Diego Santo Tomás Martínez

Rodrigo Martínez Ruiz y Judith Millán Moneo

Facultad de Ciencia y Tecnología

Grado en Química

2015-2016

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso Académico

Simulación mediante Dinámica Molecular de dímeros de Citosina y Guanina

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2016

publicaciones.unirioja.esE-mail: publicaciones@unirioja.es

Simulación mediante Dinámica Molecular de dímeros de Citosina y Guanina,trabajo fin de grado

de Diego Santo Tomás Martínez, dirigido por Rodrigo Martínez Ruiz y Judith MillánMoneo (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia

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Facultad de Ciencia y Tecnología

Trabajo Fin de grado

Grado en Química

Simulación mediante Dinámica Molecular de

dímeros de Citosina y Guanina.

Alumno:

Diego Santo Tomás Martínez Tutores:

Rodrigo Martínez Ruiz

Judith Millán Moneo

Logroño, Junio, 2016

Índice

• Resumen/Abstract V

• 1. ADN 1

• 2. Mecánica Molecular 7

• 3. Dinámica Molecular 19

• 4. Resultados 29

• 5. Conclusiones 57

• Bibliografía 60

iii

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Resumen/Abstract

v

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En el presente Trabajo de Fin de Grado se llevará a cabo un estudio conformacional de los dinucleótidos monofosfatos Citosina-Citosina y Guanina-Guanina en disolución acuosa. Dicho estudio se realizará con tres simulaciones de un microsegundo, para el dinucleósido de Citosinas libres, de Guaninas libres y de Citosinas y Guaninas emparejadas. En la Dinámica Molecular creada se estudiarán ciertos ángulos diedros, realizándose un análisis estadístico para analizar las conformaciones más estables.

Los cálculos se han realizado con el programa de software libre GROMACS, bajo condiciones de disolución acuosa con disolvente explícito con modelo Tip4P. Tras esto se analizaron los ángulos diedros a estudiar en cada uno de los fotogramas de la simulación y se compararon con los datos bibliográficos para estudiar qué conformaciones adoptaban los dímeros estudiados.

In the following Final Project a conformational study will be made about the Dinucleotides Monophosphates Citosine-Citosine, Guanine-Guanine and paired Citosine and Guanine in aqueous solution. In the resulting Molecular Dynamics some dihedral angles will be measured by a statistic analysis to find out the stables conformations.

The calculations have been done with the free software program GROMACS, under aqueous solution conditions with explicit dissolvent with Tip4P water model. After that the dihedral angles were analyzed in each photogram of the simulation and they were compared with the bibliographic data in order to study what conformations adopted the studied dimers.

vii

viii

1. ADN

1

2

Historia

El Ácido DesoxirriboNucleico (ADN) es una secuencia de nucleótidos, que son moléculas que desempeñan varias funciones, tales como llevar a cabo intercambios energéticos, actuar como señales químicas en entornos celulares o formar las cadenas de ADN y ARN. El ADN, molécula estudiada a continuación, se encuentra en el núcleo celular, codificando la información genética en forma de secuencias alternantes de nucleótidos.

En 1944 se obtuvo la primera prueba directa del ADN como transmisor de herencia genética gracias a Avery, MacLeod y McCarty,1 que hallaron que el ADN extraído de una cepa virulenta de neumococo era capaz de transformar una cepa inocua de éste en virulenta, con lo que se concluyó que este ADN contenía la información genética.

Figura 1: Representación visual del experimento de Avery-MacLeod-McCarty

Los patrones de enlaces de hidrógeno más importantes fueron definidos por Watson y Crick en 19532. Aquí se propone un modelo de doble hélice de direcciones opuestas, siendo de 5’ a 3’ uno y de 3’ a 5’ (Ver Figura 2) su complementario, siendo este el descubrimiento que sentó las bases de nuestro conocimiento actual sobre el almacenamiento y empaquetado del material genético.

Estructura 2D

Los nucleótidos están formados por una pentosa, que de ser ADN se trata de una desoxirribosa y de ser ARN de una ribosa, un fosfato y una base nitrogenada, pudiendo ser un derivado de la purina o de la pirimidina. La estructura de esta base nitrogenada determinará de qué nucleótido se trata, y el orden y estructuración de éstos será lo que codifique la información. La estructura formada por la base nitrogenada y la pentosa se llama nucleósido.

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Estos nucleósidos se unen entre sí formando una cadena a través del grupo fosfato, que enlaza dos pentosas, formando dos enlaces fosfodiéster. La cadena de ADN está formada por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí mediante enlaces de hidrógeno, uniéndose en parejas de Citosina (C) con Guanina (G) y de Adenina (A) con Timina (T), siendo este apareamiento específico lo que permite la duplicación de la información genética.

Figura 2: Estructura de los nucleótidos más comunes y su unión en el ADN. 3

Estructura 3D: Conformaciones del ADN.

Siendo el ADN una molécula extraordinariamente flexible, puede adoptar diferentes estructuras tridimensionales en función de su empaquetado. La estructura descrita por Watson y Crick2 es la denominada forma B del ADN, siendo la más estable y la que puede adquirir una hebra de secuencia aleatoria de nucleótidos. Es, por tanto, un punto de referencia en los estudios sobre ADN. La forma A se encuentra favorecida en disoluciones deficientes en agua, siendo dextrógira al igual que la forma B, favoreciéndose la cristalización en esta forma de secuencias cortas de ADN en ausencia de agua. La forma Z es una variante mucho más distanciada geométricamente de la forma B, siendo la mayor diferencia su carácter levógiro. Es una estructura más alargada y delgada. Se da principalmente en secuencias que alternan C y G, en la que las purinas adoptan la conformación syn y las pirimidinas mantienen la conformación anti.

4

Figura 3: Diferentes conformaciones del ADN.4

Figura 4: Características estructurales de las conformaciones del ADN.5

Este trabajo trata de responder a la pregunta de si las características geométricas observadas para las conformaciones de largas cadenas de ADN son también detectadas a un nivel estructural menor, más específicamente a los sistemas formados por dos nucleótidos.

