Seroprevalencia de la influenza A (H1N1) pandémica 2009 ... · Estructura del virus de la...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Seroprevalencia de la influenza A (H1N1) pandémica 2009 en trabajadores del Instituto Mexicano del Seguro Social Directores de Tesis: Dra. Rosa María Ribas Jaimes Dr. Juan Arturo Castelán Vega T E S I S QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR P R E S E N T A IBT. LAURA ESTHER BALTIERRA JASSO MÉXICO, D.F. 2011
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Seroprevalencia de la influenza A (H1N1) pandémica 2009
en trabajadores del Instituto Mexicano del Seguro Social
PRESENTA:
IBT. LAURA ESTHER BALTIERRA JASSO
Directores de Tesis:
Dra. Rosa María Ribas Jaimes
Dr. Juan Arturo Castelán Vega
T E S I S
QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS
P A R A O B T E N E R E L G R A D O D E :
MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA
Y B I O T E C N O L O G Í A M O L E C U L A R
P R E S E N T A
IBT. LAURA ESTHER BALTIERRA JASSO
MÉXICO, D.F. 2011
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Producción y Control de
Biológicos del Departamento de Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas del Instituto Politécnico Nacional (ENCB-IPN), bajo la dirección de la Dra.
Rosa María Ribas Jaimes y del Dr. Juan Arturo Castelán Vega.
Se realizó en colaboración con la Dra. Alicia Jiménez Alberto y la Dra. Iris Citlali
Estrada García de la ENCB-IPN; la Dra. Guadalupe Aguilar Madrid y el
Dr. Cuauhtémoc Arturo Juárez Pérez del Instituto Mexicano del Seguro Social
(IMSS); la Dra. Carol Weiss y el Dr. Wei Wang del Centro de Evaluación e
Investigación de Biológicos de la Agencia de Fármacos y Alimentos de los EE.UU.
(FDA por sus siglas en inglés); y con el Dr. Vianney Ortíz Navarrete del Centro de
Investigación y de Estudios Avanzados de Instituto Politécnico Nacional
(CINVESTAV).
El presente trabajo formó parte de los siguientes proyectos institucionales: Efectos de mutaciones en la hemaglutinina del virus de la influenza A (H1N1) sobre el reconocimiento de receptores celulares y el evento de fusión membranal. Registro SIP: 20101304. Búsqueda y optimización de inhibidores de la hemaglutinina del virus de la influenza. Registro SIP: 20111227. Estudio de la biología molecular de metiltransferasas y de algunas enfermedades infecciosas o genéticas para la obtención de productos biotecnológicos. Registro SIP 20113197. Además formó parte del trabajo global: Seroprevalencia durante la pandemia de influenza A (H1N1) en México, a través de los proyectos: Eficacia de la vacuna estacional contra la influenza A (H1N1) 2009. Registro: FON. INSTIT. 26/2009. Prevalencia de infección por el virus de la influenza A (H1N1), y el estudio de casos sospechosos en trabajadores del Instituto Mexicano del Seguro Social Enero – Mayo 2009. Registro: SALUD-2009-C02-126774. La alumna fue becaria del:
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) de la convocatoria Febrero2010-Enero2012. Número de becario: 238256.
Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) del Instituto Politécnico Nacional de los proyectos con registros SIP: 20111227 y SIP 20113197
AGRADECIMIENTOS Antes que todo me gustaría dedicar este trabajo a la memoria de mis abuelos quienes me han
acompañado en todo este arduo camino y permanecen siempre en mis recuerdos. Muchas
gracias por todas sus enseñanzas, amor y apoyo incondicional. También agradezco a mis
papás Inés y Lauro y a mi hermano Gabriel, por ser el soporte de cada logró que he
realizado. Soy afortunada de tenerlos a mi lado, sin su ánimo y firmeza no podría alcanzar
todas las metas que he realizado hasta el momento. Mil gracias.
Por supuesto en este sendero he tenido la dicha de conocer grandes personas las cuales no
sólo me acompañan, sino que me recuerdan lo importante que es compartir cada momento con
los amigos. Gracias a mi hermano Ricardo, a todos mis queridos amigos y compañeros de
UPIBI y del CINVESTAV, en especial a Rafa, Ilse, Beto, Braus y Charly; a mis
maravillosas amigas Chío, Ari, Bere; a mis grandiosos amigos de antaño Adrian, Miguel,
Ceci, Rebeca, Nadinne, Laura, Adriana, Alis y Betty. Gracias a mi gran amiga Lena por
escucharme y no dejar que me rinda, en verdad tus palabras han sido un gran aliento,
principalmente en los malos momentos que tristemente compartimos, pero nos recordaron lo
importante que es levantarse y continuar. Todos ustedes cada día me enseñan que la
verdadera amistad permanece inalterable, sin importar que transcurra el tiempo.
Indudablemente quiero agradecer a aquellas personas que compartieron directamente
conmigo este gran paso. Gracias a la Dra. Rosa Ma. Ribas y al Dr. Juan A. Castelán por
brindarme la oportunidad de trabajar con ellos, por su guía, enseñanzas y grandes
momentos. A la Dra. Alicia Jiménez por su instrucción y apoyo para el desarrollo del
presente trabajo. La andanza por el laboratorio de Producción y Control de Biológicos me ha
traído grandes satisfacciones, amistades y aprendizajes. Especialmente muchas gracias
Jenny, Gloria, Elian y Tani, es reconfortante saber las invaluables amistades que logré en
esta aventura. Muchas gracias chicas por alentarme y por los maravillosos días en el
laboratorio de Producción, créanme que no lo olvidaré.
Igualmente quisiera agradecer a la Dra. Guadalupe Aguilar y al Dr. Cuauhtémoc Juárez
por su tiempo y asesoría.
Mil gracias a todos.
i
CONTENIDO
ÍNDICE DE FIGURAS iii
ÍNDICE DE TABLAS v
ABREVIATURAS vi
RESUMEN vii
ABSTRACT viii
1. INTRODUCCIÓN. 1
1.1. Morfología y organización genética de los virus de influenza A. 1
1.2. Transmisión de los virus de influenza y sintomatología. 3
1.3. Ciclo de replicación del virus de influenza A. 4
1.4. Variación antigénica y reordenamiento genómico de los virus de influenza A. 7
1.5. Respuesta inmune contra los virus de influenza. 8
1.6. Pandemias de influenza: Retrospectiva histórica de las pandemias. 10
1.6.1. Pandemia por el virus de la influenza A(H1N1)pdm09. 11
1.7. Vacunación contra los virus de influenza. 14
1.8. Métodos de diagnóstico. 15
1.9. Pseudotipos retrovirales. 16
1.10. Estudios de seroprevalencia. 19
1.11. Justificación 22
1.12. Objetivo general. 23
1.12.1. Objetivos particulares. 23
1.13. Hipótesis. 23
2. MATERIALES Y MÉTODOS. 24
2.1. Plásmidos y líneas celulares. 24
2.2. Sueros 24
2.3. Obtención de los vectores de expresión para generar las proteínas que formaran a los pseudotipos retrovirales.
26
ii
2.3.1. Preparación de las células competentes de E. coli DH5α. 26
2.3.2. Transformación de las células competentes de E. coli DH5α. 26
2.3.3. Extracción y purificación del DNA plasmídico. 27
2.3.4. Electroforesis en gel de agarosa. 28
2.3.5. Reacción de restricción enzimática de los plásmidos. 29
2.4. Obtención de pseudotipos retrovirales y su empleo en ensayos de microneutralización.
29
2.4.1. Producción de pseudotipos retrovirales. 29
2.4.2. Cuantificación de los pseudotipos retrovirales. 29
2.4.3. Ensayos de microneutralización de la HA viral. 30
2.4.3.1. Primera etapa: Selección de sueros. 30
2.4.3.2. Segunda etapa: Curvas de titulación de sueros separados en la primera etapa.
31
2.5. Análisis estadístico. 31
2.6. Análisis bioinformático. 32
2.6.1. Búsqueda de sustituciones de aminoácidos. 32
2.6.2. Evaluación de estabilidad: Dinámica molecular. 33
3. RESULTADOS. 34
I. Análisis de sueros de trabajadores. 34
II. Análisis bioinformático. 49
4. DISCUSIÓN. 57
5. CONCLUSIONES. 63
6. PROSPECTIVAS 64
BIBLIOGRAFÍA. 65
URLs. 73
ANEXO I. 74
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura del virus de la influenza A (H1N1).
3
Figura 2. Mecanismo de internalización del virus de la influenza A en las células
hospederas.
4
Figura 3. Diagrama de la estructura de una subunidad del trímero HA a pH neutro y
después de una incubación a pH de fusión (pH 5.0, 20°C).
5
Figura 4. Ciclo de replicación del virus de influenza A. 6
Figura 5. Sitios antigénicos presentes en la superficie del trímero de HA del virus de la
influenza A.
9
Figura 6. Escena de una sala de atención a pacientes durante la pandemia de “gripe
española”.
11
Figura 7. Segmentos, hospederos y año del reordenamiento de los genes presentes en el
virus de la influenza A(H1N1)pdm09.
12
Figura 8. Casos confirmados de influenza A(H1N1)pdm09 y número de defunciones por
grupos de edad en México.
13
Figura 9. Distribución mundial del virus de la influenza. 14
Figura 10. Producción de pseudotipos retrovirales y su uso en ensayos de
microneutralización.
18
Figura 11. Esquema de trabajo de la parte experimental I. 25
Figura 12. Esquema de trabajo de la parte experimental II. 26
Figura 13. Mapeo de restricción de los plásmidos pMLV, pHAT y pGal. 35
Figura 14. Mapeo de restricción de los plásmidos pCaNA, pM2 y pCaCo. 36
Figura 15. Cuantificación de pseudotipos cosechados a las 48, 72 y 96 h
post-transfección.
37
Figura 16. Curva de neutralización de suero problema para el cálculo del título de NAbs. 46
Figura 17. Posiciones de las mutaciones predichas en las estructuras de la HA 3M6S y
3LZG.
49
iv
Figura 18. Ejemplo de la selección de mutaciones capaces de formar nuevas
interacciones.
50
Figura 19. Gráficas del RMSD por residuo a 600 K. 51
Figura 20. Evolución de las estructuras secundarias a 600 K. 51
Figura 21. Gráficas del RMSD global de las simulaciones realizadas. 53
Figura 22. Gráficas del RMSD por residuo a 300 K. 53
Figura 23. Evolución de las estructuras secundarias a 300 K. 54
Figura 24. Estructuras de la HA silvestre y mutada coloreadas con base en los valores del
RMSD por residuo.
55
Figura 25. Gráfica del RMSD por residuo de las estructuras a 400 K. 56
v
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Segmentos del genoma del virus de influenza A y proteínas codificadas a partir de cada uno de estos.
3
Tabla 2. Estudios de seroprevalencia de la influenza A(H1N1)pdm09 enfocados a trabajadores de la salud.
21
Tabla 3. Concentración y pureza de los plásmidos recuperados para la producción de pseudotipos retrovirales.
34
Tabla 4. Enzimas de restricción seleccionadas y el tamaño de los fragmentos esperados. 35
Tabla 5. Comparación de proporción de positivos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 por sexo, edad y centro de trabajo.
38
Tabla 6. Análisis del riesgo de los trabajadores para seroconvertir contra la influenza A(H1N1)pdm09, asociado a centro de trabajo.
39
Tabla 7. Comparación de proporción de positivos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 por puesto de trabajo, turno y transporte utilizado.
40
Tabla 8. Comparación de proporción de positivos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 por contacto con posibles personas infectadas.
41
Tabla 9. Comparación de proporción de positivos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 con base en las medidas de protección reportadas.
43
Tabla 10. Análisis del riesgo de los trabajadores para seroconvertir contra la influenza A(H1N1)pdm09, asociado a número de contactos con influenza y uso de antivirales.
44
Tabla 11. Resultados de positivos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 obtenidos comparando presencia de síntomas, adquisición o confirmación de influenza.
45
Tabla 12. Comparación de títulos de NAbs (GTMs) contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 obtenidos por edad, centro de trabajo, puesto y turno
47
Tabla 13. Comparación de títulos de NAbs obtenidos por contacto con posibles personas infectadas y formas de protección utilizadas por el trabajador para evitar el contagio con influenza A(H1N1)pdm09.
48
Tabla 14. Valores del RMSD de la HA silvestre y mutada a 300, 400 y 600 K. 52
vi
ABREVIATURAS
Abreviatura Significado
A(H1N1)pdm09 A (H1N1) pandémico 2009
ED50 Concentración efectiva al 50%, en este caso dilución de suero al cual se
obtiene el 50% de neutralización
HA Hemaglutinina
HI Inhibición de la hemaglutinación
IC Intervalo de confianza
M1 Proteína de matriz
M2 Proteína formadora de canales de iones
MN Microneutralización
NA Neuraminidasa
NAbs Anticuerpos neutralizantes
NEP/NS2 Proteína de exportación nuclear
NP Proteína de la nucleocápside
NS1 Proteína antagónica de interferón
PA Subunidad ácida de la RNA polimerasa
PB1(PB1-F2)/PB2 Subunidades básicas de la RNA polimerasa
pCaCo Plásmido que contiene el gen de la HA del virus de la influenza
A(H1N1)pdm09
pCaM2 Plásmido que contiene el gen de la proteína M2 del virus de la influenza
A(H1N1)pdm09
pCaNA Plásmido que contiene el gen de la NA del virus de la influenza
A(H1N1)pdm09
pGal Plásmido que contiene el gen que codifica a la enzima β-galactosidasa
pHAT Plásmido que contiene el gen que codifica a una proteasa presente en las
vías aéreas humanas
pMLV Plásmido que contiene al gen que codifica a la poliproteína Gag-Pol del MLV
RDRP RNA polimerasa dependiente de RNA
RMSD Desviación cuadrática de la media
RNP Complejo ribonucleoproteico
vii
RESUMEN
Los virus de la influenza tipo A fueron responsables de las pandemias que surgieron en los años 1918,
1957 y 1968; y de la primera pandemia del siglo XXI en 2009. Los anticuerpos anti-hemaglutinina (HA)
son capaces de bloquear la entrada viral y así prevenir la infección; estos anticuerpos neutralizantes
(NAbs) se pueden detectar mediante ensayos de microneutralización (MN). Existen pocos reportes
publicados acerca de la seroprevalencia de la influenza A(H1N1)pdm09 en trabajadores de la salud, a
pesar de que son un grupo estratégico en el sistema de atención sanitaria. Por lo anterior, el objetivo
de este estudio fue analizar la seroprevalencia en trabajadores del IMSS previo a la campaña de
vacunación contra la influenza A(H1N1)pdm09, realizando ensayos de MN con pseudotipos retrovirales
portadores de la HA del virus de la influenza A(H1N1)pdm09. Estos vectores retrovirales transfieren un
gen reportero a células cuyos receptores son reconocidos por la HA, como consecuencia, los
anticuerpos capaces de neutralizar la función de dicha proteína evitan a su vez la expresión del gen
reportero. Adicionalmente, debido a la baja estabilidad que posee la HA del virus de la influenza
A(H1N1)pdm09 que afecta su aplicación biotecnológica, se buscaron sustituciones que aumenten su
estabilidad, realizando estudios bioinformáticos que incluyeron simulación de dinámica molecular de la
HA silvestre y mutada con el fin de evaluar estructuralmente el efecto dichas sustituciones. Se
encontraron siete mutaciones en el tallo de la HA del virus pandémico que aumentan la estabilidad de
la proteína sin impactar en la antigenicidad. De acuerdo a los resultados obtenidos de seroprevalencia
en los trabajadores del IMSS, ésta no fue significativamente mayor que en la población en general
(26.71% vs 20%, p=0.872). Al realizar un análisis más detallado de factores que favorecieron la
seroconversión en el grupo de estudio, se encontró que el centro de trabajo (p<0.001), número de
casos con influenza pandémica con los que estuvo en contacto el trabajador (p<0.031) y uso de
antivirales (p<0.011), estuvieron relacionados con un aumento en el riesgo del trabajador a
seroconvertir. Sin embargo, ninguna de las variables estudiadas contribuyó al potenciar el título de
NAbs contra la HA del virus de la influenza A(H1N1)pdm09. Este trabajo presentó un indicio sobre de la
diseminación del virus dentro de los hospitales del IMSS, las medidas de protección empleadas durante
la pandemia y la situación de la seroprevalencia previo a la campaña de vacunación contra el virus de la
influenza A(H1N1)pdm09. Es importante recordar que la identificación de los factores de riesgo
asociados a seroconversión será de gran utilidad para que el IMSS pueda implementar estrategias de
salud en el trabajo, que disminuyan los riesgos de adquirir infecciones como la influenza en escenarios
de tipo epidémico o pandémico.
viii
ABSTRACT
Influenza viruses type A were responsible for pandemics in 1918, 1957, 1968, and for the first pandemic of
the 21st
century in 2009. Anti-HA antibodies are able to block the viral entry and prevent infection; these
neutralizing antibodies (NAbs) can be detected by microneutralization assays (MN). Few reports had been
published about the seroprevalence of influenza A(H1N1)pdm09 in healthcare workers, although they are a
strategic group in the health care system. Therefore, the aim of this study was to analyze the seroprevalence
among healthworkers from the IMSS, before the vaccination campaign against pandemic influenza of 2009,
by MN assays using retroviral pseudotypes carrying the HA from the influenza virus A(H1N1)pdm09. These
retroviral vectors transfer a reporter gene to cells whose receptors are recognized by the HA, as a result,
antibodies capable to neutralize the function of this protein, prevent the expression of the reporter gene.
