SISTEMA EXPERIMENTAL DE FITORREMEDIACIÓN A ESCALA DE

LABORATORIO PARA LA REMOCIÓN DE CROMO HEXAVALENTE (CrVI) Y

MATERIA ORGÁNICA (MO) EN AGUAS RESIDUALES SINTÉTICAS

MEDIANTE EL CULTIVO DE Lemna minor

ERIKA DEL CARMEN GÓMEZ RIOS

LUISA FERNANDA BALLESTEROS CANIZALES

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTADER

FACULTAD DE INGENIERÍAS FISICOQUÍMICAS

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA

BUCARAMANGA

2014

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SISTEMA EXPERIMENTAL DE FITORREMEDIACIÓN A ESCALA DE

LABORATORIO PARA LA REMOCIÓN DE CROMO HEXAVALENTE (CrVI) Y

MATERIA ORGÁNICA (MO) EN AGUAS RESIDUALES SINTÉTICAS

MEDIANTE EL CULTIVO DE Lemna minor

ERIKA DEL CARMEN GÓMEZ RIOS

LUISA FERNANDA BALLESTEROS CANIZALES

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de

Ingeniero Químico

Director

Prof. Luis Javier López Giraldo

Co-director

Prof. Andrés Fernando Barajas

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERÍAS FISICOQUÍMICAS

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA

BUCARAMANGA

2014

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4

5

6

7

DEDICATORIA

Nunca pensé que plasmar tantos años en este papel me moviera tantos

sentimientos.Ante todo le doy Gracias a Dios, por protegerme, bendecirme e

iluminarme cada día, por darme fuerzas cada vez que sentía desfallecer, por ser

mi guía y mi luz al darme la felicidad de cumplir uno de mis grandes sueños.

A mi papá, Eliecer Gómez Rivera, por ser uno de mis motores para seguir día a

día, por ser mi amigo, mi cómplice, por apoyarme incondicionalmente y estar en

los momentos más difíciles de mi vida para ti también es este triunfo. Te amo.

A mi hermano, Edwin Eliecer Gómez Rios, por ser una motivación para querer

seguir en este camino, porque eres uno de los regalos más bonitos que mi Dios

me ha regalado. Te amo.

A mi mamá, Maritza Ríos Beltrán,desde el cielo siempre me ha dado la

bendición, sabiduría y fuerza para seguir y ser cada día mejor.

A mi abuela, Carmen Rivera, que gracias a sus bendiciones mi vida ha sido más

fácil, sé que desde el cielo aun sigues orando por mí.

A toda mi familia especialmente a mi tia Elizabeth Gomez, por estender el brazo y

darmeel apoyo cuando más lo necesite, a mis tíos, primos y sobrina gracias y

muchas gracias por estar incondicionalmente en este camino y sus buenos

deseos.

A mi novio, Diego Fernando Villamizar Rincón,por ser mi compañero, confidente

y amigo. Por su comprensión, ayuda incondicional y haciendo cada día especial e

inolvidable. Te amo.

A mi compañera de proyecto,Luisa Fernanda Ballesteros, porque sé que día a

día trato de dar lo mejorpara la culminación de este proyecto. Muchas gracias.

A todas las personas que contribuyeron a la realización de este trabajo.

Erika Gómez Rios.

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DEDICATORIA

En el transcurso de mi vida he tenido la fortuna de contar con personas

maravillosas que me han apoyado y acompañado; hoy quiero darles las gracias

por formar parte de ella y porque son mi mayor bendición.

Para ti Dios,porque me diste la vida, fortaleza y salud necesaria para culminar

este logro. Eres mi luz, verdad y camino.

Para ti mamáAleida Canizales, por estar siempre junto a mí, tus buenos consejos

y caminar conmigo en los momentos difíciles. Sin tu dulzura y amor no hubiera

sido capaz. Por eso hoy digo y no me equivoco que eres la mejor madre del

mundo y jamás tendré como pagarte cada uno de tus esfuerzos. Te amo.

Para ti padre Rafael Ballesteros, quiero agradecerte por todo lo que eres y has

sido conmigo, tus enseñanzas son mi mayor tesoro,tú eres mi ejemplo a seguir y

esas huellas que has dejado en mi corazón jamás se borrarán. Gracias padre por

ser mi maestro de vida. Te amo y eres el mejor padre del mundo.

Para ti hermanito Camilo Ballestros, mi amor eres el mejor regalo que Dios me

ha dado, gracias por ser mi mejor amigo, por tu cariño, confianza y apoyo infinito.

Te amo.

Para mi novio Emerson Céspedes, porque llegaste a mi vida y eres un motivo de

alegría. Gracias por tu apoyo y sobre todo por tus enseñanzas y amor.

Para toda mi familia tíos,primos y mi abuelita Ruth gracias por ser

incondicionales y por todo el apoyo que me han brindado.

Para mis amigos, que siempre me brindarán una palabra de aliento, ayudaran de

una forma desinteresada y de los cuales aprendí mucho: Nathaly, Liceth, Vanesa,

Jonathan, Víctor y Sergio.

Y a ti Erika del Carmen Gómez Rios, porque sé que no fue fácil y juntas

pasamos obstáculos. Gracia por todo.

Luisa Fernanda Ballesteros Canizales.

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AGRADECIMIENTOS

Los autores agradece a:

Al Dr. Luis Javier López, por que más que un profesor es un amigo, por

regalarnosparte de su conocimiento y sabiduría.

A nuestro codirector Andrés Barajas,por su orientación y colaboración.

Al Ingeniero Guillermo, por su apoyo y paciencia.

Al Ingeniero Químico, Said Toro Uribe, por su colaboración, apoyo, orientación y

por brindarnos su tiempo.

A la Ingeniera Mónica Carreño, gracias por su entrega y persistencia.

A los técnicos de laboratorio Eduardo y Wilson por facilitar la estadia en el

laboratorio y hacer que las practicas fueran mas sencillas.

Al laboratorio de Biomasa por su colaboración con los equipos e instalaciones.

