Síntesis de un derivado de cisteína glicosilada con alfa-N ...

Miguel Ayala García

Jesús Manuel Peregrina García y Francisco Corzana López

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Grado en Química

2013-2014

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso Académico

Síntesis de un derivado de cisteína glicosilada con alfa-N-acetilgalactosamina y su incorporación al epítopo Ala-

Pro-Asp-Thr-Arg-Pro, sustituyendo al aminoácido Thr

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2014

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Síntesis de un derivado de cisteína glicosilada con alfa-N-acetilgalactosamina ysu incorporación al epítopo Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro, sustituyendo al

aminoácido Thr, trabajo fin de gradode Miguel Ayala García, dirigido por Jesús Manuel Peregrina García y Francisco Corzana

López (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.

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UNIVERSIDAD DE LA RIOJA

FACULTAD DE CIENCIAS, ESTUDIOS

AGROALIMENTARIOS E INFORMÁTICA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA

CURSO 2013-2014

SSSÍÍÍNNNTTTEEESSSIIISSS DDDEEE UUUNNN DDDEEERRRIIIVVVAAADDDOOO DDDEEE CCCIIISSSTTTEEEÍÍÍNNNAAA

GGGLLLIIICCCOOOSSSIIILLLAAADDDAAA CCCOOONNN ααα---NNN---AAACCCEEETTTIIILLLGGGAAALLLAAACCCTTTOOOSSSAAAMMMIIINNNAAA

YYY SSSUUU IIINNNCCCOOORRRPPPOOORRRAAACCCIIIÓÓÓNNN AAALLL EEEPPPÍÍÍTTTOOOPPPOOO

AAALLLAAA---PPPRRROOO---AAASSSPPP---TTTHHHRRR---AAARRRGGG---PPPRRROOO,,,

SSSUUUSSSTTTIIITTTUUUYYYEEENNNDDDOOO AAALLL AAAMMMIIINNNOOOÁÁÁCCCIIIDDDOOO TTTHHHRRR

Trabajo Fin de Grado

Grado en Química

Miguel Ayala García

Junio 2014

Tutores

Francisco Corzana López

Jesús Manuel Peregrina García

JESÚS MANUEL PEREGRINA GARCÍA, Catedrático de Química Orgánica del Departamento de

Química de la Universidad de La Rioja y

FRANCISCO CORZANA LÓPEZ, Profesor Contratado Doctor de Química Orgánica del

Departamento de Química de la Universidad de La Rioja.

HACEN CONSTAR:

Que la memoria " SÍNTESIS DE UN DERIVADO DE CISTEÍNA GLICOSILADA CON α-N‐ACETILGALACTOSAMINA Y SU INCORPORACIÓN AL EPÍTOPO Ala‐Pro‐Asp‐Thr‐Arg‐Pro, SUSTITUYENDO AL AMINOÁCIDO Thr" ha sido realizada por el Graduado MIGUEL AYALA GARCÍA en el Departamento de Química de la Universidad de La Rioja, bajo su inmediata dirección y reúne las condiciones exigidas para conseguir los 15 créditos ECTS correspondientes al período de investigación del Trabajo fin de Grado.

Logroño, Junio 2014

Fdo.: Jesús Manuel Peregrina García Fdo.: Francisco Corzana López

ÍNDICE

Abreviaciones

1. Resumen

2. Introducción y objetivos

3. Antecedentes

3.1 Formación del enlace peptídico

3.2 Síntesis de péptidos en fase sólida

3.3 Formación del enlace S-glicosídico

4. Discusión de resultados

4.1 Síntesis del building block 2

4.1.1 Preparación del carbohidrato 5

4.1.2 Preparación del aminoácido 7

4.1.3 Formación del enlace glicosídico entre aminoácido y carbohidrato

4.2 Síntesis del glicopéptido 1

5. Conclusiones

6. Experimental

7. Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear y cromatograma

I

1

5

13

15

17

19

23

25

26

26

27

28

33

37

47

I

Abreviaciones Å δ λ µL 1H RMN 13C RMN Aa Ac AcOEt Ala, A APCI Arg, R arom. Asp, D atm. tBu c Cg

CO2 tBu

col. COSY Cys, C d DBU DCC dd DIEA DMAP DMF ESI Fmoc g HPLC HSQC Hz GalNAc Gly, G h HBTU His, H HOBt J m M Me MeOH mg MHz min

ångström desplazamiento químico longitud de onda microlitro resonancia magnética nuclear de protón resonancia magnética nuclear de carbono-13 aminoácido acetato acetato de etilo alanina Atmosferic Pressure Chemical Ionization arginina aromático ácido aspártico atmósfera terc-butilo concentración cisteína glicosilada éster terc-butílico colaboradores COrrelated SpectroscopY cisteína doblete diazabicicloundeceno N,N’-diclorohexilcarbodiimida doblete de dobletes diisopropiletilamina dimetilaminopiridina dimetilformamida Electrospray Ionization 9-fluorenilmetoxicarbonilo gramo High-Performance Liquid Chromatography Heteronuclear Single Quantum Coherence spectroscopy herzio N-acetilgalatosamina glicina hora hexafluorosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)-dimetilaminometilen]-N-metilmetanoaminio histidina 1-hidroxibenzotriazol constante de acoplamiento multiplete molaridad metilo metanol miligramo megaherzio minuto

II

mL mm mmol MS Nle nm NMP OBt PBF Ph PPh3

ppm Pro, P R RMN s Ser, S SN2 SPPS t t.a. TFA THF Thr, T TioGalNAc TIS TMS Val, V

mililitro milímetro mmol Mass Spectrometry Norleucil nanómetro N-metil-2-pirrolidona 1-hidroxibenzotriazolato 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo fenilo trifenilfosfina partes por millón prolina sustituyente alquilo o arilo, arginina resonancia magnética nuclear singlete serina sustitución nucleófila bimolecular solid-phase peptide synthesis triplete temperatura ambiente ácido trifluoroacético tetrahidrofurano treonina N-acetil-1-tio-galactosamina triisopropilsilano trimetilsililo, tetrametilsilano valina

1. Resumen

RESUMEN 3

RESUMEN

Para situar el contexto de este trabajo Fin de Grado es necesario conocer que las mucinas

son glicoproteínas de gran importancia debido a su actividad biológica en el organismo y cuya

alteración está muy ligada a una de las enfermedades más relevantes de la actualidad, el

cáncer. Concretamente, la MUC1 es la mucina más estudiada, y en particular una de sus

secuencias peptídicas, el epítopo de reconocimiento formado por los aminoácidos alanina‐

prolina‐ácido aspártico‐treonina‐arginina‐prolina (APDTRP), adquiere una especial importancia

por su interacción con los anticuerpos anti‐MUC1 del sistema inmune. Este hecho ha alentado

a la síntesis de este péptido y derivados del mismo, para su estudio en el reconocimiento

molecular con anticuerpos y su utilización en vacunas contra el cáncer.

Así, es bien conocido que la sustitución de alguno de los aminoácidos de esta secuencia

peptídica por otros no naturales, así como la glicosilación de éstos, juega un papel relevante en

su reconocimiento molecular por parte de diferentes anticuerpos anti‐MUC1, abriendo la

puerta a la síntesis de vacunas más efectivas.

En el presente trabajo Fin de Grado se detalla una nueva síntesis del aminoácido cisteína

protegido con Fmoc y glicosilado con el carbohidrato N‐acetilgalactosamina (GalNAc) a través

de un enlace ‐S‐glicosídico. La síntesis de dicho compuesto (N‐Fmoc‐Cys‐‐S‐GalNAc) solo ha sido descrita en un par de ocasiones, por Wong (2005) y por el grupo de investigación donde

se ha realizado este trabajo (2014) siguiendo metodologías diferentes. En esta ocasión su

obtención ha sido llevada a cabo mediante otra nueva y práctica metodología, pendiente

todavía de optimizar. La etapa clave consiste en una reacción de sustitución nucleófila del

átomo de bromo de un derivado de bromoalanina por parte del grupo SH del tiocarbohidrato

‐S‐GalNAc protegido.

