SINTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE HIDROXIAPATITA Y PRUEBAS DE

BIOACTIVIDAD IN VITRO.

Liliana Corona Pérez1, A. B. Martínez-Valencia

2, G. Carbajal de la Torre

2

1. Instituto Tecnologico Superior deTlaxco. Predio Cristo Rey Ex Hacienda

deXalostoc Km 16.8 carr Apizaco-Tlaxco.Tlaxcala,Tlaxcala.

2. Posgrado de la Facultad de Ingeniería Mecánica de la Universidad Michoacana

de San Nicolás de Hidalgo. Santiago Tapia 403. C.P. 58000. Centro. Morelia,

Michoacán.

INTRODUCCIÓN

El término biomaterial designa a aquellos materiales, naturales (de origen animal o humano) o

artificiales (hechos por el hombre), utilizados en la fabricación de dispositivos que interactúan con

los sistemas biológicos y que se aplican en diversas especialidades de la medicina ya sea para

aumentar o reemplazar un tejido, órgano o una función del organismo. [1]

Características

Las características más importantes que influyen en un biomaterial dado son:

Biocompatibilidad

Requisitos físicos

Requisitos químicos.

Tipos de biomateriales en función a la respuesta de su organismo:

Biomateriales Inertes, biomateriales Activos y biomateriales Absorbibles. [2]

Tipos de biomateriales por composición

Según su composición química, los biomateriales se clasifican en metálicos, poliméricos, cerámicos

y compuestos. La tabla siguiente muestra las propiedades de estos biomateriales y algunas de sus

aplicaciones.

BIOMATERIAL PROPIEDADES APLICACIONES

Metales y Aleaciones

Aceros inoxidables, aleaciones de

Titanio (Ti), de cobalto (Co),

Nitinol

Alta densidad, resistencia

mecánica

al desgaste, impacto,

tensión

y compresión, baja

biocompatibilidad,

resistencia a la corrosión

Implantes y fijaciones

ortopédicas con tornillos,

placas, alambres,

varillas, clavos,

implantes dentales

Cobre (Cu) Se corroe en el útero Dispositivos

anticonceptivos.

Amalgamas y aleaciones dentales Biocompatibles con saliva Implantes dentales y

reparaciones.

Espirales vasculares elásticas

(stents)

Biocompatibles con sangre Reparación de venas y

arterias

Polímeros

Hule (goma) sintético

Polietileno, polipropileno,

acrílicos, teflón

Baja densidad y resistencia

mecánica, facilidad de

fabricación, formación de

biopelículas.

Suturas, sustitución de

arterias y venas,

restauración

maxilofacial: nariz,

oreja, mandíbula,

dientes; tendón artificial.

Cirugía plástica estética

Dacron, Nylon (Poliéster) Hilos de suturas

Cerámicos

Óxidos metálicos, alumina

(Al2O3), zirconia (ZrO2), Titania

(TiO2), fibra de carbono, apatita

artificial.

Recubrimientos

Buena biocompatibilidad,

resistencia a la corrosión,

inertes, alta resistencia a la

compresión, alta densidad

y dureza, dificultad de

maquinado y fabricación

Caderas protésicas,

dientes cerámicos,

cementos

Compuestos

Metal cubierto con cerámica: Ti

con hidroxiapatita porosa.

Material cubierto con carbón o

diamante

Buena compatibilidad,

inertes,

alta resistencia a la

corrosión y a

la tensión. Falta de

consistencia

en la fabricación del

material

Implantes ortopédicos

reforzados con fibras de

carbono, válvula

artificial

cardiaca, restauración de

articulaciones

Tabla 1. Tipos de biomateriales según su composición propiedades y aplicaciones. [3]

