listan los documentos (formularios, tablas y gráficas), que fueron referenciados

durante el desarrollo del procedimiento.

No. Documento Clave

I Ordenes taxonómicos de observación directa y de observación en montaje

S/C

7. Historial de Cambios

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Anexo I

Ordenes taxonómicos de identificación directa (microscopio estereoscópico) y de identificación por medio de micromontajes (microscopio compuesto)

Orden/Familia Nombre común Diagnóstico por estadio biológico

Microscopio estereoscópico

Microscopio compuesto

1. Prostigmata

2. Mesostigmata

3. Acari

4. Collembola

5. Diplura

6. Thysanura

7. Orthoptera

Acrididae

Gryllidae

Romaleidae

Tettigoniidae

8. Blattaria

9. Isoptera

10. Psocoptera

11. Hemiptera

Anthocoridae

Coreidae

Lygaeidae

Miridae

Pentatomidae

Pyrrhocoridae

Tingidae

Aleyrodidae

Aphididae

Cercopidae

Acaros

Acaros

Acaros

Colembolos

Dipluridos

Pescaditos de plata

Chapulines, langostas

Grillos

Saltamontes

Esperanzas

Cucarachas

Termítas

Psocopteros

Chinches

Chinches

Chinches

Chinches

Chinches apestosas

Chinches

Chinches

Mosquitas blancas

Pulgones

Moscas pintas

Adultos

Adultos

Adultos

Adultos/ninfas

Adultos/ninfas Adultos/ninfas

Adultos/ninfas

Adultos

Adultos

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Adultos

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Adultos/inmaduros

Adultos/inmaduros

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Cicadellidae

Coccidae

Margarodidae

Membracidae

Pseudococcidae

Psyllidae

12. Thysanoptera

13. Coleoptera

Anobiidae

Bostrichidae

Bruchidae

Buprestidae

Cantharidae

Cerambycidae

Coccinellidae

Chrysomellidae

Cryptophagidae

Cucujidae

Curculionidae

Dermestidae

Elateridae

Lyctidae

Meloidae

Nitidulidae

Ptinidae

Scarabaeidae

Staphylinidae

Chicharritas

Escamas blandas

Escamas

Periquitos

Piojos harinosos

Piojos saltadores

Thrips

Escarabajos

Anobidos

Bostriquidos

Gorgojos

Buprestidos

Cantaridos

Cerambicidos

Catarinitas

Catarinitas, conchuelas

Criptofagidos

Cucujidos

Picudos, barrenillos

Dermestidos

Mayates

Lictidos

Botijones

Nitidulidos

Ptinidos

Gallinas ciegas

Adultos

Adultos

Adultos

Adultos

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Adultos/larvas

Adultos/larvas

Adultos/larvas

Adultos/larvas

Adultos/larvas

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Adultos

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Adultos/ninfas

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Adultos/ninfas

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Larvas

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Tenebrionidae

14. Diptera Agromyzidae

Anthomyiidae

Cecidomyiidae

Drosophilidae

Lonchaeidae

Muscidae

Mycetophilidae

Otitidae

Sciaridae

Stratiomyidae

Tachinidae

Tephritidae

15. Lepidoptera

Arctiidae

Carposinidae

Cossidae

Choreutidae

Gelechiidae

Geometridae

Hesperiidae

Lasiocampidae

Noctuidae

Pieridae

Pyralidae

Sesiidae

Sphingidae

Estafilinidos

Tenebrios

Moscas

Minadores

Gusanillos

Mosquitas de los granos

Mosquitas de la fruta

Moscas del cogollo

Moscas domesticas

Moscas de los hongos

Moscas

Moscas detrítivoras

Moscas

Moscas

Moscas de la fruta

Palomillas, polillas

Gusanos peludos

Gusanos

Gusanos

Orugas

Gusanos alfiler

Gusanos medidores

Gusanos cabezones

Gusanos

Palomillas/gusanos

Gusanos

Barrenadores, gusanos

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Adultos

Adultos

Adultos

Adultos

Adultos

Adultos

Adultos

Adultos

Adultos

Adultos

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Larvas

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Larvas

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Tortricidae

16. Hymenoptera

Cynipidae

Diprionidae

Tenthredinidae

Barrenadores, gusanos

Gusanos

Polillas

Avispas agalladoras

Avispas barrenadoras

Avispas barrenadoras

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Larvas

Larvas

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Adultos (genitalia)

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Instrucciones de trabajo para diagnóstico fitosanitario de micología

1. Propósito.

El presente manual se ha elaborado con el fin de dar a conocer las metodologías para realizar el diagnóstico de hongos fitopatógenos dentro del área de micología

2. Alcance.

Es un documento de consulta que sirve de base para que los técnicos del laboratorio de Micología puedan llevar a cabo el diagnóstico e identificación de hongos que afectan a muestras de vegetales o que se encuentran asociados a él.

3. Referencias.

Procedimiento para el Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

Procedimiento de Elaboración y Control de Documentos (PR-RPD-01).

Agrios G.M.1988. Plant Pathology. Academic Press, San Diego.