A continuación dicho building block (N‐Fmoc‐Cys‐‐S‐GalNAc) ha sido incorporado en la secuencia APDTRP sustituyendo a la treonina (T), mediante un proceso de síntesis automática

de péptidos en fase sólida (SPPS).

La idea final, ya fuera del ámbito de este trabajo, es que este building block incorporado

pueda conferir a este glicopéptido algunas diferencias estructurales y conformacionales frente

al glicopéptido natural y a otros sintetizadas anteriormente. Estos estudios se realizarán en un

futuro próximo. De este modo, si se producen alteraciones conformacionales, éstas podrían

tener importantes consecuencias sobre el reconocimiento molecular por parte del sistema

inmune, lo que podría derivar en la síntesis de vacunas más eficaces para el tratamiento del

cáncer en un futuro.

4 RESUMEN

SUMMARY

This work is related to mucins, which are very important glycoproteins due to the

important role that they play in the organism. The alteration of their structure promotes

changes in their biologic activities and these changes are closely associated to cancer, which is

one of the most relevant diseases of our time. More specifically, MUC1 is the most studied

mucin, and one of its peptidic sequences, the recognition epitope composed by the following

amino acids: alanine‐proline‐aspartic acid‐threonine‐arginine‐proline (APDTRP), shows special

importance due to its interaction with anti‐MUC1 antibodies of immune system. This fact has

encouraged scientists to synthesize this peptide and derivatives, in order to study their

molecular recognition with antibodies and their use as vaccines against cancer.

It is well‐known that the replacement of some amino acids from this peptidic sequence

with other non‐natural amino acids, either their glycosylation, plays a relevant role in its

molecular recognition with different anti‐MUC1 antibodies, allowing the synthesis of more

effective vaccines.

The present work describes a new synthesis of the cysteine amino acid protected with

Fmoc and glycosylated with the carbohydrate N‐acetylgalactosamine (GalNAc) through a ‐S‐glycosidic bond. The synthesis of this compound (N‐Fmoc‐Cys‐‐S‐GalNAc) has been only described a couple of times before, by Wong (2005) and by the research group (2014)

responsible for the laboratory in which this work has been developed, following different

methodologies. On this occasion, the synthesis has been carried out by another new and

practical methodology, still pending optimization. The key step of this synthesis involves a

nucleophilic substitution of the bromide atom from a bromoalanine derivative with the SH

group of the protected thiocarbohydrate ‐S‐GalNAc.

Later, this building block (N‐Fmoc‐Cys‐‐S‐GalNAc) has been incorporated in the sequence APDTRP replacing threonine (T) residue, through an automatic solid‐phase peptide synthesis

(SPPS).

Finally, beyond the tasks of this work, this incorporated building block may induce a

conformational behavior on this glycopeptide different from that observed in the natural

glycopeptide and other previous synthesized derivatives. These conformational studies will be

carried out in the near future. In this way, if conformational alterations are produced, they

could have important consequences in its molecular recognition by the immune system, which

could result in the synthesis of more efficient vaccines to treat cancer in the future.

2. Introducción y objetivos

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 7

Las glicoproteínas, o sus congéneres de menor tamaño, los glicopéptidos, son moléculas

de gran interés biológico1, constituidas por una parte proteica y uno o varios restos de

carbohidrato, unidos entre sí a través de un enlace glicosídico (Figura 1). La mayoría de las

propiedades que presentan se atribuyen a su alto número de residuos glicosilados, que

aumentan la estabilidad proteica evitando su degradación química o enzimática.

Figura 1. Ejemplo de la estructura 3D de una glicoproteína (pdb: 1AX0).

Una de las glicoproteínas más importantes son las mucinas, moléculas de alto peso

molecular que asociadas a la membrana celular actúan como una barrera protectora, además

de estar también involucradas en gran número de procesos biológicos2, como inflamación,

respuesta inmunológica, comunicación intercelular, crecimiento y adherencia celular y

actividad anticongelante, entre otros.

La MUC1 es una de las mucinas más estudiadas3. Estructuralmente, esta mucina está

formada por la repetición de la secuencia de veinte aminoácidos HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA

(histidina‐glicina‐valina‐treonina‐serina‐alanina‐prolina‐aspártico‐treonina‐arginina‐glicina‐

serina‐treonina‐alanina‐prolina‐prolina‐ alanina) (Figura 2).

_________________________________________ 1 a) Buskas, T.; Thompson, P.; Boons, G.‐J. Chem. Commun. 2009, 5335‐5349; b) Essentials of Glycobiology (Eds.: Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J.; Freeze, H.; Hart, G. W.; Marth, J.), Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York, 1999; c) Pratt, M. R.; Bertozzi, R. C. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58‐68; d) Van den Steen, P.; Rudd, P. M.; Dwek, R. A.; Opdenakker, G. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1998, 33, 151‐208; e) Strous, G. J.; Dekker, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1992, 27, 57‐92; f) Varki, A. Glycobiology 1993, 3, 97‐130; g) Glycopeptides and Glycoproteins: Synthesis, Structure, and Application en Topics in Current Chemistry, (Ed.: Wittmann, V.), Springer‐Verlag, Berlín, vol. 267, 2007. 2 a) Dwek, R. A. Chem. Rev. 1996, 96, 683‐720; b) Sears, P.; Wong, C.‐H. Cell. Mol. Life Sci. 1998, 54, 223‐252. 3 a) Taylor‐Papadimitriou, J.; Burchell, J.; Miles, D. W.; Dalziel, M. Biochim. Biophys. Acta 1999, 1455, 301‐313; b) Taylor‐Papadimitriou, J.; Burchell, J. M.; Plunkett, T.; Graham, R.; Correa, I.; Miles, D.; Smith, M. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia 2002, 7, 209‐221; c) Parry, A. L.; Clemson, N. A.; Ellis, J.; Bernhard, S. S. R.; Davis, B. G.; Cameron, N. R. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 9362‐9365.

8 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

Figura 2. Secuencia de repetición de la MUC1 donde se muestran los distintos residuos que la constituyen así como

los tres epítopos principales en distintos colores.

Este dominio presenta tres regiones importantes, o epítopos propicios al reconocimiento

molecular. En primer lugar se encuentra la secuencia GVTSA (glicina‐valina‐treonina‐serina‐

alanina), que actúa como sustrato de las enzimas GalNAc transferasas4. Al final aparece la

secuencia GSTAP (glicina‐serina‐treonina‐alanina‐prolina), que es reconocida por algunos

anticuerpos. Y entre ambas, se observa la secuencia APDTRP (alanina‐prolina‐aspártico‐

treonina‐arginina‐prolina), que es reconocida por los anticuerpos anti‐MUC15, y que cobra una

gran importancia ya que ha permitido que el diseño de varias vacunas contra el cáncer sea

posible.

En la actualidad, el cáncer es una de las enfermedades de mayor relevancia en el mundo

por su incidencia, prevalencia y mortalidad. De hecho, está considerado como un problema de

salud prioritario, siendo la segunda causa de mortalidad en los países desarrollados. Cada año,

la incidencia del cáncer aumenta, aunque por otro lado disminuye su mortalidad, debido a los

avances en el diagnóstico y el tratamiento.

Esta enfermedad está provocada por la proliferación no controlada de un grupo de

células, que se multiplican de manera autónoma invadiendo localmente y a distancia otros

tejidos. Estudios sobre células tumorales han demostrado que tanto lipoproteínas como

glicoproteínas de la membrana celular sufren importantes alteraciones estructurales en células

afectadas6.