Additionally, due the low stability which has the HA from the influenza virus A(H1N1)pdm09 affecting its
biotechnological applications, we looked for substitutions sought to increase its stability, performing
bioinformatic studies involving molecular dynamics simulation of wild-type and mutated HA to evaluate
structurally the effect of such substitutions. We found seven mutations in the stem of the pandemic virus HA
that increase the stability of the protein without impacting its antigenicity. According to the results, the
seroprevalence in the healthworkers (IMSS) was not significantly higher than in general population (26.71%
vs 20%, p = 0.872). When we made a more detailed analysis of the factors that favored seroconversion in
the group of study, we found that the workplace (p<0.001), number of cases of pandemic influenza that the
worker was in contact (p<0.031) and use of an antivirals (p<0.011), were associated with an increased risk of
the worker to seroconvert. However, none of these variables contributed to enhance the titer of NAbs
against the HA of the influenza virus A(H1N1)pdm09. This work presents an indication of the spread of the
virus in hospitals of the IMSS, the protection used during the pandemic and the status of the seroprevalence
before the vaccination campaign against the influenza virus A(H1N1)pdm09. It is important to notice that
the identification of risk factors associated with seroconversion will be useful for the IMSS to implement
health strategies at work, for decreasing the risk to acquire infections such as influenza type scenarios
epidemic or pandemic.
1
1. INTRODUCCIÓN.
La influenza es una enfermedad respiratoria que puede ser causada por virus de la influenza de los
tipos A, B y C. Se han observado epidemias causadas por tipos A y B, pero sólo los virus del tipo A
tienen potencial pandémico (Klenk et al., 2011), produciendo la mayoría de las pandemias de
enfermedades respiratorias durante el siglo XX (Schmitt & Lamb, 2005) y la más reciente pandemia de
influenza en 2009 (Hensley, 2009).
1.1. Morfología y organización genética de los virus de Influenza A.
Los virus de la influenza A son miembros de la familia Orthomyxoviridae, que contiene los géneros:
Virus de la influenza A, Virus de la influenza B, Virus de la influenza C, Isavirus y Virus tipo Thogoto
(Yassine et al., 2010). Los virus de la influenza A son virus envueltos, tienen forma pleomórfica y
miden de 80 a 120 nm de diámetro. Poseen un genoma de RNA de cadena negativa sencilla, que está
dividido en 8 segmentos (Nayak et al., 2009).
La envoltura lipídica, es una bicapa derivada de la membrana plasmática de la célula hospedera en
donde el virus se replica y ensambla; la liberación se lleva a cabo mediante gemación (Brammer et al.,
2008). Insertadas en la envoltura del virión se encuentran las glicoproteínas virales hemaglutinina
(HA), neuraminidasa (NA) (Nayak et al., 2009) y pequeñas cantidades de una proteína formadora de
canales de iones (protón selectiva), llamada M2 (Schmitt & Lamb, 2005).
Los virus de influenza A se dividen en subtipos basados en las proteínas de superficie HA y NA. Se
conocen 16 tipos de HA y nueve tipos de NA (Brammer et al., 2008). La subtipificación de los virus se
basa en las propiedades antigénicas de las dos glicoproteínas, determinadas a partir de reacciones
con sueros hiperinmunes anti-HA y anti-NA; pero los análisis de las secuencias de los genes que
codifican para cada una ha reforzado esta clasificación (Russell et al., 2004).
La proteína de matriz M1 interactúa con HA, NA y M2, además con la proteína de exportación nuclear
(NEP, también llamada proteína no estructural NS2) y con un complejo ribonucleoproteico (RNP)
(Bouvier & Palese, 2008) (Tabla 1).
2
Tabla 1. Segmentos del genoma del virus de influenza A y proteínas codificadas a partir de cada uno de estos.
Segmento Tamaño del segmento (nt)
Proteína Codificada
Tamaño de la proteína (aa)
Función de la Proteína
1 2341 PB2 759 Subunidad de la polimerasa; reconocimiento de CAP del mRNA
2 2341 PB1
PB1-F2
757
87
Subunidad de la polimerasa; extensión de RNA, actividad de
endonucleasa.
Actividad pro-apoptótica
3 2233 PA 716 Subunidad de la polimerasa; actividad de proteasa
4 1778 HA 550 Glicoproteína de superficie; antígeno principal, unión a receptor y actividad
de fusión
5 1565 NP 498 Proteína de unión a RNA; regulación de entrada a núcleo
6 1413 NA 454 Glicoproteína de superficie; actividad de sialidasa, liberación del virus
7 1027 M1
M2
252
97
Proteína de matriz; interacción con vRNP, regulación de exporte de RNA
del núcleo, ensamblaje del virión.
Canal iónico; desnudamiento y ensamblaje
8 890 NS1
NEP/NS2
230
121
Proteína antagónica de interferón; regulación de la expresión de los
genes del huésped
Exportación del RNA desde el núcleo
El tamaño de los segmentos está basado en el genoma del virus A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1).Las proteínas PB2, PA, HA, NP
y NA se codifican en diferentes segmentos de RNA. M2 y NEP son expresadas a partir de cortes alternativos del mRNA,
mientras que PB1-F2 se codifica en un marco de lectura alternativo (Bouvier & Palese, 2008).
3
Los RNP consisten de subunidades repetidas de la proteína de nucleocápside NP en una configuración
helicoidal cubriendo al RNA, evitando así su degradación por RNasas (Nayak et al., 2009) (Figura 1).
Asociada a los RNP está el complejo RNA
polimerasa-dependiente de RNA (RDRP), que
transcribe el genoma viral a RNA mensajero
(mRNA). El complejo RDRP consiste de tres
subunidades: PB1, PB2 (subunidades básicas
de la polimerasa) y PA (subunidad ácida de la
polimerasa), que están presentes de 30 a 60
copias por virión. RDRP lleva a cabo varios
procesos como son la unión a las estructuras
CAP que son secuestradas de los mRNA
celulares, el corte endonucleolítico, la síntesis
de RNA y la poliadenilación (Schmitt & Lamb,
2005).
1.2. Transmisión de los virus de influenza y sintomatología.
Los virus de la influenza se diseminan de célula a célula y de huésped a huésped, en forma de
partículas infecciosas que se ensamblan y liberan de las células infectadas (Nayak et al., 2009). La
transmisión de estos virus es por aerosoles; la replicación ocurre en el epitelio del tracto respiratorio
y normalmente alcanza un máximo 2-3 días después de la infección. El periodo de liberación de
viriones es de 5-7 días, y puede durar en niños hasta 2 meses. Después de la incubación de 1-5 días,
los pacientes presentan síntomas como: fiebre, dolor de garganta, fatiga, dolor de cabeza y muscular.
Los casos severos evolucionan a neumonía primaria causada por el mismo virus o a neumonía viral-
bacteriana (Klenk et al., 2011).
Figura 1. Estructura del virus de la influenza A (H1N1). Modelo de la distribución de las proteínas del virus de influenza A (Kaiser, 2006).
4
1.3. Ciclo de replicación del virus de influenza A.
La unión de los virus de influenza a los receptores celulares es mediada por la glicoproteína HA, la
cual es la proteína mayoritaria de la envoltura (aproximadamente 80%); HA forma un trímero que
contiene sitios de unión al receptor y epítopos para anticuerpos neutralizantes (NAbs) (Nayak et al.,
2009). HA se une a los residuos de ácido siálico terminales de las glicoproteínas y glicolípidos de la
superficie celular que actúan como receptores. Las partículas virales son internalizadas por
endocitosis, seguida de fusión de membranas (Schmitt & Lamb, 2005).
La fusión de la envoltura viral con la membrana celular es mediada por la interacción de HA con su
receptor, y está acoplada al cambio conformacional esta proteína en el ambiente ácido del endosoma
(Figura 2) (Lee, 2010).
Figura 2. Mecanismo de internalización del virus de la influenza A en las células hospederas. La maduración del
endosoma expone al virus a etapas de acidificación. La fusión de las membranas del virus y el endosoma ocurre
rápidamente a pH 5; sin embargo, estudios han mostrado que la proteína de fusión HA se vuelve activa a pH 5.5-6
para iniciar el proceso que finalmente lleva a la fusión de membranas (Lee, 2010).
El procesamiento de la HA es crítico para la infectividad viral. La HA del virus se expresa como un
precursor llamado HA0, éste es cortado por proteasas del huésped en dos subunidades (HA1 y HA2)
que se mantienen unidas por puentes disulfuro. HA1 contiene el sitio de unión al receptor, mientras
que HA2 lleva a cabo la fusión de membranas (Lee, 2010).
5
A medida que el pH endosomal disminuye, se genera un cambio conformacional de HA por la
protonación de ciertos residuos de aminoácidos, principalmente histidinas. Este cambio expone el
péptido de fusión activo (HA2), el cual es capaz de atraer a las dos membranas y provocar la fusión de
la bicapa (Weissenhorn et al., 2007) (Figura 3).
Figura 3. Diagrama de la estructura de una subunidad del trímero HA a pH neutro y después de una incubación a pH
de fusión (pH 5.0, 20°C). Las cadenas polipeptídicas HA1 y HA2 están unidas por un puente disulfuro; se muestran de
color azul y multicolor, respectivamente. La comparación de los diagramas muestra que a pH de fusión los dominios
alejados de la membrana se separan. El péptido de fusión en el extremo N-terminal de HA2 (gris) se relocaliza, como
consecuencia del cambio de conformación, la región C-terminal de HA2 (morado) se reorienta y repliega formando
una estructura antiparalela, posicionando el anclaje a membrana C-terminal en el mismo extremo junto con el
péptido de fusión (Russell et al., 2008).
Cuando las capas externas de las membranas interaccionan, los fosfolípidos de forma cónica
provocan una curvatura espontánea, desestabilizando la bicapa; al mismo tiempo induce la formación
de partículas lipídicas y con ello se promueve la hemifusión de las membranas (Weissenhorn et al.,
2007).
M2 funciona como un canal iónico, participando en la fase temprana de la infección y dirigiendo la
pérdida de la envoltura que conlleva a la liberación de RNP de la proteína M1 (Russell et al., 2008).
6
Una vez liberados, los complejos RNP son transportados al núcleo de la célula hospedera, donde se
sintetizan los mRNA1 para la traducción de las proteínas virales y el RNA viral segmentado que
conformará el genoma de la progenie viral. Los componentes de las partículas virales se organizan y
concentran en la membrana celular. La acumulación de la proteína M1 del lado citoplásmico de la
membrana inicia el proceso de gemación. Se reclutan complejos de RNPs conteniendo ocho
segmentos de RNA viral en los sitios de ensamblaje, y se liberan las partículas por fisión con la
membrana. Las proteínas HA continúan uniendo al virión al ácido siálico presente en la superficie de
la membrana celular hasta que la NA, con su actividad de sialidasa, corta los residuos del ácido siálico
terminal para liberar la progenie viral (Arias et al., 2009) (Figura 4).
Figura 4. Ciclo de replicación del virus de influenza A. Después de la endocitosis los complejos RNP son liberados al citoplasma y son transportados al núcleo donde la replicación y la transcripción tienen lugar. Los mRNA son exportados al citoplasma para su traducción. Las proteínas tempranas, requeridas para la replicación y transcripción, son transportadas al núcleo. Posteriormente, las proteínas M1 y NS2 facilitan la exportación de las RNPs sintetizadas. El ensamblaje y gemación de la progenie viral ocurre en el citoplasma (Arias et al., 2009).
1 Estos mRNA tienen tanto estructura CAP, como cola de poli A conformada por una secuencia de siete uracilos
consecutivos (Arias, 2009).
7
1.4. Variación antigénica y reordenamiento genómico de los virus de influenza A.
La constante evolución de los virus de influenza A se lleva a cabo por dos mecanismos principales: la
acumulación de mutaciones puntuales introducidas por errores de la RNA polimerasa viral y el
reordenamiento de los genes entre dos cepas de diferentes linajes. La variabilidad antigénica de los
virus de influenza es la base del surgimiento de epidemias. La tasa de mutación durante la replicación
del genoma de los virus de influenza es de un nucleótido por cada copia del genoma (7.3x10-5
mutaciones/nucleótido replicado) (Arias et al., 2009).
Los cambios antigénicos reflejan la presión selectiva generada por la respuesta inmune el hospedero;
las variaciones mayores se observan en las proteínas que son blanco de los NAbs. Por ello, las
proteínas de superficie de los virus son altamente variables, aunque son capaces de seguir llevando
funciones primordiales para la infección a pesar de las mutaciones acumuladas (Gallaher, 2009).
El segundo mecanismo se produce debido a la naturaleza segmentada del genoma del virus de
influenza. Estos virus son capaces de redistribuir su genoma cuando la misma célula es infectada por
más de un virus. Este reordenamiento se produce cuando interaccionan virus de diferentes linajes,
dando origen a genotipos híbridos que contienen segmentos derivados de una cepa, mientras que
otros segmentos son derivados de la segunda (Garten et al., 2009).
Los cerdos se han considerado los reservorios adecuados para la asociación de los virus de la
influenza de diferentes linajes. Anteriormente se describió que su tracto respiratorio contiene, en
igual proporción, tanto receptores N-acetilneuramínico α2,3-galactosa (preferentemente para virus
aviares), como ácido N-acetilneuramínico α2,6-galactosa, (principal receptor en mamíferos) (Skehel &
Wiley, 2000; Klenk et al., 2011). Sin embargo, estudios recientes han mostrado que en los cerdos
existe una distribución variable en la parte baja del tracto respiratorio, mientras que en la tráquea se
encuentran abundantemente receptores α2,6-galactosa; lo anterior es similar a la distribución en
humanos (Nelli et al., 2010; Van Poucke et al., 2010; Trebbien et al., 2011).
8
1.5. Respuesta inmune contra los virus de Influenza.
La respuesta innata limita la replicación viral en los primeros días de infección. El primer blanco para
el virus de influenza son las células epiteliales del tracto respiratorio, donde los macrófagos son los
principales encargados de la respuesta inicial (Hensley, 2009). La infección por virus de influenza,
como en otros virus, está caracterizada por una alta producción de citocinas pro-inflamatorias como
el interferón (IFN) tipo I y II, factor de necrosis tumoral α (α-TNF), interleucinas 6 (IL-6), 8 (IL-8); y
quimiocinas como IP-10 (proteína-10 inducible de interferón γ), RANTES (quimiocina ligando-5) y MIG
(monocina inducida por interferón γ). El efecto antiviral limita la replicación viral mediante la
inhibición de síntesis de proteínas (Chan et al., 2005; Kreijtz et al., 2011). La activación de la cascada
de quimiocinas resulta en una acumulación de neutrófilos en el pulmón y su subsecuente
desgranulación (Cheung et al., 2002; Tate et al., 2011).
Durante el proceso de eliminación de células epiteliales infectadas participan linfocitos T CD8+
citotóxicas, las cuales aparecen en el pulmón 4 días post-infección (Brincks et al., 2008). Las
inmunoglobulinas (Ig) M y A proporcionan una defensa durante la fase inicial de la infección, pero una
vez establecida la enfermedad comienza la secreción de IgGs. Cuando se presenta una segunda
infección, los linfocitos Th cooperadoras, específicas contra la cepa viral, activan los linfocitos B de
memoria, resultando en una alta producción de anticuerpos (Combadière et al., 2010).
La infección por los virus de influenza induce una respuesta específica al virus. Especialmente las
células B maduras que secretan anticuerpos contra las glicoproteínas HA y NA son la más importante
protección contra infecciones futuras (Nayak et al., 2010; Kreijtz et al., 2011). Los anti-NA evitan la
liberación del virus de la célula hospedera y así limitan su transmisión. Los anti-HA bloquean la
entrada a la célula ya que impiden la unión del virus al receptor o la fusión con la membrana celular
(Hensley, 2009). Sin embargo, los anticuerpos anti-NA no neutralizan directamente al virus, por lo que
se considera a la HA como el determinante antigénico más importante para la neutralización del virus
mediada por anticuerpos durante una infección natural o por inmunización inducida (Temperton et
al., 2007; Kreijtz et al., 2011).
9
La estructura cristalográfica de la HA muestra dos regiones estructurales distintivas: un tallo que
comprende tres α-hélices súper-enrolladas, y una cabeza globular con un núcleo de plegamientos β
posicionado en la parte superior del tallo (Figura 5) (Knossow & Skehel, 2006). La cabeza contiene el
sitio de unión a ácido siálico, que está rodeado de determinantes antigénicos designados como Sa, Sb,
Ca1, Ca2 y Cb. La porción HA1, además de contener al sitio de unión al receptor, abarca los sitios
antigénicos (Hensley, 2009).
La reducción de la afinidad de los anticuerpos es
consecuencia de sustituciones en los
determinantes antigénicos mencionados
anteriormente; así el virus es capaz de evadir el
sistema inmune sin importar que el individuo
tenga inmunidad pre-existente contra otros
virus de influenza (Brownlee & Fodor, 2001;
Nayak et al., 2010). A pesar de los frecuentes
cambios en los aminoácidos para evadir a los
NAbs, el arreglo tallo-cabeza se conserva entre
las cepas y subtipos (Bouvier & Palese, 2008).
Como se mencionó anteriormente, los subtipos
de HA fueron definidos con base en las
propiedades antigénicas. Entre subtipos, como
por ejemplo H3, la secuencia de aminoácidos de
las HAs varia por encima de un 20%; mientras
que entre subtipos las secuencias mantienen
regiones idénticas de entre 30 a 70%. Los
dominios de HA1 son más variables que los de
HA2, lo cual es consistente con las propiedades antigénicas (Skehel & Wiley, 2000). Filogenéticamente
se han formado dos grupos de HAs: el grupo 1 contiene H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 y H16;
y el grupo 2 contiene H3, H4, H7, H10, H14 y H15. Los análisis de estructuras tridimensionales han
correlacionado estas subdivisiones. (Russell et al., 2004; Gamblin & Skehel, 2010).
Figura 5. Sitios antigénicos presentes en la
superficie del trímero de HA del virus de la
influenza A. Localización aproximada de los sitios
antigénicos Cb, Sa, Sb y Ca en la cabeza globular
de H1 del virus A/PR/8/34. Los sitios antigénicos
están presentes en cada monómero, pero sólo se
muestran en un monómero para simplificar
(Brownlee & Fodor, 2001).
10
Los NAbs con alta actividad neutralizante son específicos al dominio formado por los bucles de la
cadena HA1 en la parte superior de HA. La mayoría de los anti-HA neutralizan la unión de HA al ácido
siálico del receptor celular. Un conjunto de éstos inhiben la fusión del virus uniéndose a HA2 o a la
región próxima de HA1 (Yang et al., 2010).
