Avances en el manejode la Leishmaniosis CaninaPonencias

SEVC 2011 - Simposio

Southern European Veterinary Conference

Simposio “Avances en el manejode la Leishmaniosis Canina”30 de septiembre de 2011

Barcelona, España

Actualización en la epidemiología de la Leishmaniosis Canina en Europa del sur.Guadalupe Miró 6

Inmunología de la Leishmaniosis Canina. ¿Qué debo saber?Fernando Fariñas 9

Diagnóstico de la Leishmaniosis Canina: Aprendiendo de los casos difíciles.Lluís Ferrer 10

CaniLeish®: desarrollo de una nueva herramienta preventiva.¿Cómo se produce una vacuna que realmente funcione?David McGahie 13

Resultados de los estudios de seguridad de CaniLeish®.¿Qué podemos esperar?David McGahie 15

Resultados de los estudios de eficacia de CaniLeish®.¿Cómo actúa ante un desafío natural extremo?Christophe Rème 17

Uso práctico de CaniLeish®.¿Qué debo saber para obtener el mejor resultado con la nueva vacuna?David McGahie 19

¿Cómo tratar de la mejor forma los casos clínicos de Leishmaniosis Canina?Guías actuales.Guadalupe Miró 21

El tratamiento fue un éxito... ¿Cuál es el siguiente paso?Lluís Ferrer 22

CaniLeish® ha sido desarrollada por BVT (Bio Véto Test), empresa 100% subsidiaria de Virbac S.A., en colaboración con el IRD (Institut de Recherche pour le Développement), y los equipos de I+D de Virbac. Este proyecto se basa en una patente del IRD referente al cultivo de Leishmania para la que IRD ha otorgado a BVT una licencia exclusiva de la patente para las aplicaciones en salud animal.

Maite VerdeDoctora en Veterinaria en el Servicio de Medicina Interna y Dermatología del Hospital Universitario de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza, de la que es Catedrática de Medicina y Cirugía Animal. Miembro de los grupos de trabajo de Dermatología y de Medicina Interna de AVEPA, de la European Society Veterinary Dermatology, de la Sociedad Española de Medicina Interna Veterinaria, de la Asociación de Veterinarios Especialistas en Diagnóstico de Laboratorio, de ESCCAP España y de la International Society for Companion Animal Infectious Diseases. Ha impartido conferencias en congresos nacionales e internacionales, programas de formación continuada para veterinarios y ha publicado diversos artículos y capítulos de libros sobre Medicina Interna y Dermatología Veterinarias.

Guadalupe MiróLicenciada en Veterinaria y Doctora en Veterinaria por la Universidad Complutense de Madrid. Diplomada por el Colegio Europeo de Veterinarios Parasitólogos. Profesora Titular de Parasitología y Enfermedades Parasitarias del Departamento de Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de Madrid. Responsable de la Consulta de Patología Infecciosa y Parasitaria del Hospital Clínico Veterinario de Madrid. Miembro fundador y Presidenta, en la actualidad, del grupo europeo de expertos en Leishmaniosis Canina LEISHVET. Representante española en ESCCAP (European Scientific Council Companion Animal Parasites) y Presidenta de la delegación española (ESCCAP España). Autora de numerosas publicaciones y monografías científicas relacionadas con las parasitosis y las enfermedades infecciosas de los pequeños animales. Se ha especializado en el control sanitario de colectividades felinas y caninas, y desarrolla su investigación en diversas zoonosis como leishmaniosis, toxoplasmosis y gastroenteritis parasitarias.

Fernando FariñasEspecialista en Inmunología e Infectología clínica comparadas. Actualmente co-dirige el Instituto de Patología y Enfermedades Infecciosas y el Centro de Enfermedades Infecciosas e Inmunología Clínica de Granada. Presidente de la Fundación “IO” de lucha frente a Enfermedades Infecciosas y Zoonosis Emergentes y Coordinador del Grupo Español de Expertos en Zoonosis (GEEZ), dependiente de esta fundación. Forma parte del cuadro docente de varios cursos y masters en Inmunología Clínica y Enfermedades Infecciosas, siendo además asesor de numerosas organizaciones y empresas farmaceúticas nacionales e internacionales en el ámbito de las Enfermedades Infecciosas, Inmunología y Vacunología especialmente. Autor de varios libros y numerosos artículos sobre esta temática.

Ponentes

Lluís FerrerLicenciado y doctor en Veterinaria y Diplomado en Dermatología Veterinaria por el European College of Veterinary Dermatology. Desde 1992 es catedrático de Medicina y Cirugía Animal de la Facultad de Veterinaria de la UAB. Sus investigaciones se centran en la Leishmaniosis Canina y en la dermatología comparada, en especial en la base genética de las enfermedades de la piel. Ha sido profesor visitante de las Universidades de Cornell (USA, 1985), Utrecht (Paises Bajos, 1987), Guelph (Canada, 1992), Lisboa (Portugal, 1995) y Montreal (Canada 2009-2010). Desde 2010 es co-editor de la revista Veterinary Dermatology.

David McGahieBVMS BSc (Vet. Sci.). Graduado en la Facultad de Veterinaria de Glasgow, Escocia, en 1998. Tras 9 años de ejercicio clínico, últimamente con un mayor énfasis en animales de compañía, se incorporó a Virbac UK para trabajar como Field Veterinary Adviser. En 2009 se trasladó al sur de Francia para incorporarse al Departamento Médico de las oficinas centrales de Virbac como Technical Manager, y es responsable de la comunicación científica y los estudios en fase IV de la compañía en los campos de Inmunología y Medicina Interna.

Christophe RèmeDVM. Graduado en la Facultad de Veterinaria de Lyon, Francia, en 1995. Tras 3 años de ejercicio clínico en animales de compañía, se enfocó hacia la investigación clínica obteniendo diplomas universitarios de la Facultad de Medicina de Montpellier y de la Facultad de Ciencias de París (Estadística Médica). Obtuvo entonces el cargo de Clinical Trials Manager en una empresa de investigación antes de incorporarse a Virbac en 2001. Desde 2005 ha sido el Director del Departamento Médico en las oficinas centrales de Virbac y es responsable de la comunicación científica y los estudios en fase IV de la compañía. En este cargo, ha supervisado los ensayos clínicos y la información técnica producida para el lanzamiento de más de 20 productos en todo el mundo en los últimos 6 años. Con un especial interés en Dermatología y Parasitología, es autor de más de 20 artículos peer-reviewed publicados en revistas científicas internacionales y presenta regularmente conferencias y comunicaciones científicas en seminarios y congresos internacionales.

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Prevención de la Leishmaniosis Canina:el reto de una vacuna para EuropaMaite VerdeLa Leishmaniosis Canina (LC) es una enfermedad de elevada prevalencia en los perros de los países de la cuenca mediterránea. Cualquier perro es susceptible de contagio a través de la picadura de flebotomos infestados, pero el que un individuo presente clínicamente la enfermedad dependerá fundamentalmente de la respuesta de su sistema inmune, de la concomitancia de otras parasitosis, de posibles reinfecciones y de la patogenicidad de la cepa de Leishmania.

Gracias a las investigaciones de los últimos treinta años, hoy disponemos de un modelo de enfermedad y de mucha información sobre las formas clínicas, las pruebas laboratoriales más sensibles y específicas, las consideraciones pronósticas en función de la situación biopatológica del paciente y la concomitancia con otras enfermedades, todo lo cual nos permite tomar decisiones más seguras sobre cómo plantear el tratamiento y sus posibilidades de éxito.

Las opciones terapéuticas se basan en el uso combinado del glucantime o de la miltefosina, con alopurinol. Pero en cualquier caso, es fundamental la aplicación de medidas preventivas que eviten el desarrollo de la enfermedad. Estamos asistiendo a la presentación de los últimos avances en medicina preventiva frente a LC en Europa: CaniLeish® (primera vacuna frente a LC registrada en la Agencia Europea del Medicamento en 2011, por Laboratorios Virbac).

En este simposio tendremos el privilegio de asistir a una puesta al día de los conocimientos de la LC que más interesan a los clínicos de animales de compañía de la mano de Guadalupe Miró, Fernando Fariñas y Lluís Ferrer. Tres expertos que aúnan conocimiento y experiencia del más alto nivel en los campos de la inmunología, la anatomía patológica, la parasitología, el diagnóstico y el tratamiento de la LC. Además, David McGahie y Christophe Rème aportarán datos sobre la seguridad y la eficacia de la vacuna CaniLeish® y de cómo utilizarla desde un punto de vista práctico en la lucha contra la enfermedad.

Es el momento de resolver nuestras dudas. Es una oportunidad para avanzar un paso más en nuestro nivel de conocimiento de la alternativa preventiva más esperada.

Actualización en la epidemiología de la Leishmaniosis Canina en Europa del surGuadalupe MiróLa Leishmaniosis Canina se extiende fundamentalmente por tres zonas geográficas: Brasil, China y la cuenca mediterránea. En la cuenca mediterránea el perro es el principal reservorio del ciclo doméstico de la infección por L. infantum.

Pero existe también un ciclo selvático de la infección por L. infantum que es mantenido por cánidos salvajes como el zorro, el lobo o el chacal. La prevalencia encontrada en zorros mediante la técnica de PCR en trabajos realizados en España y sur de Italia, registra valores del 40-75%, pudiéndose considerar al zorro como reservorio secundario que supone el eslabón entre ambos ciclos por su preferencia a vivir cerca de las poblaciones domésticas. Leishmania infantum ha sido detectada también en lobos, roedores, caballos y gatos (auque son muchas las cuestiones por concretar sobre el papel epidemiológico de esta especie).

En zonas endémicas, existe un alto porcentaje de perros que están infectados (50%) pero que son clínicamente sanos y, en cambio, el porcentaje de perros enfermos de leishmaniosis es mucho menor (3-5%) debido a que la Leishmaniosis Canina es una enfermedad en la que la infección no siempre es sinónimo de enfermedad clínica.