_________________________________________ 4 Dziadek, S.; Griesinger, C.; Kunz, H.; Reinscheid, U. M. Chem. Eur. J. 2006, 12, 4981–4993 5 a) Takeuchi, H.; Kato, K.; Denda‐Nagai, K.; Hanisch, F.G.; Clausen, H.; Irimura, T. J. Immunol. Methods. 2002, 270, 199‐209. b) Burchell, J. M.; Gendler, S. J.; Taylor‐Papadimitriou, J.; Girling, A.; Lewis, A.; Millis, R.; Lamport, D. Cancer Res. 1987, 47, 5476‐5482. 6 a) Wilson, R. M.; Danishefsky, S. J. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 14462–14472; b) Rudd, P. M.; Elliott, T.; Cresswell, P.; Wilson, I. A.; Dwek, R. A. Science 2001, 291, 2370‐2376.


En células tumorales, la MUC1 se encuentra sobre‐expresada y presenta fallos en la

glicosilación por el mal funcionamiento de algunas glicosiltransferasas. Esta glicosilación

parcial y la aparición de glicanos más cortos y menos complejos de lo común, deja expuestos

en la superficie algunos antígenos que en células sanas quedarían enmascarados por

carbohidratos más ramificados, pudiendo ser reconocidos por anticuerpos7 (Figura 3). Estas

alteraciones interfieren en la adhesión y reconocimiento molecular por parte del sistema

inmune, favoreciéndose la metástasis (propagación del foco canceroso).

Figura 3. Representación de una mucina en una célula sana y una tumoral.

Actualmente, los tratamientos contra el cáncer se basan en la cirugía, la quimioterapia o

la radioterapia, métodos invasivos y poco selectivos que pueden llegar a dar lugar a reacciones

laterales, sin ser capaces de diferenciar células sanas de células cancerígenas. Por ello, la

identificación de los antígenos asociados a células tumorales es de gran importancia,

permitiendo diseñar tratamientos más efectivos contra el cáncer8.

_________________________________________ 7 a) Sell, S. Human Path. 1990, 21, 1003–1019; b) Hakomori, S.; Zhang, Y. Chem. Biol. 1997, 4, 97‐104; c) Taylorpapadimitriou, J.; Epenetos, A. A. Trends Biotech. 1994, 12, 227–233; d) Gabius, H. J. Angew. Chem. 1988, 27, 1267–1276. 8 a) Blattman, J. N.; Greenberg, P. D. Science 2004, 305, 200‐205; b) Moingeon, P. Vaccine 2001, 19, 1305‐1326; c) Jarcz, S.; Chen, J.; Kuznetsova, L. V.; Ojima, I. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5043‐5054; d) Dziadek, S.; Hobel, A.; Schmitt, E.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 7630‐7635; e) Buskas, T.; Ingale, S.; Boons, G.‐J. Glycobiology 2006, 16, 113R‐136R.


La mucina MUC1 ha sido incorporada en vacunas9,10, estimulando al sistema inmune para

producir anticuerpos capaces de reconocer los antígenos característicos de células tumorales y

eliminándolas selectivamente. Además, a estas vacunas se incorporan coadyuvantes, con la

función de romper la tolerancia que el sistema inmune presenta frente a estos antígenos que

reconoce como propios. Un ejemplo es la vacuna diseñada por el profesor Boons y col., la cual

ha sido capaz de generar una respuesta inmune en ratones capaz incluso de reducir el tamaño

de los tumores11 (Figura 4).

Figura 4. Vacuna de tres componentes sintetizada por el profesor Boons y col.

El estudio de MUC1 adquiere por ello gran importancia, pues en células tumorales estos

errores en la glicosilación dejan al descubierto antígenos como el Tn, el STn y el TF12 (Figura 5)

permitiendo la diferenciación de células tumorales frente a células sanas.

_________________________________________ 9 a) Slovin, S. F.; Keding, S. J.; Ragupathi, G. Immunol. Cell Biol. 2005, 83, 418‐428; b) Xu, Y.; Sette, A.; Sidney, J.; Gendler, S. J.; Franco, A. Immunol. Cell Biol. 2005, 83, 440‐448; c) Freire, T.; Bay, S.; Vichier‐Guerre, S.; Lo‐Man R.; Leclerc, C. Med. Chem. 2006, 6, 1357‐1373; d) Cipolla, L.; Peri, F.; Airoldi, C. Anti‐Cancer Agent Med. Chem. 2008, 8, 92‐121; e) Warren, J. D.; Geng, X. D.; Danishefsky, S. J. Top. Curr.Chem. 2007, 267, 109‐141; f) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 836‐863; g) Kuberan, B.; Linhardt, R. J. Curr. Org. Chem. 2000, 4, 653‐677; h) Liakatos, A.; Kunz, H. Curr. Opin. Mol. Ther. 2007, 9, 35‐44; i) Cobb, B. A.; Kasper, D. L. Eur. J. Immunol. 2005, 35, 352‐356. 10 a) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085‐3112; b) Dziadek, S.; Kunz, H. The Chem. Rec. 2004, 3, 308‐321; c) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 836‐863; d) Slovin, S. F.; Ragupathi, G.; Musselli, C.; Olkiewicz, K.; Verbel, D.; Kuduk, S. D.; Schwarz, J. B.; Sames, D.; Danishefsky, S. J.; Livingston, P. O.; Scher, H. I. J. Clin. Oncol. 2003, 21, 4292‐4298; e) Chen, X.; Lee, G. S.; Zettl, A.; Bertozzi, C. R. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 6111‐6116; g) Galonic, D. P.; Gin, D. Y. Nature 2007, 446, 1000‐1007; f) Hang, H. C.; Bertozzi, C. R. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5021‐5034. 11 Lakshminarayanan, V.; Thompson, P.; Wolfert, M. A.; Buskas, T.; Bradley, J. M.; Pathangey, L. B.; Madsen, C. S.; Cohen, P. A.; Gendler, S. J.; Boons, G. J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012, 109, 261‐266. 12 Müller, S.; Goletz, S.; Packer, N.; Gooley, A.; Lawson, A. M.; Hanisch, F. G. J. Biol. Chem. 1997, 272, 24780‐24793.


OHO

HOAcHN

OH

O

R

OH

NH2

O

Tn

R=HR=CH3

OHO

AcHNO

R

OH

NH2

O

sTn

R=HR=CH3

OAcHN

HO

HOOH

HO

COOH

OOH

OHO

OAcHN

OH

O

R

OH

NH2

O

R=HR=CH3

OHO

HOOH

OH

TF

Figura 5. Antígenos asociados a tumores formados por carbohidratos presentes en la MUC1.

Gran variedad de anticuerpos anti‐MUC1 reconocen estos antígenos y se unen

específicamente a células tumorales, reconociendo la secuencia APDTRP. Este reconocimiento

es más efectivo cuando la treonina se encuentra glicosilada con N‐acetilgalactosamina

(GalNAc)13, a través de un enlace α‐O‐glicosídico, dando lugar al glicosilaminoácido

denominado antígeno Tn (Figura 6).

Figura 6. Estructura del antígeno Tn (treonina glicosilada).

Actualmente, se están diseñando antígenos basados en la secuencia APDTRP con el

objetivo de inducir una mejor respuesta del sistema inmune del paciente. Hay varios modos de

conseguir este propósito. Uno de ellos sería el uso de aminoácidos o carbohidratos

modificados. Una de las líneas de investigación del grupo en el que se ha desarrollado este

trabajo, por ejemplo, está basada en la síntesis de antígenos con aminoácidos no naturales,

siendo reconocidos como extraños por el sistema inmune y provocando la producción de un

mayor número de anticuerpos.

_________________________________________ 13 Karsten, U.; Serttas, N.; Paulsen, H.; Danielczyk, A.; Goletz, S. Glycobiology 2004, 14, 681‐692.