Hidroxapatita

La hidroxiapatita es un biomaterial y básicamente es un compuesto cristalino integrado por tres

moléculas de fosfato de calcio y de una molécula de hidróxido de calcio. El concentrado de la

hidroxiapatita es la matriz de calcio de la proteína encontrada en el hueso sin procesar. Esta

sustancia natural contiene aproximadamente 14% la proteína del colágeno y 4% de otras proteínas y

aminoácidos pequeños (hidroxiprolina, glicina y ácido glumático). El calcio abarca entre el 24-30%

de la matriz de la hidroxiapatita y junto con varios minerales (zinc, potasio, silicio, magnesio,

fierro) forma un conjunto biodispensable activo de calcio. [4]

Técnicas de síntesis de hidroxiapatita

Se utilizan varias vías mayores para la preparación de las apatitas: la precipitación en vía acuosa, la

reacción sólido-sólido (vía seca), la reacción en sales fundidas, el procedimiento sol-gel y la vía de

los cementos. [5]

Reacciones en fase acuosa

Las síntesis en fase acuosa se realizan mediante dos procedimientos diferentes:

El método por doble descomposición y el método por neutralización [6]

.

Reacciones en fase sólida

La síntesis por reacción sólido-sólido consiste en calentar una mezcla reactiva que consta de

diversas sales de cationes y de aniones, en una relación Me/XO4 igual a 1.67. Esta mezcla debe ser

perfectamente homogénea para permitir una reacción total. Un ejemplo sería la síntesis de

fluorapatitafosfocálcica a partir de fosfato tricálcico y de fluoruro de calcio. [7]

Reacciones en sales fundidas

Este método permite acercarse a las condiciones de síntesis de algunas apatitas naturales. De esta

manera se han preparado fosfatos metálicos de estructura apatítica. Se obtuvieron así cristales

mezclados la mayor parte del tiempo con el exceso de reactivos de inicio.

Reacciones sol-gel

El procedimiento sol-gel se basa en la polimerización de precursores organometálicos de tipo

alcóxidosM(OR)n. Después de una hidrólisis controlada de este alcóxido en solución, la

condensación de los monómeros conduce a puentes oxo y después a un óxido orgánico. La

polimerización progresiva de estos precursores forma oligómeros y después polímeros que

aumentan así la viscosidad. Estas soluciones poliméricas conducen a gel que permiten elaborar

materiales con facilidad (películas densas y transparentes, polvos ultra finos, cerámicas con

múltiples aplicaciones tecnológicas.

Reacción líquido/sólido: la vía de los cementos

Los cementos fosfocálcicos son cementos hidráulicos minerales que fraguan gracias a reacciones

ácido-básicas entre fosfatos de calcio de tipo ácido y fosfatos de calcio de tipo básico para dar una

hidroxiapatitafosfocálcica en fase única.

Corrosión

La corrosión se define como el deterioro de un material a consecuencia de un ataque electroquímico

por su entorno. De manera más general, puede entenderse como la tendencia general que tienen los

materiales a buscar su forma más estable o de menor energía interna. Siempre que la corrosión esté

originada por una reacción electroquímica (oxidación), la velocidad a la que tiene lugar dependerá

en alguna medida de la temperatura, de la salinidad del fluido en contacto con el metal y de las

propiedades de los metales en cuestión. Se clasifican de acuerdo a la apariencia del metal corroído,

las más comunes son:

Corrosión uniforme, corrosión galvánica, corrosión por picaduras, corrosión intergranular y

corrosión por esfuerzo. [8]

Objetivo general

Sintetizar hidroxapatita, pruebas de bioactividad in vitro y corrosión de acero.

Objetivos específicos

Sintetizar y caracterizar hidroxapatita por medio de la técnica de precipitación.

Realizar fluido corporal simulado para pruebas de bioactividad en un material compuesto in vitro.

Aplicación de la técnica potensiodinámica y técnicas de impedancia electroquímica sobre acero.

Metodología

Obtención de hidroxiapatita sintética por precipitación

A partir de ácido fosfórico H3PO4, hidroxilo de calcio Ca (OH)2 y agua desionizada. Se calcularon

cantidades estequiometricas de acuerdo a la reacción [9]

:

10 Ca (OH)2 + 6 H3PO4 Ca10 (PO4)6 (OH)2+ H2O

Para obtener 5 gramos de hidroxiapatita, se prepara una solución de 3.687 gramos de Ca(OH)2 en un

volumen de 50 mililitros de agua desionizada y una solución de 4 mililitros de H3PO4 al 85% de

concentración en 58.75 mililitros de agua desionizada que se muestra en la figura 1.

