APLICACIONES DE LA INTELIGENCIA ARTIFICIAL EN LOS SENSORES Y BIOSENSORES

RED TEMÁTICA DOCENTE AGENCIA ESPAÑOLA DE COOPERACIÓN INTERNACIONAL

SENSORES ELECTROQUÍMICOS

INTRODUCCIÓN A LOS QUIMIOSENSORES Y BIOSENSORES

SALVADOR ALEGRET · MANEL del VALLE

UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA

Bellaterra, 2003

AIASYB: APLICACIONES DE LA INTELIGENCIA ARTIFICIAL EN LOS SENSORES Y BIOSENSORES

Red Temática de Docencia Programa de Cooperación Interuniversitaria España-

América Latina 2002 Agencia Española de Cooperación Internacional, Ministerio de Asuntos Exteriores, Madrid.

Módulo 2: Sensores Químicos

1ª impartición: Departamento de Química, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra Junio 2003 2ª impartición: Sección de Bioelectrónica, Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados (CINVESTAV), México DF Julio 2003

Salvador Alegret (salegret@gsb.uab.es)Manel el Valle (mdelvalle@gsb.uab.es)Grup de Sensors i Biosensors, Departament de Química, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra.

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Sensores electroquímicos

Objetivos El presente texto es una introducción general a los sensores electroquímicos en el contexto de los sensores químicos y de los sistemas analíticos integrados. Clasifica y describe los sistemas sensores electroquímicos en base a los sistemas de transducción principales: potenciométrica y amperométrica. Hace énfasis en las ventajas que aporta la modificación química o biológica de los sensores potenciométricos y amperométricos, y de los dispositivos de estado sólido constituidos por los transistores de efecto de campo sensibles químicamente. Insiste también en que la inmovilización química o biológica es un aspecto determinante en el desarrollo de los sensores electroquímicos. Finalmente destaca que con los biosensores enzimáticos, inmunosensores y genosensores electroquímicos se ha consolidado un campo bioelectroquímico de gran interés analítico.

1 Sensores químicos En electroanálisis, el concepto de sensor químico representa un redescubrimiento de un tipo de instrumentación muy habitual en este campo. Los sensores químicos tienen actualmente un interés renovado debido a las perentorias necesidades actuales de disponer más y mejor información analítica en unas condiciones no convencionales. En efecto, unas veces en complementariedad, otras en oposición al diseño o concepto que representan los grandes equipos analíticos −de elevado coste, de manipulación especializada y confinados en recintos acondicionados−, los sensores químicos representan una nueva clase de instrumentación analítica, caracterizada por unas pequeñas dimensiones, un bajo coste, una utilización amigable y una generación de la información (idealmente) en tiempo real. En electroanálisis, atendiéndonos a las características acabadas de mencionar, se utilizan sensores químicos desde principios del siglo pasado. Son muy bien conocidos, por ejemplo, los electrodos redox, los electrodos selectivos de iones, especialmente el electrodo de vidrio para medir el pH, y, en cierta forma, los distintos detectores

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electroquímicos asociados a la instrumentación analítica. Lo que ha acontecido ahora es que, desde la irrupción y popularización de los ordenadores en los laboratorios, se ha impulsado de forma sistemática I + D en sensores, tanto físicos como químicos, debido a la extraordinaria innovación que representa el seguimiento en continuo por microprocesadores de parámetros físicos y químicos de un proceso complejo (por ejemplo, biomédico, ambiental o industrial) y, en consecuencia, mediante actuadores,poderlo controlar y actuar sobre él de forma provechosa (ver Cuadro 1). Idealmente, un sensor químico está formado por dos partes bien diferenciadas. Un elemento de reconocimiento molecular o iónico (receptor) (ver Cuadro 2), que interacciona selectivamente con un determinado componente de la muestra (analito), y un elemento instrumental (transductor) que traduce la interacción en una señal procesable (ver Figura 1). Ambas partes pueden encontrarse más o menos integradas, pero en todo caso conectadas, ya que la señal primaria generada en la reacción de reconocimiento (de tipo electroquímico, óptico, térmico o másico) será convertida por el transductor en una señal secundaria, en último término, del dominio eléctrico (ver Cuadro 3). La ‘conexión’ entre el elemento receptor y el transductor se materializa mediante los procesos conocidos como inmovilización, que se discutirán más adelante.

Figura 1. Diagrama esquemático del funcionamiento de un sensor químico. Solamente un componente de la muestra es reconocido por el receptor (R). La señal asociada al proceso de reconocimiento es convertida en una señal eléctrica por el transductor (T). Esta señal es posteriormente amplificada, acondicionada, procesada y presentada en formato de dato (A). El receptor puede reconocer al analito mediante mecanismos físicos, químicos o biológicos.

Así pues, esta configuración tan simple de reconocimiento + transducción, que

integra el proceso analítico convencional (ver Cuadro 4), ha permitido un diseño de una nueva instrumentación, de características muy innovadoras dentro de la química analítica, especialmente indicada para las medidas in situ, fuera del laboratorio, en

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situaciones hasta ahora no habituales, por ejemplo, el control de parámetros clínicos por parte de personal no especializado (sensores de glucosa, de alcohol, de colesterol, etc.), la seguridad y el confort domésticos (sensores de humos, de fugas de gas, etc.) o el control de la calidad y del estado de los alimentos.

1.1 Sensores electroquímicos

Bajo la denominación de sensores electroquímicos se agrupan tres tipos específicos de sensores: en primer lugar los sensores potenciométricos, especialmente los electrodos selectivos de iones, ESIs, también conocidos en sus siglas inglesas ISE (ion-selective electrodes); a continuación, los transistores de efecto de campo sensibles a iones, más conocidos también por sus siglas inglesas ISFET (ion-sensitive field-effect transistors), donde el origen de la señal también es potenciométrico; por último, tenemos un tercer grupo que es el de los sensores amperométricos, en su forma de electrodos modificados químicamente. La modificación de las superficies electroactivas de estos dispositivos con materiales biológicos de reconocimiento molecular son los conocidos biosensores electroquímicos, que constituyen el área más avanzada de los sensores electroquímicos (ver § 4). Los sensores electroquímicos son una clase de sensores químicos que goza de una posición preeminente en el mercado de la instrumentación analítica. Si los comparamos con las otras clases de sensores químicos (ver cuadro 3), son unos dispositivos muy simples, que no necesitan de equipos de medida sofisticados; utilizan instrumentación muy común en los laboratorios (potenciómetros y potenciostatos). La señal transducida es eléctrica, fácilmente procesable por métodos electrónicos. Son dispositivos fácilmente miniaturizables, lo que permite hacer medidas en pequeños volúmenes de muestra o en zonas de dimensiones reducida. Presentan unos límites de detección suficientes para una gran mayoría de muestras de interés analítico, y un intervalo de respuesta más amplio que la mayoría de sensores químicos basados en otros principios. Finalmente, un dispositivo sensor electroquímico, especialmente si se puede fabricar en técnicas de producción en serie, tiene un coste muy bajo, pudiéndose comercializar como dispositivo desechable.

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CUADRO 1. ORDENADORES, INFORMACIÓN, SENSORES Y ACTUADORES La irrupción de los ordenadores en multitud de ámbitos de nuestra sociedad, tan vitales como son los de orden económico, social, político, cultural, artístico y, sobre todo, los de tipo científico y técnico, ha sido vista como una verdadera revolución, y hay quien aventura que tendrá un impacto mayor al que supuso la Revolución Industrial. El ordenador se ha convertido en un centro neural, una especie de ‘cerebro’, que regula, ayuda, calcula, coordina, controla, evalúa, informa, comunica o decide, cada vez más, desde aspectos puntuales cotidianos hasta otros de repercusión y alcance mundiales. De hecho, el ordenador no tan solo asiste al hombre en multitud de tareas –con gran rapidez, fiabilidad, integridad, seguridad o privacidad–, sino que lo sustituye en un gran número de actividades, que hasta hace muy poco eran inimaginables. Los ordenadores empiezan a ser unos “ingenios ubicuos”. Uno de los usos más generalizados de los ordenadores en las sociedades desarrolladas es la gestión de la información, de naturaleza muy diversa, la cual se almacena de forma jerarquizada en base de datos, de fácil acceso y diseminación a través de redes telemáticas de alcance mundial. Nunca antes de ahora, gracias a los ‘cerebros ordenadores y computadores’, no había habido tanta información disponible, fácilmente accesible y bien gestionada. Y también nunca antes de ahora, a su vez, no había habido la necesidad de generar datos de forma continua para que los ‘cerebros electrónicos’ puedan construir sus propios sistemas de información y de conocimiento, y puedan intervenir en un sistema exterior de forma inmediata y eficiente. Debido a la alta velocidad en el procesamiento de los datos que permiten los ordenadores actuales, uno de los pasos limitantes, para que dichos instrumentos puedan tomar decisiones oportunas, más o menos rápidamente, es la forma en que el ordenador adquiere los datos o las señales desde el exterior, que le permitirán reaccionar. Si, por ejemplo, la adquisición de datos se efectúa físicamente de la mano del hombre, de forma más bien lenta, esto imposibilita efectuar reacciones de forma inmediata. En este contexto, hay una demanda creciente de dispositivos que sean capaces de suministrar de forma continua a los ‘cerebros electrónicos’ información del mundo exterior. Es decir, de dotar a los ordenadores de una especie de ‘sentidos’, de unos análogos de la vista, el oído, el tacto, el gusto y el olfato. Dispositivos de este tipo se les conoce con el nombre de sensores. Son muy habituales los sensores de temperatura, presión, aceleración, nivel, caudal, sonido, radiactividad, luz, color, etc. (sensores físicos). Son menos habituales sensores de componentes (sólidos, líquidos o gaseosos) de los sistemas materiales de interés biomédico, ambiental o industrial (sensores químicos), y por esto se están haciendo actualmente muchos esfuerzos de I+D en esta dirección.

Sistema simple de control de un proceso a partir de sensores y actuadores gobernados por un ordenador, con indicación de distintas categorías de actividades informáticas realizadas y de su analogía antropomórfica.

Sin dejar este contexto, el retrato no quedaría completo si no tuviésemos en cuenta que la información percibida de forma continua por el ordenador mediante los distintos tipos de sensores, debidamente procesada, eventualmente con algoritmos de inteligencia artificial, sirve para construir conocimiento, el cual permitirá intervenir en los sistemas materiales de una forma racional, mediante los actuadores (válvulas, motores, bombas, pinzas, articulaciones, brazos, dispensadores, etc.) que, haciendo el papel de unas ‘extremidades’, permiten al ordenador intervenir en su entorno exterior (ver también Cuadro 7).