Otra aproximación sería la sustitución del oxígeno del enlace α‐O‐glicosídico por un átomo

de azufre, dando lugar a un sistema no natural con un enlace α‐S‐glicosídico. Las ventajas de

esta modificación radican en las diferencias en las propiedades de oxígeno y azufre: además de

ser el oxígeno más electronegativo que el azufre, éste último es más voluminoso, provocando

una mayor separación entre el péptido y el carbohidrato a través del enlace glicosídico, lo que

podría tener implicaciones en el reconocimiento molecular por parte de los anticuerpos. Otro

hecho importante es que los enlaces O‐glicosídicos son más lábiles a la hidrólisis enzimática

(debido al mayor número de enzimas que reconocen este sistema natural) que los S‐

glicosídicos (sistema no natural). Esto confiere una gran estabilidad al antígeno sustituido con

azufre, pudiendo permanecer más tiempo en el paciente hasta llegar a la zona afectada, dando

la posibilidad de crear así vacunas más efectivas.

En conclusión y dentro del contexto anteriormente comentado, el objetivo de este

Trabajo Fin de Grado es la síntesis, purificación y caracterización del glicopéptido 1 (Figura 7),

un antígeno no natural basado en la secuencia APDTRP donde la treonina ha sido sustituida

por una cisteína glicosilada con GalNAc, dando lugar a un enlace α‐S‐glicosídico, y que podría

tener importantes consecuencias en el reconocimiento molecular de anticuerpos del sistema

inmune.

Figura 7. APDCgRP, glicopéptido 1 objetivo de síntesis.

3. Antecedentes

ANTECEDENTES 15

En este capítulo se describen los procedimientos sintéticos para la formación de enlaces

peptídicos y glicosídicos que han sido usados para la síntesis del glicopéptido de este trabajo,

además de un breve resumen sobre la síntesis en fase sólida de péptidos, también utilizada.

Formación del enlace peptídico

El enlace peptídico está formado por la unión de los grupos amina y ácido carboxílico de

dos aminoácidos, generando un enlace amida entre ellos. Las condiciones óptimas para esta

reacción requieren la activación previa del grupo carboxílico, haciéndolo más reactivo frente al

ataque nucleófilo de la amina1.

De este modo, y para minimizar los procesos de racemización, el procedimiento más

extendido se basa en el uso de agentes de acoplamiento, capaces de formar especies muy

reactivas que facilitan la formación del enlace amida.

El uso de carbodiimidas, como la N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC), ha sido uno de los

más extendidos en reacciones de acoplamiento para síntesis de péptidos. Actualmente existen

otros agentes de acoplamiento más modernos como el HBTU (N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-

1-il)-dimetilaminometilen]-N-metilmetanaminio)2 (Figura 1).

Figura 1. Estructura del HBTU usado como agente de acoplamiento.

En presencia de una base, el HBTU puede convertir el grupo carboxilato del aminoácido

en una especie activada, reduciendo los tiempos de reacción y obteniendo buenos

rendimientos para la formación del enlace peptídico. Es por ello que éste será el

procedimiento elegido para el estudio de dicha reacción (Esquema 1).

__________________________________________ 1 Herzner, H.; Reipen, T.; Schultz, M.; Kunz, H. Chem. Rev. 2000, 100, 4495-4537.

2 Knorr, R.; Trzeciak, A.; Bannwarth, W.; Gillessen, D. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930.

16 ANTECEDENTES

Esquema 1. Ejemplo de formación de un enlace peptídico con un agente de acoplamiento.

Tanto la cadena peptídica creciente, como el aminoácido que se quiere incorporar, son

compuestos bifuncionales que poseen un grupo ácido y un grupo amino en sus extremos. Para

controlar su unión y evitar reacciones laterales y polimerizaciones indeseadas, se debe

bloquear o proteger la amina o el carboxilo que no se desea que reaccione. Por ello, el proceso

de formación de la cadena peptídica se dividirá en etapas, contando cada una con un paso de

protección, otro de formación de enlaces amidas y una desprotección final, para liberar los

grupos reactivos que participarán en la siguiente reacción.

El grupo protector del grupo amino más empleado y que vamos a utilizar a lo largo de

este trabajo es el Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), que da lugar a un carbamato de fácil

eliminación en medio básico. Por otra parte, los ácidos carboxílicos suelen protegerse como

ésteres, usando el éster terc-butílico (CO2tBu) en nuestro caso.

Esta es la base de la síntesis de péptidos en fase sólida, que ahora se describirá en mayor

profundidad.

ANTECEDENTES 17

Síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, solid-phase peptide synthesis)

En 1963, Merrifield describió por primera vez la idea de una síntesis en fase sólida, que a

día de hoy se ha convertido en la manera más sencilla y habitual de obtener péptidos3. Este

método se basa en la unión de un aminoácido a través de su grupo carboxilo terminal a un

soporte polimérico insoluble (llamado resina), para después llevar a cabo el proceso de

elongación de la cadena peptídica uniendo más aminoácidos por el extremo N-terminal.

Este método presenta numerosas ventajas comparado a la síntesis de péptidos en

disolución:

Mejores rendimientos, evitando pérdidas del péptido al mantener su soporte sólido en

el mismo recipiente hasta el final del proceso.

Posibilidad de utilizar exceso de reactivos fácilmente eliminables (por lavado y filtrado)

ya que el péptido se encuentra fijado a un soporte sólido.

Facilidad y automatización de las operaciones de lavado y filtrado.

El crecimiento de la cadena peptídica se realiza mediante la adición secuencial de

aminoácidos con el grupo ácido libre, que se van uniendo al extremo N-terminal del

aminoácido anterior ya fijo a la resina, creciendo la cadena desde el extremo carboxilo hacia el

extremo amino del péptido.

Los extremos de cada aminoácido, mientras no participen en la reacción, deben estar

convenientemente protegidos. Para ello, se sigue la estrategia Fmoc/tBu. El primero como

protector del grupo amino y el segundo para el grupo carboxilo y las cadenas laterales de los

aminoácidos.

El grupo protector del amino, Fmoc, es eliminado en medio básico usando piperidina,

dejando el grupo amino libre. Se une entonces el siguiente aminoácido por su grupo

carboxílico, previamente activado para favorecer la reacción, formando el enlace peptídico.

Este proceso de desprotección y acoplamiento se repite hasta conseguir la secuencia completa

del péptido deseado. Finalmente, la cadena peptídica se separa de la resina y se eliminan los

grupos protectores de las cadenas laterales, habitualmente en una única etapa.

El Esquema 2 muestra una visión global de las reacciones que tienen lugar, desde la

introducción de la resina junto con los aminoácidos en el sintetizador hasta la obtención del

péptido.

__________________________________________ 3 Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154.

18 ANTECEDENTES

Esquema 2. Etapas en SPPS para la obtención de un tripéptido (Aa = aminoácido).

ANTECEDENTES 19

Formación del enlace S-glicosídico

En la mayoría de las glicoproteínas, los carbohidratos aparecen unidos a la cadena

peptídica mediante enlaces O-glicosídicos4. No obstante, para este trabajo se utilizará otro tipo

de enlace, el S-glicosídico, para realizar la unión de aminoácido y carbohidrato a través de un

átomo de azufre.

Existen dos estereoisómeros posibles a la hora de formar un enlace S- (o también O-

glicosídico): los anómeros α y . En una configuración de silla 4C1 del monosacárido, el enlace α

tiene el grupo SR en axial, mientras que en el enlace se encuentra en posición ecuatorial.

(Figura 3).

Figura 3. Anómero α (izquierda) y (derecha) para un enlace S-glicosídico, en una silla 4C1.

En el presente trabajo, el enlace S-glicosídico entre el GalNAc y la L-cisteína muestra una

configuración α. En la Figura 4 se muestra el building block (compuesto 2) que se utilizará en la

síntesis del glicopéptido 1.

Figura 4. Building block utilizado en la síntesis del glicopéptido 1

__________________________________________ 4 a) Taylor, C. M. Tetrahedron 1998, 54, 11317-11362; b) Boons, G. J. Tetrahedron 1996, 52, 1095-1121;

c) Davis, B. G. J. Chem. Soc. Perk. T 1 2000, 2137-2160; d) Arsequell, G.; Valencia, G. Tetrahedron-Asymmetr. 1997, 8, 2839-2876; e) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112.