4. Contenido

4.1.0 Actividades del personal técnico de laboratorio.

4.1.1 Se recibe la muestra y revisa, estado de la misma, en caso que la muestra llegue en estado de descomposición se anota en la bitácora esta situación y no se realiza el diagnóstico, se continúa con el Procedimiento para el Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

4.1.2 Se anota en la bitácora del laboratorio, fecha de ingreso, número de remisión, nombre de la muestra.

4.1.3 Se utilizan los datos anteriores para consultar en las Normas en las que se menciona la planta y en los siguientes compendios de datos electrónicos:

Anónimo. 2003. Crop Protection Compendium, CAB International. UK

Anónimo. 1976. Fitofilo No. 71. Año XXIX. SARH. DGSV. 169 pp.

Con el fin de establecer el rango de hongos fitopatógenos asociados al cultivo y así determinar la forma en que se iniciara el diagnóstico.

4.1.4 La metodología que se aplica para el aislamiento de hongos se define en la siguiente tabla, dependiendo del tipo de muestra y de los hongos asociados a ella.


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Metodología a aplicar para el aislamiento de hongos, con base al tipo de muestra y hongos asociados

Muestra Referencia 4.2.1 Referencia 4.2.2 Referencia 4.2.3 Referencia 4.2.4

Siembra en medio de cultivo sintético y en cámara húmeda

Disección directa

(Solo Con presencia de síntomas y/o signos)

Lavado y tamizado de esporas

Flotación de esclerocios

Follaje frutos X X X

(Cuando se sospeche la presencia de royas o

carbones)

Granos X X

Tubérculos X X

Cormos, Bulbos Raíces

X X

Cereales y granos pequeños

X X X X

(Cuando se sospeche la presencia de

esclerocios)

Semillas X X

Esquejes X X

Sorgo X X

Otros X X X X

Por ejemplo, en antracnósis, tizones, pudriciones radicales, cánceres, roñas y manchas foliares, el patógeno está más activo en el margen de la lesión y de allí se toma la muestra de tejido para realizar la siembra en medio de cultivo y en cámara húmeda. Fragmentos de tallos y ramas son los convenientes cuando hay infecciones vasculares.

4.1.5 El técnico del laboratorio realiza el aislamiento conforme a las técnicas seleccionada y descrita en la sección de técnicas de aislamiento (4,2).

4.1.6 Posteriormente al aislamiento, con las estructuras reproductoras de los hongos el técnico de laboratorio recurre a claves taxonómicas, libros de consulta y de referencias, Internet y/o monografías del cultivo y sus enfermedades o compendios electrónicos de plagas y enfermedades, para ubicar taxonómicamente al hongo u hongos encontrados, la bibliografía básica de un laboratorio de micología se enlista a continuación:

1. CAB International, 2003. Crop Protecction Compendium, Global Module, 2da Edition. Wallingford, UK; CAB International.

2. Romero, C. S. 1993. Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma Chapingo. 347 p.

3. Romero C. S. 1996. Plagas y enfermedades de ornamentales. Universidad Autónoma Chapingo. 244 pp.

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4. Agrios G.N. 1999. Fitopatología. Segunda edición, quinta reimpresión. Ed. Limusa - Grupo Noriega Editores. México. 838 p.

5. Ainsworth, G.C. 1971. Dictionary of fungi. 6th. Ed. Kew, Surrey, England. Commonwealth

Mycological Institute.

6. Alexopoulus J.C., C.W. Mims., M. Blackwell. 1996. Introductory Mycology. John Wiley and Sons. Inc. USA. 869 p.

7. Arthur J.C. and G.B. Cummins. 1962. Manual of plant rusts in United States and Canada. New York. Hafner Publ. Co. 438 p.

8. Barnett H. L. and B.B. Hunter. 1972. Ilustrated genera of imperfect fungi. Third edition. Burgess Publ. Co. 241 p.

9. Booth, C. 1971. The genus Fusarium. Commonwealth mycological institute, Kew, England. 237 p.

10. Chase, A. R. 1987. Compendium of Ornamental Foliage Diseases Plant. American Phytopathological Society.

11. Clements F. E. and Shear C. L. 1964. The genera of fungi. H.W. Wilson Co. New York

12, Mendoza Z.C. 1996. Enfermedades fungosas de hortalizas. Universidad Autónoma Chapingo México.

13. Warham, E.J., L.D. Butler, y B.C. Sutton. 1996. Ensayos para la semilla de maíz y trigo, manual de laboratorio. CIMMYT. 84 p.

14. M. B. Ellis Dematiaceous Hyphomycetes Commonwealth Mycological Institute Kew, Surrey, England 1971.

4.1.7 Concluye la instrucción de trabajo y se continúa en el procedimiento para el diagnóstico

fitosanitario (PR-DFI-01).

4.2.0 Técnicas de aislamiento y disección directa.

4.2.1 Siembra en cámara húmeda y en medio de cultivo sintético para material vegetativo.

Se toma una porción de la muestra y se corta en pequeñas fracciones. (Después de cada corte desinfectar el instrumento de corte).

Estas fracciones se lavan con agua corriente para eliminar el sustrato adherido y se sumergen en NaClO al 1% durante 0.5-1.5 min. para desinfectar la superficie de las mismas, se secan con papel estéril.