Figura 1. a) Muestra las dos soluciones ya preparadas, b) Síntesis por precipitación para obtener

hidroxiapatita.

La segunda solución se coloca en una bureta y se gotea sobre de la primera como se muestra en la

figura 1, de 30 a 35 gotas por minuto de manera constante.

Se registra el pH obtenido inicialmente y se deja envejecer por el tiempo necesario para alcanzar un

pH de 8.5, o bien se deja en agitación constante por 20 horas. Una vez que se alcanza el pH o

termina el periodo de agitación se obtiene hidroxiapatita.

Opcionalmente se calcina por una hora 800 °C después de filtrar y lavar.

Técnicas de caracterización para hidroxiapatita

Microscopia electrónica de transmisión

Un microscopio electrónico de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés, o MET, en español) es

un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto, debido a que la potencia

amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. Lo

característico de este microscopio es el uso de una muestra ultra fina y que la imagen se obtenga de

los electrones que atraviesan la muestra.

Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.

[10, 11]

Estructura

Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible,

pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas.

Microscopía electrónica de barrido

El Microscopio electrónico de barrido o SEM (ScanningElectronMicroscopy), es aquel que utiliza

un haz de electrones en lugar de un haz de luz para formar una imagen. Tiene una gran profundidad

de campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra. También produce

imágenes de alta resolución, que significa que características espacialmente cercanas en la muestra

pueden ser examinadas a una alta magnificación. La preparación de las muestras es relativamente

fácil pues la mayoría de SEMs sólo requieren que estas sean conductoras.

En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de carbón o una

capa delgada de un metal como el oro para darle propiedades conductoras a la muestra.

Posteriormente es barrida con los electrones acelerados que viajan a través del cañón. Un detector

mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz

de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV o una imagen digital. Su

resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. [12,13]

Espectroscopia infrarroja

Espectroscopia infrarroja (Espectroscopia IR) es la rama de la espectroscopia que trata con la parte

infrarroja del espectro electromagnético. Esta cubre un conjunto de técnicas, siendo la más común

una forma de espectroscopia de absorción. Así como otras técnicas espectroscópicas, puede usarse

para identificar un compuesto e investigar la composición de una muestra.

Para medir una muestra, un rayo de luz infrarroja atraviesa la muestra, y se registra la cantidad de

energía absorbida en cada longitud de onda. Esto puede lograrse escaneando el espectro con un rayo

monocromático, el cual cambia de longitud de onda a través del tiempo, o usando una transformada

de Fourier para medir todas las longitudes de onda a la vez. A partir de esto, se puede trazar un

espectro de transmitancia o absorbancia, el cual muestra a cuales longitudes de onda la muestra

absorbe el IR, y permite una interpretación de cuales enlaces están presentes. [15, 14]

Difracción de rayos X

El fenómeno de la difracción de Rayos X consiste básicamente en un proceso de interferencias

constructivas de ondas de rayos X que se produce en determinadas direcciones de espacio. Significa

que las ondas tienen que estar en fase, lo que ocurre cuando su diferencia de trayectoria es cero o un

múltiplo entero de longitudes de onda.

La identificación de fases cristalinas constituye uno de los campos de aplicación más importantes

del método de polvo cristalino.[16, 17]

De la muestra y equipo utilizado

Para poder llevar a cabo la difracción de rayos X se empleó un difractómetroSiemens D500, voltaje

de 30 kV, de 15 a 55 ° y una velocidad de barrido de 0.6 grado/min, para preparar la muestra, Lo

obtenido de la síntesis se molió con un mortero y pistilo, se utilizó un porta muestras de alúmina

mostrado en la figura 2.