10

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 17

2. METODOLOGÍA ............................................................................................. 23

2.1 REACTIVOS ................................................................................................... 24

2.2 MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO .......................................... 24

2.3 DISEÑO EXPERIMENTAL ....................................................................... 24

2.3.1 FASE DE ADAPTACIÓN DE LA PLANTA ............................................ 24

2.3.2 MEDIO DE CULTIVO ............................................................................ 25

2.4 DETERMINACIÓN DE LA INFLUENCIA DE LOS FACTORES Cr, AH y

BIO SOBRE LA CAPACIDAD DE LA LEMNA MINOR A REMOVER Cr y MO .. 25

2.5 DESARROLLO EXPERIMENTAL ............................................................ 25

2.6 EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO ........................................................ 26

2.7 AJUSTE DE PARÁMETROS CINÉTICOS ............................................... 26

2.8 DETERMINACIÓN DE CROMO HEXAVALENTE ................................... 26

2.9 ANÁLISIS DE DQO PRESENTE EN EL AGUA RESIDUAL .................... 27

2.10 CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE REMOCIÓN ................................. 27

2.11 DETERMINACIÓN DE LAS MEJORES CONDICIONES PARA LA

REMOCIÓN ....................................................................................................... 27

2.12 CINÉTICA ............................................................................................. 27

3. ANÁLISIS DE RESULTADOS ....................................................................... 28

3.1 DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE REMOCIÓN ........................ 28

3.2 DISEÑO EXPERIMENTAL ....................................................................... 28

3.3 CONDICIONES FAVORABLES DE REMOCION DE CROMO

HEXAVALENTE ................................................................................................. 31

3.4 CINÉTICA ................................................................................................ 32

3.5 CRECIMIENTO DE BIOMASA ................................................................. 32

3.6 CÁLCULO DE PARÁMETROS CINÉTICOS ............................................ 33

4. CONCLUSIONES ........................................................................................... 36

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 37

ANEXOS ............................................................................................................... 40

11

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Caracterización para una central térmica. .......................................... 17

Tabla 2. Proceso de remoción de materiales pesados con macrófilas

acuáticas. ............................................................................................................. 20

Tabla 3. Proceso de remoción de materia orgánica con macrófilas acuáticas

.............................................................................................................................. 21

Tabla 4. Puntos experimentales obtenidos empleando un diseño

experimental de Box-Behnken. .......................................................................... 25

Tabla 5. Resultados del análisis estadístico (Análisis de varianza ANOVA). 29

Tabla 6. Evolución de la Biomasa, Cromo Hexavalente y DQO en función del

tiempo a condiciones favorables (Cr VI: 1.625 mg/L; AH: 160mg/L; BIO: 45

plantas)................................................................................................................. 33

Tabla 7. Parámetros cinéticos de la remoción de Cr VI ajustados a un

modelo lineal y de Monod. .................................................................................. 35

12

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Descripcion global de las etapas secuenciales ................................ 23

Figura 2.Curva de calibración para la determinación de remoción de Cr VI a

partir de Lemna Minor. ........................................................................................ 28

Figura 3. Porcentaje de remoción en función del AH vs Cr a BIO= 65 ........... 30

Figura 4. Porcentaje de remoción en función de BIO vs CR a AH=85 ............ 30

Figura 5. Porcentaje de remoción en función de AH vs BIO a Cr= 1,25 ......... 30

Figura 6. Curva de crecimiento celular de la microalga Lemna Minor a

condiciones de Cr VI: 1.625 mg/L; AH: 160mg/L y BIO: 45 plantas. ............... 33

13

LISTA DE ANEXOS

Anexo A. Determinación de cromo hexavalente (CrVI).…………..... 40

Anexo B. Datos experimentales ......................................................................... 41

Anexo C. Medio Bold Basal ................................................................................ 42

Anexo D. Diagrama de pareto para efectos estandarizados ........................ 443

Anexo E. Cálculos de parámetros cinéticos… ………………...44

14

LISTA DE ABREVIATURAS

AH Acido Húmico

BIOBiomasa (Lemna minor)

Cr Cromo

Cr VI Cromo Hexavalente

MO Materia Orgánica

15

RESUMEN

TITULO: SISTEMA EXPERIMENTAL DE FITORREMEDIACIÓN A ESCALA DE LABORATORIO PARA LA REMOCIÓN DE CROMO HEXAVALENTE (CrVI) Y MATERIA ORGÁNICA EN AGUAS RESIDUALES SINTÉTICAS MEDIANTE EL CULTIVO DE Lemna minor

*

AUTORES: ERIKA DEL CARMEN GÓMEZ RIOS, LUISA FERNANDA BALLESTEROS

CANIZALES**

PALABRAS CLAVES: Biorremoción, aguas residuales, metales pesados, materia orgánica, macrófitas. El cromo, es un metal pesado que se encuentra en los efluentes de las centrales térmicas y otras industrias asociadas, por esta razón es uno de los principales contaminantes de los recursos hídricos que poseemos. Este metal puede alterar seriamente el equilibrio biológico causando efectos tóxicos tanto en plantas como en animales, ya que es rápidamente absorbido por las membranas biológicas. En consecuencia, el objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de remoción de cromo hexavalente (Cr VI) y materia orgánica (MO) usando un proceso de fitorremediación empleando la macrófita Lemna minor. De esta manera, el trabajo se desarrolló en diversas etapas; en la primera de ellas se realizó la fase de adaptación de la planta y el medio de cultivo. Posteriormente, se implementó un diseño Box-Behnken 2

3 + compuesto central rotable para evaluar la influencia de la concentración de

cromo, materia orgánica y la biomasa sobre la capacidad de la Lemna minor de llevar a cabo el proceso de biorremoción de Cr VI y MO en un ambiente controlado. El modelo de regresión de segundo orden con un R

2 ajustado del 0.91792% predice una remoción teórica de 52.71% y

experimentalmente de 54.24%, para las condiciones de 1.625 mg/L Cr VI, 160 mg/l Acido humico y 45 plantas para la biomasa. A estas condiciones, se realizó el estudio cinético para finalmente ajustar los parámetros cinéticos a un modelo lineal y de Monod.

* Trabajo de grado.