Por tanto, las prevalencias de la Leishmaniosis Canina en España y sur de Europa registradas son muy variables dependiendo de si los datos se refieren a seroprevalencia o a infección obtenidos por técnicas moleculares.

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En la epidemiología de esta importante zoonosis juega un papel fundamental el vector artrópodo Phlebotomus spp y la presencia de L. infantum se verá influenciada en función de su actividad y tasas de incidencia.

Pero en la actualidad se barajan otras vías de transmisión no vectoriales de esta infección que han sido demostradas pero su importancia es aún poco conocida y tendrán que tenerse en cuenta: la transmisión vertical (aunque los casos recogidos en la bibliografía son anecdóticos), la transfusión sanguínea (de gran importancia en zonas endémicas donde donantes de sangre frecuentemente pueden estar infectados subclínicamente), la transmisión venérea (se ha detectado presencia de semen en machos infectados que tras la cópula infectaron a hembras sanas).

Otras hipótesis que se barajan en cuanto a posibles vías de transmisión pero que aún no han sido demostradas son la transmisión mediante otros vectores como garrapatas y pulgas (aunque aún está por demostrar la transmisión experimental al perro) y la transmisión mediante contacto directo de perro a perro (hipótesis que se baraja para explicar la presencia de casos autóctonos en zonas no endémicas en las que no se ha podido demostrar la presencia de ningún vector artrópodo eficaz, como es el caso de Estados Unidos). En este sentido es de gran importancia definir la capacidad infectante de los perros parasitados que solo se puede evidenciar experimentalmente mediante xenodiagnóstico directo. En general los perros seropositivos enfermos demuestran una mayor infectividad para los flebótomos que los perros seropositivos subclínicos y permanecen “estériles” para los flebótomos entre 4 y 6 meses después del tratamiento.

Por último, se ha propuesto considerar a los humanos como reservorio de la leishmaniosis en la coinfección L. infantum/VIH, bien por el uso compartido de jeringuillas o a través de la picadura de flebotomos parasitados tras haberse alimentado de estos enfermos. En ambas situaciones estaríamos ante una auténtica antroponosis al no participar el perro, ni ningún otro vertebrado diferente al humano, en el ciclo de la enfermedad.

En cuanto a las características del hospedador, cabe resaltar que se considera que hay ciertas razas de perros más predispuestas a padecer la enfermedad que son: Boxer, Cocker spaniel, Rottweiler y Pastor alemán; y que el desarrollo de la enfermedad presenta una curva bimodal con respecto a la edad, encontrándose más casos en animales menores de 2-3 años y en perros mayores de 8 años.

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2Inmunología de la Leishmaniosis Canina¿Qué debo saber?Fernando FariñasIntroducción a la respuesta inmuneLas enfermedades infecciosas en un individuo no se deben exclusivamente a la presencia de un patógeno, sino a la interacción de éste con el sistema inmune del hospedador. La respuesta inmune se puede dividir en dos tipos; la que se presenta al inicio, intentando contener al patógeno rápidamente, de manera inespecífica, estereotipada e incapaz de presentar memoria (respuesta inmune innata), y aquella que es capaz de montar toda una serie de estrategias particulares y sumamente específicas para eliminar al agente invasor y crear memoria (respuesta inmune adaptativa). De forma simplificada, en esta respuesta adaptativa puede predominar una respuesta Th1 de tipo celular, con producción de altos niveles de citoquinas del tipo IFN-γ, IL-12 y TNF-α y producción de inmunoglobulina IgG2a, una respuesta de predominio humoral Th2 con producción de citoquinas IL-4, IL-10 e IL-5 y producción de inmunoglobulinas A, E e IgG1, o bien respuestas mixtas Th1/Th2.

La inmunidad o respuesta innata es la respuesta inmediata, y es activada a través de receptores codificados en una línea germinal llamados receptores de reconocimiento de patrones (PRRs), los cuales reconocen patrones moleculares conservados a través de la evolución en una gran gama de patógenos. Estas moléculas llamadas patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), estimulan la señalización celular, la expresión de genes y, por lo tanto, la activación de funciones inflamatorias y antimicrobianas. La respuesta innata, además de ejercer una rápida línea de defensa contra la infección, al mismo tiempo inicia el proceso que permite el eventual desarrollo de la respuesta inmune adaptativa y el establecimiento de la memoria inmunológica.

Los mamíferos pueden ser infectados por una gran cantidad de microorganismos (virus, bacterias, protozoarios, etc.), los cuales poseen fundamentalmente diferentes estructuras, fisiología y mecanismos de propagación. Sin embargo, el sistema inmune innato tiene un limitado número de PPRs disponibles capaces de reconocer algunas partes comunes en agentes infecciosos muy diferentes.

Los PAMPs son estructuras moleculares microbianas, evolutivamente conservadas y por lo tanto se comparten entre diferentes especies microbianas. Además, los PAMPs son esenciales para el crecimiento microbiano y raramente modificadas por el organismo, lo que permite el reconocimiento por el sistema inmune innato. El segundo principio en el reconocimiento inmune innato es la detección de moléculas con localización aberrante, principalmente estructuras de nucleótidos.

La infecciones microbianas están asociadas con la introducción de nucleótidos (ambos DNA y RNA) tanto en el endosoma como en el citoplasma, las cuales son localizaciones anormales de estas estructuras.

Gracias también a la expresión de PPRs en los endosomas y citoplasma celular, el sistema inmune innato detecta nucleótidos en estas localizaciones aberrantes como si se tratara de un reconocimiento microbiano.

Todos los virus y un subgrupo de bacterias y parásitos, se propagan en la célula del hospedador que están infectando. Entre los parásitos, algunos protozoarios entran en las células y crean una membrana única que rodea el compartimento citoplásmico, la vacuola parasitófora, donde se lleva a cabo la replicación. Para el reconocimiento de los protozoarios en el espacio extracelular, el glicofosfatidil-inositol (GPI) de membrana, constituye el principal PAMP, mientras que en el endosoma, receptores para DNA y dsRNA se ha reportado que contribuyen a la respuesta inmune innata frente a estos.

Inmunología de la leishmaniosisLa resistencia del perro a la infección por Leishmania depende del desarrollo de una potente respuesta inmune celular, en la cual participan activamente los linfocitos CD4+ de tipo Th1, mediante la síntesis y liberación de citoquinas como la interleucina-2, interleucina-12 y el interferón gamma (IFN-γ), necesarios para la activación macrofágica, la respuesta efectora de los linfocitos T CD8+ citotóxicos y la actividad citotóxica de las células asesinas naturales (del inglés natural killer, NK), que dan lugar a la destrucción del parásito. La actividad leishmanicida es debida al aumento de la capacidad de los macrófagos de producir oxígeno tóxico y radicales de nitrógeno (NO) en respuesta al IFN-γ. Sin embargo, si la respuesta es protagonizada por células CD4+ de tipo Th2, productoras de interleucinas 4 y 10, esta respuesta puede predisponer a un cuadro clínico de mayor gravedad.

Algunos trabajos publicados proponen la Leishmaniosis Canina como un modelo muy útil en el estudio de la leishmaniosis humana visceral. Ciertamente, se puede argumentar que existen algunas diferencias entre la Leishmaniosis Canina y la humana a

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nivel clínico y patológico, como por ejemplo la mayor resistencia de los humanos a la infección por el parásito, y la existencia de manifestaciones clínicas que se dan en perros (p.ejemplo la dermatitis ulcerativa asociada a la infección), jamás descrita en humanos.

A pesar de esto, a nivel inmunológico ambas especies muestran muchísimas semejanzas. Así, como ya se ha comentado, tanto en la Leishmaniosis Canina como en la leishmaniosis humana, ya sea ésta cutánea, mucocutánea o visceral, la resistencia a la infección está relacionada con el tipo y calidad de la respuesta inmune. En la leishmaniosis cutánea humana, la producción local de IFN-γ que media respuestas Th1 juega un papel crítico en la resistencia, vía activación de macrófagos infectados. Igualmente, durante la fase clínica activa de la leishmaniosis visceral, se da una marcada depresión tanto de respuestas linfoproliferativas Leishmania-específica, como producción de IFN-γ y de respuestas de hipersensibilidad retardada frente a diferentes antígenos del parásito. Esta anergia parece estar mediada, al menos en parte, por un efecto supresor de la IL-10 y bajos niveles de IL-12. Todos estos mecanismos son fundamentalmente idénticos a los descritos en perros, excepto el que en éstos últimos, la IL-10 no parece jugar un papel tan importante o determinante en la patología.

Atendiendo a la inmunidad humoral frente a la leishmaniosis, tanto en humanos como en perros enfermos, se han observado incrementos policlonales y a veces también monoclonales de inmunoglobulinas por sobreactivación de linfocitos B. Estos anticuerpos no son protectivos e incluso sus niveles están asociados positivamente con la presencia y severidad de la enfermedad. Así, tanto humanos como perros resistentes tienden a producir anticuerpos de todas las clases pero en baja frecuencia y concentración, mientras que los enfermos más graves lo hacen al contrario. Entre estas inmunoglobulinas predominan las IgG, mientras que las IgM, IgE e IgA se producen en mucha menor cantidad. Incluso, se comprueba que algunos de estos anticuerpos formados durante la infección tienen carácter de auto-anticuerpo frente a eritrocitos, miocitos y componentes nucleares, principalmente en el perro, lo cual llega a explicar, en parte, las numerosas manifestaciones clínicas de la enfermedad en éstos.

Por su parte, las leishmanias no son seres inertes, sino que poseen una serie de estrategias complejas para atacar, infectar y sobrevivir dentro de los macrófagos. El hospedador puede “fallar” para controlar la enfermedad debido a la habilidad que tienen algunas cepas de resistir a la acción microbicida de los macrófagos activados y de producir estados severos de inmunodepresión.

Como decimos, Leishmania posee varias moléculas en su superficie que actúan como factores de virulencia así como de evasión contra el sistema inmune del hospedador. Estos mecanismos incluyen un denso glucocálix compuesto de lipo-fosfoglicanos y glucosil-inositol-fosfolípidos, proteínas secretadas por el parásito entre las que se encuentran todo un arsenal de gluco-conjugados, proteo-fosfo-glucanos, fosfatasas ácidas y la metaloproteasa gp63, abundante en la superficie de los promastigotes.