La mitad de estas fracciones se colocan en un recipiente cerrado (cajas petri, frascos, bolsas de plástico) con suficiente humedad relativa (se coloca en el fondo del recipiente un papel absorbente estéril y se añade agua estéril al recipiente para facilitar el crecimiento del hongo).

se observa al cabo de tres a cinco días, la otra mitad de fracciones se siembra en condiciones asépticas en medio PDA o en otro medio específico. Estos medios de cultivo se utilizan de manera alterna para complementar el diagnóstico de la cámara húmeda. De esta manera se permite el desarrollo de parásitos no obligados que pueden crecer fuera del hospedante y además se logra desarrollar otras estructuras de los patógenos que no crecen en condiciones de cámara húmeda. Ambas siembras se incuban a 25

oC +2°C

Inducción de la esporulación. La mayoría de los hongos que atacan la parte aérea esporulan abundantemente lo que se puede lograr en cámaras húmedas (24-72 hrs.). Se transfieren de forma directa las esporas o


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cuerpos fructíferos a la cámara húmeda o al medio de cultivo.

Inducción del desarrollo micelial. Los que no esporulan sobre los tejidos y/o se encuentran internamente, se aíslan usando secciones de tejidos internos.

4.2.1.1 Aislamientos de hongos a partir de sustrato

Para el caso en que se desee aislar hongos pero no se cuente con material vegetativo se pueden obtener algunas especies de estos que viven como saprofitos en el sustrato en ausencia de su hospedante.

Se desmorona y mezcla 1 kg. de sustrato (a profundidad de la raíz).

Se hacen submuestras de 100 g y seleccionamos una de ellas.

Con pinzas estériles se transfieren las partículas de sustrato a medio de agua-agar.

Se observa al microscopio.

Se transfiere las estructuras de hongos con aguja flameada al medio fresco.

4.2.2 Disección directa, realizar cortes de estructuras y cuerpos rructíferos en tejidos Enfermos.

Esta técnica es eficiente cuando se necesita conocer la estructura de cuerpos fructíferos como apotecios, peritecios, cleistotecios, pseudotecios, picnidios, acérvulos, ecias, uredias, telias, etc. que se encuentran parcial o totalmente dentro del tejido del hospedante o sobre

las hojas. Los cortes se realizan en material fresco o seco, en fresco se hace el corte directamente, en cambio en el material seco, es necesario reblandecer los tejidos para facilitar la ejecución de los mismos, para esto, se agrega una o dos gotas de alcohol al 70% más una o dos gotas de KOH al 5% sobre el área donde se encuentran las estructuras, se espera dos o tres minutos a que se seque y se procede a cortar.

Se coloca el material bajo el microscopio estereoscópico, y seleccionamos el área con cuerpos fructíferos, con una navaja de rasurar se ejecutan tres cortes iniciales que limitena los cuerpos fructíferos por cortar con el fin de que los siguientes cortes que se hagan para el montaje se obtengan libremente. Colocar el dedo índice izquierdo, junto al área por seccionar sin presionar las estructuras y de manera que al recargar la navaja sobre el dedo y efectuar el corte, éste guíe y regule el espesor del corte. Se hacen varios cortes sobre la estructura debiendo ser completos y lo más delgado posible. Posteriormente se toma con una aguja de disección húmeda y se transfieren al porta objetos con el lactofenol, después de colocar el cubreobjetos, se debe clarificar a la flama hasta eliminar burbujas, posteriormente observar al microscopio compuesto.

4.2.3 Lavado y tamizado de esporas:

Esta técnica abarca:

a) Observación directa (figura1A)

b) Hidrólisis del endospermo (figura 1C)

c) Lavado y tamizado de teliosporas propiamente (figura 2)

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a) La primera técnica consiste en la observación directa de los granos (Figura 1A) para detectar síntomas similares a “punta negra” (Figura 1B), La cual es una mancha obscura en la base del grano y contrario a la hendidura, que puede variar de coloración de café claro a negro. Al localizar los granos dañados, se extraen y se observan en un estereoscopio a 40 aumentos, los granos sospechosos de estar infectados con carbón parcial se abren con una aguja de disección y se observa si contienen teliosporas, en caso contrario se presume que el síntoma de la “punta negra” corresponde a Alternaria spp. o Helminthosporium spp

Figura 1 Granos de trigo infectados con carbón parcial

b) La segunda técnica nos permite detectar infecciones incipientes en granos asintomáticos y consiste en incubar a temperatura ambiente, durante 30 minutos, de 50 a 100 g de trigo remojados en una solución de KOH al 1%. Este tratamiento hidroliza el endospermo, lo hace transparente y nos permite ver las primeras teliosporas que se forman en las infecciones iniciales, esta técnica es especialmente útil en aquellas regiones en las que no se han detectado infecciones de carbones

c) La tercera técnica, nos permite detectar teliosporas que se encuentran sobre los granos, y consiste en agitar durante 30 minutos (figura 2A), de 60 a 100 g de trigo en una solución acuosa, en una cantidad tal que doble el volumen en el matraz, que ocupa los granos de trigo, con unas gotas (3 a 5 ) de detergente para cristalería de laboratorio, como puede ser dextran o tween 20, en caso de que no se disponga de estos productos, se puede utilizar detergente para lavandería, este lavado se vacía sobre un tamiz de 50

. (figura 2B), que a su vez se encuentra sobre otro de 20 micras, en el cual se depositaran las teliosporas, este tamiz de 20 micras se enjuaga sobre un papel filtro que se encuentra en un embudo buchner de ceramica, que a su vez esta sobre un matraz kitazato (figura 2C) conectado a una bomba de vacío, de tal suerte que sobre este papel filtro encontraremos las teliosporas

Figura 2 Proceso de lavado y tamizado de teliosporas

En seguida se observa el papel bajo el estereoscopio a 40 o 50 aumentos y se transfieren las estructuras similares a teliosporas a un portaobjetos, donde previamente se ha colocado una gota de lactofenol azul, se observan bajo el microscopio compuesto a 100 y 400 aumentos para verificar las dimensiones y morfología correspondiente, las cuales son esporas globosas o subglobosas opacas que van de café

claro, a hialinas cuando son inmaduras, a café obscuro al madurar, con dimensiones entre 24 y 47 de


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diámetro cubiertas con una doble membrana, la externa (ocasionalmente ausente) adornada con proyecciones truncas y compactas.