** Factultad de Ingenierías Físico-Químicas. Escuela de Ingeniería Química. Director: Ph.D. Luis

Javier López Giraldo. Codirector: Biol. Andrés Fernando Barajas

16

ABSTRACT

TITLE: PHYTOREMEDIATION EXPERIMENTAL SYSTEM FOR LABORATORY SCALE REMOVAL hexavalent chromium (Cr VI) AND ORGANIC MATTER IN SYNTHETIC WASTEWATER BY GROWING Lemna minor

*

AUTHORS: ERIKA DEL CARMEN GÓMEZ RIOS, LUISA FERNANDA BALLESTEROS

CANIZALES**

KEYWORDS: Bioremoval, sewage, heavy metals, organic matter, macrophytes. Chromium is a heavy metal found in effluents from thermal power plants and other related industries, for this reason it’s one of the main pollutants of water resources we have.This metal can seriously alter the biological balance causing toxic effects in both plants and animals, as it’s quickly absorbed by biological membranes.Consequently, the aim of this study was to evaluate the removal capacity of hexavalent chromium (Cr VI) and organic matter (OM) using a phytoremediation process employing the macrophyte Lemna minor. In this way the work was developed in several phases, the first one, the adaptation phase of the plant was performed and the culture medium.Subsequently, a Box-Behnken 23 + central composite rotatable design was implemented to evaluate the influence of the chromium concentration, organic matter and biomass on Lemna minor capacity to perform the process of Cr VI bioremoval and MO a controlled environment.The regression model of second order with an adjusted R

2 of 0.91792%

predict a theoretical removal of 52.71% and 54.24% experimentally, for the conditions of 1,625 mg / L Cr VI, 160 mg / lhumic acid and 45 for biomass plants.In these conditions, the kinetic study was performed to finally adjust the kinetic parameters of a linear model and Monod.

* Degree work

** Factultad of Physico-Chemical Engineering. School of Chemical Engineering. Directed Ph.D. Luis

Javier López Giraldo. Co-Director: Andrés Fernando Barajas Biol

17

INTRODUCCIÓN

En las termoeléctricaslaproducción de energía hace uso de recursos hídricos,

generando residuos altamente tóxicos que finalmente serán vertidos a las cuencas

y ríos. Estos residuosantes de ser dispuestos al medio ambiente, deben ser

tratados para cumplir las normas ambientales y garantizar que no afecten,tanto a

la sociedad como al medio ambiente presentes en las cercanías de estas

corrientes hídricas.

Durante el tratamiento de las aguas residuales se generan lodos que contienen

contaminantes como patógenos, metales pesados y tóxicos orgánicos, lo que

podría provocar la contaminación del aire, suelo y acuíferos. En Colombia, los

criterios utilizados para establecer los límites de concentración de contaminantes y

disposición final se encuentran en las Normas de Vertimiento de Residuos

Líquidos: Decreto 1594 de 1984 del Ministerio de Ambiente.

En las aguas residuales de una termoeléctrica,existe presencia de metales

pesados procedentes de las materias primas empleadas en el proceso industrial

(Tabla 1), también se cuenta con la presencia de materia orgánica en suspensión

y disuelta, que es la responsable de la aparición de malos olores y espumas del

aumento de la Demanda Química de Oxígeno (DQO) (Alvarado et al., 2008).

Tabla 1. Caracterización para una central térmica.

Parámetro Concentración Carga

pH <4,5 y >9,0 <4,5 y >9,0 Temperatura >40°C >40°C Sólidos suspendidos totales 200 mg/l 50.00 Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO)

400 mg/l 100,00

Grasas y aceites 200 mg/l 50,00

Caudal 250 m3/d

Fuente: (Ministerio de ambiente, 1997)

18

A pesar de la capacidad de autodepurarse de los ríos y efluentes, existen diversos

contaminantes que al superar niveles críticos no pueden ser degradados, tales

comoefluentes con altos contenidos de materia orgánica y metales pesados.

El cromo hexavalente (Cr VI) es considerado un metal pesado, tóxico en altas

concentraciones que afecta la salud humanaocasionando malformaciones

genéticas y graves enfermedades como erupciones cutáneas, problemas

respiratorios, daños en los riñones e hígado, cáncer de pulmón y muerte. Este

contaminante, también afecta a los animales causándoles problemas respiratorios,

defectos de nacimiento, infertilidad y formación de tumores (Alarcón, 2009). Por

las razones expuestas, es importante proponer alternativas económicas y eficaces

para su remoción.

En la actualidad hay varios métodos fisicoquímicos, que permiten la remoción de

metales pesados en aguas residuales como son la precipitación, ultrafiltración,

nanofiltración, ósmosis inversa yelectrodiálisis. No obstante, la mayoría de estos

métodos no permiten la eliminación del metal por completo, son pocos

eficientes,altamente demandantes en términos energéticos y requieren de altas

concentraciones de productos químicos.

Por otro lado, el término de biorremediaciónfue acuñado en las décadas de los

80´donde se inició a emplear procesos en los que se utilizan microorganismos

(microalgas, hongos, bacterias) y plantas macrófitas (Di Paola y Vicién, 2010)

Dentro de la biorremediación se encuentra la fitorremediación que puede

considerarse una tecnología alternativa rentable y sostenible (Kramer, 2005

Robinsonet al., 2006).En ésta, se usan plantas (Melcer y Post, 2004) y algas (Kirk

y Cain, 1996) que almacenan y eliminan sustancias tóxicas(i.e. metales) mediante

procesos metabólicos (Le Duc y Terry, 2005). En los últimos años, esta tecnología

ha generado una gran expectativa ya que cuando se le compara con los métodos

19

de tratamiento tradicionalmente usados, en la recuperación del ecosistema, resulta

una alternativa innovadoray rentable.

Existen diferentes recursos que ofrece la naturaleza para lograr su propio

equilibrio, y así contrarrestar un poco el daño de los contaminantes. Por ejemplo,

Makos & Hrncir(1995)sugieren que el empleo de macrófitas para la remoción de

Cr, Cd y Pbde aguas tiene la ventaja de requerir menores recursos económicos y

tecnológicos, por lo cual podrían ser utilizadas inclusive en países en vías de

desarrollo. Numerosos trabajos, han estudiado el potencial y la capacidad que

presentan diversas especies de macrófitas en la bioacumulación de metales.