Qué duda cabe que el conocimiento de estos mecanismos inmunológicos ha contribuido, y contribuirá, al desarrollo de estrategias inmunoprofilácticas e inmunoterapeúticas que nos permitirán un mejor control y tratamiento de la enfermedad.

Diagnóstico de la Leishmaniosis Canina:aprendiendo de los casos difícilesLluís FerrerIntroducciónLa base para el establecimiento de un diagnóstico correcto es la comprensión de la diferencia entre infección y enfermedad. Los estudios muestran que el porcentaje de perros infectados en las zonas en las que la enfermedad es endémica es muy elevado (probablemente superior al 50%), pero solo una parte es seropositiva y una parte todavía menor desarrolla la enfermedad. Se sabe que una vez que el promastigote es inoculado en la piel del perro, la progresión de la infección sigue diferentes caminos. Tal vez (no se ha demostrado de forma fehaciente) en un porcentaje pequeño de animales los mecanismos de inmunidad innata abortan la infección localmente. En la mayoría casos, por el contrario, la infección se extiende localmente y desencadena una respuesta inmunitaria específica. En función del tipo de respuesta, la infección progresa hacia la enfermedad clínica o bien permanece controlada. En los animales que desarrollan una respuesta inmunitaria celular de predominio Th1 (probablemente la mayoría) se produce una activación de los macrófagos y una destrucción de los parásitos por mecanismos mediados por el NO. Por el contrario, en los animales en que la respuesta inmunitaria tiene un perfil Th2, con predominio de producción de anticuerpos humorales (IgG1, IgG2), la infección no se controla y se avanza hacia la enfermedad clínica grave.

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Los factores que hacen que un animal determinado avance hacia el control inmunitario de la enfermedad o hacia la enfermedad clínica se desconocen. Probablemente la genética es el más importante. Hay razas en las que la enfermedad clínica es rarísima (podenco ibicenco) y otras en las que la enfermedad clínica es muy común (rottweiler, pastor alemán...). Un estudio reciente en dos razas (boxer, pastor alemán) atribuye a la genética un peso del 60% en la evolución de la infección. Un punto importante es que la situación de “resistente” (respuesta no efectiva) o “susceptible” (respuesta humoral inefectiva) no es definitiva. Una enfermedad inmunosupresora, un tratamiento farmacológico u otros factores pueden hacer que un animal que durante años ha mantenido la infección bajo control desarrolle signos clínicos de la leishmaniosis. Igualmente, la terapia actual (antimoniales, miltefosina, alopurinol) consigue que la respuesta inmunitaria se oriente hacia la respuesta celular efectiva y controle la enfermedad.

En los animales en los que la infección progresa, se desencadenan diversos mecanismos patogénicos. Por una parte la infección se extiende a numerosos órganos y sistemas (bazo, nódulos linfáticos, piel y mucosas, hígado, páncreas, testículos, intestino..), en los cuales se producen procesos inflamatorios granulomatosos. Además, se producen inmunocomplejos (ICs) circulantes que se depositan en glomérulos renales, úvea, vasos y sinovial articular. El depósito de ICs es una de las principales causas de los signos clínicos de la enfermedad. Además, en el curso de la enfermedad se producen otros mecanismos patogénicos, tales como la formación de autoanticuerpos o la anemia crónica.

El diagnóstico de la enfermedadEl diagnóstico de la leishmaniosis puede ser muy fácil o muy difícil. Las dificultades proceden de:

1. Las diferentes presentaciones clínicas de la enfermedad.2. La confusión entre infección y enfermedad.3. La presencia de infecciones/parasitosis secundarias.

Como es bien sabido, la leishmaniosis clínica es una enfermedad muy pleomórfica. En cada animal se manifiesta de forma diferente, resultado de la genética propia y de las infecciones asociadas, entre otros factores. De forma resumida, los principales signos clínicos y presentaciones clínicas de la enfermedad son los siguientes:

1. Lesiones cutáneas: dermatitis exfoliativa, ulceraciones cutáneas y en uniones mucocutáneas, nódulos cutáneos.2. Linfadenopatía (hiperplasia linfática reactiva).3. Astenia, anorexia, pérdida de peso, atrofia de masa muscular, hipertermia leve.4. Insuficiencia renal (proteinuria, azotemia).5. Lesiones oculares (queratitis, uveítis, panoftalmitis, glaucoma).6. Cojera (artritis, miositis).7. Epistaxis.8. Diarrea crónica de intestino grueso (colitis).

En todos los casos, la enfermedad tiene un inicio insidioso y un curso crónico, y se desarrolla a lo largo de semanas o meses. A veces ayuda también el dato de que el proceso no haya respondido ni a los antibióticos ni a los corticoides.

Los análisis clínicos son también muy variables, y reflejan la variedad de mecanismos patogénicos y la evolución y gravedad de la enfermedad. Suele ser constante la hiperproteinemia por hiper-gamma-globulinemia, la anemia no regenerativa moderada y la proteinuria de diferente gravedad, pero luego existen muy diversas presentaciones.

De forma resumida, se puede decir que el diagnóstico se establecerá en un paciente que presente signos clínicos o alteraciones clinicopatológicas compatibles y una serología cuantitativa (IFI, ELISA) positiva.

Hay que recordar que el diagnóstico es un juicio clínico, que emite el clínico tras valorar toda una serie de hallazgos y resultados (historia, exploraciones, análisis...). No existen los tests “diagnósticos”. De acuerdo con la llamada medicina basada en la evidencia, un buen test diagnóstico es, simplemente, aquel que incrementa mucho la probabilidad de un diagnóstico determinado.

La serología cuantitativa es la mejor forma de confirmar un diagnóstico de leishmaniosis en casos clínicamente sospechosos, puesto que:

i) Se sabe que un título de Acs elevado está correlacionado con la enfermedad clínica (es decir, no indica solo infección).ii) Es simple, rápido, barato, y está fácilmente disponible.iii) Sirve para evaluar la respuesta del paciente a la terapia.

Buena parte de la confusión procede del uso de las técnicas de PCR, más adecuadas para la identificación de la infección que para el diagnóstico ordinario. El diagnóstico de la infección sólo tiene interés epidemiológico o en determinadas investigaciones. Se puede realizar mediante:

• PCR (diferentes técnicas).• Serología.• Cultivo (baja sensibilidad y elevado coste).• Citología e histopatología (baja sensibilidad).• Test intradérmico.

El problema es que se ha extendido el uso de las técnicas de PCR (simple, nested o cuantitativa) en la convicción de que permitían un diagnóstico de la enfermedad de gran sensibilidad. Sin embargo, hay que recordar que estas técnicas únicamente informan de la presencia de DNA del parásito en la muestra analizada. Por tanto, un resultado negativo es compatible con:

1. Un perro no infectado, que no padece leishmaniosis.2. Un perro infectado, con parásito en otras partes del organismo aunque no en la muestra estudiada (situación común).3. Un perro infectado y enfermo de leishmaniosis, con parásito en otras partes del organismo aunque no en la muestra estudiada (situación rara, pero posible).

Igualmente, un resultado positivo es compatible con un animal infectado pero que no padece la leishmaniosis (situación más común en zonas endémicas) y con un animal enfermo. El problema reside en que la PCR es una técnica cualitativa (positivo/negativo) y no ayuda a distinguir un infectado-sano de un infectado-enfermo. En zonas endémicas, esto supone un grave problema. La PCR cuantitativa resuelve parcialmente este problema. Sin embargo, la correlación entre cuadro clínico y resultado de la técnica, es mucho mayor en la serología, como han demostrado diversos estudios.

En la figura se muestra un posible protocolo a seguir para establecer el diagnóstico definitivo [Solano-Gallego et al, 2011].

Referencias bibliográficas• Baneth G. Canine leishmaniosis - new concepts and insights on an expanding zoonosis: part one. Trends in Parasitology (2008); 24: 324-30.• Gálvez R. Emerging trends in the seroprevalence of canine leishmaniasis in the Madrid region (central Spain). Veterinary Parasitology (2010); 169: 327-34.• Solano-Gallego L et al. Directions for the diagnosis, clinical staging, treatment and prevention of canine leishmaniosis. Veterinary Parasitology (2009); 165: 1-18.• Solano-Gallego L et al. Leishvet guidelines for the practical management of canine leishmaniosis. Parasites and Vectors (2011); 4:86 (http://www.parasitesandvectors.com/content/4/1/86).

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Figura 1 Diagnóstico de perros sospechosos de tener signos clínicos y/o anomalías clinicopatológicas asociadas a Leishmaniosis Canina

Perro con signos clínicos y/o anomalías clinicopatológicas compatibles con Leishmaniosis Canina

Amastigotes de LeishmaniaSÍ

NOPOSITIVO

Sospechaelevadade LC

LCconfirmada

PCR NEGATIVOConsiderar

otrosdiagnósticos

Serología cuantitativaPOSITIVO NEGATIVO

Examen citológico/histológicoALTO BAJO

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4CaniLeish®: desarrollo de una nueva herramienta preventiva. ¿Cómo se produce una vacuna que realmente funcione?David McGahieHistoria del desarrolloLa historia de las investigaciones de CaniLeish® se remonta a principio de los años 80. En aquel entonces se había identificado a una clase de proteínas, las PSE, acrónimo de Proteínas Secretadas-Excretadas, en varias especies de parásitos unicelulares como Leishmania, Babesia y otros. Se pensó que esta clase de proteínas estaba implicada en la infección de los macrófagos y que, por tanto, podían ser utilizadas como antígenos, bien en tests de diagnóstico o en aplicaciones vacunales inmunoterapéuticas o inmunoprofilácticas. Sin embargo, se producía muy poca cantidad de estas proteínas y su purificación del resto de componentes del medio de cultivo era difícil porque Leishmania requería un medio de cultivo muy rico y la inoculación en animales hospedadores para completar su ciclo biológico.