Cabe mencionar que se aplica esta misma técnica para extracción de teliosporas del carbón del enanismo del trigo (Tilletia controversa ), carbón parcial del trigo (T. Indica), carbón del arroz (T. barclayana ) y del carbón común del trigo (T. tritici ) , así como para otros carbones y royas en otros hospedantes.

4.2.4 Flotación de esclerocios

Se prepara una solución salina al 5% y se sumergen alrededor de 100 g de granos de muestra con el fin de que los esclerocios, (en virtud que su densidad es menor que la del grano sano), floten y puedan ser separados manualmente de la muestra.

4.3.0 Montajes, elaboración de soluciones, medios de cultivo y disecciones.

Técnicas de montaje.

Estas técnicas se utilizan de acuerdo a la estructura reproductora del hongo que se desee observar y del medio o parte en que se encuentre el hongo a desarrollar.

a) Montaje de raspado con aguja.

Éste es útil cuando se hacen preparaciones de conidios, conidióforos, cleistotecios, micelio, etc. y en general de estructuras que se desarrollen superficialmente en las lesiones o a partir de cepas que crecen en medio de cultivo.

Colocamos una pequeña gota de agua destilada u otro medio de montaje, por ejempló ponemos una gota de lactofenol en un portaobjetos, se humedece la punta de la aguja en esa gota, la pasamos ligeramente sobre las lesiones, o en el medio de cultivo, y la depositamos en la gota que está sobre el portaobjetos, colocamos el cubreobjetos, y calentamos ligeramente en la flama de una lámpara de alcohol y observamos al microscopio compuesto. La aguja deberá esterilizarse después de cada operación exponiéndolo a la flama.

b) Montaje utilizando cinta adhesiva transparente.

Este método es adecuado en el montaje de estructuras que se desarrollan superficialmente sobre lesiones o en medios de cultivo.

Colocamos una gota de medio de montaje en el portaobjetos, se corta una tira de cinta adhesiva que rebase ligeramente la longitud del portaobjetos, tomar la cinta y doblarla de tal manera que la parte con pegamento toque ligeramente la superficie de la lesión o la cepa en desarrollo en medio de cultivo con el fin de que se adhieran las estructuras que se pretenden montar, luego adherir la cinta a lo largo del portaobjetos de tal manera que las estructuras adheridas queden colocadas sobre la gota de medio de montaje, luego se procede a observar bajo el microscopio compuesto.

c) Medios para montaje.

De esta técnica depende en gran parte la facilidad para la identificación, al permitir que se observen claramente las estructuras deseadas y de ellos depende la preservación de los montajes, ya sean temporales y/o permanentes.

1. Agua destilada. Usado en observaciones preliminares de tejidos enfermos o estructuras de patógenos.

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2. Hidróxido de potasio. Se recomienda cuando las preparaciones se hacen a partir de material seco, ya que el KOH hidrata el material y las estructuras recuperan su tamaño natural, generalmente se usa a concentraciones de 2 al 10% esta solución no debe entrar en contacto con las lentes del microscopio y si lo hace, debe lavarse y limpiarse, ya que el compuesto es

perjudicial y deteriora la lente.

. Agua-glicerina. Consiste de la mezcla de 50cc de agua destilada y 50cc de glicerina se utiliza en montajes temporales y permanentes.

4. Lactofenol. Sirve también como solución fijadora y restauradora del material seco. En nuestro laboratorio es el medio más utilizado para cualquier tipo de montajes

Preparación de soluciones y medios de cultivo.

4.3.1 Medios de cultivo:

Papa dextrosa agar

Papa agar

Agar agua

Harina de maíz –agar

Harina de Frijol-agar

Vainas de Frijol-agua

Jugo de frijol-agua

Jugo V8-agar

Jugo de Tomate-agar

Avena-agar

Extracto de malta-agar

Malta sal-agar

Jugo de tomate Sal-agr

Czapeck-agar

Jugo de zanahoria-agar

4.3.2 Medios de montaje

Agua destilada

Hidroxido de potasio

Agua-gicerina

Lactofenol

Sartory

Glicerina-gelatina

Hoyer

Para realizar todos los medios se utiliza agua estéril, cristalería limpia y esterilizada en horno de calor seco y bajo condiciones de asepsia, se pesan los ingredientes en balanza granatária verificada, y se siguen las instrucciones señaladas en las etiquetas de los reactivos y productos empleados, se esteriliza en autoclave verificada, el vaciado de los medios de cultivo se realiza bajo condiciones asépticas, con la mesa o el gabinete de seguridad biológica previamente desinfectado y con instrumental estéril o flameado al momento de usarlo, los medios de cultivo se acidifican con 10ml de ácido láctico 25% por cada 100ml de medio de cultivo.


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Papa dextrosa Agar (PDA)

Papa 200 gr.

Dextrosa 20 gr.

Agar 15 gr.