Figura 2 .a) Muestra lista para meter al equipo para su análisis y b) muestra dentro del equipo.

Fluido fisiológico simulado

Para comprobar la bioactividad sobre el material compuesto se utilizó una estrategia biomimética,

que consiste en preparar una solución semejante al del plasma del cuerpo humano, esta solución

salina se denomina Fluido Fisiológico Simulado (FFS) y se mantiene a una temperatura de 37°C y

un pH de 7.4 (condiciones semejantes al del cuerpo humano). Para preparar el FFS se mezcla los

reactivos de la tabla 2 en la cual se muestra en orden y las cantidades requeridas en 700 ml de agua

desionizada, se debe tener en cuenta que no deben mezclarse los reactivos de manera simultánea ya

que se provocara precipitación.Ya adicionado todos los reactivos del 1 al 6 se adiciona el número 7

en el cual se debe dejar agitar el tiempo necesario para su adecuada disolución, se agrega el

siguiente; al legar al tris se debe agregar hasta tener un pH de 7.42 y agregar nuevamente hasta un

pH de 7.45 y bajar a 7.42 con la solución de HCl al 1 M y de manera sucesiva hasta que se termine

el tris a una temperatura de 36.5 °C exactamente se debe ajustar el pH hasta 7.40, el proceso se

ilustra en la figura 3.La solución obtenida se completa hasta un litro y se deja enfriar.[18]

Orden Reactivo Cantidad Pureza Peso formula

1. NaCl 8.035 g 99.5 58.4430

2. NaHCO3 0.355 g 99.5 84.0068

3. KCl 0.225 g 99.5 74.5515

4. MgCl2-6H2O 0.231 g 99.0 228.2220

5. K2HPO4-H2O 0.311 g 98.0 203.3034

6. 1.0M-HCl 39 ml - -

7. CaCl2 0.292 g 95.0 110.9848

8. Na2SO4 0.072 g 99.0 142.0428

9. Tris 6.118 g 99.0 121.1356

10. 1.0M-HCl 0-5 ml - -

Tabla 2. Orden del proceso cantidades, pureza y peso formula.

Figura 3. Proceso de preparación de fluido fisiológico simulado

Aplicación del fluido fisiológico simulado

Se coloca aproximadamente 30 ml dentro del fluido fisiológico simulado en un vaso donde la

muestra se debe de encontrar de manera vertical para que el fluido interactúe de manera adecuada

con el material compuesto como se muestra en la figura 4.

Figura 4. Muestra el material de forma horizontal dentro del fluido fisiológico simulado.

La aplicación del fluido fisiológico simulado se realizó a baño maría y dentro de la mufla eléctrica

a una temperatura similar a la del cuerpo humano aproximadamente a 37 °C como se muestra en las

figuras 5 y 6.

Figura 5. Muestra la aplicación del fluido dentro de baño maría.

Figura 6. Muestra la aplicación del fluido corporal simulado dentro de la mufla eléctrica a 37 °C.

Las muestras obtenidas se analizaron con SEM.

Corrosión de acero

Se utilizó una celda electroquímica típica el electrodo de referencia, un electrodo de sulfatos

saturado y una barra de grafito.

La celda utilizada fue un recipiente de acrilico con una capacidad de 50 ml. El electrodo de trabajo

utilizado fue acero obtenido de filtros que se encuentra en contacto con aguas contaminadas con un

pH de 8.5.

Técnica potenciodinámica

Polarización

Una vez establecido el hecho de que habrá regiones con distinto potencial, se debe comprender qué

tendencia seguirán dichos potenciales cuando se establece un circuito cerrado entre ellos. Pues bien,

igual que cuando mezclamos en un recipiente agua a distinta temperatura el sistema tiende a

homogeneizar la temperatura del agua a una que será intermedia, cuando dos regiones con distinto

potencial consiguen un medio (electrólito) para intercambiar sus iones, cierran un circuito a través

del cual el sistema acabará teniendo un potencial común intermedio a los valores previos. La

representación de los potenciales normales de ánodo y cátodo, junto que el valor final de corrosión,

frente a la corriente es conocida como diagrama de Evans que se muestra en la Figura 7.