El primer gran avance se produjo cuando el equipo de Jean-Loup Lemesre en el Institut de Recherche pour le Développement (IRD) inventó un medio in vitro perfectamente definido que solo contenía las cantidades precisas de pequeñas moléculas como azúcares, aminoácidos y vitaminas que permitía el desarrollo y multiplicación del parásito.1 Este medio, además, no contiene suero ni células, aspecto importante porque las únicas proteínas que se encontrarán en el sobrenadante del medio de cultivo proceden de los parásitos de Leishmania, las PSE de Leishmania infantum (LiPSE). El equipo del IRD empezó a colaborar con Bio Véto Test (BVT), una compañía especializada en diagnóstico que actualmente es filial de Virbac, que es su único propietario, para explorar las posibilidades de los antígenos LiPSE, inicialmente en el contexto de la creación de pruebas de diagnóstico y posteriormente en el contexto de la vacunación terapéutica y profiláctica de perros. IRD otorgó una licencia exclusiva a BVT para la utilización del método de producción de LiPSE en aplicaciones para la salud animal.

Entre 1997 y 2003, y en colaboración con la Facultad de Veterinaria de Lyon, se realizaron pruebas con un prototipo de vacuna LiPSE adyuvantada con muramil dipéptido (MDP) que generaron resultados esperanzadores cuando se utilizó la vacuna como inmunoterapia y también para la prevención de la enfermedad, tanto en condiciones de campo como con modelos de desafío.2,3,4 En las pruebas de campo, la tasa de infección del grupo control fue baja (menos del 7% en dos años), pero se confirmó el uso potencial de las PSE en una vacuna profiláctica. Sin embargo, el adyuvante MDP sólo se utilizó en escenarios experimentales y se sabe que sus derivados pueden inducir una respuesta Th2 en condiciones acuosas.5 Además, no se había definido la producción de PSE a escala industrial. En consecuencia, debía realizarse una cantidad considerable de investigaciones para desarrollar el concepto de la utilización de las PSE en una vacuna que pudiera producirse comercialmente. El equipo I+D de Virbac se unió a esta colaboración para aportar su experiencia en la formulación y desarrollo de vacunas y hacer que la vacuna consiguiera su forma actual.

Pasos en el desarrolloSe necesitaron varios pasos para el desarrollo de la vacuna. Era necesario definir los parámetros necesarios para la producción de PSE a escala industrial a partir de los pequeños volúmenes de los lotes piloto para permitir que el producto pudiera estar al alcance de los clínicos. También era necesario definir mejor el carácter de las PSE. Como parte de este proceso, se confirmó la presencia de los principales antígenos en la vacuna, los antígenos de superficie del parásito (ASP). Estas proteínas se encuentran unidas a la membrana (en promastigotes y amastigotes) además de secretadas/excretadas en forma libre y están implicadas en las interacciones ente macrófago y parásito, lo que las hace una diana adecuada de las vacunas.6 El sistema exclusivo de producción utilizado para CaniLeish® utilizando a los propios parásitos para producir las proteínas, significa que las proteínas conservan su conformación original. La caracterización de las PSE también permitió la creación de pruebas específicas de control de calidad que permiten asegurar la consistencia del perfil de las proteínas entre lotes.

Además de caracterizar y definir los métodos de producción para las PSE, también era necesario elegir un adyuvante adecuado para la vacuna. El requisito principal es la inducción segura de una respuesta con predominio Th1. Se tuvieron en cuenta varias opciones y finalmente se eligió a QA-21 porque tiene un perfil beneficio:riesgo óptimo y es un inductor excelente de una respuesta Th1 mediada por el interferón gamma (IFN-γ).

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Demostración del concepto - la acción sobre el sistema inmuneLa elección de un antígeno y un adyuvante basándose en las evidencias publicadas y estudios piloto no basta para generar confianza sobre la capacidad de la vacuna para funcionar bien en las pruebas de eficacia. Se necesita, además, seguir el impacto de la vacuna sobre el sistema inmune del perro. De este modo también se pueden calibrar los niveles de antígeno y adyuvante.

Para el desarrollo de CaniLeish® se utilizaron varias pruebas para evaluar el modo en que modula la respuesta inmune. Se confirmó la capacidad de la vacuna para inducir células de memoria que luego proliferan de forma específica como respuesta a la exposición a Leishmania infantum junto con el Dr. J. Moreno del Instituto de Salud Carlos III en Madrid, Centro Colaborador de la OMS para Leishmaniasis. En el mismo laboratorio se hizo un paso más a través de la prueba ELISpot,7 que mide la proporción de células en multiplicación que está produciendo IFN-γ, y confirmó la polaridad Th1 de estas células de memoria. La combinación de estas dos pruebas demostró que los perros experimentales, cuando se vacunaron con CaniLeish®, fueron capaces de producir las células de memoria Th1 contra L. infantum esperadas.

Sin embargo, aún se podía realizar otro paso. Junto con el Profesor I. Vouldoukis del INSERM, UPMC-UMRS 945, Immunité et Infections, París, se consiguió desarrollar la prueba Test de Respuesta Leishmanicida de Macrófagos Caninos o Canine Macrophage Leishmanicidal Assay (CMLA)8 que confirmó que la vacuna no solo inducía la polaridad Th1 en las células de memoria sino que estas células de memoria podían estimular a los macrófagos autólogos para que destruyan promastigotes de L. infantum incluso habiendo transcurrido un año desde la vacunación. Otras pruebas también confirmaron que el nivel de destrucción del parásito estaba correlacionado con la inducción de la óxido nítrico sintasa inducible en los macrófagos y la producción de una destrucción oxidativa basada en el óxido nítrico. Esto concuerda con el mecanismo de acción conocido de la respuesta inmune deseada mediada por células con predominio Th1.9

La utilización de estas pruebas durante los estudios de desafío experimentales confirmó que se conserva el perfil inmune celular con predominio Th1 correcto en los perros vacunados incluso tras haber sido desafiados con cantidades ingentes de parásitos de L. infantum vivos. La combinación de este conocimiento sobre el modo de acción de la vacuna con los resultados positivos de un estudio experimental de desafío alentó el paso a un estudio de desafío natural, que es la única forma adecuada de evaluar definitivamente la eficacia de cualquier vacuna contra la Leishmaniosis Canina.

ConclusiónLa producción satisfactoria de la primera vacuna contra la Leishmaniosis Canina empezó con la selección de una combinación apropiada de un antígeno y un adyuvante, ambos conocidos por su potencial. A esto le siguió una inversión considerable para asegurar que era posible producir de forma consistente los antígenos y trabajos adicionales para comprender el mecanismo de acción de la vacuna en la respuesta inmune de los perros. Todo culminó con la decisión de avanzar hacia un estudio de desafío natural durante dos años (hablaremos de él en otra charla de este simposio) y la generación de los datos relevantes necesarios para el registro satisfactorio en la EMEA el primer semestre de 2011.

Bibliografía1. Lemesre JL. 1993. Patent Application number FR 2 705 358 – A1. Procédé de culture in vitro de différents stades de parasites tissulaires obtenus et applications biologiques.2. Bourdoiseau G, Hugnet C, Papierok G, Lemesre J. Canine leishmaniosis due to L. infantum: immunotherapy trials. Bull Acad Vet France, 2004; 157: 63-67.3. Lemesre JL, Holzmuller P, Cavaleyra M, et al. Protection against experimental visceral leishmaniasis infection in dogs immunized with purified excreted secreted antigens of L. infantum promastigotes. Vaccine, 2005; 23: 2825-2840.4. Lemesre JL, Holzmuller P, Gonçalves RB, et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine, 2007; 25: 4223-4234.5. Cox JC, Coulter AR. Adjuvants – a classification and review of their modes of action. Vaccine, 1997; 15: 248-2566. Kedzierski L, Montgomery J, Bullen D, et al. A Leucine-Rich Repeat Motif of Leishmania Parasite Surface Antigen 2 Binds to Macrophages through the Complement Receptor 3. J. Immunol., 2004; 172 : 4902-49067. Moreno J, Nieto J, Chamizo C, et al. The immune response and PBMC subsets in canine visceral leishmaniasis before, and after, chemotherapy. Vet. Immunol. Immunopathol., 1999; 71: 181-1958. Vouldoukis I, Drapier JC, Nüssler AK, et al. Canine visceral leishmaniasis: successful chemotherapy induces macrophage antileishmanial activity via the L-arginine nitric oxide pathway. Antimicrob. Agents Chemother., 1996; 40: 253-2569. Wanasen N, Soong L. L-arginine metabolism and its impact on host immunity against Leishmania infection. Immunol Res., 2008; 41:15-25.

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5Resultados de los estudios de seguridad de CaniLeish®. ¿Qué podemos esperar?David McGahieIntroducciónEl perfil de seguridad de cualquier vacuna es un factor muy importante para los clínicos que contemplan utilizarla. Las vacunas suelen emplearse para prevenir la enfermedad y, por tanto, se utilizan en animales sanos hasta entonces en los que la administración de la vacuna es opcional para el propietario. Esto significa que las reacciones adversas son percibidas como menos aceptables que con las medicaciones utilizadas para tratar enfermedades graves. Además, es probable que la población vacunada sea mucho mayor que la población que recibiría un tratamiento terapéutico por lo que incluso las reacciones adversas poco frecuentes pueden ser más aparentes.

Las reacciones adversas a las vacunas suelen clasificarse utilizando dos abordajes:1) Las reacciones se clasifican en “normales” o “inapropiadas”. La fiebre, malestar, inflamación local y leve dolor local transitorios se clasifican como reacciones “normales” a las vacunas porque son consecuencia de la respuesta inmune normal frente a la vacunación.1 Las reacciones que persisten más tiempo o tienen mayor intensidad se clasificarían como “inapropiadas”.2) Las reacciones también se dividen en “locales” y “generales”. Las reacciones locales que tienen lugar en el punto de inyección poco después de la administración de la vacuna son relativamente fáciles de vincular al acto de la vacunación. Las reacciones generales tales como trastornos gastrointestinales son menos fáciles de vincular con seguridad a la administración de la vacuna porque también pueden estar causadas por otros sucesos no relacionados.