Agua Destilada Aforar a 1000 ml.

a) Se utiliza el medio de cultivo sintético al que solo hay que añadirle agua, calentar para disolver y esterilizar o;

b) Se Parten 200 g de papa sin cáscara y se cubren con agua destilada, se dejan hervir durante 15 minutos, concluido este tiempo se cuela la infusión o caldo de papa, a través de una tela de manta de cielo.

c) Se añade el agar en más o menos 500 ml de agua destilada, calentando ligeramente, se le agrega la dextrosa y se mueve hasta disolver.

d) Se añaden a la solución de agar-dextrosa el caldo de papa, mezclando bien y se afora con agua destilada a 1000 ml.

e) Se divide en dos matraces de un litro de capacidad, el medio de cultivo preparado, se coloca en la boca de éstos un tapón de algodón; si se requiere el medio en tubos de ensayo, se agrega a éstos colocando también un tapón de algodón; de esta manera matraces y tubos de ensayo se esterilizan a 15-20 lbs/pulg

2 de presión y 115-125°C durante 20 minutos aproximadamente.

f) Después de que se enfría el medio de cultivo contenido en los matraces y antes de que solidifique, se vacía a las cajas petri, realizando esta operación bajo condiciones estériles. Los tubos de ensayo, inmediatamente después de la esterilización, se colocan en posición inclinada hasta que solidifique el medio.

Papa dextrosa (PD)

Dextrosa 20 g.

Agua destilada Aforar a 1000 ml.

Papa 200g.

a) La preparación es similar al del PDA, difiere este medio en que no contiene agar y queda en estado líquido. Se utiliza en matraces de diferente capacidad en donde se esteriliza directamente

Agua agar (AA9)

Agar 15 g.


a) Se disuelve el agar en el agua destilada calentando ligeramente

b) Se afora con agua destilada a 1000 ml y se esteriliza

c) Es un medio de cultivo pobre en nutrientes, sirve para inducir la esporulación de ciertas especies de hongos que en otros medios de cultivo, ricos en nutrientes solo crecen vegetativamente, también se recomienda utilizarlo en aislamientos de hongos del suelo, ya que por su pobreza en nutrientes se inhibe

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el desarrollo de contaminantes, como en aislamientos del género Pythium. Este medio se utiliza también para el aislamiento de Actinomycetes.

Harina de maíz-agar

Harina de maíz 20 g.

Agar 20 g.

Peptona (opcional) 20 g.

Dextrosa (opcional) 20 g.


a) En 500 ml de agua destilada a la temperatura de 70°C, agregar la harina de maíz y calentar por una hora a 60°C.

b) Filtrar la infusión a través de manta de cielo, clarificar la solución filtrada.

c) Centrifugar durante 20 minutos a 3000 rpm.

d) Decantar y juntar el líquido sin sólidos producto de la centrifugación.

e) Disolver el agar, la dextrosa y la peptona en 300 ml de agua destilada, calentando ligeramente.

f) Añadir el líquido centrifugado a la solución de agar dextrosa peptona y aforar con agua destilada a 1000 ml

e) Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento de Phytophthora cinnamomi, ya que estimula la producción de esporangios

Harina de frijol-agar

Harina de fríjol 30 g.

Agar 20 g.


a) En 500 ml de agua destilada, se agrega 30 gr de harina de fríjol, calentar la solución a una temperatura de 60-70°C para disolver.

b) Se filtra la infusión a través de manta de cielo, clarificar la solución filtrada, centrifugando durante 20 minutos a 3000 rpm. Aproximadamente.

c) Se decanta y junta el líquido sin sólidos, producto de la centrifugación.

d) Se disuelve el agar en 300 ml de agua destilada, calentando ligeramente; y se añade al líquido centrifugado la solución de agar, mezclando bien, finalmente se afora con agua destilada a 1000 ml.

e) Es un medio de cultivo específico para el género Phytophthora, se utiliza para induir la formación de esporangios de P. cinnamomi. Después de ocho días de desarrollo del hongo, se transfieren discos del

medio de cultivo con micelio del hongo a extracto de suelo no estéril para que se formen los esporangios. También se utiliza para inducir la producción de zoosporas de P. fragariae.


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Vainas de frijol- agar

Vainas de fríjol 200-250 grs.

Agar 15 g.


a) En 500 ml de agua destilada se agrega las vainas verdes partidas o el polvo de vainas secas, se disuelve calentando de 50-60°C durante 30 minutos

b) Se filtrar la infusión a través de manta de cielo y papel filtro.

c) Se disuelve el agar en 300 ml de agua destilada calentando ligeramente.

d) Se añade a la infusión filtrada, la solución de agar, mezclando bien, y se afora con agua destilada a 1000 ml.

Jugo de frijol-agar

Jugo de frijol, proveniente de vainas molidas 215 ml.

Agar 10 g.

Agua destilada 285 ml.

a) Se obtiene el jugo de fríjol, prensando o moliendo las vaínas verdes, se disuelve el agar en 285 ml de agua destilada, calentando ligeramente.

b) Se añade la solución de agar al jugo de fríjol y se esteriliza.

c) Este medio de cultivo se recomienda para desarrollar e inducir la esporulación de Colletotrichum lidemuthianium.

Jugo V8-agar

Jugo de verduras V-8 Centrifugado (150 ml) 100 ml.

CaCO3 2 g.