1.6. Pandemias de Influenza: Retrospectiva histórica de las pandemias.
El término pandemia de influenza se refiere a la ocurrencia masiva de casos, ocasionada por la
aparición de un nuevo subtipo de virus A (Kuri-Morales et al., 2006). Dos condiciones deben
satisfacerse para que un brote de influenza se pueda clasificar como una pandemia: El primero es que
el brote de la infección, surgido en un área geográfica específica, se esparza alrededor del mundo; el
segundo, que el nuevo virus pandémico de tipo A tenga una HA no relacionada a virus de influenza
circulantes anteriormente, además de que sea capaz de generar fácilmente más virus con la HA no
relacionada (Ryan, 2009).
En 1932, se aisló por primera vez un virus de influenza en el laboratorio, a partir de esto la historia de
las infecciones por influenza se ha ido recopilando y confirmando por medio del diagnóstico en
laboratorios (Brammer et al., 2008). El primer brote documentado que encaja en la descripción de
una pandemia ocurrió en 1580, originada en Asia y diseminada a través de Europa, África y América.
Posteriormente, se reportaron 31 epidemias de influenza en cuatro décadas (Ryan, 2009). Durante el
siglo XX, las pandemias ocurrieron en 1918 (tipo A H1N1), 1957 (tipo A H2N2), 1968 (tipo A H3N2)
(Brammer et al., 2008) y la primera del siglo XXI en el 2009 (tipo A H1N1) (Hensley, 2009) (Figura 6).
11
Figura 6. Escena una sala de atención a pacientes durante la pandemia de “gripe española”. Enfermeras voluntarias de la Cruz Roja atendiendo a pacientes con influenza en el Auditorio de Oakland, EE.UU., usado como hospital durante la pandemia de 1918 (Ryan, 2009).
1.6.1. Pandemia por el virus de la influenza A(H1N1)pdm09.
A finales de marzo del 2009, dos niños del sur de California en EE.UU., presentaron síntomas
parecidos a influenza y, posteriormente, se reportaron casos similares en México (Neumann &
Kawaoka, 2011). Para principios de abril del 2009 el Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) alertó
de casos atípicos de infecciones respiratorias que continuaban fuera de la temporada de influenza
estacional; además se presentaron tres brotes en Veracruz, Tlaxcala y San Luis Potosí de marzo a abril
de ese año. Estos eventos, junto con el reporte de un caso sospechoso de neumonía atípica en el
estado de Oaxaca el 13 de abril, dispararon la alerta epidemiológica el 17 de ese mes y se intensificó
la vigilancia de las infecciones respiratorias agudas. El 23 de abril, el gobierno mexicano anunció la
identificación de una cepa nueva de virus de influenza A(H1N1) en Oaxaca y Veracruz (Echevarría-
Zuno et al., 2009). La nueva cepa de influenza A(H1N1) se diseminó globalmente, a tal velocidad que
para el 11 de junio del 2009 la Organización Mundial de la Salud (OMS) decretó la alerta sanitaria
nivel 6, lo que oficialmente designó esta epidemia como una pandemia (Hensley, 2009).
El mapa genético del virus de la influenza A (H1N1) pandémico 2009 (A(H1N1)pdm09, nomenclatura
estandarizada por la OMS el 18 de octubre del 2011, URL4) contiene una combinación genes de
diferentes linajes que previamente no se habían reportado en cerdos o humanos (Garten et al., 2009)
(Figura 7).
12
Figura 7. Segmentos, hospederos y año del reordenamiento de los genes presentes en el virus de la influenza A(H1N1)pdm09. Origen de los segmentos del genoma del virus de la influenza A(H1N1)pdm09: PB2 y PB1, subunidades básicas de la RNA polimerasa; PA, subunidad ácida de la RNA polimerasa; HA, hemaglutinina; NP, nucleoproteína; NA, neuraminidasa; M, matriz; NS no estructural. El color del segmento muestra el hospedero (Garten et al., 2009).
Los segmentos de NA y M provienen del linaje de cerdo euroasiático. Estos segmentos se derivaron
originalmente de virus de influenza aviar y se cree que se introdujeron a la población porcina
euroasiática en 1979. Los genes de HA, NP y NS son del linaje clásico de cerdo, que circula desde 1918
y se encuentran también en los virus con triple reordenamiento. PB2 y PA son segmentos de un linaje
de cerdo con triple reordenamiento, provenientes de un virus aviar que entró a los cerdos en 1998,
en Norteamérica. Finalmente el segmento PB1 también proviene de un virus de triple
reordenamiento, tiene un origen humano (Norteamérica) y fue adquirido de aves alrededor del año
1968 (Garten, 2009).
Datos de la OMS señalan que hasta el 12 de julio del 2010, alrededor del mundo, más de 214 países
reportaron casos confirmados de influenza A(H1N1)pdm09, incluyendo más de 18337 muertes. Tan
solo en México, en el último reporte emitido por la Secretaría de Salud del 19 de julio del 2010, se
confirmaron 72548 casos de influenza A(H1N1)pdm09 y 1316 defunciones (URL6) (Figura 8).
13
Figura 8. Casos confirmados de influenza A(H1N1)pdm09 y número de defunciones por grupos de edad en México.
Distribución de las defunciones y de los casos confirmados de infección por el virus de la influenza A(H1N1)pdm09,
presentados por grupo de edad en México hasta el último reporte emitido el 19 de julio de 2010 (72548 casos
confirmados y 1316 defunciones). Tomado de la página oficial de la Secretaría de Salud (URL6).
El 10 de agosto del 2010, la directora general de la OMS anunció el inicio del periodo de post-
pandemia. Esta etapa indica que la actividad del virus de la influenza A(H1N1)pdm09 ha disminuido a
niveles habituales de una influenza estacional. Por el momento permanece baja o indetectable la
transmisión de la influenza A(H1N1)pdm09; pero en algunos países se han reportado casos
confirmados (Nicaragua, Camerún, Camboya y la República Democrática de Laos), hasta la semana del
13 al 19 de noviembre del 2011 (URL5) (Figura 9).
14
Figura 9. Distribución mundial del virus de la influenza. Mapa de la situación de los casos de influenza, incluyendo por el virus de la influenza A(H1N1)pdm09, hasta el 5 de noviembre del 2011. Tomado de la página oficial de la OMS (URL5).
1.7. Vacunación contra los virus de influenza.
La vacunación es una manera efectiva de reducir la morbilidad y mortalidad de la influenza, pero su
eficacia varía año con año (Deem & Pan, 2009). Actualmente, las vacunas contra los virus de la
influenza están diseñadas principalmente para la generación de inmunidad mediada por anticuerpos,
incluyendo los dirigidos contra la HA, estos últimos son los únicos capaces de prevenir la infección
(Hensley, 2009).
La eficacia de la producción vigente de vacunas es limitada, ya que se requieren dos huevos
embrionados por dosis de vacuna; cada huevo embrionado debe ser desinfectado, inoculado con el
virus, incubado, cosechado y luego purificado. Adicionalmente, las cepas virales deben adaptarse al
huevo y seguir un número serial de pases antes de proceder a su inactivación (Ambrozaitis et al.,
2009).
15
Para la adaptación de la cepa de virus de influenza en embriones de pollo, se pueden emplear dos
técnicas: reordenamiento con virus adaptados o por genética reversa; ambas generan una cepa
vacunal capaz de replicarse eficientemente en huevo embrionado debido a que se aumenta su
afinidad por el ácido N-acetilneuramínico α2,3-galactosa y mantiene su facultad de unión al ácido N-
acetilneuramínico α2,6-galactosa (Chen et al., 2010).
El proceso de pases a través de los huevos embrionados crea una variante de alta tasa de replicación,
pero pueden introducirse mutaciones a la HA que interfieren en la inmunogenicidad de la vacuna; por
ello se requiere de pruebas clínicas para establecer la eficacia, seguridad, posibles efectos adversos,
dosis óptima y dosificación (Neuzil & Bright, 2009). Además, cada año la OMS realiza un sondeo para
reformular la vacuna dependiendo de las cepas circulantes. En febrero del 2010, la OMS recomendó
que la vacuna para influenza estacional para el hemisferio norte (invierno 2011-2012) estuviera
compuesta con los virus A/California/7/2009 (H1N1), A/Perth/16/2009 (H3N2) y B/Brisbane/60/2008
(URL6).
1.8. Métodos de diagnóstico
El aislamiento y cultivo en tejido de los virus fue el estándar de oro para el diagnóstico de
enfermedades respiratorias; hasta que, aproximadamente a la mitad de la década de 1990, se
avalaron los ensayos de RT-PCR para uso clínico (Beck et al., 2009). Inmediatamente después del
reconocimiento del nuevo virus de la influenza A(H1N1)pdm09, la secuencia de éste se publicó en la
Iniciativa Global para Compartir Datos de Influenza Aviar (GISAID por su siglas en inglés); con esta
información se diseñaron y distribuyeron kits de RT-PCR en tiempo real específicos para el virus de la
influenza A(H1N1)pdm09 (Panning et al., 2009).
El análisis de los ácidos nucleicos por RT-PCR reemplazó al cultivo tradicional del virus, disminuyendo
el tiempo para obtener los resultados y aumentando la sensibilidad, ya que es altamente específico
para los subtipos de influenza. Debido a lo anterior, la OMS aconsejó que el ensayo preferente para
determinar un caso positivo de influenza A(H1N1)pdm09 sea RT-PCR en tiempo real. Sin embargo,
hay factores que tienen influencia en la sensibilidad del análisis de ácidos nucleicos, incluyendo la
tardada recolección de muestras, el muestreo inadecuado, iniciación previa de tratamiento con
antivirales, la presencia de inhibidores y la recolección de muestras en el tracto respiratorio superior
en pacientes con neumonía (Martínez-Sobrido et al., 2009).
16
No obstante existen ensayos inmunológicos que permiten cuantificar la respuesta de anticuerpos
contra el virus; los métodos clásicos son los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HI) y la
microneutralización (MN) (Wang et al., 2008). La detección de anticuerpos es crítica para evaluar la
prevalencia y diseminación de la cepa del virus de la influenza A(H1N1)pdm09. Los ensayos
serológicos son usados en estudios epidemiológicos ya que tienen dos ventajas basadas en la biología
del virus de influenza: 1) la infección por estos virus induce la producción de anticuerpos específicos
para la cepa (Ndifon et al., 2009); y 2) estos ensayos permiten hacer una detección aun cuando el
virus ya no está presente o cuando hay una infección subclínica. A pesar de que la HI es la técnica más
empleada, los ensayos de MN han mostrado una mayor sensibilidad, incluso obteniendo un título de
anticuerpos en muestras negativas por HI (Leuwerke et al., 2008).
Los problemas asociados con el empleo de ensayos de HI son la presencia de inhibidores en suero, la
variabilidad en la capacidad de las HAs de diferentes cepas para aglutinar y los frecuentes cambios
antigénicos que presentan. En el caso de los ensayos de MN, se detectan anticuerpos encargados en
prevenir la infección de las células empleadas durante la prueba, de ahí el término “neutralización”
(Leuwerke et al., 2008). Las principales ventajas que muestran los ensayos de MN son que se
detectan anticuerpos funcionales contra la HA de una cepa específica y que no requieren de la
producción de proteínas recombinantes o purificadas (Rowe et al., 1999; Chan et al., 2011).
Estas pruebas son sensibles y específicas para determinar el título de anticuerpos contra la HA viral,
pero el uso de virus “vivos” en la MN limita su aplicación a laboratorios con niveles de bioseguridad 3
cuando son nuevos virus o altamente patógenos (Wang et al., 2008). Una alternativa para emplear la
MN en laboratorios con niveles de bioseguridad 2 sin comprometer las exigencias de sensibilidad,
especificidad, seguridad y reproducibilidad, es el empleo de pseudotipos retrovirales (Kolokoltsov et
al., 2006).
1.9. Pseudotipos retrovirales.
Los pseudotipos retrovirales son partículas virales quiméricas que portan proteínas derivadas del
agente en estudio y, por consecuencia, poseen afinidad a los receptores naturales del virus de
procedencia (Cronin et al., 2005; García & Lai, 2011). Los pseudotipos retrovirales comprenden la
glicoproteína del virus de interés, el genoma incompleto de un retrovirus (principalmente se emplean
HIV o MLV) y un gen reportero. (Giroglou et al., 2004; Nefkens et al., 2007).
17
Los pseudotipos retrovirales llevan a cabo los pasos de infección que incluyen unión, fusión,
transcripción reversa e inserción del gen reportero; pero no son capaces de generar una progenie
infecciosa. Entre las ventajas de la aplicación de pseudotipos retrovirales con la HA del virus de la
influenza, se tienen:
No son virus replicativos, por lo que se pueden manejar en niveles de bioseguridad 2, y así ser
compatibles con la mayoría de los laboratorios.
Sólo se expresa la HA del subtipo del virus de influenza, sin generarse la posibilidad de
recombinación o escape del virus.
Permite un ensayo rápido y sencillo para determinar respuesta de anticuerpos, usando HA de
diferentes linajes, sin la necesidad de aislar a cada uno de diferentes muestras (Wang et al.,
2008).
El análisis de los resultados es más sensible porque se expresan genes reporteros; la
transferencia de estos genes a las células blanco depende únicamente de la glicoproteína de
superficie.
El uso de envolturas virales ajenas al virus estudiado evita un sesgo en los resultados
(Temperton et al., 2007).
Las proteínas ancladas en la envoltura viral son el blanco primario para la respuesta mediada por
NAbs, por lo que pueden emplearse los pseudotipos retrovirales para determinar el título de NAbs sin
requerir de virus replicativos durante el ensayo (Figura 10). Algunos grupos de investigación han
reportado el uso de pseudotipos retrovirales en ensayos de neutralización (Kong et al., 2006; Nefkens
et al., 2007; Temperton et al., 2007; Wang et al., 2008; Alberini et al., 2009; Oh et al., 2009; Labrosse
et al., 2010 y Wang et al., 2010a).
18
Figura 10. Producción de pseudotipos retrovirales y su uso en ensayos de microneutralización. Plásmidos que contienen los genes que codifican a la glicoproteína de superficie, la cápside (Gag-pol) y el gen reportero se transfectan a la línea celular 293 T. Después de unos días, los pseudotipos retrovirales son recuperados en el sobrenadante, filtrados y pueden emplearse para ensayos de neutralización. Si se presentan anticuerpos contra la glicoproteína, no se detectará la señal del gen reportero. (Modificado de García & Lai, 2011).
En comparación con HAs de otros virus de influenza estacionales, la HA del virus de la influenza
A(H1N1)pdm09, se considera una proteína menos estable. Se ha reportado que al producirse como
proteína recombinante puede formar monómeros o agregados; y en estudios empleando
pseudotipos retrovirales que portan la HA de este virus, han presentado una baja capacidad infectiva
en células 293T. Por ello, para aumentar la infectividad de los pseudotipos retrovirales, el grupo de
Wang y colaboradores en el 2010 adicionalmente co-expresaron los genes que codifican a las
proteínas NA y M2 del virus pandémico del 2009. El mecanismo que explica este potenciamiento
sinérgico actualmente se desconoce (Wang et al., 2010b).
Una posibilidad para incrementar la estabilidad de la HA viral es mediante la introducción de
mutaciones que puedan formar nuevas interacciones intra- o inter- monómeros (Rachakonda et al.,
2007). La HA del virus de influenza A(H1N1)pdm09 ha mantenido una secuencia homogénea (Yang et
al.,2010), asimismo la posición de aminoácidos que forman puentes disulfuro es altamente
conservado; por ello la variación en la estabilidad de diferentes HAs se adjudica a interacciones no
covalentes entre monómeros (Huang et al., 2003).
Se ha descrito la sustitución E374K en la región HA2 para aumentar la estabilidad de la proteína,
manteniendo la unión entre las dos subunidades (Yang et al., 2010), y la introducción de la mutación
19
Q223R en la HA de pseudotipos retrovirales que contienen la HA del virus de la influenza
A(H1N1)pdm09 para aumentar la infectividad sin modificar la antigenicidad.
Este tipo de modificaciones hace a los pseudotipos retrovirales que contienen la HA del virus
pandémico del 2009, más adecuados para estudios de neutralización (Wang et al., 2010b).
1.10. Estudios de seroprevalencia.
Las determinaciones de seroprevalencia contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 proveen de
información valiosa para establecer y en su caso re-dirigir estrategias de inmunización, y determinar
la probabilidad de nuevas olas de infección (Yang et al., 2010). Para la construcción de modelos de
transmisión de la enfermedad se requiere del entendimiento de la epidemiología del virus, en
particular de su potencial de diseminación en la población. En el caso de no contar con una medición
serológica directa, el perfil de la inmunidad debe ser estimado con tasas de casos clínicos ajustados a
edades específicas. Una de las limitaciones de la vigilancia clínica es que está basada en los individuos
que presentan síntomas de la infección y no consideran personas asintomáticas o con síntomas leves
(Miller et al., 2010).
Durante la etapa de la pandemia, se llevaron a cabo acciones tempranas para mitigar los efectos
clínicos y sociales por varios países, incluyendo la vigilancia de casos probables de H1N1, escaneo en
aeropuertos, cuarentena y terapia antiviral en casos probables; pero la efectividad de estas
intervenciones permanece cuestionable (Chao et al., 2011).
Para el final de marzo del 2011 se contaba con algunos estudios serológicos, dirigidos a la influenza
pandémica del 2009. La mayoría de las publicaciones se enfocaron en la respuesta cruzada de
anticuerpos preexistentes contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09, en vez de explorar la
epidemiología de la pandemia por títulos serológicos. En el Reino Unido se detectó alrededor del 20%
de personas mayores de 65 años con anticuerpos con reacción cruzada con el virus de la influenza
A(H1N1)pdm09, mientras que en grupos de menor edad fueron bajos los niveles de seroprevalencia
(1.8-9.8%). Tendencias similares se encontraron en EE.UU., Italia, Taiwan, Nueva Zelanda y Australia.