5

6

2. Mecánica Molecular

7

8

La mecánica molecular se basa en el estudio computacional mediante el uso de la física clásica de sistemas que, de abordarse desde la mecánica cuántica, tendrían unos costes computacionales inviables. Es por esto que mediante mecánica molecular se pueden simular sistemas relativamente grandes con disolvente explícito, algo que no es analizable desde el punto de vista cuántico. A pesar de esto, el uso de la física clásica impide simular correctamente el comportamiento de los electrones, por lo que no se podrán simular algunas propiedades y reacciones químicas.6

Campos de fuerza

Un campo de fuerzas es la suma de términos asociados a las tensiones de enlace, a sus ángulos, sus torsiones, sus interacciones de van der Waals, sus interacciones electrostáticas y los enlaces de hidrógeno, tal y como se refleja en la ecuación (1).

( )( )

∑∑

∑∑

∑

∑∑

−

+

+−+−

+−+

+−+−=

ij ij

ij

ij

ijij

ij ij

ji

cruzadosikikik

impropiosijklijkl

diedrosijklijkl

ángulosijkijk

enlacesijijtotal

rrrqq

rrkk

nk

krrkV

612

0

20

2'0

''

0

20

20

··4·

·4

1

)()(

·cos1

)()(

σσε

επε

ϕϕ

ϕϕ

θθ

(1)

Para poder realizar una simulación de todos los componentes de nuestro sistema, desde los átomos hasta los ángulos diedros, tienen que estar parametrizados en nuestro campo de fuerzas.

Figura 5: Ejemplo visual de campos de fuerza.7

Esta parametrización se puede llevar a cabo por la transferibilidad existente en las propiedades de los enlaces y estructuras moleculares, que mantienen sus características

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a pesar de encontrarse en compuestos diferentes. Es por esto que los campos de fuerzas tienen cierta generabilidad.

La estrategia más común para la parametrización de los campos de fuerzas es mediante el estudio de fragmentos estructurales a través de cálculos ab initio. Por este método, que utiliza la mecánica cuántica para realizar los cálculos, se realiza un estudio conformacional, energético y de momento dipolar de las estructuras básicas de un sistema, uniéndose luego los fragmentos requeridos en nuestra molécula a estudiar.

Existen múltiples campos de fuerza para aplicarse en diferentes sistemas moleculares, ya que no se pueden parametrizar todos los elementos químicos en todas las combinaciones posibles. El campo de fuerzas elegido depende del sistema a estudiar, variando cada uno en complejidad, especificidad o tamaño.

Dado el altísimo coste computacional que implica la aplicación de los campos de fuerzas de las interacciones no enlazantes, tanto culómbicas como de van der Waals, se introduce el término de los cutoffs, como se muestra en la Figura 6. Un cutoff es la distancia a partir de la cual las interacciones no enlazantes no se calculan. Esto reduce enormemente el coste computacional, ya que de no usarlos hay que calcular el efecto de cada átomo sobre otro átomo de la simulación.

Figura 6: Moléculas de disolvente incluidas en el cutoff.8

Los campos de fuerzas pueden dividirse en tres tipos principales: All Atoms, en el que se proporciona una parametrización para cada tipo de átomo, incluyendo el hidrógeno; el United Atoms, en el que la unidad estructural son fragmentos apolares tales como el CH3; y el Coarse-Grained, el más usado para simular macromoléculas que aplica el campo de fuerzas sobre fragmentos mayores, tales como propilos o fenilos. En el trabajo descrito en esta memoria se ha utilizado un campo de fuerzas tipo All Atoms.

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Moléculas de agua

A la hora de realizar una simulación computacional se debe elegir cuidadosamente el tipo de molécula de agua basándose en la naturaleza tanto de nuestro cálculo como de la molécula a estudiar. Existen dos métodos generales de expresar la presencia de disolvente:6

• Implícita (Figura 7):

Se trata de crear un potencial continuo que represente la presencia del disolvente. Este método no es apropiado para las simulaciones aquí realizadas, ya que no representa adecuadamente las fuerzas no enlazantes que pueden ser cruciales en nuestro caso, tratándose éste de un sistema de nucleótidos.

Figura 7: Representación de un dinucleótido de Citosina en un disolvente implícito.6

• Explícita (Figura 8):

En este caso se simula cada una de las moléculas de disolvente como una molécula propia, aumentando enormemente el tamaño de la simulación, así como su exactitud. Para este tipo se hace uso de una serie de modelos estructurales ya creados, entre los cuales se diferencian en función de su complejidad.

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Figura 8: Representación de un dinucleótido de Citosina en un disolvente explícito.6

Existe un compromiso entre la exactitud del cálculo y el tamaño de la simulación, características que son inversamente proporcionales, con lo que en cada caso se tendrá que decidir qué modelo es más adecuado. Los aproximadamente 50 modelos de agua existentes pueden ser clasificados de manera general en función del número de puntos que poseen:

Modelo de 3 puntos (Figura 9): se trata de la representación de cada uno de los átomos como un punto en la simulación. Su coste computacional es bajo, así como su exactitud.

Figura 9: Modelo de 3 puntos

Modelo de 4 puntos (Figura 10): se asigna un punto a cada uno de los átomos del agua y se añade un punto más que desplaza la carga del oxígeno a un átomo Dummy. Así se crea una mejor simulación de la distribución de cargas de la molécula.

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Figura 10: Modelo de 4 puntos

Modelo de 5 puntos (Figura 11): se crean dos átomos Dummy que representan los pares electrónicos del oxígeno. Así se representa adecuadamente la estructura tetraédrica de la molécula.

Figura 11: Modelo de 5 puntos

En el trabajo realizado se ha utilizado un modelo de aguas de 4 puntos buscando un compromiso entre la exactitud y número de átomos (reales y Dummy) a considerar.

Periodic Boundary Conditions

A la hora de solvatar el sistema a estudiar existe la necesidad de imponer unos límites fijos que luego se llenarán de disolvente.6 Para esto existen dos métodos principales:

• Modelo de gota:

Se trata del sistema más simple y antiguo. Se crea una superficie esférica que se rellena con disolvente. Cuando se aplica una temperatura al sistema, para evitar que las moléculas de disolvente difundan al vacío, se crea un potencial esférico que las mantiene dentro de unos límites.