Se ha realizado un trabajo importante a lo largo del desarrollo de CaniLeish® para asegurar que el elevado nivel de protección que proporciona también vaya asociado a un buen perfil de seguridad y para evaluar las reacciones esperadas que pueden aparecer durante su utilización.

Disponemos de tres conjuntos importantes de datos de los que hablaremos en esta sesión.A) Estudios de laboratorio específicos para evaluar la seguridad de dosis extras y sobredosisB) Estudios de campo para evaluar la seguridad de la vacuna en condiciones normales de utilización en un amplio abanico de razas y edadesC) Farmacovigilancia posterior a la comercialización y reacciones informales procedentes de Portugal, donde la vacuna ya está en el mercado

Datos de Seguridad

A) Estudios de laboratorio para evaluar la seguridad de dosis extras y sobredosisSe realizaron dos estudios. Primero, la seguridad de cuatro dosis (el protocolo normal consta de tres dosis a intervalos de tres semanas), y luego la seguridad de una sobredosis mediante la administración de una dosis doble.

Para ambos estudios utilizamos un diseño parecido:• Las dosis se formularon para contener un 10% más de antígeno que las dosis comerciales.• Se vacunó a diez perros y se mantuvo a un grupo de cinco perros como control.• Todos los perros fueron perros Beagle de cuatro meses de edad (dos meses más jóvenes que la edad recomendada en el prospecto, los perros más jóvenes tienen más probabilidad de sufrir reacciones adversas a la vacunación).• El punto de inyección se afeitó para permitir una evaluación sencilla y precisa de las reacciones que pudieran ocurrir en el área local.• Se realizó un examen detallado del estado clínico y del punto de inyección a diario durante los 14 días posteriores a la vacunación.• Se realizaron análisis hematológicos semanales.

En el primer estudio, diez de los diez cachorros sufrió hinchazón local, al menos en una de las ocasiones. El tamaño máximo de estas inflamaciones fue de diez centímetros, pero la mayoría fueron detectables únicamente mediante palpación, a pesar de haber afeitado la zona. Todas se resolvieron espontáneamente en un máximo de 12 días. Un solo cachorro mostró una hipertermia ligera, pero solo después de la primera inyección. En general, las cuatro inyecciones fueron bien toleradas.

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En el segundo estudio, en el que se administró una dosis doble, hubo una incidencia ligeramente superior de hipertermia ligera (tres de los diez cachorros, todos ellos durante 1 solo día). Siete de los diez perros mostraron una hinchazón local de un tamaño máximo de siete centímetros y de una duración máxima de cinco días. De nuevo, la vacunación fue muy bien tolerada.

B) Pruebas de campoTambién se realizaron dos estudios. En ambos participaron animales de razas y edades distintas con propietario a los que se administró la primovacunación normal de tres inyecciones a intervalos de tres semanas. Para estos estudios no se afeitó el punto de inyección.

En el primer estudio participaron 151 perros. 61 eran cachorros de 4 o 5 meses, y 90 tenían 6 o más meses de edad (el grupo de edad del registro). Se sometió a un examen veterinario a todos los animales antes de la vacunación, cuatro horas después y a los 2, 7, 14 y 21 días de la vacunación además de revisiones diarias por parte de los propietarios que debían incluir específicamente el examen del punto de inyección. Los cachorros se sometieron a un examen veterinario adicional los días 1, 3 y 4. Alrededor del 25% de los animales de 6 o más meses de edad mostraron reacciones locales en el punto de inyección cuando los examinaron los veterinarios. La duración máxima fue de 15 días en un solo animal y después de la primera inyección. La duración máxima después de la segunda y tercera inyecciones fue de 1 semana. En este grupo de edad, la incidencia de al menos un signo general como letargo, hipertermia, trastorno gastrointestinal, etc. se sitúa entre el 15 y el 20% después de cada inyección. Incluye algunos eventos tales como apatía y diarrea que empiezan tan tarde como 14 días después de la administración de la vacuna y que, en consecuencia, podrían no estar relacionados. La incidencia de reacciones locales y signos generales fue, como era de esperar, superior en los cachorros de menos edad. Respecto a los signos generales, en la mayoría de los casos no son los mismos perros que reaccionanrepetidamente a la vacuna. Por ejemplo, en los animales que exhibieron hipertermia, un cachorro tuvo hipertermia después de la primera y tercera inyecciones, pero no de la segunda. Un adulto tuvo hipertermia tras cada una de las inyecciones, pero este mismo animal también registró episodios de hipertermia no relacionados con la vacunación. El resto de casos de hipertermia fueron aislados y no se repitieron.

El segundo estudio de campo se obtuvo la percepción de los propietarios, que eran conscientes de que se trataba de una vacuna en fase de desarrollo que, por tanto, debía someterse a estudios de seguridad. Se utilizaron 231 perros de entre 6 meses y 12 años de edad. Cerca de una cuarta parte de éstos eran perros jóvenes de alrededor de 6 meses de edad. Los perros fueron evaluados por un veterinario los días de la vacunación y dos semanas después de la tercera vacunación. Se pidió a los propietarios que revisaran a sus animales a diario y que comprobaran específicamente si había inflamación o dolor en el punto de inyección. Cualquier anomalía debía ser comunicada al veterinario. En este estudio, 8 perros (3,5%) tuvieron reacciones locales descritas por sus propietarios, y en un solo perros de repitieron después de cada una de las inyecciones. En este perro, cada vez fueron de menor duración e intensidad. El signo general detectado con mayor frecuencia fue el letargo, descrito en 5 perros (2,2%) con una duración de 1 día en 4 perros y de 3 días en el otro. En consecuencia, cuando utilizamos un estudio en condiciones normales de campo, observamos una tasa de reacciones descritas algo mayor que las descritas normalmente para las vacunas convencionales como MHP(Pi)L, pero sigue siendo una vacuna muy bien tolerada por la mayoría de los animales.

C) Farmacovigilancia posterior a la comercialización y reacciones informalesEvidentemente, esta situación es dinámica y, al escribir este trabajo solo disponíamos de unos pocos datos para poder perfilar conclusiones definitivas puesto que la vacuna solo lleva muy poco tiempo en el mercado. Los próximos meses y años nos proporcionarán más fuentes de información detallada.

ConclusiónLos veterinarios pueden esperar que algún perro exhiba letargo, hipertermia ligera y reacciones locales de corta duración. Es casi todos los casos, deberían ser autolimitantes o responder rápidamente al tratamiento sintomático cuando fuera necesario. En contadas ocasiones, pueden prolongarse y se han descrito casos excepcionales de reacciones alérgicas.

Basta con informar al propietario que puede esperarse cierto letargo o inflamación local de corta duración en una minoría de animales para asegurar que se satisfacen sus expectativas y para reducir el grado de decepción. Solo se considera necesario no continuar con el resto de la primovacunación en casos excepcionales como consecuencia de reacciones adversas y tras la evaluación del beneficio:riesgo en cada individuo por parte del veterinario. De hecho, parece que la tendencia de las reacciones locales es a ser de menor tamaño e intensidad con las vacunaciones posteriores.

En general, esta vacuna es bien tolerada y los datos confirman que CaniLeish® tiene un buen perfil de seguridad para una vacuna anti Leishmania eficaz.

Bibliografía1. Tizard IR. Veterinary Immunology: an introduction. 8th Edition, 2009. Saunders Elsevier, St Louis, Missouri. ISBN: 978-1-4160-4989-0

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6Resultados de los estudios de eficacia de CaniLeish®. ¿Cómo actúa ante un desafío natural extremo?Christophe RèmeHerramientas y clasificaciónPara comprender cómo se evaluó la eficacia de CaniLeish®, es necesario conocer en primer lugar las diferentes herramientas que se utilizaron para observar la infección por Leishmania y cómo se emplearon para clasificar la progresión de la enfermedad.

El primer conjunto de herramientas sirve para analizar los efectos del parásito en el perro e incluyen, por ejemplo, la observación de síntomas clínicos, como la apatía o la anorexia, y dermatológicos, además de la medición de las anomalías detectadas en laboratorio, como el cociente albúmina/globulina invertido o el aumento de las proteínas totales. El nivel de anticuerpos que produce el perro en respuesta al parásito se mide mediante inmunofluorescencia indirecta.

El segundo conjunto de técnicas permite detectar los propios parásitos en el perro. La Leishmania viva puede observarse directamente en muestra extraída de la médula ósea o de los linfonodos, los aspirados se pueden cultivar mediante inoculación en un medio específico. El cultivo es el método más sensible de los dos.

Un método todavía más sensible es la detección de ADN de Leishmania mediante PCR. Mediante esta técnica se pueden detectar incluso trazas de los parásitos, y la PCR cuantitativa además permite medir la carga de parásitos.

Estas herramientas se pueden combinar para evaluar el estado del perro en cuanto a la infección para clasificarla en varias categorías:

• Estadio 1: perros que nunca han tenido el parásito y están libres de Leishmania. El resultado será negativo en todas las pruebas.• Estadio 2: en ella se incluyen perros portadores del parásito en los que no se está multiplicando de forma activa o está presente en niveles muy bajos; lo normal es que den positivo en la PCR pero negativo en el resto de pruebas. Esta fase se denomina infección subpatente.

En estas dos primeras categorías, no hay evidencias de infección activa.

• Estadio 3: cuando el parásito empieza a multiplicarse, el perro no solo da positivo en la PCR, sino también en el cultivo. En principio, el animal no presenta síntomas clínicos, por lo que esta infección activa se denomina infección activa asintomática. No obstante, es solo cuestión de tiempo que la infección progrese y se convierta en sintomática.• Estadio 4: en esta fase final aumentan los valores de IgG y los síntomas comienzan a evolucionar. Esta es por lo tanto la infección activa sintomática.