20 ANTECEDENTES

Se ha realizado una búsqueda bibliográfica para ver si este compuesto ya estaba

sintetizado con anterioridad, encontrándose que ya se había obtenido un building block

análogo al compuesto 2, con otros grupos protectores diferentes, utilizando unas condiciones

muy particulares y difíciles de reproducir5 (ver parte superior del Esquema 3). Por todo ello,

recientemente en el grupo de investigación en el que se ha desarrollado este trabajo, se

realizó la síntesis del compuesto 2 utilizando como etapa clave una reacción de S-Michael

asimétrica, seguida de posteriores transformaciones de grupos funcionales6 (ver parte inferior

del Esquema 3). Sin embargo, ahora se pretende sintetizarlo de una manera “a priori” más

fácil, utilizando la metodología consistente en el desplazamiento nucleófilo del átomo bromo

de una bromoalanina, adecuadamente protegida, por parte del grupo tiol del S-GalNAc.

Además, basándonos en un reciente trabajo donde se promueve este tipo de desplazamiento

nucleófilo mediante el uso de tamiz molecular de 4 Å7, se quiere explorar esta posibilidad para

el caso concreto que nos ocupa (ver Esquema 4).

Esquema 3. Síntesis previas del glicoaminoácido objetivo.

__________________________________________ 5 Desiree A. Thayer; Henry N; Yu,M; Carmen Galan; Chi-Huey Wong Angew. Chem. Int. 2005, 44, 4596 –

4599 6 arlos ydillo smael ompa ón; Alberto Avenoza; es s H. Busto; Francisco Corzana; es s M.

Peregrina; María M. Zurbano J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 789−800 7

Calce, E.; Leone, M.; Monfregola, L.; De Luca, S. Org. Lett. 2013, 15, 5354-5357

ANTECEDENTES 21

Por tanto, en primer lugar es necesario preparar el compuesto 5, tal y como está descrito

en la literatura8. La metodología se basa en hacer reaccionar la galactosamina peracetilada,

compuesto 3, con el llamado reactivo de Lawesson que, debido a la formación de un

intermedio cíclico rígido, compuesto 4, obtiene finalmente la configuración α para el S-GalNAc,

compuesto 5. El siguiente paso consistiría en la glicosilación de un derivado de bromoalanina,

compuesto 7, utilizando las condiciones anteriormente comentadas y que facilitan “a priori” la

reacción de sustitución nucleófila (Esquema 4). Esto se discutirá en la sección de Discusión de

Resultados.

Esquema 4. Obtención del enlace S-glicosídico en el glicoaminoácido 2.

Una vez obtenido este building block 2 y utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida ya

estaríamos en condiciones de abordar la síntesis del glicopéptido 1 objeto de este trabajo.

__________________________________________ 8 Spencer Knapp; David S. Myers J. Org. Chem. 2002, 67, 2995-2999

4. Discusión de resultados

DISCUSIÓN DE RESULTADOS 25

El objetivo de esta investigación es la síntesis de la secuencia APDCgRP (alanina-prolina-

ácido aspártico-cisteína glicosilada-arginina-prolina), compuesto 1 (Figura 1), ya que es un

derivado de uno de los epítopos principales de la mucina MUC1.


A. Síntesis del building block 2

La cisteína glicosilada con GalNAc, compuesto 2 (Figura 2), será en este caso el building

block que se deberá obtener tras el debido acoplamiento entre el aminoácido y el

carbohidrato correspondientes y que posteriormente se utilizará en la SPPS para obtener el

péptido deseado.

Figura 2. Building block utilizado en la síntesis del glicopéptido 1

26 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

A.1. Preparación del carbohidrato 5

En primer lugar, la galactosamina peracetilada, compuesto 3, se hace reaccionar con el

reactivo de Lawesson, con el que se forma un intermedio al que denominamos compuesto 4

(Esquema 1).

Esquema 1

A continuación, este intermedio 4 se hace reaccionar con ácido trifluoroacético (TFA) y

agua para obtener finalmente el carbohidrato deseado, compuesto 5, (Esquema 2) que se

deberá purificar en columna previamente a su utilización.

Esquema 2

A.2. Preparación del aminoácido 7

A continuación, se prepara el aminoácido para su acoplamiento al carbohidrato 5.

Se parte de un derivado de serina comercial, compuesto 6, cuyo grupo amino está

protegido con Fmoc y el grupo ácido como éster terc-butílico. Después, se hace reaccionar

este aminoácido con tetrabromuro de carbono (CBr4) y trifenilfosfina (PPh3), obteniendo así el

producto 7, donde el grupo –OH de la serina ha sido intercambiado por un átomo de bromo

(Esquema 3).

Esquema 3


Por último, se purifica el crudo de esta reacción en columna cromatográfica utilizando

como eluyente una mezcla de hexano y AcOEt en una proporción 7:3, respectivamente.

A.3. Formación del enlace glicosídico entre el aminoácido y el carbohidrato

Una vez obtenidos los productos 5 y 7, se realiza el acoplamiento de ambos a través de un

ataque nucleófilo del azufre al compuesto 7 desplazando el átomo de bromo mediante una

reacción SN2. La reacción tiene lugar en presencia de tamiz molecular de 4 Å, con DMF como

disolvente y bajo atmósfera inerte, durante 24 horas. Para que la reacción tenga lugar es muy

importante que el tamiz molecular esté previamente activado en mufla a 300 ºC. Así se

obtiene, con un rendimiento moderado, el producto 2 que es la cisteína glicosilada, es decir el

building block necesario para incorporarlo en la síntesis en fase sólida (Esquema 4).

Esquema 4

Para la purificación, es conveniente realizar una columna con gradiente para una

separación más efectiva del producto 2 y el crudo obtenido en la reacción, nuevamente

utilizando como eluyente una mezcla de AcOEt/hexano en las proporciones indicadas en la

parte experimental.

El posterior tratamiento del glicoaminoácido 2 con diclorometano y ácido trifluoroacético

(TFA) desprotege el grupo carboxilo de la cisteína, dejando el glicoaminoácido 2’ listo para el

acoplamiento a la cadena peptídica (Esquema 5).

Esquema 5


B. Síntesis del glicopéptido 1

La síntesis del glicopéptido objetivo se llevó a cabo mediante la metodología de SPPS

(síntesis de péptidos en fase sólida), como se ha mencionado en el capítulo Antecedentes, y

que ahora se explicará de una perspectiva más próxima a su aplicación.

Una etapa de gran relevancia es la elección de la resina (Figura 3), ya que determina cómo

se obtendrá el extremo C-terminal (-CONH2 en nuestro caso) y también condiciona la etapa

para la liberación del péptido, denominada comúnmente cleavage.

Figura 3. Resina utilizada en SPPS (Rink Amide MBHA resin, Noviabiochem®)

En primer lugar, la resina se activa liberando el grupo protector del grupo amino (Fmoc)

con piperidina (base) en dimetilformamida (DMF) como disolvente, para así tener lista la resina

para el primer acoplamiento.

A continuación, utilizando la estrategia Fmoc-tBu, se acoplan los aminoácidos en el orden

necesario para completar la secuencia peptídica APDCgRP. Se añade el primer aminoácido a

acoplar (prolina, P) con su grupo amino protegido como –NHFmoc. Para una mayor

efectividad, se utiliza HBTU (que actúa como buen grupo saliente para el acoplamiento) y

diisopropiletilamina (DIEA) como base, usando de nuevo DMF como disolvente. Se deberá

trabajar con 10 equivalentes de aminoácido por cada equivalente de resina.

Acto seguido, se desprotege el grupo N-terminal de la prolina de la misma forma que se

hizo con la resina, para continuar con el proceso. Las etapas de acoplamiento y desprotección

de Fmoc se repiten tantas veces como aminoácidos sea necesario acoplar, quedando

finalmente el extremo del péptido como un amino terminal.

No obstante, hay que tener en cuenta que el tercer aminoácido a acoplar (la cisteína

glicosilada, Cg) es nuestro building block, compuesto 2, y que se ha obtenido en la escala del

miligramo. Por ello no se puede introducir en el sintetizador con un exceso de 10 equivalentes

por equivalente de resina, así que el acoplamiento hay que hacerlo de manera manual.