• Modelo de caja:

En este modelo se crea un entorno poligonal que se repite periódicamente en las tres direcciones del espacio, siendo el dodecaedro truncado la forma más utilizada al ser la más eficiente computacionalmente, como se muestra en la Figura 12.

13

Figura 12: Dodecaedro truncado

Figura 13: Unión de dodecaedros truncados

Al repetir el sistema estudiado en las tres dimensiones se crea un espacio virtualmente infinito donde las moléculas se repiten de un dodecaedro a otro (Figura 13). Esto crea un número infinito de interacciones moleculares no enlazantes, por lo que se ve la necesidad de usar cutoffs, restringiendo la distancia a la que se tendrán en cuenta estos efectos. Dado que al interaccionar una molécula con su equivalente de la celdilla adyacente se produce un error en la simulación, el cutoff siempre debe ser menor que la longitud mínima de la caja, como se aprecia en la figura 14.

14

Figura 14: Representación de las celdillas y sus cutoff

Minimización energética

Se trata del proceso de búsqueda de una conformación espacial de un sistema de átomos a simular en la que se alcanza una conformación estable aceptablemente cercana a un mínimo la Superficie de Energía Potencial (SEP). Esta conformación puede ser aceptable estando en un mínimo relativo y no en el absoluto, ya que su principal función es refinar la estructura de partida. Sin embargo, para hallar el mínimo absoluto hay diversos métodos que pueden utilizarse:6

• Método steepest-descent:

Este método se basa en el movimiento por la SEP (Figura 15) en dirección del gradiente energético (vector formado por las derivadas de la energía potencial con respecto a las coordenadas internas del sistema Ecuación 2). Este vector es el que viene dado por la derivación de la energía potencial con respecto a las coordenadas internas del sistema.

∂∂

∂∂

∂∂

=∇ ,...,,121 θ

VrV

rVV (2)

El paso de minimización se define como un valor proporcional a cada una de las coordenadas del gradiente de potencial. Así, se define un valor de gradiente mínimo por debajo del cual se detiene la optimización. Se trata de un método muy rápido pero no muy preciso, por lo que se suele usar otro método más costoso computacionalmente a continuación.

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Figura 15: Visualización del Steepest Descent sobre la SEP

• Método Conjugated Gradient:

Es el método iterativo principal para la resolución de sistemas de ecuaciones lineales. Comienza con una iteración en la dirección del vector de la derivada de la energía potencial, al igual que el método anterior. Sin embargo, las demás iteraciones se construyen de manera diferente, creando un conjunto de vectores conjugados mutuamente que definen la dirección de la minimización energética de manera más precisa que el método Steepest Descent, pero mucho más costosa computacionalmente. En la Figura 16 se representa este método con respecto al anterior.

Figura 16: Comparación de métodos de minimización energética

• Método Adopted Basis Newton-Raphson (ABNR)

Este método sólo se aplica en una pequeña parte de la molécula, así que la geometría final es una combinación del método steepest descent con una pequeña contribución del ABNR. La minimización comienza con varios pasos de minimización de steepest descent con una minimización final de ABNR (Figura 17). En este método se utiliza, además del gradiente, una aproximación de la segunda derivada de la energía potencial

16

respecto a las coordenadas del sistema. Esto conlleva una mayor precisión, así como un mayor coste computacional.

Figura 17: Método ABNR

17

18

3. Dinámica Molecular

19

20

La Mecánica Molecular ha permitido establecer un sistema estático con una estructura de mínima energía en la Superficie de Energía Potencial. Esta estructura suele ser muy cercana a 0 K, situación que es muy poco común. Para simular estructuras y reactividad de un sistema a cierta temperatura diferente de 0 K se ha de realizar una simulación de Dinámica Molecular sobre la estructura proporcionada por la Mecánica Molecular. Ésta primera se basa en un calentamiento paulatino del sistema, modificando la distribución de velocidades de Maxwell-Boltzmann (Figura 18) y con esto la energía cinética de cada una de las moléculas implicadas.6

Figura 18: Ejemplo gráfico de distribución de Maxwell-Boltzmann.9

Colectivos NVT y NPT

Las diferentes simulaciones posibles reproducen varias condiciones físicoquímicas del sistema en su conjunto, manteniendo una serie de restricciones a lo largo de la adaptación del sistema. Es por esto que existen ciertos colectivos dependiendo de las condiciones a restringir. La simulación correspondiente al colectivo microcanónico es la NVE. En esta simulación las constantes son el número de moléculas (N), el volumen del sistema (V) y la energía total de éste (E). Esta corresponde a un sistema aislado, sin ninguna clase de intercambio energético con el medio y adiabático. Es un sistema muy útil en Dinámica Molecular, pero también muy costoso, haciendo que los más utilizados sean una combinación de colectivos NVT y NPT.

El colectivo canónico es el conocido como NVT, en el que las propiedades restringidas son el número de moléculas (N), el volumen del sistema (V) y la temperatura de éste (T). Se trata de un sistema que no controla la temperatura instantánea, sino que controla la temperatura media. En este sistema los cambios de temperatura en diversos procesos

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endotérmicos o exotérmicos, tales como cambios conformacionales, se simulan mediante termostatos, que intercambian calor con el sistema produciendo así un re-escalado de velocidades para corregir la temperatura en función de los valores deseados.

El colectivo isobárico isotermo corresponde al colectivo NPT, en el que además del número de moléculas y de la temperatura se restringe la Presión (P) del sistema. Con este sistema se simulan sistemas abiertos, sometidos a una temperatura y presión ambientales. En este caso, además de un termostato, es necesario el uso de un barostato.

En cualquiera de estos sistemas es común hacer la simulación inicial con posiciones restringidas, en el que parte de nuestra molécula o sistema de deja en su mínimo energético como posición fija, y se equilibra el resto. Así, se produce una adaptación a la temperatura más paulatina y controlada.