En muestras de personas mayores de 85 años se presentó hasta un 60% de seropositividad. En
contraste en Singapur y Hong Kong la seroprevalencia en todos los grupos de edad fue igual o menor
a un 5%. La variabilidad de los ensayos serológicos de influenza es evidente al comparar los
20
resultados entre laboratorios; lo anterior se atribuye a los diferentes protocolos y puntos de corte
establecidos para clasificar los casos positivos (Broberg et al., 2011).
Es reducido el número de estudios donde comparan las muestras obtenidas antes y después de la
pandemia de influenza. En el Reino Unido se observó que los niños aumentaron considerablemente
los títulos de anticuerpos por el ensayo de HI (de 1.8 a 23% en niños de 0 a 4 años, y de 3.7 a 46% en
niños de 15 a14 años); pero el grupo de jóvenes de más de 25 años no presentaron diferencia en el
porcentaje de positivos (Miller et al., 2010). En EE.UU. la seroprevalencia global contra el virus de la
influenza A(H1N1)pdm09 de los sueros analizados fue de un 21%, siendo considerablemente superior
que el 6% obtenido en el 2008; la prevalencia mayor fue en niños de 10 a 19 años (46%). Del 27% de
seroprevalencia en las muestras analizadas en Nueva Zelanda, los niños tuvieron un amento en la
seropositividad del 14 al 47% (de 5 a 19 años), mientras que los adultos mayores de 60 años no se
encontró diferencia significativa conforme al estudio realizado entre el 2004 a 2009 previo a la
pandemia de influenza A(H1N1)pdm09. En investigaciones realizadas en Australia, China, Noruega y
Singapur también se reportó el mayor aumento en niños menores de 14 años (Broberg et al., 2011).
Los trabajadores de la salud están expuestos a muchos agentes infecciosos y por ello pueden servir
como transmisores de enfermedades a otros pacientes o entre los mismos trabajadores. Durante la
reciente pandemia del 2009, los trabajadores de la salud tuvieron que enfrentar los inicios de la
pandemia sin guías acerca de la transmisión de la enfermedad y prevención. Los manuales del Centro
de Control y Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) de los EE.UU y de la OMS
fueron publicados semanas después del inicio de la pandemia. Existen pocos datos epidemiológicos
de la influenza A(H1N1)pdm09 en trabajadores de la salud. En los EE.UU. el primer reporte casos de
influenza H1N1 entre los trabajadores de la salud, sugirió que aproximadamente un 50% de ellos
pudieron haber contraído la infección dentro del área de trabajo. Actualmente, los reportes
publicados incluyen pocos datos que permitan diferenciar a los trabajadores de la salud y si
mantienen contacto directo o no con pacientes (Balkhy et al., 2010) (Tabla 2).
21
Tabla 2. Estudios de seroprevalencia de la influenza A(H1N1)pdm09 enfocados a trabajadores de la salud.
Lugar de Estudio Resultado, % positivos
(edad)
n Método
empleado
Punto de
corte
Referencia
EE.UU., Tennessee 89 (>55); 18% neutralizan contra la influenza pandémica del 2009, efecto de la vacuna de 1976
116 Comparación
de HI y MN
Título ≥1:40
para HI y
≥1:160 para
MN
Broberg et al.,
2011
Taiwan 20 (36.9+/-10.6), 2.9 control; 30.8% primera línea de riesgo, 12.6% segunda línea de riesgo
295 HI ≥1:40 Chan et al., 2010
Australia 19.9 vs 15.3 del grupo control; en la segunda muestra, de 87 sólo uno aumentó cuatro veces el título de NAbs
231 HI ≥1:40 Marshall et al.,
2011
México, comparación de grupos de riesgo
(Monterrey)
24.6 (38.1+/-10); detección por ELISA
309 ELISA Absorbancia
≥2
Elizondo-
Montemayor et
al., 2011
Japón, Kobe, medidas de protección
5.2; 60.4% de los trabajadores se expusieron a pacientes con influenza, de los cuales 6.8% fueron positivos vs 3.1% de los que no se expusieron (no significativo)
268 HI ≥1:40 Toyokawa et al.,
2011
China, Hong Kong, sin vacuna contra el virus
de la influenza A(H1N1)pdm09
12.4 total; 16 (19-24), 20 (25-34), 13 (35-44), 7.4 (45-54), 8.3 (55-64)
599 MN ≥1:40 Zhou et al., 2011
Nueva Zelanda 26.7 total; 29.6 (médico, enfermeras), 25.3 (auxiliares)
1156 HI ≥1:40 Bandaranayake
et al., 2010
La mayoría de los estudios realizaron ensayos de HI, por lo que al comparar con el trabajo en EE.UU.
donde realizan a la par ensayos de HI y de MN, se demostró que no todos los anticuerpos con
reacción cruzada contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 son neutralizantes; de 89% de
personas positivas por ensayos de HI (mayores de 55 años), sólo 18% de los participantes presentaron
NAbs. (Broberg et al., 2011).
22
1.11. Justificación.
El surgimiento de la pandemia de la influenza A(H1N1)pdm09, expuso uno de los mayores retos para
delimitar y contener los brotes de infección, así como para precisar el porcentaje de población
expuesta al virus. En nuestro país, se ha determinado el número de casos de influenza pandémica con
base en los ensayos de RT-PCR en tiempo real, pero la detección de anticuerpos es crítica para
evaluar la prevalencia y diseminación del virus. Los ensayos de MN permiten detectar NAbs, es decir
anticuerpos funcionales capaces de prevenir la infección, asimismo presentan una mayor sensibilidad
que los ensayos de HI. Sin embargo, debido a la variabilidad de las cepas virales entre laboratorios y
las limitaciones a niveles de bioseguridad altos cuando son virus altamente patógenos, se ha
propuesto el uso de pseudotipos retrovirales como herramienta para medir la neutralización evitando
el uso de virus replicativos. Los ensayos de MN empleando pseudotipos retrovirales han tenido una
excelente correlación de títulos de NAbs con ensayos de MN clásicos, haciéndolos convenientes
principalmente por reducir la variación en los ensayos de MN mediante la detección de la señal de un
gen reportero. Por a lo anterior, el presente trabajo se enfocó en un estudio en doble ciego de
seroprevalencia de influenza, en trabajadores de la salud del IMSS, aplicando ensayos de
microneutralización con pseudotipos retrovirales.
Esta población de estudio representa un grupo de alto riesgo porque el IMSS provee atención médica
a más de 40 millones de personas en nuestro país, en 1 099 unidades de atención médica primaria y
259 hospitales a lo largo del país; además esta institución ha reportado el mayor número de casos y
muertes por el virus de la influenza A(H1N1)pdm09.
Asimismo, la HA del virus de la influenza A(H1N1)pdm09 ha presentado inestabilidad estructural en
comparación de otras HAs; debido a esto los pseudotipos retrovirales portadores de esta
glicoproteína requieren de la incorporación de las proteínas M2 y NA del virus pandémico, y su uso
como proteína recombinante se compromete. Ya que las posiciones de aminoácidos formadores de
puentes disulfuro son altamente conservados, la variación en la estabilidad de diferentes HAs se
adjudica a interacciones no covalentes entre monómeros. Por ello, adicionalmente se buscaron, en la
región del tallo, sustituciones de aminoácidos que aumenten la estabilidad de esta HA formando
interacciones intra- o inter-monómeros.
23
1.12. Objetivo general.
Determinar la seroprevalencia contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 en trabajadores del IMSS
y analizar mutaciones en la HA del virus de la influenza A(H1N1)pdm09 que favorezcan su estabilidad.
1.12.1. Objetivos particulares.
Obtener pseudotipos retrovirales que expresen a la hemaglutinina del virus de la influenza
A(H1N1)pdm09.
Determinar la seroprevalencia en el grupo de trabajadores del IMSS.
Buscar mutaciones en la HA del virus de la influenza A(H1N1)pdm2009 que pudieran
aumentar su estabilidad.
1.13. Hipótesis.
Si los trabajadores de la salud son un grupo de alto riesgo, debido a que mantienen una mayor
exposición con casos de influenza A(H1N1)pdm09, entonces presentarán una seroprevalencia mayor
en comparación con la población en general.
Si se generan nuevas interacciones no covalentes intra- o inter-monómeros en la región del tallo de la
HA del virus de la influenza A(H1N1)pdm09, entonces se aumentará la estabilidad de la proteína sin
afectar sus funciones biológicas.
24
2. MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1. Plásmidos y líneas celulares.
Los plásmidos pVRC/SF/A/California/04/2009 HA (pCaCo), pVRC/SF/A/California/04/2009 NA (pCaNA),
pVRC/SF/A/California/04/2009 M2 (pCaM2), pRT43.2Tn-b.Gal (pGal), pCAGGS-TMPRSS11D (HAT)1
(pHAT) y pIK6 1(ATG) GaLV GalPol (pMLV) fueron donados por la Dra. Carol Weiss (División de
Productos Virales de la FDA, Rockville, MN, EE.UU.). Estos se recuperaron a partir de papel filtro, y
con ellos se transformaron células competentes de Escherichia coli DH5α (F- endA1 glnV44 thi-1 relA1
gyrA96 deoR nupG lacZΔM15 hsdR17) para posteriormente purificarlos y transfectar células 293T/17.
Las células 293T/17 (células humanas embrionarias epiteliales de riñón; ATCC:CRL-11268TM, Manassas,
VA, EE.UU.) se cultivaron a 37°C/5% CO2 en medio DMEM (Medio de cultivo Eagle modificado por
Dulbecco; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) enriquecido con aminoácidos no esenciales (100 mM;
Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), L-glutamina (2 mM; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), FBS
inactivado (10%; Suero bovino fetal EmbryoMax®, Milipore, Billerica, MA, EE.UU.), HEPES (15 mM;
Mayimex, Veracruz, México) y 100 IU/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (penicilina-
estreptomicina 100x Mayimex, Veracruz, México).
2.2. Sueros.
Los sueros se obtuvieron de 1676 trabajadores del IMSS reclutados en el año 2009, después de la
tercera ola de influenza A(H1N1)pdm09 presentada en México y antes de la campaña de vacunación
con la vacuna monovalente contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 (A/California/07/2009;
FLUZONE®). Los sueros se inactivaron calentando 30 min a 56°C, y se almacenaron a -80°C antes del
ensayo. Los trabajadores participantes firmaron una carta de consentimiento informado y la toma de
muestra se realizó conforme a los lineamientos de bioseguridad y bioética del IMSS. Adicionalmente
contestaron un cuestionario exhaustivo sobre los cuidados que tuvieron en su lugar de trabajo
durante la pandemia, si estuvieron en contacto con alguna persona infectada, si presentaron
síntomas, etc. (Véase en el Anexo I). Los sueros control (n = 55) se obtuvieron de personas que
acudieron al banco de sangre; las muestras provienen de participantes los cuales no trabajan en el
IMSS, por lo tanto representan a la población en general.
25
El desarrollo experimental se llevó a cabo en dos partes:
I. Análisis de sueros de trabajadores: Comprendió la obtención de los pseudotipos retrovirales,
los ensayos de microneutralización y el análisis de los resultados. Los ensayos de neutralización
se dividieron en dos, una de escrutinio para reducir el número de muestras mediante el
descarte de muestras negativas, y otra que consistió de curvas de neutralización con las
muestras presuntamente positivas (Figura 11).
Figura 11. Esquema de trabajo de la parte experimental I. Desglose global del desarrollo experimental que se llevó a
cabo para el análisis de los sueros problema.
II. Análisis bioinformático: Se enfocó a la búsqueda de sustituciones de aminoácidos en la región
de tallo de HA, con el fin de aumentar la estabilidad de la proteína (Figura 12).
Análsis estadístico para determinar el perfil epidemiológico de la población de estudio
Ensayos de sero-neutralización empleando los pseudotipos retrovirales
Primera etapa: Selección de sueros posibles positivos
Segunda etapa: Curvas de titulación
Obtención de los pseudotipos retrovirales que contienen a la HA del virus de la influenza A(H1N1)pmd2009
Transfección de células 293T con los plásmidos purificados
Recuperación de los pseudotipos retrovirales y cuantificación de los mismos
Obtención de los plásmidos pCaCo, pCaM2, pCaNA, pHAT, pGal, pMLV
Preparación de células competentes E. coli DH5α
Transformación de las células competentes con los plásmidos que formaran a los pseudotipos
retrovrirales
Extracción y Purificación de los plásmidos
Pruebas de identidad de los plásmidos pCaCo, pCaM2,
pCaNA, pHAT, pGal y pMLV
26
Figura 12. Esquema de trabajo de la parte experimental II. Desglose global del desarrollo experimental que se llevó a
cabo para el estudio bioinformático.
2.3. Obtención de los vectores de expresión para generar los pseudotipos retrovirales
2.3.1. Preparación de células competentes de E. coli DH5α.
La cepa de E. coli DH5α se cultivó en 3 mL de medio LB (Invitrogen, Carlsbad CA, EE.UU.), incubando
por 18 h a 37 °C. Al día siguiente se inoculó con el cultivo anterior en 100 mL de medio LB, dejando a
37 °C con agitación a 500 x g por 1.5 h. Posteriormente se mantuvo el cultivo por 10 min en hielo, y se
centrifugó a 8000 x g por 10 min a 4 °C. El sobrenadante se decantó y el paquete celular se disgregó
agitando brevemente en un vortex; se agregaron 4 mL de MgCl2 0.1 M frío para resuspender
completamente y se mantuvo la suspensión en hielo por 10 min. A continuación, se centrifugó por
10 min a 8000 x g a 4 °C, se decantó y resuspendió el paquete celular en 4 mL de CaCl2 0.1 M frío,
dejando 30 min en hielo. De nuevo se centrifugó por 10 min a 8000 x g a 4 °C, se decantó y
resuspendió el paquete celular en 2 mL de CaCl2 0.1 M frío, manteniendo en hielo 1 h. Finalmente se
almacenaron las células competentes a -70 °C hasta utilizarlas, adicionando glicerol a una
concentración final del 15% (v/v) y en alícuotas de 50 μL (Sambrook & Russell, 2001).
2.3.2. Transformación de las células competentes de E.coli DH5α.
Se adicionó 50 ng de DNA plasmídico a 50 μL de las células competentes y se mantuvieron en hielo
durante 30 min. Posteriormente esta suspensión se sometió a un choque térmico por 90 s a 42 °C y se
Evaluación de estabilidad
Introducción de mutaciones a la estructura de HA (VMD 1.8.7)
Simulación de dinámica molecular con NAMD 2.7 y
Gromacs 3.3.1 Análisis estructural (VMD1.8.7)
Búsqueda de sustituciones en la región del tallo de la HA
Secuencias de aminoácidos de HA de virus de la influenza A
(H1N1)
Alineamiento múltiple de secuencias con Clustal X 2.0.11 y
MAFFT
Secuencia consenso con BioEdit 7.0.0
27
pasó inmediatamente a hielo por 1 min. Se adicionaron 500 μL de medio LB y se incubó 90 min a 37 °C.
Se sembraron 120 μL de las bacterias por extensión con varilla en placas con medio LB y el antibiótico
correspondiente (Sambrook & Russell, 2001).
2.3.3. Extracción y purificación del DNA plasmídico.
Para la obtención de DNA plasmídico a pequeña escala se empleó el sistema comercial Wizard® Plus
SV Minipreps DNA Purification System (Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.); para lo cual un
cultivo de bacterias que contienen el plásmido de interés se incubó por 18 h a 37 °C en 3 mL de medio
LB con el antibiótico adecuado; pasando ese tiempo se centrifugó a 13000 x g durante 2 min. Se
removió el sobrenadante para resuspender el botón celular en 250 μL de la solución correspondiente
(cell resuspension solution) y se añadieron 250 μL de la solución de lisis (cell lysis solution), invirtiendo
el tubo suavemente para mezclar. Se agregaron 10 μL de la solución de proteasa (alkaline protease
solution), invirtiendo cuatro veces el tubo y se dejó incubando a temperatura ambiente por 5 min. Se
adicionaron 350 μL de la solución de neutralización (neutralization solution), invirtiendo cuatro veces
el tubo. Se centrifugó a 13000 x g por 10 min. El sobrenadante se decantó en una columna
cromatográfica; se agregaron 750 μL de la solución de lavado (wash solution) con etanol y se dejó
pasar la solución a través de la columna, repitiendo el lavado. Una vez retirado el líquido, se dejó
secar la columna por 10 min y se transfirió en un tubo colector de 2 mL para centrifugar 2 min a
13000 x g. Posteriormente se pasó la columna a un tubo estéril, adicionando 100 μL de agua
(nueclase-free water) y centrifugando a 13000 x g por 1 min. Se realizó la cuantificación del DNA
recuperado y determinación de la pureza empleando el equipo SynergyTM2: Multi-Mode Microplate
Reader (Biotek® Instruments, Inc. Winoosk, VT, EE.UU.) y se comprobaron algunos aspectos de su
calidad realizando electroforesis en gel de agarosa. El DNA se almacenó a -20°C.
La recuperación de DNA plasmídico a gran escala se llevó a cabo utilizando el sistema comercial
AxyPrep Maxiprep kit® (Axygen Biosciences, Union City, CA, EE.UU.). Un cultivo de bacterias que
contienen el plásmido de interés se incubó por 18 h a 37 °C en 150 mL de medio LB con el antibiótico
correspondiente; pasando ese tiempo se centrifugó a 3000 x g durante 10 min. Se removió el
sobrenadante, y se resuspendió el botón celular en 10 mL de la solución S1 (regulador para
resuspender bacterias con RNasa A), agitando en vortex. Se agregaron 10 mL de la solución S2
28
(regulador de lisis), invirtiendo varias veces el tubo y colocando en hielo por 5 min. Se agregaron
10 mL de la solución S3K fría (regulador de neutralización) invirtiendo el tubo para mezclar. Se incubó
5 min a temperatura ambiente y se adicionaran 10 mL de solución B fría (regulador de unión a DNA),
mezclando por inversión y centrifugando a 10000 x g por 10 min a 4 °C.