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CUADRO 2. RECONOCIMIENTO QUÍMICO, BIOLÓGICO Y BIOMIMÉTICO

El componente receptor de un sensor químico transforma selectivamente determinada información química contenida en la muestra en una forma de energía adecuada para ser medida por el transductor (ver § 1 y Cuadro 3). Es conocida la selectividad limitada de la mayoría de las reacciones utilizadas en el análisis químico, lo cual obliga a efectuar unos tratamientos previos a la muestra para separar las posibles interferencias. Por esto sólo han encontrado aplicación un número muy reducido de reacciones analíticas tradicionales como sistemas receptores de los sensores químicos, ya que éstos están diseñados para funcionar en medidas directas, sin tratamiento de la muestra. A partir de los trabajos de Pedersen, Cram y Lehn, que recibieron el premio Nobel en 1988, se abrieron unas grandes expectativas a la química analítica para poder disponer de una gran variedad de reactivos de reconocimiento iónico y molecular. De una forma muy elegante, con procedimiento de arquitectura molecular, se han ido sintetizando reactivos formadores de complejos receptor-analito (host-guest), en donde las especies implicadas se complementan a la vez en forma y dimensiones (geometría) y en grupos enlazantes (energía). Esta complementariedad geométrica y energética es la base del reconocimiento más o menos selectivo de iones y moléculas. Se han sintetizado una gran variedad de moléculas receptoras de cationes (iones metálicos, alcalinos y alcalino-térreos; amonio, bipiridinio, etc.) y, en menor extensión, de aniones (iones haluro, sulfato, fosfato, carboxilato, etc.) o de algunas moléculas neutras (dióxidos de azufre y de carbono, halometanos, hidrocarburos aromáticos, etc.). Estas moléculas receptoras tienen unas topologías muy especiales, con unas cavidades hidrofílicas bidimensionales (como los poliéteres macrocíclicos) o tridimensionales (ligandos macrobicíclicos como los criptandos o los esferandos) o con una cavidades hidrofóbicas (como los ciclofanos, los calixarenos, los cavitandos, los criptofanos o las ciclodextrinas); en definitiva, moléculas que, con el mínimo de cambios en la conformación del receptor, del analito y del solvente, permiten la interacción con el analito a la vez que proporcionan unas barreras estéricas, hidrofóbicas, quirales, etc. que se traducen en una mejora de la selectividad hacia los iones interferentes. Con todo, todo este ingente esfuerzo sólo ha encontrado una aplicación muy parcial aun en el desarrollo y fabricación de sensores químicos. Quizá donde más repercusión ha tenido es en los sensores potenciométricos, en donde la incorporación de moléculas receptoras (ionóforos, se denominan en este campo) como las acabadas de comentar ha permitido la búsqueda de membranas selectivas de iones con mejores prestaciones que las actuales (ver § 2.3.4). A pesar de que se dispone de muchos iónoforos sintéticos para analitos particulares, en algunos casos las mejores membranas selectivas de iones incorporan iónoforos naturales, como es el caso del antibiótico valinomicina, un excelente receptor selectivo de ion potasio, o de algunos derivados lipofílicos de la vitamina B12, buenos reconocedores del ion nitrito. Por otro lado, es conocido que el reconocimiento molecular es la base de la organización y de la comunicación biológicas. La comunicación química entre células y órganos, mediante sistemas moleculares complementarios, es un proceso de vital importancia, responsable de la organización y la protección de los organismos y de la regulación de su metabolismo. Este tipo de biorreconocimiento (ver Cuadro 6), optimizado por la evolución biológica, se ha utilizado para desarrollar los biosensores. En efecto, interacciones entre enzimas y substratos o inhibidores, entre anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y antígenos, entre proteínas receptoras y hormonas o fármacos, entre lectinas y carbohidratos, entre avidina o estreptavidina (proteínas tetraméricas) y la biotina (vitamina B6), entre DNA y DNA complemetario, RNA o proteínas, etc., han dado lugar a distintos sistemas biosensores, algunos de ellos ya implementados comercialmente, especialmente los biosensores enzimáticos y, en menor extensión, los inmunosensores y genosensores (ver Cuadro 6). Últimamente se han sintetizado polímeros que presentan una capacidad de reconocimiento molecular bastante selectivo, y que pueden ser la base de un nuevo tipo de quimiosensores. Para la preparación de dichos polímeros, los procesos de grabado molecular (molecular imprinting) son conceptualmente muy atractivos. Durante el crecimiento polimérico por entrecruzamiento de unos monómeros funcionalizados se generan, con la ayuda de unas moléculas ‘molde’, unas microcavidades de dimensiones y forma específicas , y con una disposición determinada de grupos funcionales en su interior, que reconocen selectivamente al analito (a las moléculas moldes de forma complementaria). Por esto, por su analogía al biorreconocimiento anticuerpo-antígeno, a estos polímeros se les ha denominado ‘anticuerpos de plástico’. Los polímeros grabados molecularmente (en inglés MIP, molecularly imprinted polymers)presentan una serie de ventajas potenciales respecto a los receptores biológicos. Poseen más estabilidad térmica y mecánica. Se pueden esterilizar, y prácticamente no se deterioran con el uso continuado. Su método de preparación permite la obtención de materiales reconocedores biomiméticos de una gran diversidad de estructuras. Además, se pueden fabricar con propiedades ópticas y electroquímicas reproducibles, se pueden procesar en capas delgadas sobre soportes, en forma de membranas o de microesferas porosas. Evidentemente aun presentan importantes limitaciones estos materiales. La principal es su limitada selectividad, lo que de momento hace que solamente tengan una aplicación competitiva como materiales cromatográficos, y que también presentan adsorción inespecífica. Sensores químicos basados en materiales, en procesos de adquisición o de tratamiento de datos o en conceptos inspirados en el mundo biológico, se les conoce con el nombre de sensores biomiméticos (ver Cuadro 5).

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CUADRO 3. TRANSDUCTORES Y SENSORES QUÍMICOS

Dejando de lado la parte receptora del sensor químico, de naturaleza química o biológica, los quimiosensores y los biosensores se acostumbra a clasificarlos según el principio de funcionamiento del su componente transductor. El transductor puede ser más o menos selectivo hacia las señales que provienen de la parte receptora, pero si el receptor es realmente selectivo el transductor no es imperativo que lo sea. En algunos casos las partes receptora y transductora están integradas, formando un mismo componente, por lo que el dispositivo transductor se le considera por sí un sensor químico. En otros casos, para prevenir que lleguen especies interferentes (distintas de las generadas en el proceso de reconocimiento, que son las que transportan información analítica) hacia el transductor, se separa éste del receptor mediante una membrana (separador). Finalmente, el término transductor concierne tanto a un material con unas propiedades determinadas de transducción (por ejemplo, un cristal piezoeléctrico) como a un dispositivo que facilita un tipo de transducción determinada (por ejemplo, un dispositivo de ondas acústicas superficiales). Atendiéndonos, pues, a los principios de transducción, podemos clasificar a los sensores químicos en los siguientes grupos: Sensores electroquímicos. Transforman el efecto de la interacción electroquímica entre el analito y el electrodo en una señal eléctrica útil. Dicho efecto puede estar estimulado eléctricamente o puede ser el resultado de la interacción espontanea (en condiciones de corriente nula). Dispositivos basados en estos principios son los sensores voltamperométricos (electrodos sólidos inertes y electrodos modificados químicamente) o los sensores potenciométricos (electrodos redox, pero especialmente los electrodos selectivos de iones [ver § 2.3 ] y ChemFET (ver § 2.3.8). Sensores ópticos. Transforman cambios de fenómenos ópticos, resultantes de la interacción del analito y el receptor, en señales optoelectrónicas útiles. Las magnitudes más habituales medidas son absorbancia, reflectancia, luminiscencia, fluorescencia, índice de refracción, etc. La aplicación de muchos de estos fenómenos a los sensores químicos ópticos (a veces llamados sensores optoquímicos)se realiza con fibras ópticas en distintas configuraciones. Estos dispositivos también se les denomina algunas veces óptodos. Las fibras ópticas o las guías de onda planas de los dispositivos ópticos integrados son medios transportadores de la radiación y no intervienen en la transducción, que se realiza en la parte modificada de dichas estructuras. Sensores másicos. Transforman un cambio de masa sobre una superficie modificada en un cambio de una propiedad del material transductor piezoeléctrico de soporte. El cambio de masa es causado por la acumulación selectiva del analito. El transductor puede basarse en la propagación de ondas acusticas de volumen o de superficie (dispositivos BAW o SAW, bulk acoustic waves or surface acoustic wave devices). Sensores térmicos. Transforman el efecto calorífico de la interacción entre el analito y el receptor en una señal eléctrica útil. En los sensores catalíticos, el calor de una reacción de combustión o de una reacción enzimática se transduce en una señal eléctrica gracias a un termistor.

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CUADRO 4. INTEGRACIÓN EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

«Integración», según el diccionario, es la acción o el efecto de juntar partes para formar un todo con nuevas propiedades y funciones diferentes a las de las partes constituyentes. La integración es un concepto de gran repercusión en el campo tecnológico. Sólo hace falta recordar lo que ha representado para la Microelectrónica los transistores, los circuitos integrados (IC) i los ordenadores digitales, como paradigma de la integración y de los diferentes niveles jerárquicos que dicha integración produce. De forma análoga pueden ser vistos los sistemas biológicos, en donde sistemas bioquímicos integrados generan les células, las cuales son los bloques de unas estructuras más complejas (los tejidos) que permiten construir unos edificios de una gran variedad formal y funcional (los organismos). El concepto de integración ha sido poco utilizado en Química; quizá más en Ciencia de Materiales. Así, los compósitos son un claro ejemplo de integración de materiales, los cuales, sin perder sus propiedades originales, conforman un material resultante con nuevas propiedades diferentes de los materiales constituyentes por separado. O los sistemas fotoelectroquímicos, en donde la conversión de la energía radiante (la luz solar) en energía eléctrica, mediante un material semiconductor, se aprovecha para provocar simultáneamente reacciones redox que nos permitirán generar productos determinados, por ejemplo, convertir tóxicos ambientales en productos inocuos. Estos dos ejemplos, los compósitos y los sistemas fotoelectroquímicos, son conocidos en inglés como ICS (Integrated Chemical Systems); en este caso, de un nivel bajo de integración. En cambio, un ICS de un nivel alto de integración es una película fotográfica en color instantánea. Pensemos en la distancia conceptual y metodológica existente entre los procesos de revelado fotográfico modernos, usuales en nuestras ciudades, los cuales se llevan a cabo, en un corto espacio de tiempo, mediante grandes y sofisticados aparatos automatizados, basados en procesos químicos “húmedos”, controlados por personal especializado, y el revelado de la película instantánea, basada en procesos químicos “secos”, hecho in situ por el propio usuario. La película instantánea posee un gran número de interfícies y de componentes integrados. Sistemas analíticos integrados Los sistemas analíticos son sistemas químicos que generan información. Esta información se obtiene siguiendo una secuencia de pasos bien establecida, conocida como proceso analítico. Los pasos principales, tanto en la medición como en la calibración, son los siguientes: toma de muestra, transporte, procesamiento de la muestra, separación, reacción, transducción, adquisición y procesamiento de la señal; y en base a dicha secuencia, parcial o completa, se diseñan la mayoría de procedimientos e instrumentación analítica. La integración del proceso analítico es una tendencia constante y un nuevo paradigma de la Química Analítica. Gracias a la integración se pueden implementar nuevos procedimientos e instrumentos analíticos que aportan nuevas perspectivas, por ejemplo, en términos de simplificación, miniaturización, automación, información, rapidez, movilidad y coste de los análisis químicos. Los sistemas analíticos integrados (en inglés, IAS, Integrated Analytical System) son de tipología muy diversa y de diferente nivel de integración. Abarcan desde un sistema analizador de inyección en flujo, que es un aparato de sobremesa que consigue la integración del proceso analítico mediante la supresión de las soluciones de continuidad entre los distintos pasos del mismo, por medio de conexiones a través de flujos continuos no segmentados; hasta los sensores químicos, que son unos pequeños dispositivos que integran esencialmente un material de reconocimiento altamente selectivo con un material transductor, sin solución de continuidad, como es el caso de los biosensores basados en enzimas, anticuerpos o ácidos nucleicos. Sobre este tema el lector puede consultar a S. Alegret, ed., Integrated Analytical Systems, Elsevier, Amsterdam, 2003.