Esquema de simulación

Un esquema de simulación (o workflow) es un diagrama que representa la estructura y los pasos de simulación que se van a realizar para alcanzar un sistema deseado. Siendo necesarios diferentes archivos que pueden contener desde información sobre la estructura hasta una distribución de velocidades. A continuación se detalla el esquema realizado en este caso. Este esquema de simulación se repite tres veces para las tres estructuras estudiadas. También hay que remarcar que al haber utilizado el programa GROMACS8,10 para la simulación, tanto el esquema como los programas y archivos descritos están adaptados a este programa.

• Estructura inicial

La estructura inicial es un formato PDB11 obtenido del programa Avogadro.4 Se realiza un ajuste debido a una incompatibilidad de la estructura proporcionada por Avogadro, que nos proporciona una cadena con un fosfato terminal y GROMACS precisa de una cadena sin dicho fosfato, ya que las bases descritas por el campo de fuerzas AMBER0312 que utiliza para los extremos no los consideran. Por esto, de la estructura proporcionada se procede a la eliminación de ese grupo. Este proceso se repite para todas las estructuras utilizadas, Citosina-Citosina, Guanina-Guanina y Citosina-Citosina y Guanina-Guanina emparejadas. Una vez trasladada la estructura de PDB a GROMACS se obtienen dos archivos de dos formatos diferentes, un archivo de extensión .gro con la geometría del sistema (similar al PDB) y otro de extensión .top con la topología del mismo: un listado de los átomos, sus cargas, parámetros de van der Waals, cómo están enlazados, los ángulos y diedros que forman… Básicamente, la información del campo de fuerzas para el sistema estudiado. La orden utilizada es “pdb2gmx”, que es la utilizada para convertir archivos en formato pdb a formato .gro y .top, los usados por el programa GROMACS.

22

c

• Minimización energética en el vacío

A continuación se procede a la realización de la primera minimización energética, siendo ésta primera en el vacío. Esto es necesario para que la estructura se encuentre en su forma lo más estable posible antes de continuar con nuestra simulación. Primero se crea (o se obtiene) un archivo .mdp. Éste es un archivo de texto que incluye los detalles de la simulación deseada, tales como número de pasos, tipo de integrador o uso y distancia de cutoffs. Se combina con el archivo .gro y el archivo .top para crear un archivo .tpr, que contiene toda la información necesaria para iniciar esta primera simulación, tras la cual obtenemos la estructura minimizada energéticamente. Para la creación del .tpr se utiliza la orden “grompp”, creándose dicho archivo con toda la información necesaria para llevar a cabo la simulación. Tras esto se lanza el cálculo con la orden “mdrun”, que ejecutará las instrucciones contenidas en el .tpr.

• Creación de la caja de simulación

En este paso se define la forma de la caja a simular, así como sus dimensiones. Posteriormente se añadirá el disolvente en esta caja, así que habrá que hacerla de tamaño suficientemente grande. En este caso se ha elegido la forma de dodecaedro truncado (Figura 12), que es la más utilizada debido a su alta eficiencia computacional. Para la definición de la caja y su modificación, se utiliza la orden “editconf”.

PDB GRO

TOP

GRO

TOP TPR Estructura

minimizada

Estructura minimizada

Estructura dentro de la caja de simulación

MDP

pdb2gmx

grompp mdrun

editconf

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• Adición de disolvente

Este paso es de vital importancia ya que el medio acuoso es en el que las biomoléculas se encuentran normalmente y es el medio en el que se quiere estudiar la estructura. Para esto primero se ha de elegir el tipo de molécula de agua deseada para la simulación. En este caso se ha elegido la molécula de cuatro puntos (Tip4P) que tiene una alta correspondencia en simulación con el comportamiento de la molécula real de agua. Así, se debe incluir en este paso la estructura minimizada en la caja, la topología del sistema y del modelo de agua a utilizar (para que se añada al archivo las moléculas de agua) y la estructura geométrica de las moléculas de agua deseada (incluida ya dentro del programa GROMACS). Para este proceso se utiliza la orden “genbox”.

• Neutralización de cargas

Debido a la presencia de grupos fosfato se requiere la adición de cationes para poder realizar la simulación, ya que es necesario que el sistema sea neutro. Para esto se añaden iones Na+, tantos como los necesarios para neutralizar la carga debida a los grupos fosfato presentes en la molécula. Primero se crea un .tpr que contenga los archivos .gro, .top y .mdp usado anteriormente. Tras esto se añaden los cationes cuya posición elige aleatoriamente el programa. Para esto se utiliza la función “genion”, que permite la adición de iones tanto por número de cargas como añadir una concentración deseada.

• Minimización energética del sistema

Ahora que el sistema está completo se procede a realizar una minimización energética de su conjunto. La adición de disolvente y de iones ha modificado la Superficie de Energía Potencial, por lo que la minimización energética puede modificar la estructura actual. Así, primero se crea un archivo .tpr con la estructura y topología actuales y un

Estructura en caja

Estructura con agua

Moléculas

de agua Topología con agua

Estructura con agua

Topología con agua

TPR

Estructura con iones

Topología con iones

TOP

genbox

grompp genion

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archivo .mdp diferente al utilizado hasta ahora, ya que el sistema es muy diferente. Tras esto se realiza el cálculo sobre el archivo .tpr y se obtiene la estructura de nuestra molécula solvatada.

• Position Restrained

A continuación se realiza el primer paso de Dinámica Molecular, incluyendo la energía cinética en la simulación, permitiendo al disolvente moverse libremente pero manteniendo los átomos no hidrogenoides de la molécula de ADN fijos en sus posiciones predeterminadas. Así se realiza una simulación de calentamiento paulatina para evitar el posible error de cálculo a la hora de realizar un calentamiento brusco. Para esto se utiliza un archivo .mdp que incluya estos parámetros.

• Creación de NVT

Habiendo dejado el sistema relativamente libre de tensiones se procede al calentamiento de todo el sistema (se eliminan todas las restricciones en las posiciones). Esta simulación se realiza, por convenio, manteniendo el volumen de la celda constante.