En primer lugar, debemos saber que el building block tiene su ácido carboxílico terminal

protegido como éster terc-butílico, por lo que previamente a su acoplamiento debemos

desproteger este grupo usando ácido trifluoroacético (TFA) y diclorometano como disolvente,

reacción que transcurre de manera cuantitativa (ver Esquema 5).


Después, el acoplamiento manual se lleva a cabo utilizando los mismos reactivos que para

el resto de acoplamientos (HBTU como pegador, DIEA como base y DMF como disolvente)

pero con cantidades en menor escala, para a continuación seguir con el acoplamiento del resto

de aminoácidos utilizando el procedimiento SPPS en el sintetizador.

Cuando se introduce como building block un glicosil-aminoácido, los grupos hidroxilo del

carbohidrato se encuentran protegidos en forma de acetatos. Esto implica una etapa extra de

liberación de estos acetatos que se realiza con una mezcla de hidrazina (N2H4) y metanol.

Además, es necesario liberar la cadena peptídica de la resina (etapa conocida como cleavage).

Este proceso se realiza usando una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA), triisopropilsilano

(TIS) y agua. En estas condiciones, además, se desprotege el resto de grupos protectores de los

aminoácidos (Esquema 6).

Esquema 6. Proceso de work-up y cleavage del glicopéptido obtenido.

Finalmente, se realiza la separación física de la resina haciendo precipitar la cadena

peptídica en éter frío, y se procede a la purificación del glicopéptido 1 mediante cromatografía

líquida de alta resolución (HPLC) semipreparativa.

En el apartado Experimental se encuentran las especificaciones de este proceso para el

glicopéptido sintetizado, compuesto 1, así como para todos los compuestos previos que han

sido necesarios para llegar a él.


Para finalizar, en el Esquema 7 se muestra un resumen de la síntesis del building block

(compuesto 2) necesario para llevar a cabo la SPPS del glicopéptido 1. Un esquema general de

la SPPS de este glicopéptido se puede observar en el Esquema 8.

Esquema 7. Ruta sintética de los glicoaminoácidos 2 y 2’ (derivados de cisteína).


Esquema 8. Síntesis en fase sólida del glicopéptido 1.

5. Conclusiones

CONCLUSIONES 35

Se ha llevado a cabo la síntesis de un derivado de una de las secuencias más importantes

de la glicoproteína mucina-1 (MUC1), el epítopo APDCgRP (1), sustituyendo la treonina de la

secuencia natural APDTR por una cisteína glicosilada con GalNAc, a través de un enlace α-S-

glicosídico. La síntesis ha sido realizada mediante una metodología de síntesis automática de

péptidos en fase sólida.

Para ello, ha sido necesario poner a punto un nuevo método de síntesis del building block

derivado de cisteína -glicosilada con GalNAc (compuesto 2). La etapa clave de dicha síntesis

ha consistido en una reacción se sustitución nucleófila de un átomo de bromo de un derivado

de bromoalanina por parte del grupo SH de la tri-O-acetil-2-acetamido-2-desoxi-1-tio--D-

galactosa, abreviada como -S-GalNAc. La preparación del tiocarbohidrato se realizó a partir

de galactosamina peracetilada, haciéndola reaccionar con el reactivo de Lawesson y posterior

tratamiento ácido. El derivado de bromoalanina se obtuvo mediante bromación del

aminoácido serina adecuadamente protegido, utilizando como reactivos tetrabromuro de

carbono (CBr4) y trifenilfosfina (PPh3).

Posteriormente, este building block 2 se incorporó a la cadena peptídica utilizando Fmoc

como grupo protector de la amina y HBTU como agente de acoplamiento para la formación del

enlace amida de manera manual para conseguir mejor rendimiento con menor cantidad de

producto. A continuación se volvió a incorporar al sintetizador automático de péptidos (con los

mismos reactivos) para acoplar el resto de aminoácidos.

De este modo, se ha conseguido sintetizar el glicohexapéptido 1 (Figura 1) en la escala del

miligramo, obteniendo 18.4 mg tras su purificación en HPLC. Este compuesto fue caracterizado

por técnicas de Resonancia Magnética Nuclear y análisis de masas.


36 CONCLUSIONES

Fuera del ámbito de este Trabajo Fin de Grado, se pretende estudiar la interacción de este

compuesto con distintos anticuerpos y lectinas. De este modo, se tratará de comprobar hasta

qué punto la disposición espacial de la cadena peptídica y del carbohidrato, así como la

sustitución de un aminoácido natural del epítopo (treonina) por uno no natural (cisteína) y la

presencia de un enlace α-S-glicosídico (sistema no natural), tiene consecuencias en la

interacción de un proteína (anticuerpo o lectina) con un glicopéptido.

Si los resultados son satisfactorios, esto podría derivar en una mayor respuesta por parte

del sistema inmune, pudiendo sintetizarse en un futuro vacunas más eficaces contra el cáncer.

6. Experimental

EXPERIMENTAL 39

Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C se realizaron en un

espectrómetro Bruker Avance-400 para todos los compuestos. Los desplazamientos químicos

se expresaron en ppm en la escala δ y las constantes de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizaron

como disolventes deuterados cloroformo, con TMS como referencia interna y agua deuterada,

con referencia interna del propio disolvente.

Los análisis electrospray-espectrometría de masas (ESI-MS) se realizaron en un equipo

microTOF-Q-BRUKER con fuente Multi Mode, ionización ESI+APCI y se registraron en modo de

ión positivo.

La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel (Polychrom SI F254)

sobre soporte de poliéster y para su visualización se utilizó luz ultravioleta, disolución

reveladora de H2SO4 al 5% en etanol y revelador de ácido fosfomolíbdico en etanol.

La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04-0.06 nm (230-240

mesh).

La purificación del glicopéptido 1 se llevó a cabo mediante HPLC semipreparativo (Waters

Delta Prep 4000 reverse phase HPLC y Waters 2987 Dual Absorbance Detector), empleando

una columna Phenomenex Luna C18 de 10 µm con dimensiones de 250 mm x 21.2 mm. La

detección UV se realizó a λ = 212 y 254 nm.

Todas las reacciones se realizaron empleando disolventes secos.

La síntesis en fase sólida se realizó en un sintetizador de péptidos Model 433A Peptide

Synthesizer de Applied Biosystems, cuyo tratamiento de datos se hizo con el software

SynthAssist 2.0.

40 EXPERIMENTAL

2-N-Acetil-3,4,6-tri-O-acetil-2-desoxi-1-tio-α-D-galactopiranosa (5)

5

Se añaden a un matraz esférico el GalNAc peracetilado (compuesto 3, 12.40 g, 32.0

mmol), el reactivo de Lawesson (11.0 g, 27.2 mmol) y el disolvente (125 mL de una mezcla

tolueno/dicolorometano, (1:1) de modo que la proporción sea 1 mL de disolvente por 0.1 g de

GalNAc). A este matraz se le acopla un tubo de refrigeración unido a un borboteador de

vaselina y se calienta a reflujo (aprox. 80 ºC) con agitación, durante aproximadamente 8 h. Se

evapora el disolvente en un rotavapor, obteniéndose de este modo y de forma prácticamente

cuantitativa el intermedio 4, el cual presenta un color rojo intenso.

A continuación, se disuelve el intermedio 4 (32.0 mmol) en metanol (120 mL) bajo

agitación y se coloca el matraz en un baño de hielos. Se añade entonces el TFA (10 mL, 130.2

mmol) y se deja el matraz a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación. Se añade

el agua destilada (10 mL, 625.0 mmol) y se deja agitando a temperatura ambiente durante 3 h.

Finalmente, se evapora el disolvente en el rotavapor, añadiendo tolueno varias veces para

facilitar la evaporación del TFA.