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2 Sensores potenciométricos

Este apartado presenta las bases en que se fundamentan los sensores potenciométricos, como se les designa ahora, aunque desde hace décadas a algunos se les conoce por electrodos selectivos de iones, ESIs. Tomando como punto de partida los principios de la química electroanalítica, se hace un recordatorio de las técnicas potenciométricas para presentar la amplia versatilidad de esta familia de sensores electroquímicos. Se presentan y clasifican los diversos modelos de funcionamiento así como las variantes más actuales, como son las basadas en transistores de efecto de campo (FETs). Se introducen las metodologías habituales de trabajo con sensores potenciométricos, junto con las expresiones y relaciones fundamentales.

2.1 Electroquímica de los sensores potenciométricos

El sensor potenciométrico es aquel en el cual la señal primaria, fruto de la interacción entre analito y elemento de reconocimiento, es un potencial eléctrico. Normalmente, la transducción y medida de este potencial de equilibrio se realiza a intensidad nula y frente a un elemento adicional, el electrodo de referencia. Más recientemente se han desarrollado dispositivos relacionados, como los basados en transistores de efecto de campo (FETs), para los que la transducción es diferente. Para que los sensores potenciométricos tengan una correcta aceptación necesitan un tiempo de respuesta reducido, una selectividad suficiente en medios con diferentes especies y un límite de detección suficientemente bajo. A cambio posibilitan un proceso de medida rápido y simple, en un amplio rango de actividad y no influenciado por el color o turbidez de la muestra. De hecho, la medición efectuada con los sensores potenciométricos se relaciona directamente con la actividad de las especies en disolución, no con la concentración, aunque haya maneras de relacionar ambas. Por ejemplo, para soluciones suficientemente diluidas, es costumbre aproximar actividad con concentración. El primer electrodo selectivo de iones (ESI), descrito hace aproximadamente un siglo, fue el electrodo de vidrio, hoy en día utilizado universalmente para la medida del pH en múltiples tipos de muestra. Actualmente, los modernos ESIs aprovechan lo que fue la revolución de los electrodos selectivos de membrana polimérica, desarrollados a partir de 1970. En los últimos 20 años, el campo de los ESIs ha consolidado el de los sensores potenciométricos, incorporando elementos de tecnologías emergentes, como nuevos

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materiales, elementos biológicos para formar el biosensor, la microelectrónica o nuevos principios de transducción. Paralelamente, la evolución en la química ha aportado mejoras notables en el elemento de reconocimiento, primera etapa funcional del sensor genérico, y de extrema relevancia en la selectividad de éste. Concretamente han sido las aportaciones de la química supramolecular, y los principios de las interacciones receptor/substrato (host/guest) (ver Cuadro 2) lo que ha posibilitado prestaciones todavía no superadas, y una aceptación universal de algunos de los dispositivos desarrollados, como es el caso de la medida de electrolitos en el laboratorio clínico. Por todo ello resulta éste un campo maduro aunque especialmente activo, con aportaciones continuas en cuanto a nuevos materiales selectivos, nuevas aplicaciones y nuevas técnicas, en aproximadamente 200 contribuciones por año en la literatura científica. Desde el punto de vista de la electroquímica, la potenciometría se acostumbra a estudiar a partir de la fuerza electromotriz (fem) generada en una celda galvánica donde una reacción química tiene lugar de forma espontánea, y donde una energía en forma química se interconvierte a una forma eléctrica. La técnica potenciométrica de análisis aprovecha la medida de la fem en una celda potenciométrica para deducir la concentración de especies químicas en una muestra. Para exponer los principios básicos del funcionamiento del sensor potenciométrico, resulta necesario retroceder hasta los conceptos de la celda electroquímica. Estos parten de la situación en que se dispone una barra del metal M o electrodo sumergido en una disolución que contiene los propios iones del metal, Mn+. En esta situación, se establece un equilibrio o reacción química, la cual escrita como una reducción es:

Mn++ ne- M

En estas condiciones, se establece un potencial de electrodo en la interfase metal/disolución, que la termodinámica nos define como:

++

−=−=nn M

o

M

MoanF

RTEaa

nFRTEE 1lnln ( 1)

siendo E el potencial (en V), R la constante del gas ideal, T la temperatura absoluta, Fla constante de Faraday, aMn+ la actividad de los iones del metal en disolución, n el número de electrones involucrados en el proceso, y Eo el potencial normal de electrodo, que es el potencial que corresponde a las condiciones estándar. Para llegar a la forma final se toma aM como la unidad, por tratarse de un sólido. La expresión anterior es una ecuación fundamental en electroquímica, y se conoce como la ecuación de Nernst. Otras

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derivaciones importantes de estas relaciones son, por ejemplo, los fenómenos de corrosión. Si se supone una temperatura de 25C, y se realiza la conversión de logaritmo natural a logaritmo decimal, la ecuación (1) se convierte en:

+

−=nM

oanEE 1log05916.0 ( 2)

Dos semiceldas como las anteriores pueden interconectarse para construir lo que se conoce como celda electroquímica (o pila), la cual se esquematiza en la Figura 2. En estas condiciones ya es posible observar la diferencia de tensión entre ambos electrodos, que dependerá en esencia de los materiales electródicos utilizados y también de la actividad de las especies que intervienen. Esto se transcribe algebraicamente en:

1

22121 log05916.0

M

Mooaa

nEEEEV −−=−=∆ ( 3)

Figura 2. Celda electroquímica (o pila) construida a partir de dos semiceldas metal/ion metálico.

Los principios anteriores no se aplican únicamente a electrodos metálicos en presencia de sus iones. Cualquier par redox electroactivo (y soluble) es capaz de interaccionar con un electrodo metálico inerte, que puede estar construido con un metal noble como puede ser el platino. En estas condiciones, el potencial de semicelda recogido por este electrodo queda definido por:

A

Aoaa

nEE 'log05916.0−= ( 4)

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para una reacción electroquímica:

A + ne- A’ Por ejemplo, una mezcla de iones de hierro en estado de oxidación 2+ y 3+ definen la semireacción:

+−+ →+ 23 FeeFe

a la que le corresponde un potencial redox de electrodo:

+

+−=3

211 log05916.0

Fe

FeoaaEE ( 5)

que se recoge a través de un electrodo de Pt para formar la semicelda correspondiente, como se esquematiza en la Figura 3.

Figura 3. Una semicelda formada por un metal inerte y el par redox Fe(II)/Fe(III).

Para esta semireacción, el potencial de semicelda permite deducir la relación de actividades de las especies que intervienen en la semireacción redox. Para que estos principios tengan una utilidad práctica, todavía es necesario hacer que la medida dependa únicamente de una de las semiceldas, de donde será posible deducir la actividad de una de las especies, o la relación de actividades de las dos formas del par redox según el caso. Esto se verá enseguida. Antes interesa completar las diferentes posibilidades de construcción de una semicelda, tal y como se resume en la Tabla 1.

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Tabla 1. Ejemplos de diferentes alternativas en la construcción de semiceldas electroquímicas.

Tipos de electrodos redox metal inerte primera especie segunda especie tercera especie

Pt en contacto con un par redox soluble

Ag en contacto con iones plata, Ag/Ag+

Ag recubierta de AgCl en contacto con iones cloruro, Ag/AgCl/Cl-

Hg/HgY2-/CaY2-

/Ca2+

Las dos variantes expuestas anteriormente con detalle son conocidas como electrodo de primera especie y como electrodo de metal inerte. A continuación encontramos lo que se conoce como electrodo de segunda especie. Un electrodo de segunda especie está formado por un metal, una sal insoluble del metal, y una disolución que contenga una sal del anión que forma la sal insoluble. Los más habituales son los útiles electrodos de referencia:

(i) el electrodo de Ag/AgCl y (ii) el electrodo de calomelanos, formado por Hg/Hg2Cl2,

ambos necesitando la presencia de iones Cl-.

La reacción electroquímica involucra especies sólidas o insolubles mayoritariamente. Por ejemplo, para el caso del Ag/AgCl, en su ecuación de Nernst únicamente interviene la actividad del ión Cl-:

−− +→+ ClAgeAgCl ss )()(

−−= Clo

AgClAg aEE log05916.0/ ( 6)

y el potencial de la semicelda queda definido únicamente a partir de la actividad del anión en la disolución. El electrodo de tercera especie, que utilizaría dos equilibrios de complejación combinados, actualmente ha perdido cualquier utilidad práctica. Una adaptación ingeniosa del electrodo de segunda especie es la que permite obtener las actividades de las especie de la otra semicelda a partir del potencial de pila. Esta adaptación consiste en utilizar al electrodo de segunda especie como una de las semiceldas, y a utilizarlo en unas condiciones tales que el potencial de semicelda sea constante. Así, el potencial medido depende únicamente de las especies en la primera semicelda. Una condición típica que permite tomar como constante el potencial de semicelda corresponde al limite de solubilidad de la sal utilizada, valor que dependerá

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de un único factor externo, la temperatura. Por tanto, un electrodo de Ag/AgCl o un electrodo de calomelanos, utilizado con una disolución de KCl en saturación (aprox. 3M a 25C) constituye una semicelda con potencial constante, o electrodo de referencia.

Figura 4. Electrodo de referencia de Ag/AgCl.

Así pues, según lo especificado, la celda electroquímica se adapta para construir la celda potenciométrica, que es la que permitirá deducir la actividad del ión principal de la segunda semicelda (por ejemplo, de primera especie), y por tanto formará el antecedente del sensor químico.

+

+

+=−−=−=∆ nn

MREFM

oREF anKEanEEEV log05916.01log05916.0

11 ( 7)

Figura 5. La celda potenciométrica que utiliza un electrodo de referencia y un electrodo metálico permite deducir la relación de actividades que intervienen en la semireacción.