• Creación de NPT

Tras el calentamiento del sistema se lleva a cabo la simulación a presión constante (en este trabajo interesa este tipo de colectivo, ya que las moléculas en sistemas biológicos

Estructura con iones

Topología con iones

Estructura solvatada

Estructura solvatada

Topología con iones

Estructura con PR

TPR

TPR

Estructura con PR

Topología con iones

Estructura calentada

TPR

grompp mdrun

grompp mdrun

grompp mdrun

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se encuentran a presión constante), así se fija la presión en la simulación a la vez que la temperatura, ya que, al igual que con la presión, las moléculas en sistemas biológicos se encuentran a temperaturas constantes o muy estables. Con esto se espera conseguir unas condiciones deseadas de presión y temperatura, 1 atm. y 300 K, en el caso que nos ocupa, temperatura a la que se encuentra en medios biológicos. A esta fase se le conoce como de equilibrado. Las condiciones de simulación son las mismas que las del cálculo a analizar pero estos datos no sirven para su análisis ya que el sistema necesita un tiempo de simulación para adaptarse (equilibrarse) desde las condiciones anteriores a las nuevas.

• Producción

Una vez creado y equilibrado el sistema se procede al envío del cálculo más largo (y computacionalmente costoso) del que se extraerán y analizarán las propiedades de interés. Tras una simulación de aproximadamente una semana (si bien depende de las características del ordenador dónde se envía, el tamaño del sistema, del tiempo deseado de simulación…) se obtienen una serie de archivos con la información a analizar. Un archivo .gro que contiene la estructura final resultante de la simulación, un archivo .edr que contiene información energética de la simulación, un archivo .trr que contiene información de la geometría y las velocidades de cálculo y un archivo .xtc que contiene información sobre la trayectoria del sistema. Este último archivo sólo contiene la geometría del sistema, así que ocupa menos espacio que el archivo .trr, además puede elegirse qué parte del sistema simulado elegir, por ejemplo, sólo el soluto.

Estructura calentada

Topología con iones

Estructura equilibrada

TPR

Estructura relajada

Topología con iones

TPR

XTC

TRR

EDR

GRO

grompp mdrun

grompp mdrun

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Análisis de trayectoria

Tras haber realizado la etapa de producción es necesario estudiar mediante algún método si esta etapa se ha realizado correctamente y comprobar que no haya habido ningún error en el proceso. Para esto tenemos varios métodos que se expondrán a continuación.

• Estudio de la temperatura

Las órdenes enviadas al cálculo indicaban que la temperatura deseada era de 300 K, por lo que tras analizar el fichero .edr mediante un programa de análisis del paquete GROMACS, se representó la temperatura a lo largo de la simulación para comprobar que ésta es estable y en torno a este valor.

• Estudio de la energía potencial

Al igual que en el caso anterior, se espera un comportamiento estable, que aunque pudiera tener una alta dispersión su comportamiento fuera lineal y con pendiente cero, ya que se está buscando un equilibrado a temperatura constante. Esto indica que se ha sondeado la misma zona de la superficie de energía potencial (lo deseado en este caso, ya que se quiere observar un sistema en equilibrio). Así, se representa a continuación la energía potencial frente al tiempo para la molécula de Citosina-Citosina como ejemplo.

Figura 19: Representación de la temperatura frente al tiempo para la molécula de Citosina-Citosina

/ps

/K

27

Figura 20: Representación de energía potencial (J) frente al tiempo (ps) para Citosina-Citosina

/ps

/J

28

4. Resultados

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30

A continuación se detallan los resultados obtenidos así como los métodos de obtención de éstos. Se comenzará hablando del programa GROMACS8-10, programa del cual se realizó un tutorial13 al que se llegó desde la página web de GROMACS8 para aprender su manejo, por lo que ahora se detallan algunos aspectos de éste.

Programa GROMACS

El programa utilizado para realizar las sucesivas simulaciones es el GROMACS8,10 (GROningen MAχne for Chemical Simulations). Se trata de un programa de Dinámica Molecular diseñado principalmente para la simulación de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Se ha utilizado bajo un sistema operativo basado en Linux (Ubuntu) y con un sistema de introducción de órdenes en comandos.

Se ha utilizado este programa, entre otros motivos, por ser de software libre, lo que facilita su uso y amplía enormemente el número de usuarios. Este amplio número es lo que hace que haya un gran número de tutoriales disponibles, uno de los cuales se ha realizado para el aprendizaje del sistema.

Órdenes del programa y su función

En el apartado “3. Dinámica Molecular”, se han presentado algunas de las órdenes necesarias para la realización de diferentes tareas. Asimismo, existen ciertas órdenes, que a su vez llaman a programas, que no forman parte del esquema de simulación y no están incluidas en dicho apartado, que se relatarán a continuación.

- g_energy: se trata de una orden que crea un archivo .xvg que podrá usarse para representar una característica termodinámica del sistema a lo largo de la simulación.

- xmgrace: esta orden abre un programa para representar los archivos .xvg. - g_angle: se trata de la orden utilizada para la obtención de los ángulos diedros. - trjconv: esta orden nos permite centrar la molécula en la caja para evitar los saltos a

través de los límites de caja, que podrían modificar nuestros resultados.

Análisis de ángulos diedros (ficheros index)

Una vez realizadas la simulación de producción la medida de los ángulos diedros a lo largo de la simulación se realiza a través de los denominados ficheros index. Estos ficheros son unos archivos de texto que identifican ciertos átomos, a través de su índice en la simulación (cada átomo está numerado consecutivamente en todos los ficheros que el programa usa, fichero de estructura, topología, trayectorias…), como un determinado grupo a analizar, de esta manera se puede realizar una operación sobre ellos o, como en este caso, identificar y nombrar ciertos ángulos para su análisis. Así, un index file simple consta de un nombre para cada grupo de átomos y los números de

31

dichos átomos en la simulación. A continuación se expondrá uno de los index files que se han creado y utilizado en esta simulación, donde se indican los ángulos analizados en el sistema Citosina-Citosina.