Según Olguín y Hernández 1998, entre las características que deben poseer las

plantas acuáticas usadas para el tratamiento de las aguas residuales están las

siguientes: alta productividad, alta eficiencia de remoción de nutrientes y

contaminantes, alta predominancia en condiciones naturales adversas y fácil

cosecha.

Entre las plantas que cumplen con las condiciones anteriormente descritas, se

encuentran las macrófitas de Lemna minor. Este tipo de plantas tiene un tamaño

que oscila entre 2 a 4 mm de longitud y 2 mm de ancho. Es una de las especies

de angiospermas más pequeñas que existen en el reino de las plantas (Raven et

al. 1971).Se encuentra en charcos de agua dulce, lagos, y ciénagas. Presenta

adaptación a cualquier condición de iluminación, y su crecimiento es acelerado en

ambientes con altos niveles de nitrógeno y fosfatos. Asimismo, esta planta reduce

las probabilidades de que se presente la proliferación de algas y los consecuentes

procesos de eutroficación.

Entre los trabajos precedentes, han empleado plantas macrófitas para el

tratamiento de aguas contaminadas con metales pesados, de allí se pueden citar

los resultados más relevantes Tabla 2.

20

Además, recientementeRahmani et al., (2011), empleo la Lemna minor para tratar

aguas contaminadas con Pb y sus resultados evidenciaron que la planta es capaz

de alcanzar porcentajes de remoción de 85 al 90%.Por otra parte,Hurd y Sternberg

(2008), reportaron rendimientos de remoción de Mn2+ del 86% y López y

Tapias(2013),presentaron biorremoción de Mn2+ de 66,47%.

Tabla 2. Proceso de remoción de materiales pesados con macrófilas acuáticas.

Macrófita Metal

Pesado

Metodologia de

Investigación

Resultados finales Referencia

Lenteja de

agua

(Lemna

minor)

Pb

Las plantas fueron

expuestas a una

concentración de 5,0

mg/L durante 21 días. Las

concentraciones fueron

medidas en el agua y en

la biomasa

Este estudio demuestra el

potencial de la Lemna

minor en la remoción de

plomo y se evidencia su

efectividad en el

tratamiento de aguas

residuales.

Nazmul et al., 1999

Lenteja de

agua

(Lemna

minor)

Pb y Ni

Se puso a prueba en un

proceso por lotes con

concentraciones iniciales

de 5,0 y 10,0 mg/l de

plomo y concentraciones

de 2,5 y 5,0 mg/l de

níquel.

Eliminación del 76% de

plomo y el 82% de níquel.

Las concentraciones de

plomo y níquel usadas en

este estudio no parecieron

influir con la absorción de

los otros metales.

Axtell et al., 2003

Lenteja de

agua

(Lemna

minor)

Cr VI

Las pruebas de

laboratorio se realizaron

en diferentes condiciones

iniciales de Cr VI (0,5 y

2,0 mg/l) y temperatura

(285 y 291K) durante 16

días. Se realizó el

seguimiento de las

concentraciones de

cromo en aguas

residuales.

El estudio confirma la

viabilidad de utilizar este

tipo de macrófitas para la

eliminación de Cr VI de las

aguas residuales. Los

resultados muestran la

dependencia de la

temperatura y

concentración de cromo en

las aguas residuales.

Oporto et al., 2006

Lemna minor

y Eichhornia

crassipes

As

Se pusieron en contacto

con concentraciones de

0,15 mg/L del metal

durante 21 días. El

Arsénico se determinó en

muestras de tejido foliar y

agua por

espectrofotometría de

adsorción atómica.

No se encontraron

diferencias en la

capacidad de

bioacumulación de las dos

especies. La velocidad de

remoción de la Lemna

minor fue 140 mg As/ha d

y del Eichhornia crassipes

fue de 600 mg As/ha d.

Alvarado et al., 2008

21

También existen precedentes de la utilización de macrófitas para la remoción de

materia orgánica, entre los que se destacan los resumidos en la Tabla 3.

Tabla 3. Proceso de remoción de materia orgánica con macrófilas acuáticas

Macrófita Parámetros

medidos Metodologia de

Investigación Resultados finales Referencia

Lemna gibba

(Lenteja de

agua) DQO

Los experimentos se

desarrollaron a escala

laboratorio empleando

aguas residuales

domésticas. El objetivo

fue determinar la

eficiencia y velocidad

de remoción de carga

orgánica.

Las eficiencias de

remoción después

de 3 días están

entre 74-78%. Se

mejoró la reducción

de carga orgánica

cuando se

suministró oxígeno

al medio.

Skorner et al.,

1998

Lenteja de

agua

(Lemna minor)

NH4-N

Sistema integrado de

estanques con lentejas

y algas para el

tratamiento anaerobio

de aguas residuales

domésticas.

Concentraciones de

amonio en el rango

de 20-60 mg/l NH4-

N no afectaron el

crecimiento de la

biomasa.

Principalmente el

56% del amonio fue

eliminado del cual el

18% fue absorbido

por las lentejas de

agua.

Van der Steen

et al., 1998

Lemna gibba

(Lenteja de

agua) DQO

Se empleó un reactor

por lotes para el

tratamiento de aguas

residuales. Se estudió

la influencia que tiene

la carga orgánica de

entrada (DQO entre

200 – 500 m/l) sobre el

rendimiento del

proceso.

Los resultados

obtenidos fueron

ajustados a una

cinética de primer

orden en donde la

velocidad específica

de crecimiento está

en el rango de 0,04

– 0,06 d-1

.

Al-Nozaily et al.,

2000

22

A pesar que son numerosos los trabajos que emplean macrófitas para la

fitorremediación, a lo mejor de nuestro conocimiento, no existe precedente en

donde se evalúe el efecto combinado de la presencia de un metal pesado y

materia orgánica sobre la capacidad que tiene la Lemna minor para efectuar

procesos de fitorremediación.

En consecuencia, en este trabajo se propuso evaluar el grado de influencia que

tienen las concentraciones de cromo, materia orgánica y biomasa sobre la

capacidad de remoción que tiene la Lemna minor. Además, se determinolas

mejores condiciones a las cuales la Lemna minortiene la mayor capacidad de

remover el cromo y la materia orgánica simultáneamente. Finalmente, se procedio

a realizar el ajuste de los parámetros cinéticos que describen el proceso de

fitorremediación.