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2.1.1 Puente salino En las mediciones potenciométricas existe un problema fundamental que tiene como origen los elementos de contacto entre las semiceldas que forman la celda potenciométrica. Resulta que en la interfase entre cada semicelda y el puente salino (que se encuentra de momento incorporado en el electrodo de referencia) se establece una pequeña diferencia de potencial (que puede alcanzar varias decenas de mV), el potencial de unión líquida, Eul, que se adiciona al potencial de celda:

ulREF EEEV +−=∆ 1 ( 8)

El valor del potencial de unión líquida no es posible predecirlo con exactitud, aunque es posible trabajar en condiciones en que su valor sea pequeño y constante. Para justificar cuales son dichas condiciones se puede considerar el caso simplificado del contacto entre una disolución de una sal, por ejemplo NaCl, y agua destilada. En esta situación se produce una difusión de los iones hacia el agua destilada, pero por la naturaleza física de cada ión, su velocidad de difusión será diferente. Cada ión, Na+ o Cl-, se difundirá en proporción a su movilidad característica en el interior del puente salino. Y es esta diferencia de velocidad la que causa una separación de cargas a lo largo del trayecto de difusión, la cual se traduce en una diferencia de potencial, el potencial de unión líquida. Las recomendaciones para hacer que este fenómeno tenga un efecto mínimo son de dos tipos. Por una parte conviene utilizar sales en las que las especies iónicas tengan una movilidad lo más parecida posible. Este es el motivo de que determinadas sales, por ejemplo KCl, K2SO4, NH4NO3, o acetato de litio, sean de uso frecuente en estudios electroquímicos. El segundo factor es el de las características geométricas de la unión líquida, donde cada usuario o fabricante aporta su experiencia, y donde es importante que un (muy) pequeño flujo de electrolito esté asegurado. Para un cálculo teórico de la magnitud del potencial de unión líquida es posible utilizar la ecuación de Henderson, cuya derivación se encuentra en los tratados de electroquímica. Esta ecuación establece, asumiendo actividades iguales a concentración:

)()(log)()(

)()(·05916.0 '2

'2

'1

'1

'2

'2

'1

'1

2211VUVU

VUVUVUVUEul +

++−+−−−= ( 9)

y en ésta:

)()()()(

'1

'1

11

−−−+++

−−++

Σ=Σ=Σ=Σ=

uzCVuzCUuCVuCU ( 10)

donde C indica concentración, u la movilidad iónica, z la carga del ión, el subíndice + y– al catión y anión respectivamente y los subíndices 1 y 2 se refieren a las dos regiones diferenciadas entre las cuales se establece la unión líquida.

15

2.2 Potencial de membrana

El sensor potenciométrico por excelencia basa su funcionamiento en una derivación de los principios expuestos en el apartado anterior, que parte del fenómeno conocido como pila de concentración. Resulta que dos semiceldas idénticas, pero en las que haya diferencias en la actividad de los iones que intervienen en la ecuación de Nernst, presentarán una diferencia de potencial, traducción de la tendencia a igualar las actividades en ambos compartimentos. La modificación adicional resulta de utilizar como puente salino un material, la membrana permselectiva, que es permeable únicamente a una de las especies que se encuentran en el medio iónico. En estas condiciones, el hecho de que no se pueda alcanzar la neutralidad eléctrica por el hecho de que se difunde un ión pero no el de carga contraria, hace aparecer un potencial estable, el potencial de membrana, que depende únicamente de la carga del ión implicado (z) y de la diferencia de actividades a ambos lados de la membrana:

1

2log05916.0aa

zV −=∆ ( 11)

Figura 6. Ejemplo de potencial de membrana, fruto de interconectar dos semiceldas Ag/AgCl con actividades diferentes de ión principal (a1 y a2) aambos lados de una membrana selectiva.

Para visualizar como el sensor potenciométrico moderno se construye a partir del montaje anterior, sólo es necesario especificar que la disolución de la izquierda, con actividad a1 de la especie en cuestión, sea la muestra, y que el conjunto de membrana permselectiva, disolución con actividad a2 constante y segundo electrodo Ag/AgCl forma el electrodo selectivo de iones (ESI), y que el primer electrodo Ag/AgCl será el electrodo de referencia.

16

En las condiciones especificadas, el potencial medido depende básicamente de la actividad a1que presente el ión involucrado en la muestra problema,

1log05916.0 azKV +=∆ ( 12)

Por lo que se dispone ya de un montaje experimental capaz de suministrar la actividad de una especie analito en una muestra. El electrodo selectivo de iones (ESI) o sensor potenciométrico puede tomar ahora un diseño más práctico, como esquematiza la Figura 7. Generalizando a un ESI modelo, en éste distinguiremos las partes siguientes:

(i) membrana selectiva, a un único ión, que se conoce por ión principal, o en su defecto, a un grupo de iones similares;

(ii) electrodo de referencia interna, por ejemplo de Ag/AgCl; y (iii) solución de referencia interna, la cual contiene el ión necesario para

establecer el potencial del electrodo de referencia interna, normalmente Cl-, junto con el ión en cuestión para establecer el valor de actividad a2de la membrana permselectiva.

Figura 7. Electrodo selectivo de iones (ESI), donde se resalta el electrodo de referencia interna, la solución de referencia interna y la membrana permselectiva.

Un ejemplo común de ESI o sensor potenciométrico es el electrodo de vidrio, comúnmente utilizado para la medida del pH. En él, la membrana selectiva es una fina pared de vidrio hidratado, que separa dos disoluciones a distinto pH: la interna con actividad constante y la de la muestra de actividad desconocida. Desde el punto de vista conceptual del sensor, el ESI tiene su elemento de reconocimiento implementado en la química selectiva que logra hacer permselectiva la

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membrana. Es decir, será una reacción química de reconocimiento, que normalmente implica un reactivo inmovilizado e integrado en la membrana, la que consigue la selectividad. El lugar físico donde ocurre este reconocimiento es en la interfase muestra/membrana. La transducción no resulta ser tan clara, ya que se reparte en diferentes puntos. El potencial inicial, el potencial de membrana, aparece simultáneo al reconocimiento, y físicamente se adscribe a la membrana permselectiva. Así pues, en el mismo punto físico tienen lugar los dos procesos, reconocimiento y transducción. Este potencial de membrana es trasladado al exterior interponiendo una semicelda en serie, como es el electrodo de referencia interna, y una vez recogido en el terminal metálico ya está disponible para la medida. Con otras palabras, el electrodo de referencia interna viene a ser un contacto líquido que nos une termodinámicamente la membrana (conductor iónico) con el electrodo metálico (conductor electrónico):

membrana | solución interna | electrodo Existe también la posibilidad de conectar la membrana con el electrodo o transductor interno sin solución de continuidad:

membrana | electrodo Esta configuración se la denomina all-solid-state o de contacto interno sólido. Este es el caso de los conocidos electrodos de hilo recubierto y también de los ChemFETs (ver §2.3.8) Una precaución habitual es la de utilizar el electrodo de referencia con una disolución de su ión a saturación, para lo que sólo es necesario interponer un puente salino entre ésta y la muestra problema. La celda potenciométrica queda ahora en la configuración habitual de la técnica potenciométrica de análisis, que se esquematiza en la Figura 8.

Figura 8. Celda potenciométrica preparada para la determinación de una actividad problema en una muestra.

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2.3 Los diferentes sensores potenciométricos

2.3.1 Una primera clasificación Según los principios expuestos anteriormente, un moderno sensor potenciométrico tiene como elemento clave una membrana selectiva a un ión, que interesa que muestre la mayor selectividad posible para la especie que se mide. Esta membrana formará parte de una celda electroquímica junto con la muestra en el momento de la medida, y presupone que utiliza en la cara interna una segunda disolución con una actividad constante de la especie de interés. Como veremos, hay simplificaciones que permiten prescindir de este último condicionante experimental. A lo largo de la evolución de los sensores potenciométricos (que tienen una edad cercana al siglo) se ha producido una notable actividad en la búsqueda de materiales de los que explotar su selectividad en diferentes formatos y matrices, de materiales potencialmente utilizables como membranas potenciométricas. En este apartado tomaremos la clasificación que realiza la International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) de los electrodos selectivos de iones, que los distingue en función de la naturaleza de la membrana selectiva, tal y como recoge la Tabla 2. En los siguientes apartados se presentarán y discutirán los diferentes tipos así como ejemplos significativos de cada uno.

Tabla 2. Clasificación IUPAC de los electrodos selectivos de iones según el tipo de membrana que utilizan.

Electrodos selectivos de iones (ESIs) Primarios

Cristalinos No cristalinos

Compuestos

membrana homogénea

membrana heterogénea

matriz rígida portador móvil sensibles a gases

de substrato enzimático

2.3.2 Electrodos cristalinos Los electrodos cristalinos contienen unos sitios fijos cargados de un signo, e iones móviles de carga opuesta. El material que permite esta funcionalidad es el de formas cristalinas de ciertas sales inorgánicas, que tienen la propiedad de ser conductores iónicos a temperatura ambiente. Las membranas basadas en elementos cristalinos pueden utilizar un único compuesto, por ejemplo el LaF3 o Ag2S, o mezclas

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homogéneas de diversos componentes. Algunos ejemplos de éstas se resumen en la Tabla 3. Estas formas cristalinas pueden ser incorporadas junto con un elemento aglutinante o cemento inerte, y en ese caso reciben la clasificación de membranas cristalinas heterogéneas. Un ejemplo corriente es la incorporación de sulfuros metálicos en matrices poliméricas. El fenómeno responsable del reconocimiento se debe al intercambio entre la disolución y la superficie del cristal iónico. El transporte de carga a lo largo del cristal es posible gracias a la movilidad de los defectos de la estructura cristalina, de forma análoga a los huecos en un semiconductor.

Tabla 3. Ejemplos de membranas cristalinas homogéneas

Membranas cristalinas homogéneas Ion primario Material Interferencias

F-

Ag+, S2-

I-

Cu2+

LaF3 dopado con EuF2

Ag2SAgI Ag2S+CuS

OH-

Hg2+ CN-, S2-

Pb2+, Hg2+

Figura 9. El electrodo selectivo a ión fluoruro, que encuentra aplicación en la potabilización de aguas, donde es usual la fluoración.