Ejemplo de fichero index:

[ alfa ]

28 29 32 33

[ beta ]

29 32 33 36

[ gamma ]

32 33 36 53

[ delta ]

33 36 53 58

[ epsilon ] 6 26 31 32 [ dseta ] 26 31 32 35

[ chi1 ]

8 9 11 21

[ chi2 ]

38 39 41 51

[ chis ]

8 9 11 21 38 39 41 51

Como se observa los nombres entre corchetes indican el nombre del ángulo diedro y los cuatro números separados por espacios indican los átomos que determinan dicho ángulo. Estos ángulos corresponden a los siguientes ángulos de un dinucleótido.

32

Figura 21: Representación de ángulos diedros en un nucleótido.14

Con esto se van a representar, para cada uno de los ángulos de cada molécula, su frecuencia relativa. Así se observarán las conformaciones más abundantes que pueden relacionarse con las más estables. Los sistemas estudiados han sido un dinucleótido de Citosina libre (Figura 22), un dinucleótido de Guanina libre (Figura 23) y un dinucleótido de Guanina y Citosina emparejadas (Figura 24).

Figura 22: Molécula de dinucleótido de Citosina

Figura 23: Molécula de dinucleótido de Guanina

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Figura 24: Molécula de un par de bases de Citosina emparejadas con Guanina

Efecto de las PBC en la simulación

Un efecto del uso de las Periodic Boundary Conditions (PBC) es que el sistema no queda restringido en la caja inicial sino que puede traspasar los límites de ésta apareciendo en la cara opuesta de la misma. El efecto de esta situación es que la molécula parece partida como puede verse en la Figura 25.

Los programas de análisis de GROMACS (g_trjconv) permiten centrar la posición de la molécula en la caja principal a lo largo de la simulación (ver Figura 26). Este centrado no afecta a la información termodinámica de la simulación, ya que el centrado se realiza sobre la trayectoria, sin embargo se quiso comprobar si el tratamiento de centrar la trayectoria afectaba a la medida de los ángulos diedros a lo largo de la simulación, ya que el proceso de centrado lleva su tiempo (varios minutos) antes del análisis.

Así, se realizó la medida de la distribución de los ángulos diedros de la simulación para el sistema Citosina-Citosina sin centrar y centrada y se comprobó que los resultados eran perfectamente coincidentes, concluyéndose que el proceso de centrado tampoco afecta a la información geométrica de la simulación que éste es sólo necesario para el análisis visual de la trayectoria.

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Figura 25: Molécula atravesando un extremo de una caja con PBC

Figura 26: Molécula centrada en una caja

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Resultados Citosina-Citosina

El cálculo de la dinámica molecular se realizó utilizando el programa GROMACS sobre una máquina de cálculo Dell, utilizando en paralelo 8 núcleos tipo Xeon de 2400 Mhz.

La dinámica molecular se llevó a cabo en el colectivo NPT simulándose un dímero de Citosina solvatado en una caja de tipo dodecaedro truncado con moléculas de agua (modelo TIP4p) a 300 K, utilizando el campo de fuerzas AMBER0312. Una vez equilibrado el sistema (simulación NVT de 500 ps y NVT 500 ps), se simuló el sistema durante un tiempo total de 1 µs, almacenándose la información de la trayectoria cada 500 ps. Tras haber realizado la simulación se procedió al análisis de sus ángulos diedros. Dichos ángulos son α (Figura 27), β (Figura 28), γ (Figura 29), δ (Figura 30), ε (Figura 31), ζ (Figura 32), χ1 (Figura 33) y χ2 (Figura 34). A continuación se representarán los resultados de este análisis.

Figura 27: Ángulo α para el dinucleótido libre de Citosina

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Figura 28: Ángulo β para el dinucleótido libre de Citosina

Figura 29: Ángulo γ para el dinucleótido libre de Citosina

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Figura 30: Ángulo δ para el dinucleótido libre de Citosina

Figura 31: Ángulo ε para el dinucleótido libre de Citosina

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Figura 32: Ángulo ζ para el dinucleótido libre de Citosina

Figura 33: Ángulo χ1 para el dinucleótido libre de Citosinas

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Figura 34: Ángulo χ2 para el dinucleótido libre de Citosina

Dadas estas figuras se observa que la distribución de los ángulos no es homogénea, indicando que existe una preferencia en determinados valores restringidos de los ángulos y, por lo tanto, ciertas estructuras del dímero presentan una mayor estabilidad, algo por otra parte esperado dado que los enlaces de hidrógeno restringirán la movilidad. Además, varios de estos ángulos tienen más de una posición preferente, por los diversos picos observados, ángulos que serán más restringidos cuanto más estrecha sea la banda. Esto indica que no es sólo una la conformación más estable de los dímeros.

Resultados Guanina-Guanina

A continuación se repite el mismo proceso para el dinucleótido de Guanina-Guanina, el complementario del anterior, Citosina-Citosina. Al igual que en el caso estudiado con anterioridad, se realiza la simulación completa para el posterior estudio de los ángulos diedros. Los resultados se representan en las Figuras 34-41.

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Figura 34: Ángulo α para el dinucleótido libre de Guanina

Figura 35: Ángulo β para el dinucleótido libre de Guanina

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Figura 36: Ángulo γ para el dinucleótido libre de Guanina

Figura 37: Ángulo δ para el dinucleótido libre de Guanina

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Figura 38: Ángulo ε para el dinucleótido libre de Guanina

Figura 39: Ángulo ζ para el dinucleótido libre de Guanina

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Figura 40: Ángulo χ1 para el dinucleótido libre de Guanina

Figura 41: Ángulo χ2 para el dinucleótido libre de Guanina

Al igual que lo observado en el apartado anterior, se observa una distribución no homogénea, con varias conformaciones preferentes en la disposición de los ángulos diedros. Estos ángulos no coinciden totalmente con los anteriores, por lo que habrá una diferencia de conformación para las cadenas de Citosina y Guanina.

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Resultados Guanina y Citosina emparejados

Tras ambas simulaciones se realiza una tercera con un dinucleótido de Guanina emparejado con uno de Citosina. El objetivo es observar las diferencias conformacionales reflejadas en los ángulos diedros cuando estos nucleótidos están en un par de bases con respecto a cuando están libres. A continuación se reflejarán dichas diferencias representando conjuntamente las gráficas de dinucleótido libre y emparejado. En primer lugar en la Citosina, representado en las Figuras 42-49.