El sobrenadante se filtró, haciéndolo pasar a través de una jeringa Maxiprep, transfiriendo el
contenido a una columna limpia para agregar 12 mL de la solución W1 (regulador de lavado). Una vez
que sale la solución W1 de la columna, se hicieron pasar 14 mL de solución W2 (regulador para
eliminar sales) a través de la columna. Se colocó la columna en un tubo de 50 mL, se agregaron 4 mL
de solución W2 y se centrifugó a 8000 x g por 10 min a 4 °C. Posteriormente se transfirió la columna a
un tubo nuevo de 50 mL y se adicionaron 1.5 mL de agua destilada, dejando 5 min a temperatura
ambiente. Se centrifugó a 8000 x g por 5 min para recuperar el DNA plasmídico. Se realizó la
cuantificación del DNA recuperado y determinación de la pureza empleando el equipo SynergyTM2:
Multi-Mode Microplate Reader y se comprobó su calidad realizando electroforesis en gel de agarosa.
El DNA se almacenó a -20°C.
2.3.4. Electroforesis en gel de agarosa.
Una cantidad de agarosa para una concentración final de 0.8%, se disolvió en TBE 1x (90 mM Tris-
boratos, 2 mM EDTA) calentando en microondas hasta que la agarosa se disolvió totalmente para
verterla sobre el molde de la cámara de electroforesis, y se dejó gelificar. Una vez gelificado, se
retiraron los separadores y peine, y se colocó el gel en la cámara de electroforesis, agregando TBE
0.5x hasta cubrirlo. A cada muestra de DNA se le añadió 1/10 de volumen de regulador de carga
(6 mM EDTA pH 8, 25 % v/v glicerol, 1 % v/v SDS, 0.25 % m/v de azul de bromofenol).
El marcador de tamaño molecular (MTM), DNA del fago λ (λDNA) (Invitrogen; Invitrogen, Carlsbad, CA,
EE.UU.) restringido con la enzima PstI, se empleó como referencia para determinar el tamaño del
fragmento amplificado. Las muestras se sometieron a 100 V el tiempo necesario para la separación de
la banda amplificada. Finalmente tiñó el gel con bromuro de etidio y se observó en un
transiluminador de luz ultravioleta (Sambrook & Russell, 2001).
29
2.3.5. Reacción de restricción enzimática de los plásmidos.
Para la digestión con enzimas de restricción se colocó 1 µg del plásmido extraído, 2 μL de regulador
compatible para las enzimas empleadas, 5 U de las enzimas seleccionadas con base en el mapa del
vector y lo necesario de agua desionizada y esterilizada para completar 20 μL de reacción. Se mezcló y
se centrifugó a 10000 x g por 20 s, incubando 18 h a 37 °C. Posteriormente el patrón de restricción se
analizó por electroforesis en un gel de agarosa (Sambrook & Russell, 2001).
2.4. Obtención de pseudotipos retrovirales y su empleo en ensayos de microneutralización.
2.4.1. Producción de pseudotipos retrovirales.
Se cultivaron 5 x 106 células 293T con medio DMEM sin antibióticos, en placas de cultivo celular de
100 cm2, 18 h antes de la transfección a 37°C con 5% de CO2. Se mezclaron en vortex 60μL de Fugene
6 (Roche, Basel, Suiza) y 600 μL de medio Opti-MEM1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se incubó a
temperatura ambiente 5 min. A esta mezcla se le añadieron los plásmidos purificados: 2.5 μg del
plásmido pHAT, 5.5 μg de plásmido de pGal, 5 μg del plásmido pMLV, 0.5 μg del plásmido pCaCo,
2.5 μg del plásmido pM2 y 4 μg del plásmido pCaNA; se agitó en vortex e incubó a temperatura
ambiente durante 15 min. Después de concluir el tiempo de incubación, se adicionó la mezcla
Fugene-plásmido gota a gota a las células 293T, agitando suavemente para cubrir toda la monocapa.
Se incubaron 24 h a 37 °C con 5% de CO2. Una vez pasadas las 24 h se removió el medio, se
adicionaron 20 mL de medio DMEM completo y se continuó la incubación a 37°C con 5% de CO2. A las
48, 72 y 96 h post-transfección se recolectó el sobrenadante y éste se hizo pasar, en condiciones de
esterilidad, a través de un filtro de 0.45 μm; añadiendo 20 mL de medio DMEM completo entre las
cosechas. Finalmente se conservó el filtrado en alícuotas de 2 mL a -80 °C (Wang et al., 2008).
2.4.2. Cuantificación de los pseudotipos retrovirales.
Se sembraron, en placas blancas de 96 pozos para cultivo celular, 2.5x105 células 293T con 100 μL de
medio DMEM completo por pozo. Las placas se dejaron 30 min a temperatura ambiente y luego se
incubaron 18 h a 37 °C y 5% de CO2 antes de usar. Se hicieron diluciones seriales de los pseudotipos
retrovirales, siguiendo un factor de 1:5, en medio DMEM completo adicionado de 16 μg/mL de
polibreno (Sigma-Aldrich, Múnich, Alemania). Posteriormente se removió el medio de las placas
blancas y se les adicionó a la monocapa 100 μL de las diluciones de pseudotipos (NOTA: Se debe
30
incluir un control que contenga únicamente DMEM completo con polibreno). Las placas se
centrifugaron a 500 x g por 10 min a temperatura ambiente y posteriormente se incubaron por a
37 °C y 5% de CO2.
Después de 40 a 48 h de incubación total, se removió el medio de las células y se lavaron con 100 μL
de DPBS (0.14 M NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, 1 mM CaCl2, 2.7 mM MgCl2 ·
6H2O), empleando el lavador de microplacas EL406 de BioTek. Se adicionaron 25 μL de regulador de
lisis 1x, incubando 10 min a temperatura ambiente con agitación (500 x g). Se cuantificó la expresión
del gen reportero mediante el sistema comercial Galacto-Star® (Applied Biosystems, Bedford, MA,
EE.UU.), para lo cual se preparó una solución 1:50 del sustrato y se adicionaron 100 μL del mismo a
las células una vez concluido el tiempo de incubación; se dejaron en agitación (500 x g) a temperatura
ambiente durante 1 h. Las lecturas de luminiscencia se realizaron empleando el equipo SynergyTM2:
Multi-Mode Microplate Reader con el programa Gen5TM para Windows y los resultados se analizaron
en el programa Microsoft Office Excel 2007 (Wang et al., 2008).
2.4.3. Ensayos de microneutralización de la HA viral.
2.4.3.1. Primera etapa: Selección de sueros presuntamente positivos.
Se sembraron 2.5x105 células 293T con 100 μL de medio DMEM completo en placas blancas de 96
pozos para cultivo celular, incubando de 18 h a 37 °C y 5% de CO2 antes de usar. Se diluyó el suero
problema 1:40 con medio DMEM completo en placas de polipropileno; a estas diluciones se les
adicionó el mismo volumen de pseudotipos retrovirales ajustados a 10000 unidades relativas de
luminiscencia (URL) con polibreno (concentración final de 16 μg/mL) y se incubó la placa a 37 °C con
5% de CO2 por una hora (volumen final de aproximadamente 400 μL). Por otra parte, se removió el
medio de las células y se adicionaron 100 μL de la mezcla de suero-pseudotipo, se centrifugó a 500 x
g por 10 minutos a temperatura ambiente e incubó a 37 °C a 5% de CO2. Después de 40 a 48 h de
incubación, se removió el medio y se lavaron las células con 100 μL de DPBS. Se removió el DPBS para
adicionar 25 μL de regulador de lisis 1x e incubó a temperatura ambiente por 10 minutos con
agitación (500 x g), en este tiempo se preparó el sustrato y se realizó el ensayo de luminiscencia como
se describió anteriormente (Cuantificación de pseudotipos).
31
Los resultados se exportaron al programa Microsoft Office Excel 2007 para seleccionar algunos sueros
que presentaron un porcentaje de neutralización mayor o igual a 50%, y así descartar los sueros
negativos. El porcentaje de neutralización se calculó con la siguiente fórmula:
Muestras que se consideraron positivas en esta etapa de escrutinio, se emplearon en la segunda
etapa de realización de curvas de titulación (Wang et al., 2008).
2.4.3.2. Segunda etapa: Curvas de titulación de sueros separados en la primera etapa.
Se sembraron 2.5x105 células 293T con 100 μL de medio DMEM completo en placas blancas de 96
pozos para cultivo celular, incubando 18 h a 37 °C y 5% de CO2 antes de usar. Se preparó una
pre-dilución 1:5 de suero con 120 μL de medio DMEM completo, y se realizaron diluciones seriadas
1:2 (volumen final 75 μL). Se preparó una dilución de pseudotipos retrovirales ajustados a 10000 URL
con polibreno (concentración final de 16 μg/mL) y se adicionó el mismo volumen a las diluciones de
sueros. Se incubó la placa a 37 °C con 5% de CO2 por una hora. Posteriormente, se removió el medio
de las células y se les adicionaron 100 μL de la mezcla de suero-pseudotipo, se centrifugó a 500 x g
por 10 min a temperatura ambiente e incubó a 37 °C a 5% de CO2. Después de 40 a 48 h de
incubación, se removió el medio y se lavaron las células con 100 μL de DPBS. Se removió el DPBS, se
lisaron las células y se reveló como se describió anteriormente (Cuantificación de pseudotipos). Los
resultados se analizaron con el programa GraphPad Prism® Versión 5.0, para Windows (Wang et al.,
2008).
2.5. Análisis estadístico.
Se compararon las proporciones de resultados positivos, obtenidos durante la primera etapa, entre
trabajadores de la salud y el grupo de donadores de sangre, mediante una prueba de χ2.
Adicionalmente se analizaron las variables discretas mediante pruebas de χ2 y aquellas diferencias
que resultaron significativas se les determinó la razón de momios con un intervalo de confianza del
32
95% (IC95%). Para comparar múltiples variables continuas dentro de las variables categóricas se
utilizó un análisis de varianzas de una vía de ANOVA con corrección de Bonferrioni.
Se manejaron pruebas de t de Student para examinar los títulos de anticuerpos comparando entre
variables dicotómicas. Los títulos de NAbs se obtuvieron aplicando regresión logística de cuatro
parámetros (4PL) a las curvas de neutralización, tomando como base un 50% de neutralización. Se
calculó la media geométrica de los títulos (GTM, por sus siglas en inglés), los valores se transformaron
a su logaritmo base 10 (Log10) antes de calcular la media y asociar los IC95%, los GTMs se obtuvieron
calculando el inverso del valor logarítmico. El valor de diferencia significativa manejado en las
pruebas estadísticas fue de p<0.05, con un IC95%. Se emplearon los programas Stata/SE 9.2, para
Windows y GraphPad Prism® Versión 5.0, para Windows.
2.6. Análisis bioinformático.
2.6.1. Búsqueda de sustituciones de aminoácidos.
Las secuencias correspondientes a las HAs de diferentes virus de influenza A H1N1, se obtuvieron de
la base de datos Influenza Virus Resource del NCBI. Las 2440 secuencias descargadas, de 566
aminoácidos de longitud (en promedio), se alinearon con el programa Clustal X 2.0.11 y, a partir de
éste alineamiento múltiple, se calculó la secuencia consenso utilizando las herramientas del programa
BioEdit 7.0.0. Adicionalmente se realizó otro alineamiento múltiple, descargando 2702 secuencias y
empleando el programa MAFFT v6.240 (URL1), para incluir secuencias de virus aislados recientemente.
De igual modo, se obtuvo la secuencia consenso con BioEdit 7.0.0. A partir de las secuencias consenso
se buscaron sustituciones en la región del tallo de la HA, que inicia aproximadamente en el residuo
315. Las sustituciones seleccionadas fueron aquellas que podrían formar nuevas interacciones intra- o
inter- monómeros, para lo cual se buscaron en la estructura cristalizada de la HA (PDB: 3M6S) y se
observaron los residuos cercanos para verificar si se podría formar una nueva interacción. Las
sustituciones de aminoácidos se introdujeron a la estructura de la HA (PDB: 3M6S o 3LZG),
empleando las herramientas de mutagénesis del programa PyMOL v0.99 y VMD: Visual Molecular
Dynamics versión 1.8.7 para Windows.
33
2.6.2. Evaluación de estabilidad: Dinámica molecular.
Las simulaciones de dinámica molecular consideran a átomos y moléculas como partículas que se
mueven en una celda, y se rigen por leyes de la mecánica clásica. Las fuerzas que actúan en estas
partículas se basan en funciones de potenciales de energía. Con lo anterior, se pueden calcular las
trayectorias de los átomos gracias a la resolución de ecuaciones usando campos de fuerzas empíricos,
con lo cual se hace una aproximación del comportamiento de sistemas biológicos a nivel atómico
(Balbuena & Seminario, 1999). Las coordenadas de los átomos de las proteínas, ácidos nucleicos o
lípidos de interés, así como de moléculas de agua y iones, son obtenidos de estructuras
cristalográficas conocidas. Para las simulaciones se emplearon dos programas: NAMD, Molecular
Dynamics Software versión 2.7 (Phillips et al., 2005) y Gromacs v3.3.1 (Lindahl et al., 2001). En el caso
de la simulación con NAMD 2.7, se crearon las cadenas polipeptídicas, se agregaron iones y moléculas
de agua al sistema empleando la opción para modelación automática del programa VMD 1.8.7
(Humprey et al., 1996). El cubo de agua se creó con base en el modelo TIP3P y mide 12 Å a partir de
los extremos de la proteína; se adicionaron iones Na+ y Cl- para neutralizar las cargas de la proteína y
proveer de una concentración iónica de 0.5 M. El campo de fuerza empleado fue CHARMM 22, en
condiciones periódicas, es decir, se crearon un número infinito de celdas idénticas en la celda de
simulación para permitir el flujo de moléculas, evitando pérdidas de las mismas. Se realizó la
simulación de 2 ns a 600K y presión constante (1 atm) de la HA silvestre (PDB:3M6S) y la HA mutada.
Los resultados se analizaron con el programa VMD 1.8.7 utilizando las herramientas RMSD Trajectory
Tool, para calcular el valor de RMSD global de las estructuras, y Timeline, para determinar las gráficas
de RMSD por residuo y de comportamiento de estructuras secundarias a través de la simulación.
Para el programa Gromacs v3.3.1 se usó como molde la secuencia del PDB: 3LZG, que contiene una
molécula de ácido siálico en el sitio de unión a receptor. Se adicionaron iones Na+ y Cl- a una
concentración final de 0.5 M. El cubo de agua se creó utilizando el paquete Amber’s Tools v1.5,
adicionando un cubo de agua (modelo TIP3P) de 9 Å de distancia a partir de los iones y neutralizaron
las cargas. Se llevaron a cabo simulaciones de 5 ns a 300 K y 400 K, de la HA silvestre y mutada,
empleando el campo de fuerza GLYCAM06 en condiciones periódicas y a presión constante (1 atm);
los resultados se analizaron con la herramienta Timeline, VMDICE y RMSD Trajectory Tool de VMD
1.8.7.
34
3. RESULTADOS.
I. Análisis de sueros de trabajadores.
Los plásmidos que portan los genes necesarios para la producción de pseudotipos retrovirales se
recuperaron a partir de papel filtro y se emplearon para transformar a células de E. coli DH5α
competentes. A partir de las clonas generadas, se recuperó el DNA plasmídico, se realizaron ensayos
de digestión enzimática y secuenciación para corroborar la identidad de los genes requeridos para
producir pseudotipos retrovirales (Sandoval, 2011). Las clonas que contenían los plásmidos pCaCo,
pCaM2, pCaNA, pHAT, pGal y pMLV fueron conservadas y, para obtener el DNA plasmídico a gran
escala, se crecieron en medio LB con el antibiótico correspondiente, obteniendo los siguientes
resultados de pureza y concentración (Tabla 3):
Tabla 3. Concentración y pureza de los plásmidos recuperados para la producción de pseudotipos retrovirales.
Plásmido [ng/μL] Relación 260/280
pCaNA 415.36 2.02
pGal 446.6 1.9
pHAT 297.41 2.0
pCaCo 369.38 1.9
pCaM2 100.02 1.82
pMLV 314.91 1.92
Dado que la relación de absorbancias a 260 y 280 nm de los plásmidos recuperados se encontró en el
rango de 1.8 a 2, podemos señalar que el DNA plasmídico tuvo una pureza adecuada para emplearlo
en ensayos posteriores, es decir no contuvo proteínas ni sales que interfirieran en la transfección a
células 293T. Adicionalmente, se verificó la identidad y calidad del DNA plasmídico por medio de
reacciones de restricción enzimática y electroforesis en gel de agarosa. Las enzimas de restricción se
seleccionaron utilizando la herramienta NEBcutter V2.0 de la Base de Datos de Enzimas de Restricción
(URL2) (Tabla 4) y se comparó con el patrón electroforético (Figuras 13 y 14).
35
Tabla 4. Enzimas de restricción seleccionadas y el tamaño de los fragmentos esperados.
Plásmido Tamaño de plásmido (pb)
Enzimas seleccionadas (número de cortes)
Fragmentos esperados(pb)
pHAT 6048 EcoRI (2), HindIII (1) 4234, 1192, 622
pMLV 9152 HindIII (3) 4956, 3946, 250
pGal 9922 EcoRV (3), HindIII (2) 4356, 2190, 2185, 1116, 75
pCaCo 6120 PstI (2), SmaI (1) 2457, 1944, 1719
pCaNA 5836 BamHI (2), PstI (1) 4358, 1141, 310
pCaM2 5721 PstI (2) 4072, 1649
Figura 13. Mapeo de restricción de los plásmidos pMLV, pHAT y pGal. El DNA plasmídico recuperado de maxipreparaciones se digirió con las enzimas seleccionadas a través de un análisis bioinformático (Tabla 5). A) Se muestran los plásmidos pMLV, pHAT (carriles 1, 3) y sus productos de digestión (carriles 2 y 4). B) El carril 1 es el plásmido pGal sin restringir, en el carril 2 se presentan sus productos de digestión. El tamaño de las bandas se determinó con base en el marcador de tamaño molecular λDNA digerido PstI.