El ESI de mayor aceptación ha sido el de ión fluoruro, que utiliza como membrana un monocristal de LaF3, como se esquematiza en la Figura 9. Para mejorar la conductividad iónica se utiliza un cristal de LaF3 dopado con EuF2 que incorpora defectos de fluoruro en la red cristalina. Este monocristal, en forma de un disco fino, se

20

utiliza como membrana que separa la muestra de una solución interna que es mezcla de NaF (para definir la actividad a2 del ión principal) y NaCl (para definir el potencial del electrodo interno de Ag/AgCl). La única limitación en el uso de este sensor es restringir el valor de pH de la muestra a valores no muy ácidos, para evitar la formación de HF, ni muy básicos, que alteren el monocristal de fluoruro de lantano. Otro ejemplo importante de sal inorgánica con propiedades de conductor iónico es el sulfuro de plata (Ag2S). Este material puede formar un monocristal, pero es posible utilizarlo en una forma especialmente conveniente, como es la de disco sinterizado. El Ag2S en polvo finamente dividido funde en un disco fino al ser presionado en una prensa hidráulica como las utilizadas en espectroscopia IR (aprox. a 25.000 kg/cm2). Este tipo de sensores se pueden construir con una configuración especialmente robusta como es la que sustituye al electrodo de referencia interna por un contacto óhmico interno, tal y como esquematiza la Figura 10. De esta manera se consiguen dispositivos especialmente compactos y robustos, también llamados sensores all-solid-state. Una propiedad adicional significativa de esta variante, es que los discos preparados con mezclas de Ag2S y otras sales presentan respuesta a los nuevos iones incorporados. Debido a la baja conductividad de sales como AgBr, AgCl o CuS, las membranas respectivas se preparan como mezclas junto con Ag2S. De esta manera se obtienen sensores para Cl- a partir de mezclas Ag2S y AgCl, o sensores para iones metálicos, como Cu2+, incorporando el nuevo sulfuro metálico en la mezcla que sinteriza.

Figura 10. ESI de membrana de estado sólido con contacto óhmico interno formado por una resina epoxídica conductora con base de Ag.

Esta misma familia de materiales puede ser incorporada, en forma finamente dividida, en una matriz plástica inerte que ejerza una función aglutinante o de cemento (en proporción aproximada del 50%) como puede ser silicona o resina epoxídica. En este caso se consigue una membrana heterogénea, como las resumidas a modo de ejemplo en la Tabla 4. Los sensores así construidos presentan como ventaja una gran robustez y flexibilidad en el diseño.

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Tabla 4. Ejemplos de membranas cristalinas heterogéneas

Membranas cristalinas heterogéneas Ion primario Material

CN-

Cl-Ag2S + AgI en matriz de PVC Ag2S + AgCl en resina epoxídica

2.3.3 Electrodos no cristalinos El sensor potenciométrico no cristalino implica el uso de una membrana selectiva formada a partir de una matriz de soporte que aloja sitios activos capaces de coordinar con el analito de la muestra en la interfase membrana/disolución. Hay múltiples soportes que pueden ser utilizados, pero pueden clasificarse en los macroporosos (un filtro de nylon) y en los no porosos (un vidrio o un material polimérico inerte como pueda ser el PVC). Esta clasificación da lugar a dos tipos muy diferentes de sensores, los de matriz rígida, cuyo ejemplo es el que utiliza membrana de vidrio, y los de portador móvil, donde se incluyen los modernos sensores de membrana polimérica, que se tratan en el apartado 2.3.4.

Electrodos de matriz rígida – Electrodo de vidrio El electrodo de vidrio, comúnmente utilizado para la medida del pH, es el ejemplo más exitoso de sensor potenciométrico, el cual es disponible comercialmente desde la década de 1930. En realidad fue el primer ESI desarrollado, y las primeras observaciones de su respuesta en relación con el pH datan de 1906. El principio de funcionamiento aprovecha las propiedades de permselectividad de una fina membrana (< 1 mm) de vidrio. El vidrio es en realidad un sólido amorfo formado por una red de silicatos cristalinos subenfriados, que muestran permeabilidad a H+, Na+ y K+ por interacción con los sitios fijos SiO- del vidrio. El principio de funcionamiento se basa en el intercambio de protones e iones sodio por parte de una capa hidratada de silicato, capa que tiene un grosor de unos 100 nm.

R-SiO-·Na+(vidrio) + H+ R-SiO-·H+(vidrio) + Na+

Este intercambio de iones Na+ en la matriz del vidrio depende del pH de la disolución, y es esta la propiedad más interesante, aunque todo electrodo de vidrio posee una respuesta residual a sodio, conocido como error de sodio, que se manifiesta especialmente para los valores más altos de pH. Otra característica de las membranas de vidrio es su alta resistencia, en el rango de los MΩ, lo cual impone condiciones

22

especiales en la medición de su potencial de membrana. Formulando vidrios con diferentes proporciones de SiO2, Al2O3 y Na2O se consiguen electrodos de vidrio selectivos a Na+, K+ o Li+.

Actualmente, la forma comercial más corriente de este dispositivo es la de dos electrodos combinados en un mismo cuerpo, el ESI de pH y el electrodo de referencia, el cual se le conoce como “electrodo combinado para la medida del pH” y se esquematiza en la Figura 11.

Figura 11. Un diseño típico de un electrodo combinado de vidrio para la medida de pH.

2.3.4 Electrodos de portador móvil Aunque esta es una subdivisión de los electrodos no cristalinos, representa una familia de sensores muy significativa en la actualidad y que ha permitido al sensor potenciométrico una aplicación casi universal. Esto se debe a que utiliza unos principios generales aplicables a multitud de especies, a diferencia de las familias anteriores donde fenómenos específicos son los que permiten disponer de membranas selectivas, tal y como ya ha sido expuesto. El electrodo de portador móvil extrae sus principios de funcionamiento a partir de las reacciones de complejación en dos fases. En éstas se utiliza un disolvente orgánico inmiscible con agua que disuelve un agente capaz de interaccionar con el ión principal, normalmente mediante una reacción de formación de complejos. Es esta reacción la que otorga las propiedades de conducción iónica, y la que permite lograr una elevada selectividad. En su diseño original, que no el que se utiliza actualmente, traslada los principios citados a un cuerpo de electrodo, utilizando un material poroso que actúe de soporte del reactivo disuelto en un disolvente orgánico de viscosidad apropiada. Este diseño se muestra en la Figura 12.

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Figura 12. El concepto de ESI de membrana líquida, antecesor del electrodo de membrana polimérica.

El diseño anterior fue adaptado hacia 1970 en el País de Gales por J.D.R.Thomas, donde utilizó un soporte polimérico de PVC plastificado con el mismo disolvente orgánico que contiene al portador móvil, también conocido como ionóforo. Esta configuración utiliza la reacción de intercambio citada pero inmovilizada en una membrana plástica, homogénea, elástica pero consistente, que da unas perfectas características de robustez y estabilidad de respuesta. Como razón de éxito hay que mencionar que se mantienen las características de respuesta del ESI de membrana líquida, y que sus principios generales son extrapolables a multitud de reacciones químicas diferentes para el reconocimiento. La composición típica de una de estas membranas poliméricas de matriz de PVC se basa en una pequeña cantidad de ionóforo disuelto en el disolvente orgánico (o plastificante), y éstos embebidos en una cantidad de polímero que suministra unas mínimas prestaciones mecánicas. La composición típica de la formulación de una de estas membranas poliméricas de portador móvil se muestran en la Figura 13. En situaciones especiales se incorpora a la composición una pequeña proporción de aditivos que tienen por objeto mejorar las características de respuesta. El procedimiento general para preparar una de estas membranas consiste en disolver el elemento electroactivo junto con el plastificante, y mezclar estos con prepolímero de PVC y un diluyente volátil, como el tetrahidrofurano. Una vez se logra una disolución homogénea, o “cóctel sensor”, se prepara una membrana por vaciado en un molde, donde tiene lugar la evaporación del componente volátil (el tetrahidrofurano) y como resultado se obtiene una fina película de polímero. Este proceso puede realizarse sobre lo que será el propio sensor potenciométrico, o bien, puede separarse una sección circular (membrana) de la película evaporada, que a continuación se monta sobre un soporte cilíndrico para formar el ESI. La Figura 14 muestra el diseño de un ESI de membrana polimérica así construido.

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Figura 13. Típica distribución de componentes en una membrana polimérica de PVC de portador móvil.

Figura 14. Esquema de un sensor potenciométrico que utiliza una membrana polimérica con portador móvil (a) con contacto interno líquido – la configuración convencional – y (b) con contacto interno sólido (configuración all-solid-state).

En la descripción de los ESIs de membrana polimérica falta por describir la naturaleza de los elementos portadores, que serán los que suministren la interacción con el ión principal presente en la muestra. Normalmente se trata de elementos hidrofóbicos, que son solubles en la fase membrana y que se transfieren a la fase acuosa. En su presentación se sigue la recomendación establecida por la IUPAC (Tabla 5), que distingue la carga del portador, según posea éste carga positiva e interaccione con aniones, carga negativa e interaccione con cationes, se trate de un portador neutro, o un par iónico de dos elementos lipofílicos, que puede interaccionar con ambos.

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Tabla 5. Diferentes posibilidades en el elemento electroactivo en ESIs de portador móvil.

Electrodos de portador móvil cargado positivamente

cargado negativamente

neutro par iónico hidrofóbico

Membranas selectivas de portador móvil cargado

Portador catiónico: membranas selectivas a aniones En este caso, el elemento electroactivo es un intercambiador iónico (por ejemplo, ión amonio cuaternario) y un anión, orgánico o inorgánico. En esta situación se da la reacción de intercambio mostrada a continuación, en lo que seria un reconocimiento de la especie Y-.

R4N+·X- (membrana) + Y- R4N+·Y- (membrana)+ X-

La selectividad de un sistema de membrana de esta naturaleza está determinada por las propiedades del disolvente utilizado en la membrana, para el cual se establece una relación que depende de la lipofilicidad del anión considerado. Así pues, el sistema anterior muestra un patrón de selectividad fijado, conocido como serie de Hofmeister:

R- > ClO4- > I- > NO3- > Br- > Cl- > HCO3- > CH3COO- > SO42-

De esta manera, los ESIs construidos con estos elementos mostraran una respuesta preferente por aniones orgánicos voluminosos (por ejemplo salicilato), o lo que es equivalente, será prácticamente imposible disponer de sensores suficientemente selectivos para especies del final de la serie (por ejemplo sulfato). Algunos elementos electroactivos diferentes son los que se basan en aniones complejos metálicos, como los complejos de níquel, que se utilizan como portadores para ión nitrato.

Portador aniónico: membranas selectivas a cationes El mismo principio del agente intercambiador se puede utilizar para interaccionar con cationes, por ejemplo de una misma familia. Un intercambiador aniónico hidrofóbico, por ejemplo con un grupo sulfónico, o el anión tetrafenilborato, presentará un patrón de selectividad también fijado por la relación de volumen del catión, que por ejemplo para la familia de los iones alcalinos es:

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R4N+ > Cs+ > Rb+ > K+ > Na+ > Li+

Algunos reactivos concretos han encontrado utilidad para iones específicos, como sucede con esteres orgánicos del ácido fosfórico. Así pues, una formulación optimizada para detectar calcio utiliza bis(p-tetrametilbutil)fenilfosfato de calcio como ionóforo, y dioctilfenilfosfonato como plastificante.

Par iónico hidrofóbico Una situación singular utiliza como elemento electroactivo un par iónico cuyos catión y anión son ambos hidrofóbicos. En este caso, el sensor resultante presenta respuesta, tanto al anión, como al catión. Este principio se utiliza para construir sensores para detergentes, por ejemplo a partir de dodecilsulfato de cetiltrimetilamonio, o para principios farmacéuticos, formando par iónico con el anión tetrafenilborato. Estos dispositivos, dado que el ión principal es voluminoso y altamente lipofílico, permitirán la determinación de los iones principales aún en presencia de altos niveles de iones inorgánicos. La Tabla 6 resume algunas aplicaciones del uso de portador móvil cargado en la construcción de ESIs de membrana polimérica.