Figura 42: Ángulo α en Citosina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

Figura 43: Ángulo β en Citosina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

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Figura 44: Ángulo γ en Citosina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

Figura 45: Ángulo δ en Citosina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

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Figura 46: Ángulo ε en Citosina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

Figura 47: Ángulo ζ en Citosina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

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Figura 48: Ángulo χ1 en Citosina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

Figura 49: Ángulo χ2 en Citosina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

En la mayoría se observa una restricción de movimientos de los ángulos diedros y un estrechamiento de las bandas, indicando una mayor rigidez en las estructuras. Esto es debido a que al estar emparejadas las bases existe una mayor restricción de movimientos debido a los enlaces de hidrógeno creados entre los dímeros. En el caso del ángulo diedro α de observa la casi total desaparición de la conformación situada a -67⁰ y el desplazamiento de la conformación situada a 70⁰ hasta 80⁰. En el ángulo β se produce un desplazamiento de 172⁰ a -168⁰ junto con un importante estrechamiento

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de la banda. En el ángulo γ deja de ser estable la conformación de 54⁰, desapareciendo, y la situada en torno a -170⁰ se estrecha de manera significativa. En el ángulo δ se observa un aumento en la definición de las dos bandas, centradas en 112⁰ y 155⁰, que daban la banda ancha en la Citosina libre. En el ángulo ε se observa que en estado libre formaba dos bandas anchas, a 0⁰ y 96⁰, formando ahora una única banda en -83⁰ con un apreciable estrechamiento de ésta. En el caso del ángulo ζ la banda antes situada en -143⁰ se reduce a un vestigio de banda en –65⁰, mientras que la banda de 82⁰ crece y se estrecha notablemente, situándose en 72⁰. En el ángulo χ1 desaparece la conformación situada a -137⁰ que formaba una banda muy ancha, situándose ahora la gran mayoría de moléculas en la conformación correspondiente a 45⁰. En el ángulo χ2 desaparece la leve estructura formada a 50⁰ y la banda principal de -125⁰, junto con su hombro a -66⁰, se unen para formar una banda relativamente ancha entre -93⁰ y -83⁰.

A continuación se representan las variaciones conformacionales en la Guanina, representadas en las Figuras 50-57.

Figura 50: Ángulo α en Guanina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

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Figura 51: Ángulo β en Guanina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

Figura 52: Ángulo γ en Guanina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

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Figura 53: Ángulo δ en Guanina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

Figura 54: Ángulo ε en Guanina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

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Figura 55: Ángulo ζ en Guanina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

Figura 56: Ángulo χ1 en Guanina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

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Figura 57: Ángulo χ2 en Guanina como dinucleótido libre (negro) y como par de bases (rojo)

Al igual que en la representación de la Citosina, se observa un estrechamiento de bandas unido a una desaparición de algunas de ellas por la desestabilización de algunas conformaciones. En el ángulo α se observa una disminución del número de moléculas en la conformación de -72⁰, que además se desplaza a -112⁰, junto con una estabilización de la conformación de 71⁰, que se desplaza ligeramente a 77⁰. En ángulo β se mantiene la conformación situada a -180⁰ pero se observa un estrechamiento de la banda debido al aumento de las restricciones de movimiento. Para el ángulo γ se desestabiliza ligeramente la conformación situada en torno a 50⁰ y se estabiliza la situada a -166⁰. En el ángulo δ se observa una mayor resolución de las dos bandas que antes solapaban en una sola. En el ángulo ε se observa que desaparece la banda situada en -167⁰ y la situada en -77⁰ crece y se estrecha enormemente, desplazándose a -84⁰. En el ángulo ζ es apreciable que la banda situada en -74⁰ desaparece y la situada en 79⁰ se crece y se estrecha, situándose en una banda estrecha en 73⁰. En ángulo χ1 se observa un estrechamiento de la banda situada a 38⁰. En el ángulo χ2 desaparece la leve banda situada de 10⁰ a 79⁰, y la situada de -103⁰ a -62⁰ se consolida en una banda estrecha en -75⁰.

Comparación con resultados bibliográficos

En el estudio realizado por Svozil y colaboradores15 se analizaron 447 estructuras cristalizas de cadenas simples y dobles de ADN y se extrajeron los ángulo de torsión de un total de 7739 dinucleótidos mediante la combinación técnicas de clustering y promediado de Fourier. En este trabajo, además de las variantes A,B y Z ya descritas, los

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autores identifican mezclas de estas variantes. La comparación de los valores medios de los distintos ángulos de torsión obtenidos en la simulación de dinámica molecular nos permitirá comprobar si estos valores se corresponden con geometrías ya conocidas del ADN o si al realizarse el estudio con estructuras pequeñas y en disolución acuosa se adoptan ángulos de torsión que no se detectan en estructuras cristalinas.

Para la comparación de los resultados se ha determinado el valor o valores de los ángulos donde las distribuciones presentaban un máximo y estos valores (Tabla 1) se han localizado sobre la Figura 58, [15]. Como los resultados de la figura están representado de 0 a 360°, se han sumado 360 a los resultados de las simulaciones negativos para hacer coincidir el intervalo angular.

Tabla 1: Ángulos a los que aparecen máximos en los resultados de las simulaciones realizadas. Representación de los dinucleótidos monofosfato (dDMP’s) de Citosina (dCdpC) y Guanina (dGdpG).

dDMP’s α β γ δ ξ ε χ1 χ2 Libre dCdpC 70;293 172 54;190 112;155 81;216 0;96 45;223 50;235 dGdpG 71;288 180 50;194 105;154 82;288 194;283 38 297

En pareja de nucleótidos dCdpC 80 192 190 112;155 71;294 278 45 98 dGdpG 77;248 180 50;194 105;154 72 276 38 285

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Figura 58: Diagramas en dos dimensiones para los ángulos de torsión en cadenas simples (azul oscuro) y dobles (cian) de ADN. Las letras A, B y Z corresponden con la identificación de las estructuras de doble hélice, “r” para purinas e “y” para pirimidinas. Las conformaciones de casi 4000 dinucleótidos de ARN se representan en rosa para su comparación. Figura reproducida de [15].