En estos dos estadios finales se confirma la infección activa y que el perro ya está perdiendo la batalla contra el parásito. El objetivo de las vacunas contra la leishmaniosis es estimular y dirigir la respuesta inmunitaria del perro de modo que responda adecuadamente a la infección por el parásito antes de que esta progrese hasta la fase activa para evitar que los perros pasen al estado de enfermedad.

Modelo de exposición experimentalCaniLeish® se evaluó en primer lugar mediante un modelo de exposición experimental. Se extrajo Leishmania infantum del bazo de un perro infectado y se inyectó 108,5 por vía intravenosa a 20 perros. La mitad de esos perros habían sido primovacunados un año antes con tres inyecciones de CaniLeish® y el resto no se vacunó. Los perros se observaron durante un período de cuarenta y siete semanas después de la exposición. Se realizaron análisis de sangre de rutina para evaluar los parámetros hematológicos y bioquímicos y realizar una inmunofluorescencia indirecta, y se extrajeron muestras de la médula ósea para detectar el parásito mediante cultivo y PCR cuantitativa.

Siete de los perros de control desarrollaron una infección persistente a lo largo del estudio, y dieron positivo tanto en la PCR como en el cultivo, lo que confirma la infección activa. Este número extremadamente alto pone de manifiesto el grado de la exposición, ya que de forma natural suelen desarrollar la enfermedad bastante menos del 70% de los perros. Un perro de control

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dio positivo en la PCR al final del estudio pero seguía siendo negativo en el cultivo, por lo que se clasificó como con infección subpatente. En los otros dos perros se obtuvo un resultado positivo transitorio en la PCR, aunque ambos volvieron al estado negativo al final del período del estudio. Estos perros lograron bloquear la infección y ahora tienen una alta resistencia natural a la enfermedad.

Por el contrario, siete de los diez perros vacunados bloquearon la infección. Cuatro de ellos dieron positivo en la PCR y/o el cultivo en algún momento y volvieron al estado libre de Leishmania al final del estudio, y los otros tres no presentaron Leishmania en ninguna de las pruebas.

Sin embargo, tres de los perros sí desarrollaron una infección activa persistente durante el estudio. Es un número reducido teniendo en cuenta el grado de exposición y los resultados del grupo de control, además del hecho de que la exposición tuviese lugar un año después de la vacunación y no se administrasen vacunas de refuerzo.

Este estudio confirmó que CaniLeish® induce una respuesta inmunitaria de larga duración que ha demostrado ser eficaz durante más de un año después de la última vacunación.

Exposición natural de alto nivel: evaluación de la eficacia fundamental.Para evaluar realmente la eficacia de una vacuna frente a la Leishmaniosis Canina es necesario saber cómo se comporta frente a una exposición natural en la que hay una presión infecciosa elevada y constante por la presencia de los insectos vectores, los flebotomos. Para el estudio de eficacia fundamental de CaniLeish® se utilizó este modelo de exposición en condiciones naturales.El estudio se realizó en dos partes. En la primera parte participaron 80 beagles sin Leishmania de aproximadamente 6 meses de edad que se mantuvieron en condiciones de laboratorio bajo control y se aleatorizaron en dos grupos. Un grupo recibió un primer tratamiento con CaniLeish® (tres inyecciones a intervalos de tres semanas) y la otra mitad de los perros no se vacunó. Se hizo un seguimiento de los perros durante casi un mes después de la vacunación para observar la respuesta serológica y celular de los perros vacunados.

Después los perros se trasladaron a perreras abiertas situadas en dos zonas muy contaminadas, una en España (cerca de Barcelona) y la otra en Italia (cerca de Nápoles). Se envió el mismo número de perros vacunados y de control a cada perrera, y se trasladaron durante la estación del flebotomo para garantizar una exposición rápida. Los animales se expusieron a este entorno de infección natural durante dos estaciones de transmisión consecutivas, en 2007 y 2008. No se les aplicó ningún repelente ni ningún tratamiento frente a la leishmaniasis. Los perros vacunados recibieron un refuerzo anual de CaniLeish®.

Los perros se evaluaron cada tres meses mediante exámenes clínicos y paraclínicos, así como con cultivos de muestras de la médula ósea o linfonodos y PCR cuantitativa para detectar los parásitos. Se emplearon estos parámetros de la forma descrita anteriormente para clasificar a los perros en las cuatro categorías de infección y evaluar específicamente si estaban desarrollando o no una infección activa.

Se confirmó el alto grado de exposición natural en las condiciones del estudio porque el 72% de los perros de control dio positivo en la PCR al menos una vez durante los dos años del mismo, lo que demuestra con claridad la fuerte presión del parásito. Además, la afirmación se refuerza por el hecho de que el 23% de los perros de control desarrollaron síntomas clínicos de la enfermedad a lo largo de los dos años del estudio, y en otro 10% se observó una infección activa asintomática, por lo que aproximadamente un tercio de los perros de control desarrollaron la infección en su forma activa.

En el grupo vacunado, solo un 7% de los perros desarrollaron la infección sintomática y un 5% desarrollaron una infección activa asintomática, lo que significa que casi nueve de cada diez perros vacunados no desarrollaron la infección activa durante el estudio a pesar del alto grado de exposición al que fueron sometidos.

La reducción del número de perros que desarrollaron la infección activa al final del estudio es estadísticamente significativa (p=0,025). Al examinar los resultados con el paso del tiempo mediante un análisis de supervivencia el resultado es igualmente significativo (p=0,027)

Si se comparan los grupos solo en cuanto al desarrollo sintomático de la enfermedad, las diferencias son también significativas. Al final del ensayo, el 93% de los perros del grupo vacunado permanecían libres de síntomas (p=0,046) y el análisis de supervivencia de la diferencia con el paso del tiempo también confirma que la vacuna reduce la probabilidad de desarrollar la enfermedad en su forma sintomática. (p=0,047).

Los efectos de la vacunación a nivel de la población son interesantes, pero lo que tiene mayor interés en la práctica veterinaria con animales pequeños es, por supuesto, el beneficio de la vacunación para cada animal en particular. Para determinar este beneficio, se emplean cálculos de riesgo que permiten obtener determinar la eficacia en un perro en concreto. La probabilidad es

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una medida clásica del riesgo relativo que se emplea en los estudios clínicos, y se halla calculando la probabilidad de que ocurra un acontecimiento dividida por la probabilidad de que dicho acontecimiento no ocurra. Los grupos se comparan calculando la razón de probabilidades (odds ratio). En este estudio el odds ratio de la infección activa es de 1 a 3,6 y el de la enfermedad asintomática es de 1 a 3,8, lo que en la práctica significa que la vacuna reduce aproximadamente cuatro veces el riesgo de enfermedad. Por lo tanto, esta reducción del riesgo es el argumento oficial que figura en la ficha técnica aprobada del producto.

ConclusiónEn condiciones de exposición rigurosas, en zonas muy endémicas, CaniLeish® ha demostrado ser capaz de reducir cuatro veces el riesgo de que un perro desarrolle la infección activa o la enfermedad sintomática. Los resultados obtenidos con la vacuna son coherentes con el mecanismo de acción. Como la gran mayoría de las vacunas, no impide que el patógeno entre en el cuerpo, sino que estimula y dirige la respuesta inmunitaria para hacer frente a la exposición e impedir que la infección progrese hasta la enfermedad activa.

Uso práctico de CaniLeish®. ¿Qué debo saber para obtener el mejor resultado con la nueva vacuna?David McGahieIntroducciónEl objetivo de esta sesión es el de contemplar alguna de las recomendaciones y requerimientos de la ficha técnica además de algunas sugerencias prácticas para que los clínicos comprendan cómo utilizar la vacuna de forma óptima cuando esté disponible en sus países.

Protocolo básicoCon CaniLeish®, el protocolo básico inicial de primovacunación consta de tres inyecciones (subcutáneas) a intervalos de tres semanas. Es ligeramente distinto al de las vacunaciones convencionales contra parvovirus o moquillo porque el objetivo es el de inducir una inmunidad celular con predominio Th1. La simple inducción de anticuerpos no es suficiente para proteger frente a Leishmania. Los estudios realizados durante el desarrollo han confirmado que este es el calendario óptimo para la primovacunación.El inicio declarado de la inmunidad es de cuatro semanas después de la tercera inyección.

Los cachorros pueden empezar a vacunarse a partir de los seis meses de edad. Las pruebas de eficacia en todos los estudios de desarrollo se realizaron a partir de los seis meses de edad y se cree que la maduración de la capacidad de respuesta inmune mediada por células en los perros jóvenes es más lenta que la de la respuesta humoral.1

Actualmente no existen datos sobre la administración simultánea de CaniLeish® con otras vacunas como DHPPiL. Por tanto, la recomendación actual es separar la administración de CaniLeish® del resto de vacunaciones al menos dos semanas, que es una recomendación bastante común en las situaciones en las que no se han realizado pruebas específicas para confirmar la compatibilidad.

Existe el requisito de una revacunación anual con una sola dosis de vacuna para mantener la inmunidad.

La vacunaLa vacuna, propiamente, se suministra de forma muy convencional: una parte liofilizada y solución salina isotónica como disolvente. Es interesante notar que el liofilizado parece considerablemente mayor que el de otras vacunas convencionales para perros. El disolvente tiene un volumen normal (1 ml) y el liofilizado se disuelve para formar un volumen normal de 1 ml de solución rojiza para inyección.

Como la vacuna contiene un contenido elevado de proteínas, una agitación enérgica durante la reconstitución causará la formación de algo de espuma, por lo que se recomienda mezclar suavemente la solución para asegurar su completa disolución, que se consigue fácilmente.

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Como ocurre con casi todas las otras vacunas, debe conservarse en el frigorífico, del que debe sacarse y reconstituirse justo antes de ser utilizada. Igual que con cualquier vacuna refrigerada, siempre resulta apropiado templarla ligeramente en la mano para acercarla a la temperatura corporal y que no resulte incómoda para el animal cuando se inyecte, y como es normal, se recomienda realizar un masaje ligero en el punto de inyección.