23

1. METODOLOGÍA

En la Figura 1,se muestra un esquema general de las etapas secuenciales

desarrolladas para la ejecución del presente trabajo.

Figura 1. DESCRIPCIÓN GLOBAL DE LAS ETAPAS SECUENCIALES

24

1.1 REACTIVOS

Para el desarrollo de trabajo de grado se emplearon: acido húmico, dicromato de

potasio, agua destilada, ácido sulfúrico, difenil carbacida, medio Bold Basal. Todos

los reactivos fueron grado analítico.

1.2 MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO

Se utilizó una balanza analítica AB204-S marca Mettler Toledo, espectrofotómetro

Geneys 20 marca Thermo Spectronic, pH metro marca Geratey.

1.3 DISEÑO EXPERIMENTAL

Para determinar la capacidad que tiene la macrófita Lemna minor a remover las

cargas de cromo hexavalente (Cr VI) y materia orgánica (MO) a escala de

laboratorio, se realizaron las siguientes etapas:

1.3.1 FASE DE ADAPTACIÓN DE LA PLANTA

Se utilizaron contenedores rectangulares, fabricados en vidrio (30cm largo x 20cm

ancho x 15cm alto) con una capacidad de 8L. Se preparó 5 litros de medioBold

Basal (Anexo C), que fue vertido en dos contenedores cada uno de 2,5L.

Finalmente, las plantas fueron inoculadas al medio de cultivo durante 5 días a

condiciones ambientales y con una luminosidad artificial (156 µmol Quanta/m2) en

periodos de 12 horas (Oporto et al., 2001). Una vez, el material fue acondicionado

se procede a llevar a cabo los experimentos (Tabla ), en los cuales se determinará

la influencia de los factores densidad de la biomasa (BIO), concentración de cromo

(Cr) y concentración materia orgánica (MO) sobre la capacidad de la planta a

realizar el proceso de fitorremediación.

Para cada unidad experimental, el Cr fue dosificado a partir de una solución madre

de K2Cr2O7 de concentración 100 mg/L.

25

1.3.2 MEDIO DE CULTIVO

El medio escogido para aportar los macro y micro nutrientes necesarios para el

crecimiento de la planta fue el medio nutritivo de Bold Basal

1.4 DETERMINACIÓN DE LA INFLUENCIA DE LOS FACTORES Cr, AH y BIO

SOBRE LA CAPACIDAD DE LA LEMNA MINOR A REMOVER Cr y MO

La influencia de los factores fueron estudiados empleando un diseño de

experimentos de Box-Behnken (Tabla 2). En todos los casos, tanto el volumen de

reacción, así como las condiciones de iluminación fueron constantes y se

mantuvieron en valores de 250 ml y 156 µmol Quanta/m2, respectivamente. Los

medios utilizados fueron sintéticos y se prepararon usando dicromato de potasio y

ácido húmico de acuerdo con la Tabla .

Tabla 4. Puntos experimentales propuestos empleando un diseño experimental de Box-Behnken.

ORDEN DE CORRIDA

CROMO ACIDO HÚMICO (mg / L)

No. Individuos

(mg/ L) (Unidad)

1 0,5 10 65

2 1,25 85 65

3 1,25 160 45

4 2,0 160 65

5 0,5 160 65

6 1,25 160 85

7 2,0 85 85

8 1,25 10 85

9 2,0 85 45

10 0,5 85 45

11 0,5 85 85

12 1,25 10 45 13 2,0 10 65 14 1,25 85 65

15 1,25 85 65

1.5 DESARROLLO EXPERIMENTAL

Una vez se finaliza la fase de adaptación se procede a realizar los diferentes

medios experimentales. En cada uno de estos últimos, la concentraciónde Cr, BIO

y MOvariaron según lo consignado de la Tabla . En cada uno de los medios

26

sintéticos se empleó Dicromato de Potasio(K2Cr2O7) y Ácido Húmico como

analitos representativos para el cromo hexavalente y materia orgánica,

respectivamente. Por ejemplo, para las condiciones:i)concentración de Cr 0,5

mg/L, ii) concentración de AH10 mg/L y iii) BIO 65 plantas, se tomaron 5 ml de la

solución madre de K2Cr2O7 (100 mg/ml), se pesaron 0,01 g de AH y de BIO se

contaron 65 plantas. Losdemás puntos experimentales,se realizaron de la misma

forma pero las cantidades varían en función de las concentraciones.

1.6 EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO

En esta etapa se evaluó el incremento de biomasa en cada unidad experimental

por el método directo de conteo a los tiempos de 0, 3 y 6 días.

1.7 AJUSTE DE PARÁMETROS CINÉTICOS

Finalmente, se desarrolló el ajuste de los parámetros cinéticos. Para este ajuste,

se eligió el medio sintético que facilita la remoción de cromo. Para el ajuste se

ensayaron dos modelos: el primero en el cual se considera la velocidad específica

de crecimiento constante y el segundo fue el de Monod.

Una vez encontradas las condiciones más favorables, donde se obtiene la mayor

remoción de Cr VI y MO, se prosiguió a realizar el seguimiento cinético a

diferentes intervalos de tiempo (0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 y 10 días) con el objeto de

ajustar los datos experimentales a un modelo cinético.

1.8 DETERMINACIÓN DE CROMO HEXAVALENTE

La concentración de cromo hexavalente presente en el agua sintética, se

determinó mediante el método Colorimétrico SM 3500 – Cr B (Anexo A).

27

1.9 ANÁLISIS DE DQO PRESENTE EN EL AGUA RESIDUAL

El seguimiento de materia orgánica presente en el agua sintética,fue cuantificada

a través de la demanda química de oxigeno (DQO), siguiendo el método 5220 D

SM.

1.10 CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE REMOCIÓN

El porcentaje de biorremediación, fuecalculado empleando la Ecuación 1.

(Nacorda et al., 2010 y Sánchez y Galván, 2010).

Concentración inicial al día cero. Concentración final (día que termina la remoción).

1.11 DETERMINACIÓN DE LAS MEJORES CONDICIONES PARA LA

REMOCIÓN

Por medio del software estadístico Statistical 10 (versión prueba para

Windows), se ajustaron los resultados experimentales a una función polinómica la

cual fue maximizada con el fin de obtener la máxima remoción de Cr VI.