Tabla 6. Algunos ejemplos de electrodos de portador móvil cargado

Variantes en electrodos de portador móvil cargado Ión principal Elemento de reconocimiento

Portador catiónico Cl-

NO3-

Portador aniónico Ca2+ Zn2+

Par iónico detergentes aniónicos efedrina

cloruro de hexadeciltrimetilamonio nitrato de tris(difenil-1,10-fenantrolina) níquel(II)

bis(p-tetrametilbutil)fenilfosfato de calcio di-n-octil-fenilfosfato de zinc

par iónico dodecilsulfato de cetiltrimetilamonio par iónico tetrafenilborato de efedrina

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Membranas selectivas de portador móvil neutro

La variante que ha permitido una mayor versatilidad en la formulación de membranas poliméricas es la que utiliza portadores móviles no cargados. Estas membranas usan agentes formadores de complejos como éteres corona, compuestos macrocíclicos o antibióticos ionofóricos, y para aniones, agentes formadores de aductos, como algunos compuestos organoestánnicos o algunas porfirinas. En el poder de reconocimiento para iones específicos intervienen los principios de la química supramolecular receptor/substrato (host/guest), en los que se necesita una disposición espacial o geometría predeterminada junto con una complementariedad dimensional con la especie principal (ver cuadro 2). Estos principios logran romper el patrón de selectividad marcado por las series de Hofmeister, un objetivo largamente ansiado en el desarrollo de elementos para el reconocimiento de iones. La Tabla 7 resume algunos ejemplos significativos del uso de portadores neutros en membranas potenciométricas. Una de las formulaciones mas estudiadas es la que utiliza el antibiótico natural valinomicina para construir sensores para potasio, base de prácticamente la totalidad de las medidas de este ión que se realizan actualmente en los laboratorios clínicos. El complejo que resulta de dicha interacción se muestra en la Figura 15 e ilustra el origen etimológico del nombre que recibe, por su capacidad de enmascarar al ión cargado y así permitir su paso a través de las membranas celulares, que son esencialmente lipófilas.

O

OHN

O

NH

O

O

OO

O

NH

NH

O

OO

NH

ONH

OO

O

O

O

OK+

Figura 15. Complejo de inclusión formado por la valinomicina con el ión potasio. La estructura 3D real se repliega sobre el ión, ocultándolo del medio en que se encuentre.

Es conveniente representar en forma de reacción química los procesos que tienen lugar durante el reconocimiento del ión potasio en solución acuosa:

V(membrana) + K+ VK+ (membrana) siendo V el portador neutro (o ionóforo) valinomicina. Al reparar en el balance eléctrico se detecta un desequilibrio de éste, ya que se estarían incorporando cargas al interior de la fase membrana. Este fenómeno tiene que quedar compensado con los contraiones correspondientes, que pueden ser impurezas aniónicas en el polímero, aunque

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frecuentemente se incorporan aditivos en la formulación de la membrana para compensarlo. Estos aditivos son especies lipofílicas aniónicas, normalmente derivados del tetrafenilborato, siendo el más utilizado el tetrakis(p-clorofenil)borato potásico y se utilizan en una proporción entre el 10/50% en fracción molar respecto al ionóforo. Actualmente se disponen de portadores neutros para numerosos cationes, y también para algunos aniones. Algunos de los plastificantes utilizados en estas membranas son el sebacato de dioctilo, fosfato de dioctilo, ftalato de dioctilo, adipato de bis(1-butilpentilo) o 2-nitrofeniloctiléter. La firma Fluka (Buchs, Suiza) dispone de un completo catálogo comercial de componentes para formulación de membranas de portador móvil. Muchos de estos, etiquetados con un número precedido de ETH, han sido desarrollados en el instituto Eidgenössische Technische Hochschule (ETH) de Zürich, donde W.Simon fue pionero en el uso de los portadores móviles neutros.

Tabla 7. Algunos ESI de membrana polimérica basados en portador móvil neutro.

Ejemplos de electrodos de membrana con ionóforos neutros Ión principal Ionóforo

pH K+

NH4+

Na+

Li+

Ca2+ Cl-

tri-n-dodecilamina valinomicina nonactina cálix[4]:tetrametoxietil éster derivado del 12-corona-4 ionóforo ETH1001 trioctilestaño

2.3.5 Electrodos selectivos miniaturizados Con relación a la sección anterior, dedicada a los sensores que utilizan membrana polimérica, es necesario mencionar los esfuerzos y la posibilidad de miniaturizar dichos dispositivos, lo que les faculta para ser utilizados en estudios in vitro del campo microbiológico o celular. La primera estrategia reemplaza la solución interna de referencia por un contacto óhmico interno. Una variante interesante es la configuración de hilo recubierto (coated wire), aunque ha sido cuestionada en cuanto a la reproducibilidad que se consigue con ella. En esta configuración se aplica el material de la membrana (cóctel sensor) directamente sobre un alambre o hilo conductor, que puede ser de Pt, Ag, o simplemente Cu (Figura 16). Esta configuración no utiliza electrodo de referencia interna, lo que posibilita aplicaciones especialmente simples y económicas, como las de

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“usar y tirar”. El mayor impedimento, es que al faltar la disolución de “referencia”, el potencial no está termodinámicamente definido. Como ventaja importante se tiene la posibilidad de fabricarlos en cualquier diseño y tamaño. Una segunda estrategia de acceder a espacios reducidos simplemente miniaturiza el electrodo de membrana polimérica (o incluso el de membrana líquida) hasta el límite practicable, lográndose puntas sensoras inferiores a 10 µm, como muestra la Figura 17. Con dispositivos de este tipo se posibilita el estudio de procesos biológicos a nivel tisular o incluso celular.

Figura 16. Un electrodo de hilo recubierto, que deposita la membrana polimérica sobre un contacto metálico.

Figura 17. Esquema de un micro-electrodo de membrana polimérica.

2.3.6 Electrodos sensibles a gases Los electrodos sensibles a gases son ejemplos de ESI compuesto o modificado, ya que utiliza dos membranas, una la selectiva, y otra permeable a gases pero capaz de contener líquidos. Este tipo de ESI conviene introducirlo ahora por su interrelación con el electrodo de vidrio. Otro tipo significativo de ESI compuesto es el biosensor potenciométrico, que será expuesto en el apartado siguiente y más adelante en § 4.1.1. En esencia, los electrodos sensibles a gases utilizan un diseño común, conocido como configuración Severinghaus. Un electrodo convencional está en contacto con una disolución apropiada, que a su vez se encuentra en contacto con la muestra a través de una membrana permeable a gases. Estos dispositivos responden a especies que tengan una forma gaseosa, y que por tanto, puedan difundirse desde la muestra al compartimiento separado, donde son detectados de forma indirecta por el electrodo interno. A modo de ejemplo, la Figura 18 muestra el electrodo de NH3, el cual funciona

30

según el principio expuesto. Para la medida, se alcaliniza la muestra, de forma que se consigue la formación de NH3 gas a partir del ión NH4+ presente. Este gas NH3 puede atravesar ahora la membrana permeable a gases, y equilibrarse en la disolución interna. El gas NH3, debido a sus propiedades de base, alcaliniza la disolución de recogida, fenómeno que es detectado por el electrodo de vidrio interno. De esta manera se logra una respuesta que está relacionada con la actividad amoniacal inicial en la muestra. Con este mismo principio es posible la detección de otras especies que tengan una forma gaseosa con propiedades ácido-base, como pueden ser el CO2 y SO2. También es posible utilizar electrodos internos de diferente naturaleza, según la aplicación final buscada. Algunas de estas aplicaciones se han resumido en la Tabla 8.

Figura 18. Un electrodo de amoníaco como muestra de electrodo sensible a gases.

Tabla 8. Algunos ejemplos de electrodos sensibles a gases

Electrodos sensibles a gases (configuración Severinghaus) Sensible al Gas Reacción interna Electrodo interno

CO2

SO2

NH3

H2SHCN

CO2 + H2O → HCO3- + H+

SO2 + H2O → HSO3- + H+

NH3 + H2O → NH4+ + OH-

H2S → S2- + 2H+

Ag(CN)2- → Ag+ + 2 CN-

pH pH pH Ag2SAg/Ag+

31

2.3.7 Biosensores potenciométricos Es posible adaptar el sensor potenciométrico como biosensor, simplemente aportando la especificidad de una enzima para el reconocimiento del ión principal. Normalmente, una enzima no será un buen elemento electroactivo potenciométrico, es decir no actúa como portador. La manera de acoplar los dos principios es combinando la reacción enzimática con la detección potenciométrica, en un dispositivo compuesto, o en etapas. En este diseño se determina un substrato enzimático, que reacciona con la enzima en una primera etapa, y en una segunda, los productos de la reacción enzimática son detectados gracias al uso de un sensor potenciométrico. La Figura 19 esquematiza como disponer de un montaje para conseguir este objetivo, si el resultado de la reacción enzimática es un producto con propiedades ácido-base, ya que el sensor utilizado es un electrodo de vidrio. Para la inmovilización de la capa enzimática existen diversas posibilidades, como el uso de una membrana de diálisis, o también la formación de una capa de gel que contenga a la enzima, por ejemplo, utilizando poliacrilamida. Estos sensores muestran una gran selectividad aportada por la reacción enzimática, pero con el defecto de una velocidad de respuesta reducida, que está causada por las necesidades de difusión de substrato y producto.

Figura 19. Un biosensor potenciométrico de substrato enzimático.

Como ejemplo de esta combinación se puede mencionar un biosensor de penicilina, que utiliza penicilinasa y un sencillo seguimiento de variaciones de pH:

+ H+N

S

COO-

CNH

O

RCH2

O

+ H2Openicilinasa

NS

COO-

CNHRCH2

O

OOCH

penicilina acido peniciloico

32

Otras reacciones enzimáticas pueden utilizar la medida de otras especies, como por ejemplo la medida de NH4+ para un biosensor de urea que utilice ureasa. Aunque los productos de la hidrólisis enzimática presentan propiedades ácido-base, es mucho más conveniente un funcionamiento en el pH óptimo de la enzima y la detección de productos específicos resultantes, que pueden ser tanto el ión amonio como el carbonato (o también CO2).

+ 2-ureasaCO

NH2H2N + 2H2O 2 NH4 + CO3

Estas posibilidades, junto con ejemplos adicionales, se muestran en la Tabla 9. Un caso singular es el sensor de amigdalina. Ésta es un carbohidrato cianogénico, capaz de producir ácido cianhídrico tóxico durante su hidrólisis, y se presenta en variedades de determinados vegetales o semillas de frutas, como en el caso de las almendras amargas. El biosensor de amigdalina incorpora una capa enzimática basada en β-glucosidasa capaz de realizar la hidrólisis mencionada, y un simple sensor potenciométrico de cianuro, como los especificados en § 2.3.2 para una detección rápida de las variedades mencionadas. Alternativamente, también existe la posibilidad de utilizar sensores potenciométricos recubiertos de una enzima determinada para detectar un inhibidor. Entre diversos ejemplos destaca la detección de metales pesados a muy bajos niveles de concentración por interacción con diversas enzimas, uno de ellas la ureasa.