Pruebas previas a la vacunaciónLa autorización de comercialización es para la inmunización activa de perros negativos a Leishmania.2 El objetivo de la vacunación es la prevención de la enfermedad, no su tratamiento, por lo que un perro que se encuentra en vías de desarrollar la enfermedad no es un candidato para la prevención sino que necesita tratamiento. Con Leishmania sabemos que la infección activa, cuando el perro ha llegado a tener una carga elevada de parásitos multiplicándose de forma activa, raramente remite hacia el estado de negatividad sin ayuda.

Existen varias opciones para detectar la infección:• La serología es un método convencional y de rutina, y títulos elevados en las pruebas serológicas tales como IFI están asociados a una enfermedad avanzada y progresiva. Es un método sencillo, rápido y económico.• La visualización directa de amastigotes en extensiones de linfonodos o médula ósea confirma que el perro está infectado. Sin embargo, esta técnica no es lo suficientemente sensible para las pruebas de screening previas a la vacunación y los perros pueden dar negativo a pesar de tener la enfermedad.• La inmunohistoquímica de esas extensiones puede aumentar la sensibilidad, pero no se utiliza de forma rutinaria en demasiadas clínicas y no está adaptada a las condiciones de screening.• El cultivo de los parásitos es más sensible, pero no está disponible para ser utilizado de forma rutinaria en la clínica general.• Por último, la PCR es la técnica más sensible de todas, pero un resultado positivo no indica si el parásito sigue estando presente en forma viva. Los perros pueden tener resultados positivos transitorios en la PCR durante las estaciones de transmisión activa a pesar de no desarrollar la enfermedad. No está adaptada a las condiciones de screening.

Está claro que las pruebas serológicas son el método más apropiado para el screening antes de la vacunación en la clínica general.

La ficha técnica de CaniLeish® dice que “se recomienda la detección de la infección de Leishmania antes de la vacunación utilizando un test de diagnóstico serológico rápido”. Las pruebas facilitan resultados casi instantáneos en tiempo real, lo que permite que la vacunación pueda realizarse el mismo día que el test si fuera necesario, lo que resulta más práctico para el propietario. Sin embargo, está claro que hay otras pruebas serológicas tales como IFI que están bien adaptadas para el test previo a la vacunación en aquellos casos en los que no tenemos prisa por obtener el resultado, y en los casos que tengamos un resultado positivo tienen la ventaja adicional de proporcionar un título que sirve para evaluar acciones futuras.

Cuando utilizamos un test rápido en el contexto del screening previo a la vacunación, es importante utilizar un test con una concordancia excelente con IFI, y lo ideal sería que tuviera un umbral conocido que no fuera excesivamente elevado para evitar las situaciones en las que los perros ya están desarrollando la enfermedad y se vacunan. Uno de estos test es Speed Leish K,TM en la que los datos presentados recientemente mostraron una concordancia excelente con IFI y un umbral de corte de entre 1/80 y 1/100 en la escala IFI.3 Si un perro da negativo con una prueba rápida apropiada como Speed Leish KTM o mediante IFI, puede vacunarse.

Otros consejosComo con cualquier otra vacunación, se recomienda desparasitar a los animales entes de la vacunación. Es bien sabido que las cargas elevadas de helmintos favorecen una respuesta inmune con predominio Th2, y el requisito para la prevención de la leishmaniosis es la estimulación de una respuesta con predominio Th1. Puede que otros parásitos hagan lo mismo; hay indicaciones publicadas de que Ehrlichia podría favorecer el establecimiento y desarrollo de leishmaniosis en perros. Por tanto, un buen control general de los parásitos, incluyendo los parásitos internos como los helmintos y los parásitos externos como las garrapatas, no solo es beneficioso para la salud general del perro sino que también reduce otros factores que pueden actuar de forma contraria a los efectos beneficiosos de CaniLeish®.

La utilización de la vacuna no debería evitar las medidas para reducir la exposición a los flebotomos. Y el motivo es que funcionan de modo completamente distinto. La reducción de la exposición a flebotomos reduce el desafío que recibe el perro. Sin embargo, CaniLeish® es la única opción dirigida a estimular las respuestas inmunes al desafío al que van afrontar de forma inevitable.

Bibliografía1. Day MJ. Immune System Development in the Dog and Cat. Journal of Comparative Pathology, 2007; 137(Suppl 1): S10-S152. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Product_Information/veterinary/002232/WC500104954.pdf3. Chêne J, Bourdoiseau G, Chabanne L et. al. Comparison of a rapid immunochromatographic test with immunofluorescence assay for the detection of anti-L. infantum antibodies in dogs. 2nd Congresso Internazionale SCIVAC – Leishmaniosi canina. Pisa, Italy, April 2010.

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8¿Cómo tratar de la mejor forma los casos clínicos de Leishmaniosis Canina? Guías actualesGuadalupe MiróEl tratamiento de la Leishmaniosis Canina no siempre es el mismo, debido al amplio abanico de manifestaciones clínicas que pueden desarrollar los pacientes enfermos. El principio básico del tratamiento debe incluir el definir bien los casos clínicos de leishmaniosis estableciendo un adecuado diagnóstico.

Hasta el momento no existen drogas eficaces al 100% frente a esta enfermedad; pero en general, en la mayoría de los perros tras el tratamiento mejora el cuadro clínico pero no se produce la “curación parasitológica” y en algunos casos pueden aparecer recaídas que exigen reconsiderar los tratamientos previos e incluso el diagnóstico.

Aunque los protocolos de tratamiento y el seguimiento clínico se han modificado considerablemente en los últimos años, las drogas utilizadas son básicamente las mismas. De todos modos, gracias a la mejora de la asistencia veterinaria, las expectativas de curación clínica -no parasitológica- son mucho mayores que antes, aunque en ocasiones no sea posible impedir la recidiva originada en situaciones de inmunosupresión (estrés, enfermedades debilitantes...). De entre todos los fármacos disponibles, los leishmanicidas más utilizados son los antimoniales pentavalentes (Glucantime®), seguidos de la miltefosina (Milteforan®) en combinación con el leishmaniostático por excelencia que es, por su inocuidad y eficacia, el alopurinol (Zyloric®).

Se tiende a un consenso general en cuanto a los protocolos de administración de los antimoniales, recomendándose ciclos de 75-100 mg/kg/día durante 4-8 semanas (repartidas las dosis totales en 2 veces al día). Estudios farmacocinéticos han demostrado que la administración de los antimoniales pentavalentes por vía subcutánea es la más adecuada. La toxicidad de los antimoniales puede dar lugar a estibointolerancia, que se manifiesta tras las primeras administraciones, o a estibotoxicidad, que puede aparecer al final del tratamiento por efecto acumulativo. Ambos cuadros se manifiestan con astenia, intolerancia al ejercicio, vómitos y diarreas, disminución del apetito y fiebre en algunos casos. Aunque a veces es difícil determinar si las alteraciones que se producen en el enfermo tratado son efectos secundarios de la quimioterapia o consecuencia de la propia enfermedad, la toxicidad que se presenta en pacientes con alteraciones renales es mayor tanto en perros como en humanos. La combinación de antimoniales pentavalentes y alopurinol es la terapia más documentada. Ambos fármacos tienen un efecto sinérgico que potencia la eficacia, prolonga los periodos de remisión clínica y retrasa la aparición de recidivas.

Otra opción que se puede aplicar es un alquilfosfolípido, la miltefosina (Milteforan®), a una dosis de 2 mg/kg durante 4 semanas por vía oral administrado siempre con el pienso. Está indicado en animales que no hayan perdido el apetito ni tengan problemas digestivos. Es la primera opción en perros con proeteinuria y/o enfermedad renal declarada.

Ambos leishmanicidas se emplean siempre en combinación con alopurinol a la dosis de 10-20 mg/kg/BID administrado por vía oral durante largos periodos de tiempo (12-18 meses, de media) en los casos de leishmaniosis clínica clásica. El tratamiento prolongado con alopurinol es efectivo para evitar la remisión de los cuadros clínicos pero, dependiendo de la capacidad del animal para controlar la enfermedad, éste tendrá una duración variable en el tiempo. En cualquier caso es necesario monitorizar los posibles efectos adversos que puede producir a largo plazo en algunos pacientes como urolitiasis y/o nefrolitiasis por xantina.

La mejoría clínica de los perros enfermos variará dependiendo del estado clinicopatológico previo de los mismos y normalmente se observa entre el primer y tercer mes de tratamiento. Es bien conocido que los perros con grave daño renal tendrán en general una peor recuperación clínica. Se aconseja la interrupción del alopurinol cuando el paciente se haya recuperado clínicamente (historia clínica, examen físico y pruebas de laboratorio) de forma completa y cuando los niveles de anticuerpos sean negativos o débilmente positivos.