El residuo se purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice en una mezcla de

AcOEt/diclorometano, 8:2, obteniéndose así el compuesto 5 (60-70%), como un sólido rojizo.

Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los descritos en la

bibliografía1.

__________________________________________ 1 Spencer Knapp; David S. Myers J. Org. Chem. 2002, 67, 2995-2999

EXPERIMENTAL 41

Éster terc-butílico de N-Fmoc-bromoalanina (7)

7

En un matraz esférico se disuelve la PPh3 (1.03 g, 3.91 mmol) en 10 mL de diclorometano

bajo agitación. Se añade después el CBr4 (0.52 g, 1.56 mmol), dejando la disolución en

agitación durante 40 minutos. Por otra parte, se disuelve la serina con los extremos ácido y

amino protegidos como tBu y Fmoc, respectivamente, (compuesto 6, 0.5 g, 1.30 mmol) en 5

mL de diclorometano y se añade gota a gota al matraz de reacción, dejándolo agitar durante

otros 10 minutos.

Para eliminar los óxidos de trifenilfosfina que se hayan podido formar y así evitar

problemas en la purificación, éstos se hacen precipitar añadiendo unos 50 mL de una

disolución formada por éter etílico/hexano en una proporción 3:2 y se filtra en una placa

filtrante con arena y gel de sílice, recogiendo el filtrado para evaporar en el rotavapor.

El residuo se purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice, usando una mezcla

de hexano/AcOEt (7:3) como eluyente, obteniéndose el compuesto 7 (0.465 g, 80%) en forma

de sólido blanco.

(c 1.0000, CHCl3)

HRMS ESI+ (m/z) = 446.0952 [M+H]+; calculado C22H25BrNO4+ = 446.0889

1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.78 – 7.74 (m, 2H, Fmoc), 7.62 – 7.58 (m, 2H, Fmoc), 7.41 – 7.29 (m, 4H, Fmoc), 5.74 (d, 1H, J = 7.2 Hz, NH), 4.74 – 4.62 (m, 1H, Hα), 4.38 (m, 2H, CH2 Fmoc), 4.23 (t, 1H, J = 7.1 Hz, CHFmoc), 3.76 – 3.80 (m, 2H, H Ala), 1.51 (s, 9H, tBu).

13C RMN (100 MHz, CDCl3) δ (ppm): 167.7, 155.5 (C=O), 143.7, 143.6, 141.2, 127.7, 127.0, 125.1, 125.1, 119.9 (arom.), 83.5 (CtBu), 67.3 (CH2 Fmoc), 54.49 (Cα), 47.0 (CH Fmoc), 34.3 (C ), 27.9 (CH3 tBu).

42 EXPERIMENTAL

Éster terc-butílico de N-Fmoc-L-cisteína(α-S-D-2-N-acetil-3,4,6-tri-O-acetil-2-desoxigalactosil)

(2)

2

En primer lugar se debe activar el tamiz molecular de 4 Å, dejándolo en mufla durante

toda una noche a 600 ºC. Se trasvasa el tamiz molecular a un schlenck y se cierra. La reacción

tiene lugar en atmósfera inerte, por lo que se hará vacío en el schlenck mientras se agita

durante unos minutos a 300 ºC, para después dejar enfriar a temperatura ambiente.

En otro matraz se coloca el tioazúcar (compuesto 5, 0.41 g, 1.13 mmol) y se introduce con

jeringa la DMF (6 mL) para disolverlo. Esta disolución se trasvasa al schlenck con el tamiz, a

través de una cánula, dejándolo agitar después durante 5 minutos. Se repetirá el mismo

procedimiento con la bromoalanina protegida (compuesto 7, 0.17 g, 0.38 mmol, disuelto en 2

mL de DMF). Se deja agitando la disolución final durante 24 h y, finalmente, se filtra el

contenido del schlenck en placa filtrante sobre tierra de diatomeas para desechar el tamiz

molecular. A continuación se evapora el disolvente en el rotavapor.

El residuo se purifica por cromatografía de columna en gradiente, sobre gel de sílice

siguiendo la siguiente serie de proporciones: AcOEt/hexano, 1:1, 6:4 y 7:3, obteniéndose el

compuesto 2 (0.105 g, 26%) como un sólido blanco.

HRMS ESI+ (m/z) = 729,2608 [M+H]+; calculado C36H45N2O12S+ = 729.2615

1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.80 – 7.74 (m, 2H, Fmoc), 7.64 – 7.60 (m, 2H, Fmoc), 7.42 – 7.24 (m, 4H, Fmoc), 6.11 (d, 1H, J = 8.5 Hz, NHCys), 5.68 (d, 1H, J = 8.9 Hz, NHGalNAc), 5.40 – 5.36 (m, 2H, H-1, H-4), 4.96 (dd, 1H, J = 11.8, 3.0 Hz, H-3), 4.88 – 4.75 (m, 1H, H-2), 4.63 – 4.50 (m, 1H, Hα Cys), 4.50 – 4.34 (m, 3H, H-5, CH2 Fmoc), 4.23 – 419 (m, 2H, H-6, CHFmoc), 4.01 (dd, 1H, J = 11.2, 7.5 Hz, H-6), 3.26 (dd, 1H, J = 14.3, 4.8 Hz, H Cys), 3.01 (dd, 1H, J = 14.3, 3.1 Hz, H Cys), 2.19 (s, 3H, AcNGalNAc), 2.09 – 1.91 (m, 9H, AcOGalNAc), 1.47 (s, 9H, tBu).

13C RMN (100 MHz, CDCl3) δ (ppm): 170.9, 170.5, 170.2, 170.0, 168.8 (C=O), 155.8, 143.9, 143.8, 141.4, 141.3, 127.7, 127.1, 127.0, 125.1, 120.0 (arom.), 87.3 (C-1), 82.9 (C tBu), 68.3 (C-3), 68.2 (C-5), 67.4 (C-4), 66.9 (CH2 Fmoc), 62.0 (C-6), 54.5 (Cα Cys), 48.4 (C-2), 47.2 (CH Fmoc), 36.2 (C

Cys), 28.03 (CH3 tBu), 20.7 (AcNGalNAc), 20.6 (AcOGalNAc).

EXPERIMENTAL 43

Procedimiento general para la obtención de péptidos y glicopéptidos por SPPS.

Se introduce la resina Rink Amide MBHA de Novabiochem (178 mg, 0.1 mmol de NH2) en

el reactor tipo Vessel del sintetizador automático de péptidos. En los diferentes cartuchos se

añade 1 mmol del correspondiente aminoácido, convenientemente protegido.

La iniciación del proceso se realiza lavando la resina con una disolución al 22% de

piperidina en N-metilpirrolidona (NMP) durante 10 minutos. Posteriormente, el equipo

expulsa el cartucho de iniciación y añade al reactor el del primer aminoácido junto con DIEA (1

mL), HBTU (3.4 mg) y DMF (3 mL) durante 30 min. Tras expulsar el cartucho, el proceso

continúa cogiendo el siguiente y repitiendo el proceso tantas veces como aminoácidos haya

que acoplar.

Finalmente, se retira la resina del reactor y se introduce en un tubo de plástico con TFA

(1.8 mL), TIS (0.1 mL) y H2O (0.1 mL) dejando en agitación durante 3 h para la liberación de la

resina. A continuación se añade éter frío, haciendo precipitar el péptido que se filtra lavando

con éter. Haciendo lavados con agua conseguimos redisolver la cadena peptídica, separándola

de la resina sólida, y obteniendo el péptido deseado tras la evaporación del filtrado.

En la Imagen 1 se puede observar el modelo utilizado para llevar a cabo la SPPS así como

sus diferentes partes y reactivos disponibles.

Imagen 1. Fotografía del dispositivo instrumental Model 433A Peptide Synthesizer de Applied Biosystems, utilizado

para la síntesis de péptidos en el presente trabajo.