36
Figura 14. Mapeo de restricción de los plásmidos pCaNA, pM2 y pCaCo. El DNA plasmídico recuperado de maxipreparaciones se digirió con las enzimas seleccionadas a través de un análisis bioinformático (Tabla 5). A) Se muestra el plásmido pCaNA (carril 1) y sus productos de digestión (carril 2). B) Los carriles 1 y 3 son los plásmidos pCaM2 y pCaCO sin restringir; y los carriles 2 y 4 son sus productos de digestión. El tamaño de las bandas se determinó con base en el marcador de tamaño molecular λDNA digerido PstI.
Las bandas observadas en los electroferogramas de las figuras 13 y 14 coinciden al tamaño de los
fragmentos esperados según el análisis informático (Tabla 4), con ello se corroboró la identidad de
cada plásmido. La forma molecular I (súper enrollada) fue predominante en los plásmidos extraídos,
por lo tanto los plásmidos recuperados tuvieron una calidad adecuada para continuar con la
transfección a células 293T.
Una vez transfectadas las células 293T, se recuperaron los pseudotipos cosechando el sobrenadante a
las 48, 72 y 96 h post-transfección. Se produjeron pseudotipos retrovirales que presentan en su
superficie la HA del virus de la influenza A(H1N1)pdm09 y portan, como gen reportero, el gen que
codifica a la enzima β-galactosidasa. Para probar la infectividad de los pseudotipos, se determinaron
las Unidades Relativas de Luminiscencia por mililitro (URL/mL) que resultan al infectar con ellos
células 293T (Figura 15).
37
Figura 15. Cuantificación de pseudotipos cosechados a las 48, 72 y 96 h post-transfección. Se muestran los valores obtenidos de luminiscencia (URL/mL) al infectar células 293T con los pseudotipos retrovirales cosechados. Los colores empleados corresponden a tres lotes de producción diferentes.
Al comparar los valores de quimioluminiscencia, se observa que éstos son variables entre las tres
cosechas realizadas; los mayores valores de señal de la enzima β-galactosidasa se obtuvieron con los
pseudotipos retrovirales recuperados a las 72 h. A pesar de la variación, los resultados de infectividad
son adecuados para tener suficiente cantidad para emplearlos en ensayos de microneutralización. Se
calculó, para cada lote y cosecha, la dilución de los pseudotipos retrovirales requerida para manejar
10000 URL en los ensayos de microneutralización. Para la etapa de escrutinio, los sueros se analizaron
al azar, por duplicado y en ciego, a una dilución final de 1:40 con el fin descartar aquellos que
presentaran una neutralización menor al <50%, los cuales se consideraron como negativos. Aquellos
sueros que tuvieron un porcentaje de neutralización ≥50% se consideraron positivos y algunos de
éstos se analizaron en la segunda fase mediante la realización de curvas de titulación, para
determinar el título de NAbs y factores que puedan favorecer el aumento en la generación de NAbs.
De esta primera etapa se analizaron los resultados para determinar la seroprevalencia en los
trabajadores del IMSS.
38
En total obtuvimos un 26.71% de trabajadores de la salud con resultado positivo en la primera etapa
de eliminación de muestras negativas; para el grupo de control se encontró un 20% de positivos. La
diferencia entre la seroprevalencia en los trabajadores y la población en general no fue significativa
(p = 0.872). Sin embargo, se desglosaron los resultados para analizar si se presentaron factores que
pudieron favorecer a contraer el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 en los trabajadores de la salud
(Tablas 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11):
Tabla 5. Comparación de la proporción de positivos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 por sexo, edad y centro de trabajo.
Resultado
Positivo Negativo Valor p
Número Porcentaje Número Porcentaje
Sexo Masculino Femenino
146 298
27.1 26.5
392 826
72.9 73.5
0.788
Edad**
18-34 años 35-42 años 43-48 años >49 años
101 104 106 115
24.9 27.6 26.4 27.4
305 273 295 305
75.1 72.4 73.6 72.6
0.815
Centro de Trabajo HECMNSXXI HPCMNSXXI HGCMN LA RAZA HECMN LA RAZA HICMN LA RAZA HGO No 3 LA RAZA HGO No 3 A MAGDALENA HTRAUMA MAGDALENA HGO/UMF 13 HG2/UMF 26 UMF-57 SNTSS CVE. COORD. VIG. EPID. C.E. CENTRO MED. LA RAZA SALUD EN EL TRABAJO
11 42
133 19 32 36 35 25 21 6
34 5
32 12 1
8.1
37.5 33.2 18.4 30.2 23.8 29.2 24.0 21.0 6.7
35.8 50.0 44.4 21.8 11.1
124 70
267 84 74
115 85 79 79 84 61 5
40 43 8
91.9 62.5 66.8 81.6 69.8 76.2 70.8 76.0 79.0 93.3 64.2 50.0 55.6 78.2 88.9
<0.001* n = 1676 *Diferencia estadísticamente significativa (p<0.05). **
Los grupos se dividieron con base en los percentiles por edad, generando subgrupos cada 25%.
De la tabla 5 puede observarse que no se encontró diferencia significativa entre los porcentajes de
muestras positivas obtenidas en hombres y mujeres. Las seropositividad por edades tampoco
presentó diferencia significativa a pesar de los rangos determinados por percentiles para
39
homogeneizar el número de muestras incluidas en cada rango, por lo que se compararon las edades
entre grupos encontrando que se formaron grupos homogéneos de edades tanto por sexo como por
centro de trabajo (p=0.991 y 0.992, respectivamente). Como se puede apreciar en la tabla 5, sí hubo
diferencia importante estadísticamente en el porcentaje de positivos por centro de trabajo, por lo
que este factor se analizó para estimar el riesgo del trabajador con base en el lugar de trabajo, por
medio del cálculo de la razón de momios (Tabla 6):
Tabla 6. Análisis del riesgo de los trabajadores para seroconvertir contra la influenza A(H1N1)pdm09, asociado a centro de trabajo.
Variable Razón de momios (OR) IC95% Valor p
Centro de Trabajo HECMNSXXI HPCMNSXXI HGCMN LA RAZA HECMN LA RAZA HICMN LA RAZA HGO No 3 LA RAZA HGO No 3 A MAGDALENA HTRAUMA MAGDALENA HGO/UMF 13 HG2/UMF 26 UMF-57 CVE. COORD. VIG. EPID. C.E. CENTRO MED. LA RAZA
0.224 1.713 1.523 0.604 1.201 0.846 1.141 0.860 0.716 0.185 1.573 2.287 0.759
0.108-0.421 1.120-2.594 1.182-1.957 0.342-1.017 0.755-1.873 0.555-1.264 0.734-1.741 0.518-1.386 0.415-1.188 0.065-0.424 0.986-2.472 1.370-3.787 0.361-1.482
>0.001* 0.007*
>0.001* 0.050* 0.403 0.403 0.529 0.524 0.183
>0.001* 0.039* >0.001*
0.404 *Diferencia estadísticamente significativa (p<0.05). Los valores señalados en rojo, indican que no el resultado de OR no reveló un mayor o menor riesgo con base en el IC95%. No se calculó la OR para el Sindicato de Trabajadores del Seguro Social (SNTSS), ni para el centro de Salud en el trabajo debido al bajo número de muestras (n=10 y 9, respectivamente).
De los centros que presentaron una estimación de riesgo significativa, el personal del Hospital
General de Zona No.2/Unidad Médica Familiar 26 (HG2/UMF26) exhibió un menor riesgo en adquirir
la influenza pandémica. Por el contrario, el Hospital Pediátrico del Centro Médico Nacional Siglo XXI
(HPCMNSXXI) presentó una mayor probabilidad de presentar algún caso positivo en esta institución
en comparación con los otros organismos, seguido del Hospital General Centro Médico Nacional La
Raza.
Ya que se presentó una diferencia significativa por centro de trabajo, se examinó si el puesto, turno,
medio de transporte utilizado o disponer de un segundo empleo pueden ser una variable de riesgo
(Tabla 7).
40
Tabla 7. Comparación de la proporción de positivos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 por puesto de trabajo, turno y medio de transporte utilizado.
Resultado
Positivo Negativo Valor p
Número Porcentaje Número Porcentaje
Puesto de Trabajo Servicios básicos
a
Enfermería y otrosb
Médicoc
127 173 143
27.9 24.7 28.4
328 528 360
72.1 75.3 71.6
0.276
Turno Matutino Vespertino Nocturno Jornadas acumuladas Mixto Rotativo Guardias ABC No Especificado
324 47 41 4
21 4 3 0
26.3 28.8 29.5 57.1 23.1 22.2 27.3 0.0
908 116 98 3
70 14 8 1
73.7 71.2 70.5 42.9 76.9 77.8 72.7
100.0
0.598
Transporte Auto Taxi Metro Metrobus Combi Otro
130 24 17 4
45 18
28.3 35.8 19.5 30.8 27.3 29.5
329 43 70 9
120 43
71.7 64.2 80.5 69.2 72.7 70.5
0.379
Segundo empleo Si No
27
397
24.5 26.7
83
1092
75.5 73.3
0.627
Categoría de segundo empleo Servicio Básico Enfermería y otros Médico
4 2
19
36.4 10.0 26.0
7
18 54
63.6 90.0 74.0
0.199
a Auxiliar de oficinas, trabajador de intendencia y otros.
b Asistente médico, auxiliar de enfermería, enfermera, fisioterapeuta, jefe o subjefa de enfermeras, jefatura de enfermería,
laboratorista, nutrición y técnico de rayos X. c Anestesiólogo, médico familiar, médico interno de pregrado, médico no familiar, residente, cirujano y odontólogo.
Los trabajadores de la salud reclutados provenían de diferentes áreas que se agruparon en tres
categorías: Servicios básicos, enfermería y otros y médicos; con ello se pretendió dividir de menor a
mayor riesgo, con base en la exposición con personas infectadas. Sin embargo, no hubo diferencia
significativa en cuanto a puesto laboral; aunque, como se esperaba según la división, el mayor
porcentaje de positivos se presentó en el grupo de médicos. Además, se examinó el efecto del turno
laboral; aquellos que tenían turnos con jornadas acumuladas tuvieron mayor frecuencia de positivos,
seguido de trabajadores de turno nocturno, pero el número de participantes no influyó en generar
41
una diferencia significativa. Los trabajadores de la salud con un segundo empleo tampoco tienen un
mayor riesgo de contraer la enfermedad, sin importar la categoría de este segundo empleo.
Adicionalmente se comparó la seroprevalencia en los trabajadores de la salud con base en el medio
de transporte usado para llegar a sus centros de trabajo, porque se esperaba que usuarios de
transporte público se expusieran más al agente infeccioso. Como se observa en la tabla 7 no hubo
diferencia significativa en los resultados.
Se consideró que un aspecto que pudo facilitar el contagio fue el contacto con personas con o
sospechosos de padecer influenza A(H1N1)pdm09, para ello se analizó si el número de casos con los
cuales tuvo contacto el trabajador o la cercanía con la persona infectada podrían favorecer a la
transmisión del virus (Tabla 8).
Tabla 8. Comparación de la proporción de positivos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 por contacto con posibles personas infectadas.
Resultado
Positivo Negativo Valor
p
Número Porcentaje Número Porcentaje
Contacto, en su empleo, con caso de influenza
A(H1N1)pdm09 o sospechoso
Si
No
262
163
28.1
24.6
672
499
71.9
75.4
0.127
Número de personas con sospecha o confirmación de
influenza A(H1N1)pdm09 con quien tuvo contacto
0
1-5
>5
195
130
119
24.9
25.7
32.0
589
376
253
75.1
74.3
68.0
0.031*
Contacto con caso de influenza A(H1N1)pdm09 o
sospechoso en el segundo empleo
Si
No
15
12
25.9
26.7
43
33
74.1
73.3
0.927
Contacto con familiar con influenza A(H1N1)pdm09 o
sospechoso
Esposo(a)
Hijo
Padres
Hermanos
Otros
Ninguno
7
17
2
11
45
320
35.0
30.9
13.3
45.8
29.4
25.9
13
38
13
13
108
913
65.0
69.1
86.7
54.2
70.6
74.1
0.158
42
Continuación de la tabla 8. Comparación de la proporción de positivos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 por contacto con posibles personas infectadas.
Resultado
Positivo Negativo Valor
p
Número Porcentaje Número Porcentaje
Contacto en la comunidad con caso con influenza
A(H1N1)pdm09 o sospechoso
Vecinos de edificio
Vecino de la calle
Vecinos de la colonia
Escuela
Compañeros de trabajo
Ninguno
2
6
5
4
64
307
66.7
24.0
19.2
66.7
26.9
26.1
1
19
21
2
174
868
33.3
76.0
80.8
33.3
73.1
73.9
0.138
*Diferencia estadísticamente significativa (p<0.05).
Los resultados de la tabla 8 señalan que la cercanía con personas infectadas no representa un riesgo
en contraer la enfermedad, sin embargo el número de personas infectadas con las que estuvo en
contacto el trabajador si aumentó significativamente el porcentaje de positivos en el grupo de estudio.
Debido a que el número de contactos con o sospechosos de influenza A(H1N1)pdm09 evidenció un
aumento en la seropositividad, y pueda ser el factor que explique el 6.71% de aumento en la
seroprevalencia en los trabajadores en comparación al grupo control, se compararon algunas
medidas de protección en la tabla 9.
43
Tabla 9. Comparación de la proporción de positivos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 con base en las medidas de protección reportadas.
Resultado
Positivo Negativo Valor p
Número Porcentaje Número Porcentaje
Utilizó equipo de protección personal Si No
225 25
27.5 33.3
592 50
72.5 66.7
0.285
Tipo de equipo de protección personal Mascarilla quirúrgica o tapabocas Goggles Bata o delantal
223
0 0
27.8 0.0 0.0
578
4 3
72.2
100.0 100.0
0.260
Uso de equipo de protección antes de iniciada la pandemia de influenza A (H1N1) 2009 Habitual Frecuente Poco frecuente Nunca
174 72 78 80
25.3 25.4 33.2 24.5
514 212 157 246
74.7 74.6 66.8 75.5
0.130
Utilizó equipo de protección personal en el segundo empleo Si No
17 0
29.8 0.0
40 6
70.2 100.0
0.117
Vacunación contra influenza estacional, vacuna del periodo invierno 2007-2008*** Si No
356 88
27.8 23.0
924 294
72.2 77.0
0.064
Recibió antivirales para prevenir influenza estacional o A(H1N1)pdm09
**
Si No
52 365
35.4 25.6
95 1061
64.6 74.4
0.011* *Diferencia estadísticamente significativa (p<0.05). **
El tratamiento que mencionaron recibir fue Tamiflu, Zanamivir u Oseltamivir. ***
La vacuna administrada contenía las cepas vacunales A/Brisbane/59/2007 (HIN1), A/Brisbane/10/2007 (H3N2) y B/Florida/4/2006.
La variación en los porcentajes de trabajadores que recurrieron al uso de equipo de protección
durante la pandemia, no fue significativo sin importar el tipo de indumentaria empleada. De la tabla 9
es imperativo recalcar que no se presentó cruce antigénico debido a la vacunación contra la influenza
estacional, pues la variación no influyó el aumento significativo de la seropositividad.
Sorpresivamente en los trabajadores que recibieron antivirales para prevenir la influenza aumentó
significativamente el porcentaje de positivos. Dado el resultado contradictorio sobre tratamiento
antiviral, se analizó la base de datos, encontrando que muchos de los trabajadores que recibieron
medicamento reportaron haber presentado algún síntoma relacionado con influenza, lo que podría
44
indicar que la administración de medicamento no fue como medida profiláctica, sino como
tratamiento. Se procedió a determinar el riesgo atribuido por el uso de antivirales, así como el
número de personas infectadas con quienes estuvo en contacto el trabajador (Tabla 10).
Tabla 10. Análisis del riesgo de los trabajadores para seroconvertir contra la influenza A(H1N1)pdm09, asociado a número de contactos con influenza y uso de antivirales.
Variable Razón de momios IC95% Valor p
Número de personas con sospecha o confirmación de influenza A(H1N1)pdm09 con quien tuvo contacto 0 1-5 >5
1.044 1.396
0.800-1.360 1.075-1.807
0.741 0.009*
Recibió antivirales para prevenir la influenza estacional o A(H1N1)pdm09
No Si
1.591
1.089-2.305
0.010*
*Diferencia estadísticamente significativa (p<0.05). El valor señalado en rojo, indican que el resultado de OR no reveló un mayor o menor riesgo con base en el IC95%.
Aquellos trabajadores que estuvieron en contacto con más de cinco personas infectadas presentaron
un mayor riesgo de exponerse con el virus de la influenza A(H1N1)pdm09. Por otro lado, los
trabajadores que recibieron antivirales aumentaron su riesgo a adquirir la infección, lo que también
nos señala que este factor no se empleó como medida para prevenir la influenza A(H1N1)pdm09 ya
que los tres antivirales mencionados en las encuestas son inhibidores de la NA del virus de la
influenza, y por consiguiente se emplean como tratamiento contra virus de la influenza tipo A y B
(Lackenby et al., 2008). Conjuntamente se investigó la frecuencia de síntomas y casos reportados de
influenza estacional o pandémica (Tabla 11).
45
Tabla 11. Resultados de positivos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 obtenidos comparando presencia de síntomas, adquisición o confirmación de influenza.
Resultado
Positivo Negativo Valor p
Número Porcentaje Número Porcentaje
Presentó síntomas de enfermedad respiratoria*
Fiebre Cefalea Tos Dolor de garganta Rinorrea Dolor muscular
81 134 155 185 145 87
27.9 26.9 26.2 26.5 25.9 23.1
209 365 436 512 414 289
72.1 73.1 73.8 73.5 74.1 76.9
0.479 0.797 0.925 0.903 0.742 0.093
Enfermó por influenza estacional Si No
40
369
24.2 26.7
125
1012
75.8 73.3
0.495
Confirmación de influenza estacional Si No
2
412
15.4 26.6
11
1138
84.6 73.4
0.362
Enfermó por influenza A(H1N1)pdm09 Si No
3
408
15.0 26.6
17
1125
85.0 73.4
0.242
Confirmación de influenza A(H1N1)pdm09 Si No
1
410
9.1
26.6
10
1132
90.9 73.4
0.190
*La comparación se realizó entre los que presentaron o no cada uno de los síntomas.