Bibliografía recomendada• Baneth G, Shaw SE, 2002, Chemotherapy of canine leishmaniosis. Vet Parasitol 106, 315-324• Bianciardi P, Brovida C, Valente M, Aresu L, Cavicchioli L, Vischer C, Giroud L, Castagnard M, 2009, Administration of miltefosine and meglumine antimoniate in health dogs: Clinicopathological evaluation of the impact on the kidneys. Toxicol Pathol 37, 770-775• Ciaramella P, Oliva G, Luna RD, Gradoni L, Ambrosio R, Cortese L, Scalone A, Persechino A, 1997, A retrospective clinical study of canine leishmaniasis in 150 dogs naturally infected by Leishmania infantum. Vet Rec 141, 539-543

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• Denerolle P, Bourdoiseau G, 1999, Combination allopurinol and antimony treatment versus antimony alone and allopurinol alone in the treatment of canine leishmaniasis (96 cases). J Vet Intern Med 13, 413-415• Koutinas AF, Polizopoulou ZS, Saridomichelakis MN, Argyriadis D, Fytianou A, Plevraki KG, 1999, Clinical considerations on canine visceral leishmaniasis in Greece: a retrospective study of 158 cases (1989-1996). J Am Anim Hosp Assoc 35, 376-383• Koutinas AF, Saridomichelakis MN, Mylonakis ME, Leontides L, Polizopoulou Z, Billinis C, Argyriadis D, Diakou N, Papadopoulos O, 2001, A randomised, blinded, placebo-controlled clinical trial with allopurinol in canine leishmaniosis. Vet Parasitol 98, 247-261• Manna L, Vitale F, Reale S, Picillo E, Neglia G, Vescio F, Gravino AE, 2009, Study of efficacy of miltefosine and allopurinol in dogs with leishmaniosis. Vet J 182, 441-445• Mateo M, 2007, Estudios sobre la eficacia comparada y la tolerancia de la miltefosina y el antimoniato de n-metilglucamina, y la monitorización post-tratamiento con alopurinol en la infección natural por Leishmania infantum en el perro. Tesis doctoral. Universidad Complutense de Madrid• Mateo M, Maynard L, Vischer C, Bianciardi P, Miró G, 2009, Comparative study on the short term efficacy and adverse effects of miltefosine and meglumine antimoniate in dogs with natural leishmaniosis. Parasitol Res 105, 155-162• Miró G, Cardoso L, Pennisi MG, Oliva G, Baneth G, 2008, Canine leishmaniosis - new concepts and insights on an expanding zoonosis: part two. Trends Parasitol 24, 371-377• Miró G, Molina R, 2006, Leishmaniosis canina: manejo clínico y situación actual en España. Ediciones Bayer HealthCare.• Miró G, Oliva G, Cruz I, Canavate C, Mortarino M, Vischer C, Bianciardi P, 2009, Multicentric, controlled clinical study to evaluate effectiveness and safety of miltefosine and allopurinol for canine leishmaniosis. Vet Dermatol 20, 397-404• Oliveira AL, Brustoloni YM, Fernandes TD, Dorval ME, Cunha RV, Boia MN, 2009a, Severe adverse reactions to meglumine antimoniate in the treatment of visceral leishmaniasis: a report of 13 cases in the southwestern region of Brazil. Trop Doct 39, 180-182• Pennisi MG, De Majo M, Masucci M, Britti D, Vitale F, Del Maso R, 2005, Efficacy of the treatment of dogs with leishmaniosis with a combination of metronidazole and spiramycin. Vet Rec 156 (11) 346-349• Ribeiro RR, Moura EP, Pimentel VM, Sampaio WM, Silva SM, Schettini DA, Alves CF, Melo FA, Tafuri WL, Demicheli C, Melo, MN, Frezard F, Michalick MS, 2008, Reduced tissue parasitic load and infectivity to sand flies in dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) chagasi following treatment with a liposome formulation of meglumine antimoniate. Antimicrobial agents and chemotherapy 52, 2564-2572• Solano-Gallego L, Koutinas A, Miró G, Cardoso L, Pennisi MG, Ferrer L, Bourdeau P, Oliva G, Baneth G, 2009, Directions for the diagnosis, clinical staging, treatment and prevention of canine leishmaniosis. Vet Parasitol 165, 1-18• Solano-Gallego L, Miró G, Koutinas A, Cardoso L, Pennisi MG, Ferrer L, Bourdeau P, Oliva G, Baneth G, 2011, LeishVet guidelines for the practical management of canine leishmaniosis. Parasit Vectors 4, 86• Valladares JE, Alberola J, Esteban M, Arboix M, 1996, Disposition of antimony after the administration of N-methylglucamine antimoniate to dogs. Vet Rec 138, 181-183• Woerly V, Maynard L, Sanquer A, Eun HM, 2009, Clinical efficacy and tolerance of miltefosine in the treatment of canine leishmaniosis. Parasitol Res 105, 463-469• Zaghloul IY, Al-Jasser M, 2004, Effect of renal impairment on the pharmacokinetics of antimony in hamsters. Annals of tropical medicine and parasitology 98, 793-800

El tratamiento fue un éxito...¿Cuál es el siguiente paso?Lluís FerrerIntroducciónLa Leishmaniosis Canina, como hemos visto, es una enfermedad enormemente compleja y diversa. No puede, por tanto, establecerse un único protocolo terapéutico para todos los casos y es necesario establecer una clasificación clínica que permita realizar abordajes terapéuticos diferenciados y más efectivos y emitir pronósticos más ajustados.

Como se ha visto anteriormente, en los estadíos más comunes (II y III) el tratamiento que se ha demostrado más efectivo y seguro es la combinación de un fármaco parasiticida, como las sales de antimonio (antimoniato de meglumina – Glucantime®) o la miltefosina, con el alopurinol, de efecto parasitostático. Los estudios publicados hasta la actualidad muestran una eficacia similar de la combinación miltefosina+alopurinol a la de la terapia clásica (antimoniato de meglumina+alopurinol)(Tabla 1) [Miró et al, 2009].

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Este protocolo de tratamiento, en perros sin enfermedad renal grave (estadios II y III) ofrece unos resultados muy buenos. Más del 80% de los animales muestran una mejoría clínica muy evidente en los dos primeros meses y el 90% a los 3 meses. Los parámetros clinicopatológicos se normalizan en general a los 3 meses (incluido el proteinograma). Un aspecto diferente es el título de anticuerpos. Aunque el título medio tiende a reducirse lentamente en los animales tratados, no hay que esperar una seronegativización en los seis primeros meses de tratamiento. Además, en un porcentaje considerable el título de anticuerpos se mantiene elevado durante años. [Torres et al, 2010].

El seguimiento de los pacientes durante y tras el tratamiento es tan importante como el tratamiento en sí. Los objetivos del seguimiento de los pacientes son:

1. Detectar si la respuesta es la esperada y si el paciente, clínicamente, evoluciona correctamente. Detectar fallos en la terapia.2. Identificar posibles efectos adversos de la terapia y corregirlos.3. Identificar lesiones asociadas con la enfermedad, de presentación tardía (lesiones por inmunocomplejos, enfermedades asociadas a la inmunodepresión, coinfecciones..).4. Detectar, lo más precozmente posible, recidivas de la leishmaniosis.

El protocolo de seguimiento, por tanto, debe estar orientado a la consecución de todos estos objetivos. La Tabla 2 recoge un protocolo “standard” de seguimiento de los pacientes después del inicio del tratamiento. En general, el examen clínico, los análisis (en especial el proteinograma) y la serología permiten valorar la evolución de un paciente. Tal vez, la mayor dificultad consista en la correcta valoración de un animal tratado desde hace meses, que ha respondido a la terapia y que se presenta con unos signos clínicos que podrían ser compatibles con la leishmaniosis (pérdida de peso, astenia, cojera, lesiones cutáneas u oculares). ¿Hay que atribuir los signos clínicos a la leishmaniosis diagnosticada previamente; sin más? ¿cómo se puede tomar una decisión?.

Fármaco Dosis Duración Efectos colaterales

Antimoniato de meglumina 80-100 mg/kg/día, SC 4 semanas Astenia, anorexia, dolor

Miltefosina 2 mg/kg/24 h, PO 4 semanas Vómitos, diarreas, anorexia

Alopurinol 10 mg/kg/12 h, PO 1 año Urolitiasis (xantina)

Tabla 1 Tratamiento de la Leishmaniosis Canina

I. Revisiones 1, 2, 3, 6 y 12 meses

II. A partir de entonces, dos revisiones anuales

III. En cada revisión se realiza:

• Examen clínico completo.• Proteínas totales – proteinograma.• Serología (no hace falta antes de los 3 meses).• Bioquímica y urianálisis.• Hematología.

IV. Ocasionalmente se realiza también:

• Recuento de CD3+, CD4+, CD8+.• Test intradérmico con Leishmania.• Valoración de la proteinuria.• PCR cuantitativa de sangre y/o médula ósea (identificación de recidivas).• Proteínas de Fase Aguda (PCR, haptoglobina).

Tabla 2 Seguimiento de los pacientes con leishmaniasis a partir del tratamiento

Si los signos clínicos aparecen asociados a un cambio en el proteinograma y en la serología, suele ser evidente que estamos delante de una recidiva. Si no es así (por ejemplo, el perro siempre se ha mantenido con un título elevado), puede ser más difícil. En estos casos lo más recomendable es utilizar la proteína C reactiva y, mejor todavía, la PCR cuantitativa (Real Time) [Martínez et al, 2011].

Además, es muy importante que los animales que han padecido leishmaniosis clínica y se han tratado reciban cuidados especiales, entre ellos, destacaríamos:

1. Alimentación de máxima calidad adecuada al tipo de perro y de actividad. Valorar el uso de una dieta de prevención de urolitiasis.2. Acceso constante al agua (prevención de urolitiasis por xantina asociada al alopurinol).3. Desparasitación regular (endo y ectoparásitos). Realización anual de análisis coprológicos.4. Uso de repelentes de flebótomos (deltametrina, permetrina), dado que los perros enfermos son los que tienen mayor carga parasitaria.5. Evitar, siempre que sea posible toda terapia inmunosupresora (corticoides).6. Evitar fármacos que puedan presentar interacciones medicamentosos, en especial con el alopurinol (azatioprina).

Referencias bibliográficas1. Martínez V. Canine leishmaniasis: the key points for qPCR result interpretation. Parasites and Vectors (2011); 4: 57 http://www.parasitesandvectors.com/content/4/1/572. Miró G et al. Multicentric, controlled clinical study to evaluate effectiveness and safety of miltefosine and allopurinol for canine leishmaniosis. Veterinary Dermatology (2009); 20: 397-4043. Solano-Gallego L et al. Directions for the diagnosis, clinical staging, treatment and prevention of canine leishmaniosis. Veterinary Parasitology (2009); 165: 1-18.4. Solano-Gallego L et al. Leishvet guidelines for the practical management of canine leishmaniosis. Parasites and Vectors (2011); 4:86 http://www.parasitesandvectors.com/content/4/1/865. Torres et al. Long term follow-up of dogs diagnosed with leishmaniosis (clinical stage II) and treated with meglumine antimoniate and allopurinol. Vet Journal (2010) (in press, electronic access)

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