44 EXPERIMENTAL

N-Acetil-L-alaninil-L-prolininil-L-aspartinil- L-(α-S-D-2-N-acetil -3,4,6-tri-O-acetil-2-

desoxigalactosil)-cisteinil-L-argininil-L-prolinamida (1)

Ac-L-Ala-L-Pro-L-Asp-L-Cys-(α-S-D-GalNAc)-L-Arg-L-Pro (1)

1

Siguiendo la metodología general para la obtención de péptidos en SPPS, se introduce

inicialmente en el reactor tipo Vessel la resina Rink Amide MBHA (178 mg, 0.1 mmol NH2) y en

cartuchos Pro-Fmoc (337 mg, 1 mmol) y Arg-Fmoc (649 mg, 1 mmol), obteniéndose el primer

fragmento deseado del péptido acoplado a la resina. Éste se trasvasa a un tubo de plástico

para la posterior reacción.

A continuación se realiza el acoplamiento manual del building block de cisteína. En primer

lugar se trasvasa el building block (compuesto 2, 170 mg, 0.25 mmol) a un matraz para

desproteger su éster terc-butílico y se añade TFA (10 mL, 130.2 mmol) y diclorometano como

disolvente (10 mL), dejándose en agitación durante 3 h a temperatura ambiente. Se evapora el

disolvente en el rotavapor, añadiendo tolueno para facilitar la evaporación del TFA.

Para el acoplamiento manual, en el matraz con el building block se añade HBTU (86 mg,

0.23 mmol), DIEA 2M (0.5 mL) y DMF como disolvente (1 mL). Se deja en reposo 10 minutos, y

se trasvasa el contenido del matraz al tubo con la resina, haciendo lavados con DMF (1 mL) en

el matraz. Se tapa el tubo con aluminio (ya que el HBTU es fotosensible) y se deja agitando

durante toda una noche.

Finalmente, se trasvasa el contenido del tubo de nuevo al sintetizador, haciendo lavados

con DMF y diclorometano, y se continúa con la secuencia por el método SPPS, introduciendo

en cartuchos Asp-Fmoc (412 mg, 1 mmol), Pro-Fmoc (337 mg, 1 mmol) y Ala-Fmoc (311 mg, 1

mmol) obteniéndose así el glicopéptido 1 unido a la resina, y con sus grupos

convenientemente protegidos.

El work-up del producto tiene lugar realizando varios lavados en una placa filtrante de

poro 4 con una disolución de hidrazina/metanol (7:3) y posteriormente con metanol, dejando

EXPERIMENTAL 45

reposar la disolución con el péptido 45 minutos antes de cada filtración. De este modo, quedan

desprotegidos los grupos OH acetilados del GalNAc.

El cleavage, destinado a liberar el glicopéptido de la resina (dejando un extremo amida) y

a desproteger el resto de grupos de la cadena peptídica protegidos con tBu, se realiza en un

tubo de ensayo con 2 mL de una disolución TFA/H2O/TIS, 90:5:5, dejando agitar durante 3 h. A

continuación se añade éter etílico muy frío al tubo para hacer precipitar el glicopéptido, que se

filtra en una placa filtrante de poro 4, lavando con éter. Para separar resina y cadena peptídica

del sólido obtenido, se lava con H2O para redisolver el glicopéptido, que se recoge en un

matraz. Finalmente se evapora el H2O en el rotavapor.

Por último, se debe realizar la purificación en HPLC. El glicopéptido se disuelve en H2O con

una concentración no mayor de 20 mg/mL, siendo filtrado previamente a través de un filtro de

teflón, y se introduce en el cromatógrafo con jeringa en sucesivos pinchazos de 500 µL cada

uno de ellos. El proceso de separación se realiza mediante un método con gradiente,

comenzando con un eluyente formado por H2O/acetonitrilo (98:2) para terminar con una

proporción 85:15. Cada pinchazo durará 40 minutos, con un flujo que aumenta de 0 a 10

mL/min a lo largo de 10 minutos, y registrando a dos longitudes de onda: λ = 212 y 254 nm. El

tiempo de retención del glicopéptido 1 es de 21.30 minutos.

Finalmente, se evapora el disolvente en el rotavapor, obteniendo el glicopéptido 1

purificado (18.4 mg), tal y como se puede observar en la figura superior.

HRMS ESI+ (m/z) = 860.3894 [M+H]+; calculado C34H58N11O13S+ = 860.3858

1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm): 8.70, 8.41, 8.36 (12H, señales correspondientes a NH), 5.58 (d, 1H, J = 5.4 Hz, H-1), 4.73 (t, 1H, J = 6.7 Hz, Hα Asp), 4.68 (d, 1H, J = 3.9 Hz, Hα Arg), 4.65 – 4.57 (m, 1H, Hα Cys), 4.54 – 4.46 (m, 1H, Hα Pro), 4.44 – 4.35 (m, 3H, H-2, Hα Ala, Hα Pro), 4.27 – 4.17 (m, 1H, H-5), 4.00 (d, J = 2.9 Hz, 1H, H-4), 3.85 – 3.59 (m, 6H, H-3, 2H-6, 4Hδ Pro), 3.30 – 3.18 (m, 2H, 2Hδ Arg), 3.00 (m, 4H, 2H Asp, 2H Cys), 2.45 – 2.25 (m, 2H, 2H Pro), 2.14 – 1.91 (m, 9H, AcNGalNAc, 2H Arg, 2H Pro, 2Hγ Pro), 1.82 – 1.60 (m, 4H, 2Hγ Arg, 2Hγ Pro), 1.55 (d, J = 7.0 Hz, 3H, 3H Ala).

13C RMN (100 MHz, D2O) δ (ppm): 176.8, 174.6, 173.9, 173.6, 171.9, 171.4, 171.1, 169.2 (C=O), 156.7 (Cε Arg), 85.4 (C-1), 71.9 (C-5), 68.4 (C-4), 67.6 (C-3), 61.1 (C-6), 60.4, 60.3 (2Cα Pro), 53.7 (Cα

Cys), 51.1 (Cα Arg), 50.1 (Cα Asp), 50.0 (C-2), 48.0 (Cα Ala), 47.9, 47.7 (2Cδ Pro), 40.6 (Cδ Arg), 35.2 (C Cys), 32.6 (C Asp), 29.6, 29.3 (2C Pro), 27.67, 24.7 (2Cγ Pro), 24.6 (C Arg), 24.1 (Cγ Arg), 21.9 (AcGalNAc), 15.1 (C Ala).

7. Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear y

cromatograma

ANEXO: ESPECTROS DE RMN Y CROMATOGRAMA 49

A continuación se recogen los espectros de RMN mono y bidimensionales de los

productos 1, 2 y 7, además del cromatograma obtenido en HPLC para el glicopéptido 1.

Los espectros de 1H, 13C, COSY y HSQC fueron tratados y representados con el software

MestReNova (5.2), a partir de los archivos fid y ser obtenidos del espectrómetro Bruker

Avance‐ 400 MHz.

El cromatograma fue obtenido del cromatógrafo Waters Delta Prep 4000 reverse phase

HPLC y Waters 2987 Dual Absorbance Detector.

50 ANEXO: ESPECTROS DE RMN Y CROMATOGRAMA

1H RMN 400 MHz en CDCl3

13C RMN 100 MHz en CDCl3

CO2tBu

NHFmocBr


COSY en CDCl3

HSQC en CDCl3


1H RMN 400 MHz en CDCl3

13C RMN 100 MHz en CDCl3


COSY en CDCl3

HSQC en CDCl3


1H RMN 400 MHz en D2O

13C RMN 100 MHz en D2O

15.1

22.0

24.1

24.6

24.7

27.6

29.3

29.6

32.6

35.2

40.6

47.7

47.9

48.0

50.0

50.1

51.1

53.7

60.3

60.4

61.1

67.6

68.4

71.9

85.5

156.

7

169.

317

1.1

171.

417

2.0

173.

617

3.9

174.

617

6.8


COSY en D2O

HSQC en D2O


Cromatograma HPLC (A: CH3CN; B: H2O)

Síntesis de un derivado de cisteína glicosilada con alfa-N ...

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