Ninguno de los síntomas especificados en el cuestionario se relacionó con incremento en la
seropositividad. Tampoco se observó diferencia significativa cuando el trabajador reportó si enfermó
con influenza A(H1N1)pdm09 o influenza estacional, o si la enfermedad fue confirmada. Pese a que
gran parte de los casos confirmados de influenza A(H1N1)pdm09 no se detectaron en la primera
etapa, es fundamental señalar que se desconoce el tipo de métodos de diagnóstico utilizado para la
confirmación; algunos de ellos, como el ensayo rápido de influenza, únicamente permiten discriminar
entre virus de influenza A o B sin especificar subtipo. La principal razón por la cual se anexó el
resultado de confirmación de casos fue para enfatizar que muy pocos trabajadores de la salud
participantes se realizaron pruebas de diagnóstico en caso de haber presentado síntomas.
46
Algunos de los sueros que resultaron positivos en la primera etapa se examinaron para precisar el
título de anticuerpos. Para determinar la dilución de suero a la cual se obtiene el 50% de
neutralización (ED50), se graficó el Log10 de la dilución de suero contra el porcentaje de neutralización
calculado (Figura 16). El valor ED50 fue calculado ajustando los resultados de neutralización a una
curva sigmoidea mediante un análisis por 4PL.
Figura 16. Curva de neutralización de suero problema para el cálculo del título de NAbs. Ejemplo de la
determinación del título de anticuerpos neutralizantes presentes en las muestras separadas a partir de la primera
etapa. En este caso la ED50 se obtuvo a la dilución 1:810.4, con una R2=0.8204.
De los sueros procedentes de los trabajadores del IMSS a los cuales se les realizaron curvas de
neutralización, 48 presentaron títulos ≥40, teniendo un rango de valores de ≥40 a ≤10240. Por lo cual,
se examinaron diferentes factores que pueden estar relacionados con el aumento del título de
anticuerpos en estas muestras con títulos ≥40 (Tablas 12 y 13).
47
Tabla 12. Comparación de los títulos de NAbs (GTMs) contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 obtenidos por edad, centro de trabajo, puesto y turno.
Número GTM (IC95%) Desviación Estándar Valor p
Sexo Masculino Femenino
15 33
380.2 758.6
4.3 4.6
0.144
Edad 18-34 años 35-42 años 43-48 años >49 años
9
10 11 16
851.1 467.7 831.7 616.6
6.0 5.6 4.7 3.5
0.598
Centro de Trabajo HPCMNSXXI HGCMN LA RAZA HECMN LA RAZA HICMN LA RAZA HGO No 3 LA RAZA HGO No 3 A MAGDALENA HTRAUMA MAGDALENA HGO/UMF 13 HG2/UMF 26 UMF-57 SNTSS CVE. COORD. VIG. EPID.
2
10 1 5 6 5 1 3 2 7 3 3
501.2 251.2 316.2
1096.5 436.5 380.2 204.2
2089.3 3090.3 1148.2 467.7
1174.9
8.5 4.6 ---- 3.5 7.1 5.4 ---- 3.9 3.5 2.8 4.3 3.6
0.981
Puesto de Trabajo Servicios básicos
a
Enfermería y otrosb
Médicoc
16 14 18
776.2 380.2 724.4
4.3 4.0 5.4
0.727
Turno Matutino Vespertino Nocturno Mixto Guardias ABC
36 3 6 2 1
812.8 72.4
195.0 776.2 10000
3.8 1.7 2.0
28.2 ----
0.073 a
Auxiliar de oficinas, trabajador de intendencia y otros. b Asistente médico, auxiliar de enfermería, enfermera, fisioterapeuta, jefe o subjefa de enfermeras, jefatura de enfermería,
laboratorista, nutrición y técnico de rayos X.
Aunque las mujeres presentaron en promedio un mayor título de anticuerpos que los hombres, la
diferencia de ambos géneros no fue significativa (758 vs 380, p=0.144). Tampoco varió
significativamente el título de NAbs con base a la edad, centro de trabajo, puesto y turno. Debido a
que ningún factor correspondiente a características del trabajador tuvo un efecto en el aumentó de
NAbs, se analizó la GTM relacionada con contacto con personas infectadas y medidas de protección
del trabajador (Tabla 13).
48
Tabla 13. Comparación de los títulos de NAbs obtenidos por contacto con posibles personas infectadas y formas de protección utilizadas por el trabajador para evitar el contagio con influenza A(H1N1)pdm09.
Número GTM (IC95%) Desviación Estándar Valor p
Contacto, en su empleo, con caso de influenza A(H1N1)pdm09 o sospechoso Si No
30 16
588.8 831.8
4.1 5.4
0.468
Número de personas con sospecha o confirmación de influenza A(H1N1)pdm09 con quien tuvo contacto 0 1-5 >5
18 13 17
645.7 467.7
707.95
5.6 4.4 4.0
0.659
Segundo empleo Si No
2
43
1148.2 645.7
13.8 4.7
0.614
Utilizó equipo de protección personal Si No
26 3
602.6 562.3
4.6 1.7
0.948
Vacunación contra influenza estacional Si No
40 8
691.8 331.1
4.8 3.5
0.212
Recibió antivirales para prevenir influenza A (H1N1)
Si No
4 40
616.6 660.7
9.3 4.5
0.925
Enfermó por influenza estacional Si No
7
37
1096.5 616.6
2.9 5.0
0.376
Al igual que en la tabla 12, las variables de la tabla 13 no puntualizaron factores que potencien el
título de NAbs contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09. Es importante recordar, que se
utilizaron para este análisis estadístico sólo un pequeño grupo de sueros con títulos de NAbs ≥40, por
ello es probable que el número de muestras analizadas limitó la búsqueda de factores que
contribuyan al aumento de la respuesta mediada por NAbs.
49
II. Análisis Bioinformático.
Se identificaron siete mutaciones en la región del tallo que posiblemente favorezcan al aumento de
la estabilidad de la HA, ya que se localizan en una posición adecuada para generar nuevas
interacciones con aminoácidos presentes en los otros monómeros. Las mutaciones seleccionadas se
muestran en la estructura de la HA con clave en el PDB:3M6S (Figura 17).
.
Figura 17. Posiciones de las mutaciones predichas en las estructuras de la HA 3M6S y 3LZG. Las mutaciones
seleccionadas se localizaron en la HA PDB:3M6S, se muestra en el cuadro la posición de las mismas por cadena,
recordando que las mutaciones se introdujeron en los tres monómeros que forman la HA viral.
Es importante señalar que ninguna de las sustituciones estudiadas se presenta en el sitio de
reconocimiento al receptor, en los sitios de reconocimiento de anticuerpos, ni en el péptido de
fusión; por lo cual se espera que estas mutaciones mejoren la estabilidad de la HA, sin comprometer
las funciones de la proteína ni su antigenicidad.
La figura 18 es un ejemplo de la búsqueda realizada en la estructura para seleccionar sustituciones de
aminoácidos cercanos a otros residuos, con los cuales podrían formar nuevas interacciones.
Mutación Cadena
N71K B, D y F
E47W B, D y F
E21K A, C y E
H72K B, D y F
N81H B, D y F
N43H B, D y F
Q62H B, D y F
*Las posiciones se determinaron con base en la estructura PDB: 3M6S.
50
Figura 18. Ejemplo de la selección de mutaciones capaces de formar nuevas interacciones. Se buscaron las
sustituciones de aminoácidos, determinadas a partir de los alineamientos múltiples, en la estructura de la HA; se
verificó que se encontraran residuos con los cuales podría interaccionar el nuevo aminoácido. La línea punteada
representa interacciones polares. A) En color azul oscuro se muestra el aminoácido asparagina presente en la
estructura HA silvestre PDB:3M6S. B) Mutación N62H (asparagina por histidina) realizada en la estructura de la HA
(color azul oscuro).
Las primeras simulaciones que se realizaron fueron de 2 ns a 600K con el programa NAMD 1.8.7 para
dilucidar, a alta temperatura, si las mutaciones podrían o no ser capaces de estabilizar a la proteína a
condiciones extremas. Se analizó la movilidad de los residuos y el comportamiento de las estructuras
secundarias durante el tiempo de simulación, creando gráficas del RMSD por residuo y de estructuras
secundarias (Figuras 19 y 20):
N62
H62
51
Figura 19. Gráficas del RMSD por residuo a 600 K. Representaciones de la movilidad de los residuos basándose en
una estructura inicial. A) HA silvestre, B) HA mutada. El color azul indica menor movimiento, por lo tanto mayor
rigidez.
Figura 20. Evolución de las estructuras secundarias a 600K. Se muestra el comportamiento de las estructuras
secundarias al aumentar la temperatura. A) HA silvestre, B) HA mutada. El color verde señala giros, el color amarillo
representa β-plegamientos, el color azul π-hélices, y el color rosa α-hélices.
Al comparar las gráficas de la figura 19, se observa la reducción global de los valores de RMSD
(desviación de la raíz cuadrática de la media), debido a las mutaciones. Lo anterior se evidencia
gracias al código de colores empleado, donde a los valores menores del RMSD les corresponde un
color azul y estos resultados representan un menor movimiento de los residuos y, por consecuencia,
la estabilización de la HA. Con respecto a las gráficas de estructuras secundarias (Figura 20), la HA
mutada presentó un diferente comportamiento durante la simulación. Dado que se presentaron
resultados globales del comportamiento de las estructuras secundarias, las diferencias en las gráficas
son apreciativas. En las representaciones de la figura 19, no se puede diferenciar con claridad la
variación en el mantenimiento de estructuras secundarias; posiblemente la desnaturalización
52
generada por la temperatura de 600 K dificulta obtener patrones característicos del comportamiento.
Para corroborar los resultados se prosiguió a realizar las simulaciones a 300 y 400 K; en estas últimas
simulaciones se utilizó como modelo la proteína 3LZG, porque contiene en la estructura un residuo de
ácido siálico del receptor celular y el programa Gromacs 3.3.1 permite analizar sistemas que
contengan algunos carbohidratos.
Para todas las simulaciones se calculó el valor de RMSD global, con la herramienta RMSD Trajectory
Tool del programa VMD 1.8.7. Estos valores señalan en promedio la variación estructural conforme
avanza el tiempo de simulación, calculada con base en el alineamiento con las estructuras iniciales
(Tabla 14).
Tabla 14. Valores del RMSD de la HA silvestre y mutada a 300, 400 y 600K.
Temperatura Valor de RMSD, HA silvestre Valor de RMSD, HA mutada
300 K 1.863 1.635
400 K 2.325 2.379
600 K 4.654 4.498
Un menor valor en el RMSD significa una menor fluctuación de los residuos de la proteína, así a 300 K
la HA mutada parece tener una mayor rigidez que la HA silvestre a la misma temperatura. Sin
embargo, la HA silvestre presentó menor movilidad a 400 K comparada con la HA mutada; pero a
600 K disminuye la fluctuación de los residuos en la estructura mutada. Como se muestra en la tabla
14, conforme aumenta la temperatura las proteínas se van desnaturalizando, por ello el aumento de
los valores de RMSD con respecto a la temperatura es una tendencia esperada. Debido a que se
aumentó el tiempo de simulación para las estructuras a 300 y 400 K hasta 5 ns, se obtuvo la gráfica de
RMSD global (RMSD Trajectory Tool) con el fin de visualizar si se estabilizaron los sistemas o si era
necesario extender el tiempo de simulación (Figura 21).
53
Figura 21. Gráficas del RMSD global de las simulaciones realizadas. A) RMSD de la HA silvestre a 300 K (azul) y 400 K
(gris), B) RMSD de la HA mutada a 300 K (azul) y 400 K (rojo).
Las gráficas de la figura 21 señalan el marco (frame) en el que se estabilizan las estructuras durante la
simulación, es decir que se genera una tendencia en la gráfica del RMSD, reduciendo la variación en
los picos de la misma. La HA silvestre se estabiliza a los 2.5 ns (marco 250) a 300 K, a los 2 ns (marco
200) la HA mutada a 300 K; se observa en las gráficas que para la proteína HA mutada (Figura 21B
color rojo) no se alcanzó la estabilización del sistema a 400 K, por ello se procedió a extender el
tiempo de las simulaciones a 400 K hasta 10 ns.
Se analizaron las gráficas del RMSD por residuo, de estructuras secundarias y se obtuvieron
estructuras de las HAs coloreadas según el valor RMSD, usando la herramienta de VMDICE, de la HA
silvestre y mutada a 300 K (Figuras 22, 23 y 24).
Figura 22. Gráficas del RMSD por residuo a 300 K. Representaciones de la movilidad de los residuos basándose en una
estructura inicial. A) HA silvestre a 300 K, B) HA mutada a 300 K. El color azul indica menor movimiento, por lo tanto mayor
rigidez.
54
A 300 K es notoria la reducción de la movilidad de los residuos de la HA mutada. La interpretación de
los resultados globales del comportamiento de las estructuras secundaria es difícil; a pesar de ello, al
comparar los resultados se ve una ligera diferencia en el comportamiento, pero se requiere de un
análisis puntual de las zonas donde se presenten las mutaciones para verificar el efecto de las mismas
(Figura 23).
Figura 23. Evolución de las estructuras secundarias a 300K. Se muestra el comportamiento de las estructuras secundarias
de A) HA silvestre y B) HA mutada. El color verde señala giros, el color amarillo representa β-plegamientos, el color azul
π-hélices, y el color rosa α-hélices.
Otra forma de examinar si las mutaciones fueron estabilizantes, es coloreando la estructura con base
en sus valores de RMSD utilizando la herramienta VMDICE. Las estructuras de la figura 24, indican que
la HA mutada a 300 K es más estable que la HA silvestre a la misma temperatura y también muestran
las regiones en las cuales se presenta mayor diferencia en la movilidad. Como se observa, siguiendo el
mismo código de colores empleado en las gráficas de RMSD, la mayor variación se presenta en la
sección del tallo donde se realizaron las mutaciones.
55
Figura 24. Estructuras de la HA silvestre y mutada, coloreadas con base en los valores del RMSD por residuo. Visualización
de las estructuras de las HAs coloreadas con respecto a sus valores de RMSD. A) HA silvestre a 300 K, B) HA mutada a 300 K.
El código de colores es igual que el presentado en las gráficas del RMSD por residuo.
Finalmente, se examinaron los resultados a 400 K durante 10 ns de simulación. Dado que los archivos
de salida del programa Gromacsv3.3.1 fueron muy grandes (aproximadamente 7Gigabytes por
archivo) para la capacidad computacional disponible, se extrajeron los resultados numéricos de los
valores de RMSD por residuo y se graficaron con el programa Microsoft Office Excel 2007. Al igual que
en los resultados anteriores, la HA mutada presentó una disminución global de los valores de RMSD
por residuo, lo que se evidencia en la disminución de la amplitud de los picos de la gráfica (Figura 25,
color rojo).
56
Figura 25. Gráfica del RMSD por residuo de las estructuras a 400 K. Se muestran los valores de RMSD de cada residuo de la
proteína HA silvestre (azul) y mutada (rojo); se aprecia una menor distorsión de la gráfica con la HA mutada.
Como se observa en las figuras 23 y 24, el aumento de la estabilidad es desigual en los monómeros de
la HA; sin embargo, aunque no todas las subunidades presenten una mejoría evidente, las estructuras
completas mostraron un aumento general en la estabilidad.
Por otro lado, debido a que la selección de las mutaciones fue con base a la formación de nuevos
enlaces, se analizaron in silico las mutaciones para verificar la generación de interacciones. Se
encontraron dos situaciones: 1) se formaron nuevos puentes salinos, principalmente, y en el caso de
la sustitución E47W (cadenas B, D y F) se formó un enlace π- π con una tirosina cercana o 2) las
sustituciones generaron puentes salinos más fuertes, los cuales fueron capaces de mantenerse
durante más tiempo de simulación.
57
4. DISCUSIÓN.
Se produjeron pseudotipos retrovirales que presentaron en su superficie la HA del virus de la
influenza A(H1N1)pdm09 y portan el gen que codifica a la enzima β-galactosidasa. Se ha empleado
como gen reportero el gen que codifica a la enzima luciferesa (Wang et al., 2008), pero ésta tiene un
corto tiempo en el cuál se puede realizar la lectura; por ello la detección con base en reacción de la
enzima β-galactosidasa con su sustrato, disminuye la posibilidad de lecturas erróneas generadas por
el tiempo de reacción. En los ensayos de neutralización de la primera etapa, se planteó como punto
de corte un porcentaje de neutralización ≥50% a una dilución de 1:40, para considerar sueros
positivos a la influenza A(H1N1)pdm09. Esta dilución se eligió con base en estudios como el realizado
por Kolokoltsov y colaboradores en 2006, donde demostraron que en ensayos de neutralización
empleando pseudotipos retrovirales, sueros con títulos de anticuerpos mayores a 1:40 son relevantes
para indicar presencia de NAbs (Kolokolstov et al., 2006).
Para la primera etapa se presentó una diferencia de 6.71% entre los resultados positivos del grupo
control y los trabajadores del IMSS (26.71% vs 20%), la cual no resultó significativa (p=0.872). Por lo
tanto, a pesar de que se ha considerado a los trabajadores de la salud como un grupo de riesgo,
confrontado con la población en general, no tuvieron mayor probabilidad de contraer la influenza
A(H1N1)pdm09 debido a su empleo. Al igual que en informes elaborados en Hong Kong y Nueva
Zelanda (Bandaranayake et al., 2010; Zhou et al., 2011), en este estudio los trabajadores de la salud
no presentaron un mayor riesgo en contraer la infección; por el contrario, en el trabajo de Chan y
colaboradores en el 2010 (Taiwan) reportaron una seroprevalencia significativamente mayor en los
trabajadores de hospitales que en su grupo control, principalmente lo relacionaron con el contacto
con pacientes con influenza A(H1N1)pdm09 ya que al separar los trabajadores que tienen contacto
directo con pacientes de los que no, encontraron diferencia significativa entre los dos grupos (30.8%
vs 12.6%, p<0001) (Chan et al., 2010). Es importante señalar que de los artículos mencionados, sólo
en el de Nueva Zelanda efectuaron ensayos de microneutralización, es decir únicamente detectando
NAbs (Bandaranayake et al., 2010). Por otra parte, se reportó una disminución significativa en el
porcentaje de positivos dentro del grupo de trabajadores de la salud en una investigación realizada
en Monterrey, Nuevo León (Elizondo-Montemayor et al., 2011), pero los autores señalan que la
heterogeneidad de su grupo de comparación pudo influir en este resultado.