Tabla 9. Algunos ejemplos de biosensores enzimáticos potenciométricos

Electrodos de substrato enzimático Especie Enzima Electrodo interno

Urea Penicilina Glucosa Amigdalina L-Arginina

Ureasa Penicilinasa Glucosa Oxidasa β-Glucosidasa Arginina descarboxilasa

NH4+

pH I-

CN-

CO2

Una ampliación de lo comentado hasta ahora sobre los biosensores potenciométricos se encuentra en el capítulo 4, dedicado específicamente a los biosensores electroquímicos (ver § 4.1.1)

33

2.3.8 Sensores potenciométricos basados en FETs Estos dispositivos se obtienen a partir de la tecnología de estado sólido, en una adaptación del transistor de efecto de campo (FET) para la obtención de un sensor químico. Sus ventajas residen en sus reducidas dimensiones y en la posibilidad de ser fabricados en paralelo por millares, utilizando las técnicas fotolitográficas planares de la industria de los semiconductores. Un transistor de efecto de campo metal-óxido-semiconductor (MOSFET) tiene un funcionamiento que se esquematiza en la Figura 20. Su operación implica la aplicación de una tensión, tensión de drenaje, entre los terminales drenaje y fuente. Como esta tensión encuentra uniones p-n polarizadas inversamente, no se establece paso de corriente. Este dispositivo dispone de un tercer terminal, el terminal de puerta, el cual se encuentra aislado del semiconductor. Cuando se aplica un potencial suficientemente positivo a través este terminal de puerta, ocurre el “efecto de campo”, en el que los portadores de carga positivos del semiconductor p son repelidos por el campo aplicado, de forma que llega a establecerse un canal de conducción entre los terminales principales y una corriente fluye entre drenaje y fuente. De forma esquemática, la intensidad que circula (iD) crece con el potencial de puerta (VP) una vez superado un valor mínimo o tensión umbral, VU

21 )(· UPD VVKi −= ( 13)

El sensor ISFET (acrónimo de transistor de efecto de campo sensible a iones, en expresión inglesa) elimina la puerta metálica del MOSFET y situa en esa región una membrana selectiva. Ésta puede ser el propio dieléctrico (SiO2) sensible a H+, o bien una membrana potenciométrica de naturaleza similar a las expuestas anteriormente y, para la medida, pone en la zona de puerta con los iones en una disolución. De esta manera es ahora el potencial de membrana, el cual a su vez depende de la actividad de los iones en la disolución, el que modula la intensidad del circuito principal. La forma de explicitar este efecto recae sobre el potencial umbral, VU, que ahora es variable y depende de la actividad de los iones (de carga z) en disolución según una expresión análoga a la del potencial de membrana:

12 log05916.0 azKVU += ( 14)

Ahora bien, para su utilización práctica, estos dispositivos se emplean de forma que se mantenga constante la intensidad de drenaje, para lo cual se interpone en serie con el potencial de membrana un potencial adecuado a través de un electrodo de referencia (VP), tal y como muestra la Figura 21. De esta manera, el potencial VP aplicado es la medida final que se relaciona con la actividad de la especie principal de la membrana depositada en la puerta.

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La expresión de trabajo se obtiene directamente combinando las expresiones (10) y (11):

13121

log05916.0log05916.0 azKazKKiV D

P −=−−= ( 15)

De donde se observa que las expresiones de trabajo para el sensor ISFET son equivalentes a las del potencial de membrana para un ESI, sólo que la dependencia con la actividad presenta el signo opuesto. El sensor ISFET es un tipo especial de sensor potenciométrico, en el que ocurre una repetida interconversión de señales. Aunque la señal primaria del reconocimiento es un potencial, el potencial de membrana, ésta se manifiesta en forma de una intensidad, aunque en las condiciones habituales de medida se reconvierte al potencial de puerta contrapuesto para mantener la intensidad en un valor prefijado.

Figura 20. Un transistor de efecto de campo (MOSFET). Figura 21. Un sensor ChemFET

obtenido a partir de un transistor FET.

La misma variedad de principios que se utilizan para la obtención de membranas selectivas en ESIs pueden emplearse como elemento de puerta en los dispositivos ISFET, bien como capa única, o en capas múltiples, tal y como se recoge en la Tabla 10. El ISFET más difundido es el que se prepara para responder a pH, lo que se logra con materiales en la zona de puerta como alúmina o nitruro de silicio (Si3N4). Así, se habla genéricamente de ISFET para las diferentes variantes de este sensor semiconductor, ChemFET cuando se utiliza una membrana cristalina o polimérica, EnFET para el biosensor enzimático, e incluso InmunoFET cuando se aprovechan interacciones entre antígeno y anticuerpo para generar el efecto de campo.

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Es necesario mencionar que, desde un punto de vista estrictamente termodinámico, las membranas depositadas sobre dispositivos ISFET presentan un inconveniente similar al de las depositadas sobre electrodos de hilo recubierto. Resulta que al no estar bañadas simétricamente, ya que adolecen del contacto de una disolución por la cara de la referencia, pueden presentar derivas y falta de reproducibilidad en sus medidas.

Tabla 10. Algunos ChemFETs desarrollados según las diferentes variantes ya presentadas con ESIs

Ejemplos de diferentes modificaciones para ChemFETs Variante Implementación Analito

ISFET de membrana de alúmina ChemFET de membrana cristalina ChemFET de membrana polimérica ISFET sensible a gases EnFET

óxido aislante

recubrimiento de haluro de plata

ionóforo en matriz de silicona membrana permeable a gases membrana conteniendo ureasa

pH

Cl-

Ca2+ NH3

Urea

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2.4 Aspectos prácticos en el trabajo con sensores potenciométricos

2.4.1 Expresiones de trabajo La ecuación fundamental de trabajo de un sensor potenciométrico, que relaciona la medida con la especie química medida es la expresión de Nernst:

11 ·loglog05916.0 asKazKV +=+=∆ ( 16)

siendo z la carga del ión (con su signo) y a1 la actividad que presenta en la disolución. Un sensor potenciométrico tiene pues la sensibilidad (s) fijada. Para un catión monovalente, la respuesta se incrementa en 59,16 mV por década de actividad (29,58 para un ión divalente), mientras que para un anión el potencial decrece en la proporción especificada. Cuando un sensor presenta una respuesta que se ajusta a dicho modelo se dice que tiene un comportamiento nernstiano. Un sensor potenciométrico responde idealmente a una única especie, el ión principal, pero el hecho que reciba el calificativo de selectivo y no de especifico, ya nos previene que puede presentar respuesta a iones adicionales llamados iones interferentes, que puedan interaccionar con la membrana selectiva. Para tener en cuenta este hecho, se amplía la ecuación de Nernst, en lo que se llama la ecuación de Nicolsky-Eisenman, la cual recoge la contribución de posibles iones interferentes presentes en la misma disolución de trabajo:

)·log(05916.0 /,

jx zzj

xj

potjxx

xaKazKV ∑

≠++=∆ ( 17)

donde ax es la actividad del ión principal, aj la actividad del ión interferente, zx y zj las cargas de los iones principal e interferente respectivamente, y pot

jxK , , que recibe el nombre de coeficiente de selectividad potenciométrica, la medida de la influencia del ión interferente en la respuesta final. Valores muy pequeños de pot

jxK , son propios de sensores que muestran una elevada selectividad por el ión principal. Representando esta ecuación para unas condiciones donde sólo se varía la actividad del ión principal se obtiene un comportamiento como el que se muestra en la Figura 22. En la ecuación (17) el término que suma a la derecha del logaritmo cuantifica la contribución de las especies interferentes. Su valor relativo respecto a la del ión principal determina tres zonas, que se muestran en el gráfico.

(i) ZONA A. La zona nernstiana, donde no hay ninguna discrepancia respecto al comportamiento teórico. Corresponde a una situación en la que la contribución de los iones interferentes es despreciable. Esto sucede bien por

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estar presentes a mucha mayor dilución que el ión principal, o bien por poseer el sensor unos coeficientes de selectividad de valor muy reducido. En esta zona se deduce la actividad del ión principal en una muestra por comparación con patrones adecuados y ajuste de la ecuación de Nernst:

sKVa /)(1 10 −∆= ( 18)

(ii) ZONA B, o zona plana. En esta zona no hay respuesta respecto del ión principal, y la medida está determinada por la contribución de los iones interferentes.

(iii) ZONA C, corresponde a una situación en que la contribución de iones

interferentes e ión principal es similar. Esta zona presenta una respuesta residual al ión principal, por lo que recibe el nombre de zona sub-nernstiana. El punto en que se igualan los dos comportamientos, que gráficamente corresponde a la intersección de las dos asíntotas, tiene un significado especial, ya que por convención representa el límite de detección de la técnica potenciométrica. El límite de detección, a*, no representa el límite de determinación y es posible utilizar sensores potenciométricos para realizar medidas en la zona sub-nernstiana si se emplean técnicas de calibración no lineal, siempre que el componente sumatorio de interferentes se mantenga constante.

Figura 22. Ejemplo de respuesta de una membrana potenciométrica ideal. Las zonas A, B y C se explican en el texto.

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2.4.2 Caracterización de la selectividad

Un ESI ideal presenta respuesta únicamente al ión principal en disoluciones con cualquier ión presente. En la práctica, esta situación se da sólo ocasionalmente, y es habitual que el ESI responda a iones de características parecidas, como es el caso de los halógenos. Como se ha visto (ecuación 17), la forma de tener en cuenta esta respuesta interferente es mediante el coeficiente de selectividad potenciométrica, pot

jxK , , que mide en que grado se distorsiona la medida debida al ión principal, x, en presencia del ión interferente, j. La caracterización exhaustiva de los coeficientes de selectividad constituye uno de los esfuerzos experimentales más extensos en la caracterización de un nuevo sensor potenciométrico. Para ello existen diferentes procedimientos, aunque el recomendado es el llamado Método de las disoluciones mezcladas. En él, se prepara un conjunto de disoluciones con un nivel de interferencia fija y en el que varia la actividad del ión principal. El comportamiento que se obtiene es el equivalente al de la Figura 22. Del valor del límite de detección para el ión principal obtenido en esas condiciones , a*, que corresponde a igual peso entre ión principal e interferente, se deduce fácilmente el coeficiente de selectividad potenciométrica, ya que el nivel de interferencia es conocido:

jx zzj

potjx a

aK /,*= ( 19)

log KK+,Y

-4

-3

-2

-1

0

pot

K+

Na+

Rb+Cs+

NH4+

Li+

Ca2+

Mg2+

Ba2+

Figura 23. Representación gráfica de los parámetros de selectividad de un ionóforo neutro para potasio en desarrollo. Se observa una correcta discriminación de los iones alcalinotérreos frente a los iones alcalinos.