Agar 15 g.


a) se centrifuga el jugo de verduras V-8, y se recupera de la fase superior 100 ml.

b) Se disuelve el agar en más o menos 500 ml de agua destilada, calentando ligeramente, se le agrega el jugo de verduras, mezclando bien y se afora con agua destilada a 1000 ml.

c) Se divide en dos matraces de un litro de capacidad, el medio de cultivo preparado, se le coloca en la boca de éstos un tapón de algodón; si se requiere el medio en tubos de ensayo, se agrega a éstos colocando también un tapón de algodón; de esta manera matraces y tubos de ensayo se esterilizan a 15-20 lbs/pulg

2 de presión y 115-125°C durante 20 minutos aproximadamente.

d) Después de que se enfría el medio de cultivo contenido en los matraces y antes de que solidifique, se vacía a las cajas petri, realizando esta operación bajo condiciones estériles. Los tubos de ensayo, inmediatamente después de la esterilización, se colocan en posición inclinada hasta que solidifique el medio.

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Jugo tomate-agar

Jugo de tomate Centrifugado (90 ml) 60 ml.

CaCO3 0.6 g.

Agar 14 g.


a) Este medio se prepara de igual forma al jugo de verduras V-8 agar, solamente que en este caso se

trata de jugo de tomate. Se procede a esterilizar como en jugo agar V-8.

Avena-agar

Avena 60 g.

Agar 12 g.

Extracto de levadura 2 g.


a) Este medio y los siguientes se elaboran y esterilizan como en jugo agar V-8.

Extracto de malta agar

Extracto de malta 20 g.

Dextrosa 20 g.

Peptona 1 g.

Agar 20 g.


Malta sal-agar

NaCl (sal) 75 g.

Agar 15 g.

Extracto de malta 20 g.


Jugo de tomate sal-agar

Jugo de tomate agar (medio deshidratado) 25.5 g.

NaCl (sal) 100 g.

Agar 15 g.



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Czapek-agar

Peptona 15 g.

Fosfato di-ácido de potasio (KH2PO4) 1 g.

Agar 20 g.

Sulfato de magnesio (MgSO4) 0.5 g.

P.C.N.B. P.H 75% 1 g.

Sulfato de estreptomicina.5 g de sulfato x 100 ml de agua 20 ml.

Sulfato de neomicina 1g de sulfato x 100 ml de agua 12 ml


Jugo de zanahoria-agar

Jugo de zanahoria 125-750 ml.

Agar 15 g.

Estreptomicina 100 mg.


Medios de montaje

Agua destilada: Se usa principalmente para efectuar observaciones preliminares de tejidos enfermos o estructuras de los patógenos. Debe estar libre de sedimentos y renovarse periódicamente. El método consiste en colocar una pequeña gota en el porta objetos, después se le agrega el material por examinar y se cubre con cinta adhesiva o cubreobjetos. Este procedimiento es similar para la mayoría de los medios de montaje.

Hidróxido de potasio: El hidróxido de potasio es uno de los compuestos químicos usados para preparaciones microscópicas y se recomienda especialmente cuando estas preparaciones se hacen de material seco, puesto que el KOH tiene la capacidad de hidratar y con esto las estructuras recuperan su tamaño natural. Se recomienda usarlo a concentraciones del 2-10 %. Debido a que las soluciones del KOH forman un precipitado floculento se recomienda pasarlas a través de papel filtro del No.1, además de esto las soluciones deben renovarse periódicamente. Puesto que el compuesto es perjudicial a las lentes del microscopio, éstas no deben entrar en contacto con la solución de KOH. Si llegaran a entrar en

contacto, inmediatamente deben lavarse y limpiarse.

Agua-glicerina: Es un medio muy usado en montajes temporales y permanentes. Consiste en una mezcla de 50 cc., de agua destilada y 50 cc., de glicerina, si se desea pueden adicionarse unas gotas de colorante.

Lactofenol: Además de utilizarse como medio de montaje, actúa como solución fijadora y restaura la turgencia del material seco. Es este un excelente medio para montajes temporales y permanentes.

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Fenol (cristales) 20 g.

Acido láctico 20 ml.

Glicerina 40 ml.


a) Para obtener una mezcla rápida conviene calentar ligeramente, hasta disolver los cristales de fenol, agregar la glicerina y el ácido láctico. Se puede agregar como colorante azul de algodón, en la cantidad de 0.1 g-0.005 g/100 ml de lactofeno.l

Medio de Sartory: Este medio es útil en montajes permanentes y temporales.


Acido láctico 20 ml.

Glicerina 40 ml.


Glicerina – gelatina: Este medio se recomienda únicamente para montajes temporales debido a que solo dura alrededor de 6 meses.


Glicerina pura 50 ml.


Gelatina 7 g.

Eritrosina en 9 ml de agua destilada 1 g.

a) Todos los ingredientes a excepción de la eritrosina se calientan hasta que se disuelven, se prepara por separado una solución de 1 g de eritrosina en 9 ml de agua destilada. Después se adiciona la solución de eritrosina a la mezcla con los demás ingredientes, antes de enfriarse.

b) Este medio de montaje se utiliza colocando una pequeña cantidad del medio solidificado en un portaobjetos, se calienta con una lámpara de alcohol hasta derretirlo, luego se agrega el material por examinar, se coloca un cubreobjetos y se vuelve a calentar con el fin de eliminar las burbujas de aire.

Medio Hoyer: Se emplea en montajes permanentes.

Goma arábiga 30 g.

Glicerina 20 ml.