1.12 CINÉTICA

Para hallar un modelo matemático que describa el crecimiento de la macrófita, la

variación del Cr y de DQO en función del tiempo, se tomaron muestras de 20 ml a

intervalos de tiempos 0, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 192, 240 horas a las

condiciones más favorables de remoción (cada experimento se realizó por

triplicado). Posteriormente las muestras se filtraron y se depositaron en balones de

100 ml. A continuación, se realizó el protocolo para la determinación de Cr VI, BIO

y toma de muestra para análisis de DQO.

28

2. ANÁLISIS DE RESULTADOS

2.1 DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE REMOCIÓN

La primera fase de la experimentación consistió en la determinación del porcentaje

de remoción de Cr VI en agua residual. De esta manera, se procedió a realizar la

curva de calibración de absorbancia versus concentración (Figura 2) siguiendo el

método Colorimétrico SM 3500 – Cr B.

Se consideró el proceso de bioacumulación de Cr en la Lemna minor como un

fenómeno de adsorción superficial, caracterizado por una capacidad máxima por

parte del adsorbente (Oporto et al., 2001)

Figura 2.Curva de calibración para la determinación de remoción de Cr VI a

partir de Lemna Minor.

2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL

A partir de los resultados de los 15 experimentos (Anexo B) se procedió a analizar

la remoción de Cr VI obtenidaal sexto día. Al evaluar el efecto de las variables y su

interacción, aplicando el análisis de varianza ANOVA (Tabla 5), Se infiere que

todas las variables excepto el efecto lineal de la biomasa y su interacción con el

y = 0,7789x + 0,0053 R² = 0,9998

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Ab

sorb

anci

a

Concentración [µg/ml]

29

cromo tienen incidencia significativa sobre las variables de respuesta a un nivel de

confianza del 95%. En el Anexo D, se puede apreciar el diagrama de Pareto que

confirma lo obtenido por el ANOVA.

Tabla 5. Resultados del análisis estadístico (Análisis de varianza ANOVA).

Factores SC GL SMC F p

Cr 159,814 1 159,8145 113,9556 0,008661

Cr2 55,164 1 55,1641 39,3347 0,024493

AH 125,041 1 125,0407 89,1602 0,011031

AH2 229,686 1 229,6863 163,7777 0,006050

Bio 17,000 1 17,0005 12,12222 0,073513

Bio2 76,975 1 76,9749 54,8869 0,017736

Cr*AH 30,333 1 30,3328 21,6288 0,043257

Cr*Bio 13,614 1 13,6138 9,7073 0,089414

AH*Bio 317,536 1 317,5365 226,4192 0,004388

Falta de Ajuste 28,651 3 9,5504 6,8099 0,130724

Error puro 2,805 2 1,4024

Total SC 1073,00 14

R2:0,97068; R

2Ajustado:0,91792; SC: suma de cuadrados; GL: grados de libertad; SMC: suma

media de cuadrados; F y P: Coeficientes de Fisher; Cr: Cromo; AH: Ácido Húmico y BIO:Biomasa.

Se prosiguió a realizar el ajuste de los resultados experimentales (STATISTICA

10, versión prueba para Windows) por medio de un polinomio de segundo orden

con un R2 de 0.97068 (Ecuación 1)

Ecuación 1.Función objetivo empleada para maximizar la remoción de Cr VI y MO a partir de Lemna Minor.

Empleando la Ecuación 1, fue posible representar el comportamiento de la

variable de respuesta a través de sus respectivas superficies (Figura 3-5)

30

Figura 3. Porcentaje de remoción en función del AH vs Cr a BIO= 65

Figura 4. Porcentaje de remoción en función de BIO vs CR a AH=85

Figura 5. Porcentaje de remoción en función de AH vs BIO a Cr= 1,25

31

Como se puede observar, en las superficies de respuesta (Figura 3-5) hay una

tendencia no lineal quesugiere la interacción de las variables de estudio. De esta

manera, el rendimiento de la remoción aumenta a medida que aumenta la

biomasa y el ácido húmico.

La respuesta no lineal del efecto de la biomasa sobre la remoción de Cr VI, se

puede explicar por lo expuesto porMiretzkHolan & Volesky (1995) y Greene et al.,

(1986)que encontraron que algunos genotipos de microalgas tienen la capacidad

de desarrollarse en aguas contaminadas, de absorber, tolerar y acumular altas

concentración de metales pesados como Mn2+, Hg y Cr.

El efecto significativo del cambio de la pendiente con respecto al AH permitiría

inferir que la asimilación de éste por la microalga juega un rol importante para el

intercambio catiónico. Este fenómeno de competencia por la asimilación de AH fue

encontrado por Miretzky y Fernández (2010), en el cual, la adsorción de

sustancias húmicas provoca una carga negativa sobre la superficie de hidróxidos

de hierro, inhibiendo la adsorción de iones de los metales pesados.

2.3 CONDICIONES FAVORABLES DE REMOCION DE CROMO HEXAVALENTE

Bajo condiciones favorables (Cr VI: 1,625 mg/L; AH: 160mg/L; BIO: 45 plantas) se

obtiene un máximo teórico de remoción de 52,71%en un tiempo de 6 días.

Experimentalmente, se obtuvo un porcentaje de remoción del 54,24%. Los

porcentajes de remoción obtenidos en este trabajo son inferiores en un 30%

cuando se les compara con los resultados del trabajo de Hurd y Sternberg

(2008).En efecto, estos autores reportaron que la Lemna minor es capaz de

alcanzar un grado de remoción del 86% cuando se trata de Mn+2. No obstante, se

puede explicar por la diferencia en los metales sujetos de estudio.

Al comparar estos resultados se encuentra que Lemna minor ha presentado

biorremoción de Mn2+ de 66,47% (López y Tapias, 2013) y de 86% para

32

eliminación de Pb2+ (Hurd y Stemberg, 2008). Otras macrófitas por ejemplo S.

minima alcanzaron rendimientos de 54% para biorremoción de Pb2+ (Olguin et al.,

2005) y un 37% usando helecho acuático Azolla filicuoides (Benaroya et al., 2004).