A continuación de la Tabla 2 a la Tabla 5, se exponen los valores de los máximos de las distribuciones agrupados en parejas, según la Figura 58, y su asignación según la posición de los valores en las figuras correspondientes.

Tabla 2: Asignación de los máximos agrupados en parejas en Citosina libre

ξ:α Asignación α:γ Asignación δ:ξ Asignación ξ:β Asignación 81:70 Z, ARN 70:54 ARN 112:47 Zr, ARN 81:172 Z, ARN

81:293 Sin asignar 70:190 Zr,ARN 112:230 A, ARN 216:172 ADN c.s. 216:70 ARN 293:54 A,B,ARN 155:47 ADN c.s. ARN - -

216:291 B1, ADN c.s. 293:190 ARN 155:230 ARN - -

Tabla 3: Asignación de los máximos agrupados en parejas en Guanina libre

ξ:α Asignación α:γ Asignación δ:ξ Asignación ξ:β Asignación 82:71 Z, ARN 71.50 ARN 105:38 Zr, ARN 180:82 Z

82:288 Sin asignar 71:194 Zr,ARN 105:300 ARN 180:288 A, ARN. 288:71 Sin asignar 288:50 A,B,ARN 154:38 ARN - -

288:288 A, ARN 288:194 ARN 154:300 BII, ARN - -

Tabla 4: Asignación de los máximos agrupados en parejas en Citosina emparejada

ξ:α Asignación α:γ Asignación δ:ξ Asignación ξ:β Asignación 71:80 Z 80:190 A, ARN 112:45 Zr 71:192 Z

294:80 Sin asignar - - 112:98 ARN 294:192 Z1, ARN. - - - - 155:45 ARN - - - - - - 155:98 ARN - -

Tabla 5: Asignación de los máximos agrupados en parejas en Guanina emparejada

ξ:α Asignación α:γ Asignación δ:ξ Asignación ξ:β Asignación 72:77 Z 77:50 ARN 105:72 Zr 72:180 Z

72:248 ARN 77:194 Zr 154:72 ARN 248:50 Sin asignar 248:194 Sin asignar

En los resultados en las Tablas 2-5 se han marcado en rojo zonas de la Figura 58 donde no existían datos asignados o asignaciones que no correspondían al dinucléotido analizado (por ejemplo, Zr corresponde a una estructura Z de purinas, por lo que en análisis de los sistemas de una Citosina, una pirimidina, se ha marcado en rojo). A pesar de esto, la mayor parte de las combinaciones de ángulo han sido asignadas. La mayoría

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corresponden a combinación de ángulos existentes en estructuras de ARN. Tanto la Citosina como la Guanina aparecen también en el ARN, siendo la principal diferencia entre estas macromoléculas biológicas el azúcar que forma el nucleósido (ribosa o desoxirribosa), por lo que tampoco es extraño que haya zonas asignadas a esta macromolécula. Es razonable pensar que es más esperable que se asigne a una estructura de ARN a que se localice en una zona sin datos (de ahí que el resultado ARN no se haya marcado en rojo), ya que dada las similitudes estructurales entre el ADN y el ARN, las configuraciones obtenidas en la simulación no son anómalas.

El hecho de que no todas las configuraciones resultantes de la simulación no sean asignadas a estructuras del ADN se achaca a la diferencia entre las condiciones analizadas. En primer lugar el resultado experimental procede del análisis de largas cadenas estáticas en fase cristalina de ADN (y ARN), mientras que los resultados simulados son para pequeños fragmentos (dinucleótidos), analizados a lo largo del tiempo y en fase acuosa. El pequeño tamaño de los sistemas estudiados, el efecto de la energía cinética y la presencia del disolvente hacen que los sistemas simulados adopten conformaciones no observadas en los cristales. Esto confirma la idea de que la conformación activa de macromoléculas biológicas (ADN, ARN, proteínas, enzimas…) no es la observada en los cristales, sino que el efecto de la temperatura, el disolvente y la longitud de la cadena provocará cambios estructurales importantes.

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5. Conclusiones

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En el trabajo se han llevado a cabo diferentes simulaciones de Dinámica Molecular de 1 µs de duración en fase acuosa de los sistemas dímero de Citosina, dímero de Guanina y el sistema resultante del emparejamiento de los dos primeros. De las trayectorias resultantes se han analizado la distribución de ciertos ángulos diedros que definen la geometría de los sistemas.

En general se ha observado que existen distribuciones de valores alrededor de determinados ángulos, indicando que existe preferencia a ciertas geometrías en las dinámicas estudiadas, geometrías seguramente más estables. La distribución de valores angulares en los dímeros libres se ven estrechadas y algo cambiadas cuando se analizan las distribuciones del sistema emparejado. Seguramente esto sea debido a que los enlaces de hidrógeno que se forman al emparejar los dímeros, restringen el movimiento y las geometrías adoptadas con respecto a los sistemas libres.

Los valores angulares encontrados se han comparado con los determinados en estructuras cristalinas de cadenas de AND y ARN. Algunas de las estructuras halladas en la simulación corresponden con estructuras de ADN, mientras que la mayor parte coinciden con los datos correspondientes al ARN. Así, se puede apreciar que, a pesar de la diferencia del azúcar presente en el ADN y ARN (desoxirribosa y ribosa respectivamente), los sistemas estudiados pueden adoptar cualquiera de estas conformaciones estructurales.

El hecho de que no todas las estructuras halladas en las simulaciones hayan podido ser asignadas a confórmeros de ADN se debe a las diferencias entre la simulación y los datos bibliográficos. Así, las simulaciones de Dinámica Molecular están realizadas en sistemas de dos o cuatro nucleótidos a 300 K y en fase condensada (considerando el agua de manera explícita), mientras que las estructuras experimentales corresponden a las largas cadenas de material genético en fase cristalina.

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