Hidrato de cloral 200 g.


a) Se agrega la goma arábiga en lágrimas al agua destinada para el medio, se deja remojando por 24 horas y luego se calienta a no más de 50°C hasta su dilución cuando se emplea goma arábiga purificada se disuelve de inmediato. Si la solución no resulta clara, después se agrega el hidrato de cloral y la glicerina a la solución filtrada.


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4.4. Listado de instrucciones de trabajo:

No. Documento

1 IT-MIC-02 Instrucción de trabajo para uso y verificación de la calibración de autoclave.

2 IT-MIC-03 Instrucción de Trabajo para uso y verificación de la calibración de Horno eléctrico.

3 IT-MIC-04 Instrucción de trabajo para uso y verificación de la calibración de Incubadora

4 IT-MIC-05 Instrucción de Trabajo Para uso y verificación de la calibración de Potenciómetro.

5 IT-MIC-06 Instrucción de Trabajo para uso y verificación de la calibración de Balanza Analítica.

6 IT-MIC-07 Instrucción de Trabajo para uso de Microscopios.

7 IT-MIC-08 Instrucción de Trabajo para uso y verificación de la calibración de termómetros de laboratorio.

5. Registros:



1 Bitácora de registro de muestras de laboratorio de micología.


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5. Anexos

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6. Historial de cambios:

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Instrucción de trabajo de nematología 1. Propósitos.

Describir los diferentes procedimientos analíticos empleados para la detección e identificación de

nematodos fitopatogenos.

2. Alcance.

Esta instrucción de trabajo solo aplica para la detección e identificación de nematodos que atacan a

vegetales y sus productos y al laboratorio de Nematología del Centro Nacional de Referencia

Fitosanitario (CNRF). No abarca a los nematodos que afectan a humanos y animales.

3. Referencias.

Procedimiento para diagnostico fitosanitario (PR-DFI-01).

Procedimiento para elaboración y control de los documentos (PR-RPD-01). 4. Contenido. a. Procedimiento: Técnicos de laboratorio/apoyo técnico.

1. recibe muestras, verifica que contenga los siguientes datos: Número de muestra, origen, número de remisión, producto, origen y tipo de análisis. Si los datos no coinciden no se recibe. Verifica que la muestra no se encuentre en estado de descomposición.

2. Registra en la bitácora del laboratorio de Nematología.

3. Si la muestra presenta estado de descomposición, no se procesa, se registra en bitácora y se contesta en la base de datos como muestra en mal estado. Continua conforme a lo establecido en el procedimiento para diagnostico fitosanitario (PR-DFI-01).

4. Las muestras en buen estado se conservan a 8 5 °C.

5. En base al tipo de producto y tipo de nematodos asociados a este producto vegetal se revisa en normas oficiales mexicanas (NOM), así como Normas Regionales de Medidas Fitosanitarias (NRMF) para identificar qué tipo de nematodos se deben detectar; dichas NOM y NRMF son: Norma Oficial Mexicana NOM-007-FITO-1995, por la que se establecen los requisitos fitosanitarios y especificaciones para la importación de material vegetal propagativo. Norma Oficial Mexicana NOM-008-FITO-1995, por la que se establecen los requisitos y especificaciones fitosanitarios para la importación de frutas y hortalizas frescas. Norma Oficial Mexicana NOM-009-FITO-1995, por la que se establecen los requisitos y especificaciones fitosanitarios para la importación de flor cortada y follaje fresco.


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Norma Oficial Mexicana NOM-010-FITO-1995, por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas del plátano. Norma Oficial Mexicana NOM-011-FITO-1995, por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas de los cítricos. Norma Oficial Mexicana NOM-012-FITO-1996, por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas de la papa. Norma Oficial Mexicana NOM-013-FITO-1995, Por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas del arroz. Norma Oficial Mexicana NOM-014-FITO-1995, Por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas del algodonero. Norma Oficial Mexicana NOM-017-FITO-1995, Por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas del trigo. Norma Oficial Mexicana NOM-018-FITO-1995, Por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas del maíz. Norma Oficial Mexicana NOM-025-FITO-2000. Para el establecimiento de zonas bajo protección y zonas libres de plagas cuarentenarias de la papa. Norma Oficial Mexicana NOM-040-FITO-2002. Requisitos y especificaciones para la producción y movilización nacional de papa comercial. Norma Oficial Mexicana NOM-041-FITO-2002. Requisitos y especificaciones fitosanitarios para la producción de material propagativo asexual de papa. NRMF # 3 Requisitos para la importación de papas hacia un país miembro de la NAPPO. NRMF # 15 Directrices para la importación de vides en los países miembros de NAPPO. 6. Determina las técnicas de aislamiento conforme a la biología y hábitos de los nematodos asociados. Detalladas en Instrucción de trabajo para aislamiento de nematodos fitopatógenos (IT-NEM-02)

Aislamiento de Nematodos filiformes de follaje (Nematodos foliares).

Aislamiento de Nematodos filiformes de partes subterránea (raíces, cormos, bulbos, cutícula de tubérculos, etc.).

Aislamiento de Nematodos filiformes de raíces y suelo.

Aislamiento de Nematodos filiformes (Anguinidos) que forman agallas en semillas: semillas de trigo y pasto.

Aislamiento de Nematodos filiformes que se transmiten por semilla.

Aislamiento de Nematodos formadores de quistes de suelo.

Aislamiento de Nematodos formadores de quistes de tubérculos.