Estos resultados confirman la potencialidad de emplear Lemna minor para la

biorremediación y destoxificación de metales pesados de efluentes industriales.

2.4 CINÉTICA

Con base en las condiciones favorables se determinaron los parámetros cinéticos

de crecimiento de biomasa, remoción de Cr VI y remoción de DQO. Bajo estas

circunstancias, los resultados obtenidos se muestran a continuación:

2.5 CRECIMIENTO DE BIOMASA

En la Figura 6, se observa la curva de crecimiento de la Biomasa (Lemna minor)

donde se aprecia las diferentes fases del crecimiento de un cultivo bacteriano: i)

fase de latencia, ii) fase exponencial, iii) fase estacionaria, iv) fase de declive. Con

el objeto, de ajustar un modelo se parte del hecho que se evaluaran modelos no

estructurados no segregados, empleándose los datos correspondientes a la zona

de crecimiento exponencial. Esta zona se escoge porque allí se puede garantizar

que existe un crecimiento balanceado.

33

Ln(X) = 0,0056 t + 3,6809 R² = 0,9531

3,4

3,5

3,6

3,7

3,8

3,9

4

4,1

4,2

LN(X

)

t (horas)

Curva crecimiento celular Ln X vs t

crurva de crecimiento celular fase de crecimiento celular Lineal (fase de crecimiento celular)

Figura 6.Curva de crecimiento celular de la microalga Lemna Minor a

condiciones de Cr VI: 1.625 mg/L; AH: 160mg/L y BIO: 45 plantas.

2.6 CÁLCULO DE PARÁMETROS CINÉTICOS

A partir de los datos experimentales (Tabla 7;Anexo D) se determinaron los

parámetros cinéticos de la velocidad de crecimiento máxima ( ), tiempo de

duplicación ( ) y constante de saturación ( ).

Tabla 6. Evolución de la Biomasa, Cromo Hexavalente y DQO en función del tiempo a condiciones favorables (Cr VI: 1.625 mg/L; AH: 160mg/L; BIO: 45 plantas).

Horas 0 12 24 48 72 96 120 144 192 240

Biomasa (No plantas) 45 46 46 49 61 60 60 59 52 33

Biomasa (No plantas/L) 180 183 185 197 242 239 240 237 208 130

Cromo (mg/L) 1,625 0,856 0,918 1,042 1,035 0,974 0,856 0,760 0,878 1,003

DQO mg/L O2 175,3 179,0 175,0 163,5 151,5 158,0 159,0 186,8 200,8 217,0

34

A partir de laTabla 7, se puede observar que la Lemna minor tiene un

comportamiento de adsorción rápida del metal pesado (Cr) seguido por un

fenómeno de desorción.

Este comportamiento también ha sido observado por Hurd y Sternberg (2008)

yAlvarado et al., (2008),y se explica al considerar que la acumulación de metales

por organismos acuáticos se presenta en un proceso que consta de dos pasos: un

primer paso de absorción rápida o vinculación a la superficie biológica

(biosorción), seguido por un segundo paso de transporte lento e irreversible,

controlado por difusión al interior de la célula (bioacumulación), que puede ser por

difusión del ion metálico a través de la membrana celular o por transporte activo

por una proteína transportadora.

Además, los mayores porcentajes de remoción de la DQO concuerdan con el

período de máximo crecimiento de biomasa (Tabla 7).En efecto, en el período de

24 a 72h se observa una marcada disminución de 23,83 mg/L O2. Sin embargo,

una vez la planta se encuentra en la fase estacionaria o de declive (96 – 240h)

existe un aumento significativo de la DQO. Resultados similares fueron

encontrados por García, Zarela (2012)al usar Lemna minor en el afluente de la

Laguna CITRAR con una remoción de DQO entre el 9,9 a un 43,5 mg/L.

En efecto, el comportamiento en función de la etapa de crecimiento, fue observado

porKimm et al., (1999),en el cual expone que la remoción de DQO se debe

principalmente a que la remoción de metales pesados por un sistema tratado con

plantas acuáticas se presenta en los sitios activos de las raíces densas donde las

colonias bacterianas degradadoras de materia orgánica actúan como filtros de

material particulado.

35

Tabla 7. Parámetros cinéticos de la remoción de Cr VI ajustados a un modelo lineal y de Monod.

Modelo Lineal Modelo Monod

R2 = 0.9144

= 0,1348 h-1

= 5,0606 h

R2 = 0.9765

= 1.0632 h-1

= 1.874 g/L

=0.315 h-1

A partir de los resultados de la Tabla 8, se puede inferir que el modelo Monod

presenta un mejor ajuste. Así mismo, los resultados obtenidos muestran que la

remoción de Cr VI usando Lemna Minor, remueve 1,874 g/L para una velocidad

específica de crecimiento de 1,0632 h.

En consecuencia, se puede subrayar que en la fase exponencial hay afinidad del

organismo por el sustrato. Además, la Figura 6, indica que el avance después de

la 72h comienza la fase estacionaria debido quizás a una limitación del

crecimiento de la Lemna minor por la alta densidad de la planta, lo que ha sido

observado por Gazi et al., (1999)ySteven et al., (2005).

36

3. CONCLUSIONES

La implementación de Lemna minorpara la biorremoción de cromo hexavalente y

materia orgánica tiene el potencial de biorremediar el 54,24% en 6 días, lo cual

indica que esta macrófita podría ser usada para los procesos de biosorción de

metales y destoxificación de efluentes industriales

A partir de los resultados experimentales y soportados en el análisis ANOVA se

determinó que los factores de tienen mayor influencia en el proceso de remoción

de cromo hexavalente son la concentración del ácido húmico y la concentración

del metal en un tiempo de 6 días.

A partir de la ecuación de segundo orden se obtuvo que las condiciones más

favorables para el proceso simultáneo de biorremoción de cromo hexavalente y

materia orgánica son:160 mg/L de AH, 1,625mg/Lde Cr VI y 45 plantas en 250 ml.

En los resultados experimentales de la cinética, se puede observar un proceso de

adsorción-desorción, en el que la máxima remoción del metal se encuentra en el

día 6 y después de éste se libera parte del cromo adsorbido, haciéndolo disponible

nuevamente en el medio.