58
Los valores de seroprevalencia obtenidos son menores del 30% a pesar de que se trate del estudio de
un virus pandémico, pero son cercanos a los estudios realizados hasta el momento de la presencia de
anticuerpos contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09 (Bandaranayake et al., 2010; Chan et al.,
2010; Miller et al., 2010; Broberg et al., 2011; Elizondo-Montemayor et al., 2011; Marshall et al.,
2011; Zhou et al., 2011). Las variaciones en los porcentajes reportados en estos trabajos sobre
seroprevalencia, se atribuye a los diferentes puntos de corte para clasificar los casos positivos y el
tipo de método aplicado para determinar la seropositividad. En nuestro estudio nos enfocamos a
ensayos de neutralización porque éstos son capaces de detectar únicamente anticuerpos
neutralizantes, es decir funcionales. Por ello, la detección de NAbs empleando los pseudotipos
retrovirales es indicativa de la presencia de anticuerpos capaces de evitar la infección. Además, la
controversia generada desde inicio de la pandemia acerca de cruce antigénico con virus anteriores,
justifica el empleo de ensayos de microneutralización ya que se ha reportado que aquellos
anticuerpos capaces de reconocer al virus de la influenza A(H1N1)pdm09 no necesariamente
neutralizan al nuevo virus. Inclusive se publicó en un estudio realizado en el 2010, teniendo como
grupo de estudio trabajadores de la salud, que de las muestras que presentaron reacción cruzada,
únicamente el 18% de ellas contenían NAbs (Broberg et al., 2011).
Los resultados de las tablas 5 a 11 muestran el porcentaje de individuos positivos obtenidos en la
primera etapa de escrutinio, divididos por factores, con el fin de determinar si alguno favoreció a
contraer la influenza A(H1N1)pdm09 dentro del grupo de estudio. Aunque en reportes anteriores se
ha encontrado diferencia significativa en la seroprevalencia con respecto a grupos de edad (Broberg
et al., 2011), en nuestro estudio las edades no influyeron significativamente en la propensión a la
enfermedad. Lo anterior se puede explica con base en el rango de edades analizado, el cual no incluye
niños ni adultos mayores (el trabajador de mayor edad fue de 71 años, y el siguiente de 67 años),
grupos en los que en estudios realizados por otros grupos de investigación se ha encontrado un
mayor porcentaje de seropositividad (Broberg et al., 2011). El centro de trabajo al cual pertenecen los
trabajadores si influyó en la probabilidad de contraer la infección, como se muestra en la tabla 5. Los
trabajadores que exhibieron un menor riesgo fueron los pertenecientes al Hospital General de Zona
No.2/Unidad Médica Familiar 26 (HG2/UMF26). Por el contrario, el Hospital Pediátrico del Centro
Médico Nacional Siglo XXI (HPCMNSXXI) presentó un aumento en el riesgo de los trabajadores en
contraer la enfermedad en comparación con los demás hospitales, además de ser el tercer centro con
mayor porcentaje de positivos de la primera etapa. Cabe destacar que para los trabajadores del
59
Sindicato Nacional de Trabajadores del Seguro Social (SNTSS) y de la Coordinación de Salud en el
Trabajo no se estimó el valor de OR debido al bajo número de muestras (n=10 y n=9). Gran parte de
los centros analizados no presentaron una estimación de OR tal que muestre si existe un menor o
mayor riesgo de contraer la influenza A(H1N1)pdm09 en esa institución (OR tomó un valor de uno
dentro del rango de IC95%)
A pesar de que los trabajadores se dividieron por puesto de trabajo, con base en su posible
exposición con personas infectadas, no se encontró diferencia significativa del porcentaje positivos
por categoría laboral. De los reportes publicados hasta el momento donde diferencian entre
trabajadores clínicos y el resto del personal, dos han señalado un aumento significativo en los casos
positivos en trabajadores clínicos. En uno el análisis fue mediante ensayos de RT-PCR en tiempo real
(6% vs 4.3% p<0.001) (Balkhy et al., 2010), y en otro trabajo, que empleó ensayos de HI, se
obtuvieron valores de 30.8% vs 12.6%, (p<0.001) (Chan et al., 2010). Los resultados que obtuvimos
coinciden con lo reportado por Bandaranayake y colaboradores en el 2010, donde no encontraron
diferencia significativa si los trabajadores mantienen contacto directo con pacientes contagiados
(29.3% vs 25.3%). Inclusive el turno y la exposición por el medio de transporte utilizado o por
mantener un segundo empleo no contribuyeron al aumento del riesgo de contraer la enfermedad.
Con respecto a contacto con casos de influenza A(H1N1)pdm09 o sospechoso, aunque la
seroprevalencia fue mayor en el grupo que indicó haber estado en contacto con personas infectadas,
no fue significativo si estuvo expuesto al virus, ni si éstas personas pertenecían a su familia o eran de
su comunidad; pero si fue contrastante el riesgo conforme a número de personas con las que tuvo
contacto. A pesar de que se esperaría una diferencia significativa con respecto al contacto, Toyokawa
y colaboradores (2011) también señalaron que, a pesar del aumento en la seroprevalencia en
trabajadores expuestos a pacientes infectados en contraste con los que no estuvieron en contacto, la
diferencia no es significativa. Aquellos trabajadores que estuvieron con más de 5 personas
posiblemente contagiadas, presentaron mayor frecuencia de positivos y mayor probabilidad de
presentar un caso positivo a diferencia de los trabajadores que no estuvieron en contacto o con
menos de 5 personas posiblemente infectadas (Tabla 8 y 10).
Se esperaba que las medidas de protección redujeran el número de positivos en los trabajadores que
las emplearon, pero no influyeron en la prevención de contraer la infección. Es importante señalar,
que sólo se reportó el uso de cubrebocas, goggles y bata. Como mencionó el Centro Nacional de
60
Vigilancia Epidemiológica y Control de Enfermedades (CENAVECE) en el reportaje del periódico La
Jornada el 30 de abril del 2009, los cubrebocas únicamente son de utilidad en personas enfermas, por
ello, al ser este el equipo de protección preferente en los trabajadores, no generó una reducción de
casos positivos. La comparación de porcentajes obtenidos entre trabajadores de la salud que
reportaron haber sido vacunados contra la influenza estacional y los que no, no fue significativa,
teniendo un mayor porcentaje en aquellos vacunados. A diferencia del trabajo publicado por
Labrosse y colaboradores en 2010, donde encontraron un ligero aumento en el título de anticuerpos
en personas vacunadas contra la influenza estacional (A/Brisbane/59/2007) (Labrosse et al., 2010),
nuestros resultados no indican cruce antigénico al igual que reportó Hancock y colaboradores en el
2009 y según la información emitida en el 2009 por la CDC (Hancock et al., 2009).
El grupo de trabajadores que recibieron antivirales como tratamiento para evitar contagiarse con el
virus de la influenza (estacional o pandémico) mostró un mayor riesgo de contraer la infección Este
factor no es confiable para suponer que el uso del tratamiento confiere susceptibilidad de adquirir la
enfermedad, ya que aunque se señale como tratamiento profiláctico ante la influenza, es probable
que muchos trabajadores recibieran medicamento al presentar alguno de los síntomas.
La presencia de algunos de los síntomas de la influenza no se puede relacionar específicamente con
influenza A(H1N1)pdm09, ya que muchas enfermedades comparten estos síntomas, por ello las
comparaciones con respecto a estos no arrojó diferencias significativas. Los porcentajes presentados
sobre confirmación e infección por influenza estacional o pandémica, tampoco señalaron diferencia
significativa, además de ser un número reducido de trabajadores a los cuales se les confirmó el
diagnóstico de influenza. Al desconocer el método de diagnóstico utilizado, no pudimos discernir
entre positivos por virus de la influenza A o B y por lo tanto hacer una correlación con nuestros
resultados.
Por otra parte se buscaron factores que pudieran contribuir al aumento del título de NAbs en los
trabajadores de la salud. Para lo cual se analizaron las características de 48 sueros con títulos ≥40 que
se evaluaron mediante curvas de neutralización. El género, características del trabajador, contacto
con personas infectadas o medidas de protección no contribuyeron a aumentar significativamente los
valores de GTM, los cuales quedaron dentro de un rango de 72.4 a 10000. En la literatura, gran parte
de los trabajos publicados indican la seroprevalencia en su grupo de estudio con base en puntos de
corte para indicar positivos. Se han señalado como positivos aquellos sueros que presenten títulos
61
≥40 mediante ensayos de HI (Bandaranayake et al., 2010; Ross et al., 2010; Tian et al., 2010; Chao et
al., 2011; Skowronski et al., 2010; Toyokawa et al., 2011) o valores ≥40 por MN (Zhou et al., 2011). De
los artículos donde muestran los valores de GTM que obtuvieron, especifican valores de 40 a 160 por
ensayos de HI (Chan et al., 2010); y de 13 a 211 por ensayos de MN (Skowronski et al., 2010).
Como se observa en las tablas 12 y 13 los valores de GTMs que calculamos fueron mayores,
posiblemente por que manejamos genes reporteros que aumentan la sensibilidad de los ensayos de
MN (por quimioluminiscencia). Este mismo aumento en los títulos de NAbs, debido al empleo de
pseudotipos retrovirales en ensayos de MN, ejemplificó Labrosse y colaboradores en el 2010, donde
encontraron un aumento de 12 veces la GTM debido a la vacunación analizando con pseudotipos
retrovirales, el cual es considerablemente mayor a los resultados con HI (≥80 después de la
vacunación, teniendo antes valores <40). La limitante en el análisis realizado en este trabajo es que, a
diferencia de varias publicaciones, no contamos con títulos base para comparar el efecto en la
producción de anticuerpos mediada por la infección por la influenza A(H1N1)pdm09. Además el
reducido número de sueros empleados para la comparación de los GTMs por cada factor, pudo haber
enmascarado la importancia de alguno debido al número de muestras.
En cuanto a la búsqueda de sustituciones para aumentar la estabilidad de la HA del virus de la
influenza A(H1N1)pdm09, a diferencia del estudio trabajo publicado por Wang y colaboradores en el
2010, las mutaciones que seleccionamos no se encuentran en el sitio de unión a receptor (Wang et al.,
2010), ni se encuentran cerca del péptido de fusión (Yang et al., 2010), por ello se espera que el
efecto de estas mutaciones no impacte en sus funciones biológicas y sólo se relacione con la
estabilidad. De las sustituciones seleccionadas (Figura 16) cuatro se encontraron en secuencias de
diferentes virus de la influenza A(H1N1)pdm09 (N71K, E21K, N43H y Q62H) y las otras en secuencias
de virus A(H1N1) de 1947, 1977 y 2005 (E47W, H72K y N81H, respectivamente).
Para determinar el efecto generado por las mutaciones, se introdujeron estas sustituciones en dos
diferentes estructuras de HA del virus de la influenza A(H1N1)pdm09. La simulación a 600 K Permitió
determinar una estabilización global de la HA mutada en condiciones extremas de temperatura. Las
mutaciones también generaron un comportamiento diferente a nivel de estructuras secundarias, ya
sea por la extensión del número de residuos que forman la estructura o por su mantenimiento
durante el tiempo de simulación. Ya que a alta temperatura el movimiento y despliegue de las
cadenas podría causar la formación de interacciones al azar debidas al acercamiento de residuos
62
distantes, se decidió realizar el análisis a temperaturas de 300 y 400 K. Al igual que a 600 K, se
presentó la disminución de la movilidad de los residuos en la HA mutada y la variación en el
comportamiento global de las estructuras secundarias fue más evidente a 300 K que a 600 K. Aunque
el efecto de las mutaciones fue variable entre los monómeros, globalmente se obtuvo un aumento en
la estabilización de la estructura de la HA, además se encontrar la formación de nuevos enlaces,
primordialmente puentes salinos, o el mantenimiento de los puentes salinos, debido a la mutación de
aminoácidos, durante un mayor tiempo de simulación.
Nos enfocamos principalmente a la búsqueda de formación de puentes salinos debido a que se ha
señalado que este tipo de interacciones son necesarias para mantener unido al homotrímero durante
tratamientos a diferentes pH (Rachakonda et al., 2007).
Los resultados anteriores expusieron que las simulaciones de dinámica molecular fueron útiles en
para la evaluación de los modelos estructurales de proteínas HAs, con ello se planteó que las siete
sustituciones son capaces de afectar favorablemente la estabilidad de la HA del virus de la influenza
A(H1N1)pdm09. En un artículo publicado por Bloom y colaboradores en el 2009, predijeron
mutaciones que podrían afectar la estabilidad de la HA del virus de influenza y usaron algunas de las
predicciones para medir los efectos de la mutación experimentalmente. Para lo cual eligieron 12
mutaciones para analizar in vitro la capacidad del virus de la influenza A (H1N1) en mantenerse a altas
temperaturas; de éstas únicamente cuatro mostraron mejoría (Bloom & Glassman, 2009).
A diferencia de este artículo, en donde a partir de árboles filogenéticos plantean ecuaciones para
seleccionar por probabilidad posiciones en la HA que si son mutadas afectan la estabilidad de la
proteína, en el presente trabajo directamente se analizó el efecto de las sustituciones seleccionadas,
realizando simulaciones de dinámica molecular y buscando la generación de nuevas interacciones.
Aunque se requiere de realizar estudios in vitro, esta exploración permite discernir entre posiciones
favorables, reduciendo el tiempo del desarrollo experimental y el número de rediseños.
63
5. CONCLUSIONES.
Se obtuvieron pseudotipos retrovirales portadores de la HA del virus de la influenza A(H1N1)pdm09,
con valores de infectividad convenientes para emplearlos en ensayos de microneutralización.
Se encontraron siete mutaciones que favorecen la estabilidad de la HA del virus de la influenza
A(H1N1)pdm09, las cuales pueden facilitar en aplicaciones biotecnológicas.
A pesar de que los trabajadores de la salud tuvieron una mayor seroprevalencia que el grupo control
(26.7% vs. 20%), esta no resultó significativa.
Los trabajadores pertenecientes al Hospital General de Zona No.2/Unidad Médica Familiar 26,
tuvieron un menor riesgo de seroconversión en contraste con los demás centros de trabajo. Por el
contrario, trabajadores del Hospital de Pediatría del Centro Médico Nacional Siglo XXI presentaron
una mayor estimación de riesgo.
Aquellos trabajadores que estuvieron en contacto con más de cinco personas posiblemente
infectadas, presentaron mayor frecuencia de positivos y por lo tanto un mayor riesgo de contraer la
infección.
Contradictoriamente, en el grupo de trabajadores que recibió antivirales para prevenir la influenza
A(H1N1)pdm09 aumentó significativamente el porcentaje de casos positivos pudiendo atribuirse al
uso del medicamento como tratamiento contra la infección, en vez de medida profiláctica.
No se encontraron factores que contribuyan al aumento en el título de NAbs contra el virus de la
influenza A(H1N1)pdm09.
Aunque sólo identificamos tres variables que pueden contribuir al aumento de la seropositividad y del
riesgo en los trabajadores del IMSS a contraer la influenza A(H1N1)pdm09, este trabajo presentó un
indicio sobre de la diseminación del virus dentro de los hospitales del IMSS, las medidas de protección
empleadas durante la pandemia y la situación de la seroprevalencia previo a la campaña de
vacunación contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09.
64
6. PROSPECTIVAS.
Comparar los títulos de anticuerpos de las muestras pareadas, recuperadas antes y después de la
campaña de vacunación contra el virus de la influenza A(H1N1)pdm09.
Evaluar el efecto de las mutaciones en la HA del virus de la influenza A(H1N1)pdm09, mediante
ensayos in vitro.
65
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73
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4. Sitio de la Organización Mundial de las Naciones Unidas, nomenclatura del virus de la influenza
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5. Sitio de la Organización Mundial de las Naciones Unidas, situación mundial de la influenza
A(H1N1)pdm09: http://www.who.int/influenza/surveillance_monitoring/updates/en/index.html,
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6. Sitio de la Secretaria de Salud de México:
http://portal.salud.gob.mx/contenidos/noticias/influenza/estadisticas.html , 21/11/2011.
74
ANEXO I.
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81
8 FOLIO_________________
INFORMACIÓN SOBRE PRACTICAS DE CONTROL DE INFECCIONES En caso haya tenido contacto directo con pacientes con sospecha o confirmación de influenza especifique que tipo de protección utilizó y su frecuencia de uso:
Todos los días (1)
2 a 3 veces por semana (2)
Una vez por semana (3)
Una vez cada 15 días (4)
Nunca (5)
No recuerda (99)
63.-Mascarilla quirúrgica o tapabocas
64.- Respirador N95
65.-Goggles
66.- Protector facial
67.- Guantes
68.- Bata o delantal
69.- Lavado de manos con agua y jabón
70.- Uso de alcohol gel para manos
71- En los casos que respondió nunca, podría usted decir los motivos de su respuesta ____________________________________________________________________________
Mencione usted la frecuencia de uso de las medidas de protección personal antes de la aparición epidemia:
Todos los días (1)
2 a 3 veces por semana (2)
Una vez por semana (3)
Una vez cada 15 días (4)
Nunca (5)
No recuerda (99)
72.- Mascarilla quirúrgica o tapabocas
73.- Respirador modelo N95
74.- Goggles o lentes de seguridad
75.- Protector facial (careta)
76.- Guantes
77.- Bata o delantal
78.- Lavado de manos con agua y jabón
79.- Uso de alcohol gel para manos
80.- En los casos que respondió nunca, podría usted decir los motivos de su respuesta ___________________________________________________________________________________________ 81.- Nombre del coordinador de la encuesta________________________________________________________________