Aislamiento de Nematodos formadores de agallas en raíces

Aislamiento de Nematodos formadores de agallas en tubérculos

Aislamiento de Nematodos formadores de agallas en partes subterráneas de plantas (cormos, rizomas, tubérculos, etc.).

Aislamiento de Nematodos filiformes por el método del Elutriador de Oostenbrik.

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7. Prepara espécimen y correr claves conforme a lo establecido en la instrucción de trabajo Instrucción de trabajo para el uso de claves taxonómicas para la identificación de nematodos fitopatógenos (IT-NEM-03). 8. En caso de detectar Meloidogyne chitwoodi o Globodera rostochiensis y si cuenta con los ejemplares suficientes, se procede a realizar la corroboración de este resultado por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Según Instrucción de trabajo para PCR de Nematodos (IT-NEM-04). 9. Registrar el resultado en la bitácora y en la base de datos imprimir dictamen, rubricar y entregar a recepción de muestras. Continua conforme a lo establecido en el procedimiento para diagnostico fitosanitario (PR-DFI-01).

a) Listado de instrucciones de trabajo.

Instrucción de trabajo para aislamiento de nematodos fitopatogenos (IT-NEM-02)

Instrucción de trabajo para el uso de claves taxonómicas para la identificación de nematodos fitopatogenos (IT-NEM-03).

Instrucción de trabajo de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la Detección de Nematodos Fitopatógenos (IT-NEM-04).

1. Registros:



2. Anexos:

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Instrucción de trabajo para diagnostico de virus

1. Propósito.

Describir las etapas para realizar el diagnóstico fitosanitario a Virus Fitopatógenos.

2. Alcance.

Aplica a todas aquellas muestras vegetales que ingresen al Laboratorio de Virus Fitopatógenos; considerando la normatividad nacional.

3. Referencias.

Procedimiento para Diagnóstico Fitosanitario (PR-DFI-01).

Procedimiento de Elaboración y Control de documentos (PR-RP-01).

4. Contenido.

Actividades:

(Personal técnico de laboratorio)

4.1 Descripción de la técnica.

1) Recibe y registra en bitácora de registro de muestras para el Laboratorio de Virus Fitopatógenos el número de control que acompaña a la muestra. Si la muestra ingresa después de las 13:00 hrs. Analiza hasta el siguiente día en consecuencia se almacena ya sea en agua o en el refrigerador.

2) Revisa que la muestra se encuentre en buen estado. Si la muestra no se encuentra en las condiciones requeridas para su análisis, registra en bitácora, reportándola en mal estado en la base de datos general, procede conforme a la Instrucción general de Diagnóstico Fitosanitario. Si la muestra se encuentra en buen estado continúa el proceso normal de diagnóstico.

3) Revisa que la muestra cuente con los siguientes datos: Especie vegetal, tipo de estructura vegetal (plantas, tallos, corteza, tubérculos, polen etc.) y origen del producto. Consulta las Normas Mexicanas Fitosanitarias correspondientes y determina que virus fitopatógeno de importancia cuarentenaria está asociado al producto.

4) Revisa la lista de antisueros disponibles. Si se encuentra en existencia realiza la prueba de ELISA (Instrucción de trabajo para diagnostico de virus mediante la prueba de ELISA (IT-VIR-02). En caso de que no exista el antisuero, pasa al paso 8.

5) Obtiene un resultado, si el resultado es negativo, imprime el dictamen y lo entrega al responsable de recepción de muestras terminando en este punto la instrucción de trabajo. Si la muestra resulta positiva, corre otra vez la prueba de ELISA. En caso de resultados diferentes realiza otra vez la prueba y por similitudes en las pruebas obtiene resultados, captura en la base de datos general y procede conforme a la Instrucción General de Diagnostico Fitosanitario, terminando en este punto la instrucción de trabajo para el laboratorio de virología.

6) En caso de resultado positivo para el virus PVY N (Virus Y de la papa variante necrosis de la

nervadura del tabaco) mediante la prueba de ELISA y en especies solanaceas (papa, chile, tomate y tomate verde), realiza la prueba de la Reverso Transcriptasa Reacción en Cadena de la Polimerasa RT-PCR) (Instrucción de trabajo para Diagnóstico de Virus mediante RT-PCR (IT-VIR-03).

Producto 7

48

Pro

toco

los d

e d

iagn

óstico

7) Si la prueba de RT-PCR resulta positiva o negativa, captura resultado en la base de datos general, procede conforme a la Instrucción General de Diagnóstico Fitosanitario, terminando en este punto la instrucción de trabajo para el laboratorio de virología.

8) Viene del punto 4, si no se cuenta con antisuero, consulta información en bases de datos de plagas o internet, investiga asociación al producto de virus a nivel taxonómico de familia (potyvirus), en caso de encontrar información de asociación a nivel de familia, realiza la prueba de ELISA para este grupo de virus (Instrucción de trabajo para Diagnóstico de virus, mediante la prueba de ELISA) (IT-VIR-02).

9) Obtiene resultado procede conforme a la Instrucción General de Diagnóstico Fitosanitario terminando la instrucción de trabajo.

1 Registros:



1 Bitácora (s/c) Técnico de laboratorio 5 años/destrucción

2 Anexos:

No. Documento Clave

1

2

3

3 Historial de Cambios:

Revisión Páginas afectadas Motivos y breve descripción del

cambio

NOTA: “Para el caso especifico de alguna plaga consultar las fichas técnicas contenidas

en el producto cuatro en el encabezado de identificación y detección.”

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