Figura 7. Diagrama de Evans.

La curva de Tafel

El proceso de polarización que sigue un metal es de difícil caracterización. Una técnica sencilla que

aporta bastante información, es la potenciodinámica. En ella, trazamos una curva en la que

representamos potencial (E) frente a corriente en escala logarítmica (log I) (Figura 8).

Figura 8.Curva de Tafel de una representación potenciodinámica. [19]

Esta técnica consiste en esperar a que el metal estabilice, es decir, que alcance un potencial

constante en el que las semirreacciones anódica y catódica están compensadas, para aplicarle

después unos pocos milivoltios que le alejen del potencial de equilibrio y registrar la respuesta en

corriente. La figura que obtenemos es la llamada curva de Tafel, que muestra de una forma bastante

clara los procesos de intercambio de electrones que se producen en las inmediaciones del metal.

Esta polarización pasa por tres fases por activación, resistencia y concentración.

Polarización de activación

Referente al número de electrones que son capaces de abandonar la superficie anódica, superando la

energía de activación, y generando a su vez cationes metálicos. En la curva de Tafel aparece

representada como una línea casi recta en las proximidades al potencial de corrosión. Trazando una

tangente a cada una de estas secciones, se consiguen las rectas con las que luego se obtendrá la

corriente de corrosión.

Polarización de resistencia

Se origina como consecuencia de cualquier caída óhmica en la inmediata vecindad del electrodo.

Polarización de concentración

Es la que representa la variación en el potencial como consecuencia de los cambios de

concentración que se producen en la inmediata vecindad del electrodo. Este proceso puede ser por

difusión, convección o migración.

La aparición de alguno de los dos últimos procesos, provoca que la representaciónsufra un marcado

cambio de pendiente.19

Técnica de impedancia electroquímica

La impedancia electroquímica usualmente se obtiene aplicando un potencial de corriente alterna a

una celda electroquímica y midiendo la corriente a través de la celda como se muestra en la figura

9. La respuesta a este potencial sinusoidal de excitación es una señal de corriente alterna que puede

ser analizada como la suma de funciones sinusoidales (series de Fourier).

Otro concepto a tener presente es el de la capacidad o capacitancia, la cual expresa la habilidad de

un capacitor para almacenar carga eléctrica.

Figura 9. (A) Configuración típica de dos electrodos para la medición de impedancia (B) Circuito

equivalentesimplificado para un sistema de dos electrodos. Cdl - Impedancia del electrodo; Rs - Resistencia

del electrodo. (C) Curva de impedancia vs. Frecuencia.20

Conclusiones

En la síntesis de hidroxiapatita por precipitación vía acuosa utilizando el método de neutralización,

se obtuvo la fase de hidroxiapatita utilizando difracción de rayos X como se muestra en el

difractograma de la figura10.

Figura 10.Difractograma obtenido con difracción de rayos x donde se aprecia la presencia de la fase

hidroxiapatita.

Se logró obtenerfluido fisiológico simulado, sin precipitación en el proceso, los resultados de la

aplicación del fluido fisiológico simulado sobre el material compuesto obtenida por SEM se

muestra en la figura 11, en las micrografías se muestra el crecimiento hidroxiapatita sobre el

material compuesto y los elementos obtenidos por EDS sobre la superficie, después de un día de

aplicación.

a) Micrografias obtenidas por SEM del material compuesto.

b) EDS del material compuesto.

Figura 11. Muestra el crecimiento de hidroxiapatita sobre el material compuesto y los elementos

existentes sobre la superficie.

En cuanto a la corrosión de acero se realizó la técnica potenciodinámica y técnica de impedancia

electroquímica.

En la primera se observó picaduras y en la segunda no se observaban picaduras con lo que se puede

obtener el tiempo de vida medio para el acero que se encuentra en contacto con el agua residual.

Bibliografía

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Note: CORR-1.