El modelo de Monod presentó el mejor ajuste de los parámetros cinéticos con un

R2 de 0,9765. Así mismo, los parámetros velocidad específica de crecimiento y

constante de saturación describen apropiadamente el proceso de biorremoción de

Cr VI por Lemna Minor.

37

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40

ANEXOS

Anexo A. DETERMINACIÓN DE CROMO HEXAVALENTE (Cr VI)

Método Colorimétrico SM 3500 – Cr B:

Para cada unidad experimental, el cromo fue dosificado a partir de una solución

madre de K2Cr2O7 de concentración 100 mg/L. Se puede observar en la (Tabla 3)

el número de experimentos con sus niveles, se realizó los cálculos pertinentes y

obtuvo tres volúmenes diferentes (12.50 ml, 5 ml y 20 ml) se aforaban en un litro

de solución Bold Basal más la concentración de (AH) y el número de Lemna

minor, con estas resultados nos aseguramos que los puntos a analizar estuviera

en la curva de calibración que ya se había hecho con experimentos anteriores.

Según la calibración se pipeteo 20ml del medio, se filtró y se depositó en balones

de 100 ml, se agregó 0,25 ml de ácido sulfúrico (H2SO4) 0.2N hasta ajustar la

solución a un pH de 1,0. Se afora a 100 ml y se añaden 2 ml de la solución Difenil

Carbacida y se deja reposar en oscuridad de 5 a 10 minutos hasta alcanzar el

desarrollo del color.

Se debe medir la absorción del blanco en este caso es el agua. Se transfiere un

poco de la solución coloreada a la celda de absorción 1cm y medir la absorbancia

a 540 nm.

41

Anexo B. DATOS EXPERIMENTALES

Cromo

(mg/L)

Ácido

Húmico

(mg/L)

Lemna

Minor

(Unidad)

CONCENTRACIÓN

REMOCIÓN CROMO VI

PROMEDIO / DÍA

0 3 6

%Remoción

día 3

%Remoción

día 6

0,5

10

65

0.500

0.387

0.323

22,501 ± 1,210

35.352 ± 1,604

1,25 85 65 1.250 0.930 0.734 25,583 ± 3,368 41.310 ± 1,048

1,25 160 45 1.250 0.991 0.592 20,095 ± 2,181 52.662 ± 2,222

2,0 160 65 2.000 1.541 1.362 22,934 ± 1,119 31.882 ± 4,630

0,5 160 65 0.500 0.437 0.306 12,654 ± 3,704 38.845 ± 2,652

1,25 160 85 1.250 1.183 0.841 5,329 ±4,722 32.742 ± 1,852

2,0 85 85 2.000 1.537 1.262 23,152 ± 6,482 36.902 ± 3,360

1,25 10 85 1.250 1.100 0.703 11,964 ± 1,000 43.747 ± 2.000

2,0 85 45 2.000 1.545 1.114 22,752 ± 1,852 44.323 ± 4.544

0,5 85 45 0.500 0.449 0.270 10,166 ± 3,143 46.041 ± 0.761

0,5 85 85 1.250 1.183 0.900 38,845 ± 1,210 46.047 ± 1.489

1,25 10 45 1.250 1.183 0.900 5,329 ± 4,666 28.028 ± 4.210

2,0 10 65 2.000 1.947 1.653 2,036 ± 0,741 17.375 ± 3.210

1,25 85 65 1.250 1.194 0.705 4,456 ± 3,143 43.590 ± 0.775

1,25 85 65 1.250 0.939 0.722 24,885 ± 0,926 42.260 ± 3.094

42

Anexo C. MEDIO BOLD BASAL

COMPONENTE SOLUCIÓN STOCK

(g*L-1 d H2O)

CANTIDAD UTILIZADA

(mL*L de medio)

CONCENTRACIÓN FINAL EN MEDIO

(M)

Macronutrientes

NaNO3. 25,0 g 10 ml 2,94 X 10-3

MgSO4.7H2O 7,50 g 10 ml 3,04 X 10-4

NaCl 2,50 g 10 ml 4,28 X 10-4

K2HPO4 7,50 g 10 ml 4,31 X 10-4

KH2PO4 17,5 g 10 ml 1,29X 10-3

CaCl2. 2H2O 2,50 g 10 ml 1,70 X 10-4

Micronutrientes

Solución de metales

1 mL

ZnSO4.7H2O 8,82 g 3,07 X 10-5

MnCl2.4H2O 1,44 g 7,28 X 10-6

MoO3 0,71 g 4,93 X 10-6

CuSO4.5H2O 1,57 g 6,29 X 10-6

Co(NO3)2.6H2O 0,49 g 1,68X 10-6

Solución de Boro

1 mL

H3BO3 11,42 g 1,85 X 10-4

Solución Alcalina

1 mL

EDTA 50,0 g 1,71 X 10-4

KOH 31,0 g 5,53X 10-4

Solución de Hierro

1 mL

FeSO4.7H2O 4,98 g 1,79 X 10-5

H2SO4 (98%) 2,4 ml

43

Anexo D. DIAGRAMA DE PARETO PARA EFECTOS ESTANDARIZADOS

44

Anexo E. CÁLCULO DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS

a) Para el caso del modelo lineal y aplicando logaritmo natural:

b) Modelo de Monod

Cuando no se especifica el modelo cinético se asume el modelo de Monod para

realizar el cálculo de los respectivos parámetros cinéticos, teniendo así:

Siendo la velocidad especifica de crecimiento máxima, constante de

saturación y concentración de sustrato limitante.

De igual forma se ajustan los datos a una línea y recta y Linealizando se obtiene la

siguiente expresión.

Realizando el balance de masa de biomasa se obtiene el modelo de la siguiente

forma:

45

La derivada se calculó con datos experimentales espaciados por el método

de diferencias divididas finitas de newton:

Punto inicial :

Intermedios :

Punto final:

Se realiza la curva de crecimiento vs y aplicando regresión lineal en la

fase de crecimiento exponencial más la fase de crecimiento desacelerado en el

rango 24 – 72hse obtiene:

R2= 0.9765

Aplicando Monod linealizado de la siguiente forma:

La velocidad especifica de crecimiento máxima y constante de saturación igual a

0,315 h-1 y 1,874 g/l respectivamente.