La Figura 23 resume los resultados de uno de estos estudios de caracterización, presentando de forma gráfica los valores obtenidos para una rápida visualización del comportamiento de selectividad. Para especies poco interferentes se da log pot

jxK , < -3,

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mientras que valores próximos a 0 significa una respuesta similar para ión principal e ión interferente. Valores logarítmicos positivos implican una preferencia del sensor por el ión preferente y por tanto una distorsión importante en la respuesta debida al ión principal.

2.4.3 Actividad y concentración Una primera limitación que es necesario resolver está relacionada con la dependencia de la respuesta de los sensores potenciométricos con la actividad de los iones en disolución, y no con la cantidad presente, su concentración. En ocasiones singulares, como por ejemplo en estudios con fluidos biológicos o en el campo medioambiental es importante conocer la actividad real antes que la cantidad total presente. No obstante, en la mayoría de casos se necesita conocer el valor de concentración. Para resolver esta necesidad se hace uso de la teoría de los electrolitos en disolución, que permiten relacionar su concentración con la actividad que presentan en disolución. Dicha relación se establece a partir del coeficiente de actividad (γx) según:

xxx Ca ·γ= ( 20)

El valor del coeficiente de actividad es posible calcularlo a partir de la fuerza iónica de la disolución, según las expresiones derivadas de la teoría de Debye-Hückel, como la ecuación de Davies:

ICIBIzzA ∗−∗+

∗=− −+± '1

||log 2/1

2/1γ ( 21)

donde A es una constante que para agua a 25ºC vale 0,5108. Los parámetros B y C’ se encuentran tabulados para cada especie iónica para poder ajustar el modelo teórico. Por ultimo, I es la medida de la fuerza iónica de la disolución, calculada según:

221

iizcI ∑= ( 22)

Una aproximación habitual es tomar valores promedio para los diferentes iones, y así:

II

Iz ∗−+

=− ± 15.0151.0log

2γ ( 23)

Esta expresión es costumbre usarla con la simplificación de menospreciar el término que resta siempre que la fuerza iónica sea inferior a 0,01 M.

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Si el coeficiente de selectividad puede ser considerado constante, el potencial medido con un sensor potenciométrico se relaciona con la concentración del ión principal según:

xxx CzKCzKV log05916.0·log05916.0 +′=+=∆ γ ( 24)

La aparente contradicción de que el sistema es irresoluble, ya que para conocer el coeficiente de actividad hay que conocer la fuerza iónica total, en la que interviene a su vez el ión cuya concentración se busca, se resuelve con el ardid de que su influencia sea despreciable. De este modo para concentraciones diluidas no se efectúa ninguna corrección, ya que se presupone γx = 1. Para concentraciones mayores se utiliza una disolución de iones no interferentes, que definan el valor de la fuerza iónica y permitan el cálculo de los coeficientes de actividad que tendrán un valor casi constante. Una costumbre habitual es el empleo de un exceso añadido de sal inerte, cuyo objeto es ser la fuente determinante de la fuerza iónica. Cuando los protocolos en el uso de sensores hacen referencia a esta práctica, se le refiere como disolución ajustadora de la fuerza iónica total (TISAB en la terminología inglesa).

2.4.4 Procedimientos y aplicaciones Se dispone de un número de diferentes técnicas para el uso de los sensores potenciométricos que varían en complejidad y en prestaciones. Brevemente se presenta una somera descripción de las principales.

Potenciometria directa Tras una calibración con patrones adecuados, que se asemejen a las muestras, la potenciometría directa implica poner en contacto la muestra con el sensor más electrodo de referencia, y deducir la actividad por interpolación directa. Con esta técnica, cualquier presencia de interferentes causará un error en el resultado. Para determinar la relación entre actividad y concentración, es corriente el uso de una solución ajustadora de la fuerza iónica, que debe estar presente en patrones y muestras. El rango de trabajo de esta metodología puede estar entre 10-5 y 10-1 M, lo que sitúa la escala de trabajo entre los mg/L y los g/L. Para los casos en los que la difusión de iones K+ o Cl- provenientes de la solución interna del electrodo de referencia puedan ser una interferencia significativa, se dispone de electrodos de referencia que interponen un segundo puente salino que puede contener una sal escogida para minimizar este efecto. A estos se les conoce como electrodos de referencia de doble unión líquida (Figura 24).

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Figura 24. Electrodo comercial de referencia con doble unión líquida

Adición patrón Esta variante es la preferida cuando la matriz de la muestra tiene un efecto no cuantificable pero significativo en la medida. Para ejecutar la técnica, primero se realiza una medida de la muestra y a continuación se realizan k adiciones conocidas de la especie buscada. Es conveniente realizar pequeñas adiciones de una solución concentrada para minimizar los efectos de la dilución. En esta situación la respuesta se incrementa (para un catión) según la cantidad añadida. Extrapolando esta relación para la adición nula, se deduce el analito inicialmente presente en la muestra, tal y como se deduce de la viñeta correspondiente en la Figura 25.

∑∑

++

+=∆ko

kooVV

VcVCsKV ··log ( 25)

Figura 25. Ilustración que resume tres técnicas habituales cuando se trabaja con sensores potenciométricos, potenciometría directa (A), adición patrón (B) y valoración (C).

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Valoración Un sensor potenciométrico puede ser un detector adecuado del punto final en valoraciones, tanto ácido-base, como redox, de precipitación, de formación de complejos o de formación de par iónico. La disponibilidad de un potencial de electrodo que sigue el volumen de valorante utilizado suministra una información útil para la realimentación del proceso, lo que posibilita la realización de valoraciones automatizadas. Un análisis posterior del registro completo de valoración permite identificar los puntos de inflexión con los volúmenes de equivalencia de las diferentes reacciones que hayan podido suceder en sucesión. Con las técnicas mencionadas, junto con otras, como el uso de analizadores en línea, analizadores por inyección en flujo (FIA) es posible desarrollar y optimizar aplicaciones en diferentes campos de aplicación, que varían desde los análisis clínicos de electrolitos, la monitorización de vertidos contaminantes mediante redes automatizadas de analizadores o el seguimiento de procesos industriales. La Tabla 11 resume algunas aplicaciones significativas en diferentes campos de aplicación. En cuanto a cuales son las líneas de avance representativas para esta familia de sensores, el Cuadro 5 intenta dar una idea de su utilización en forma de matrices o de arreglos (en inglés : arrays).

Tabla 11. Algunas aplicaciones consolidadas de los sensores potenciométricos en la obtención de información química

Procesos que utilizan sensores potenciométricos Campo de aplicación Determinación Fundamental Constantes de estabilidad

Estudios cinéticos de procesos enzimáticos Industrial Control de biorreactores

Análisis farmacéutico Plantas potabilizadoras de agua

Ambiental Monitorización de lluvia ácida Análisis de efluentes Nutrientes en aguas superficiales Contaminantes específicos en agua residual Análisis de suelos

Clínico Análisis de electrolitos en sangre Análisis de CO2

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CUADRO 5. MATRICES DE SENSORES Y APROXIMACIONES BIOMIMÉTICAS

El desarrollo de nuevas estrategias que emplean sensores sigue siendo un área muy dinámica de investigación, donde confluyen los campos de la química, bioquímica, física, y más recientemente la electrónica e informática. Una de las líneas de avance que combina conocimientos de los campos citados es la de las matrices de sensores. Ésta es una aproximación complementaria a la de la búsqueda del sensor ideal, prácticamente específico para una especie determinada. La situación tradicional depende en extremo de la disponibilidad de un sensor suficientemente sensible y selectivo para la especie problema. En la nueva orientación, se propone la utilización de matrices de sensores, y de procesar en su conjunto la información obtenida. De esta manera se consiguen unas prestaciones no alcanzables con el uso de un sensor único. Entre las prestaciones descritas se pueden mencionar tres tendencias diferenciadas, la búsqueda de indicadores para el diagnóstico de la medida, la utilización de matrices de sensores selectivos, y la utilización de matrices de sensores poco selectivos. Veamos que posibilidades se deducen de cada una de ellas. Un primer uso de las matrices de sensores busca la obtención de información en exceso, que calificaríamos redundante. El objetivo es extraer de ella indicaciones que sirvan para el diagnóstico o la detección de averías. Se han descrito por ejemplo aplicaciones, donde el uso de la matriz de sensores es lo que permite dar robustez al sistema. Otro ejemplo significativo es el que ha permitido la compensación de derivas en sistemas donde la recalibración periódica no es factible, como por ejemplo en sondas submarinas. En esta situación, se emplean potentes herramientas de análisis multivariable para extraer y separar los componentes significativos de los que constituyen únicamente la deriva. En segundo lugar, la aplicación de tecnologías compatibles con una fabricación masiva de sensores ha supuesto un abaratamiento de los dispositivos, abriendo la posibilidad de un solo uso. En estas condiciones, el sobrecoste que supone disponer de un conjunto de sensores donde antes teniamos uno solo ya no es significativo. De esta manera se plantea el uso de matrices de sensores específicos idénticos, que permitan un mapeado de concentración de la especie en cuestión. De igual manera, se puede disponer de un conjunto de sensores diferentes, que lleven al multianálisis. Cuando esta posibilidad coincide con el uso de biosensores, y con la miniaturización, que probablemente utiliza tecnologías microfotolitográficas y/o microelectrónicas, todo esto nos lleva al biochip. A éste, aunque acabe de llegar, se le pronostica ya una difusión exponencial, sólo en lo que representará el diagnóstico clínico a partir de la identificación de genes específicos. Y el significado añadido que se aporta es el de la múltiple obtención de información en una única operación. Por último tenemos la posibilidad de utilizar sensores no selectivos y con respuesta cruzada, para la aplicación en muestras complejas. Esta aproximación está inspirada en el mundo de los sentidos animales, pues es de esta manera como se procesa la información en los sentidos del olfato y del gusto. En éstos, se dispone de un numero limitado de receptores para aromas y gustos primarios, y es la respuesta compleja al conjunto la que define un olor/sabor único entre millares. Estos sistemas claramente bioinspirados han recibido el nombre de nariz electrónica cuando está formado por sensores de gases y de lengua electrónica cuando emplean sensores para líquidos. Un primer objetivo es obtener simultáneamente la media de las especies principales junto con las especies interferentes. Esta desconvolución de las contribuciones de las diferentes especies aporta mejoras en la exactitud de las medidas. Pero adicionalmente, esta aproximación permite abordar problemas mas complejos, donde el objetivo no es la medida de una(s) especie(s) concreta(s) sino la adquisición de información compleja, como pueda ser “una planta de tratamiento despide mal olor”, o “determinada bebida refrescante va a causar rechazo en el consumidor”. Este tipo de información sólo era posible obtenerla hasta ahora mediante la intervención humana, que podía ser mediante un “experto” o mediante paneles sensoriales. Con la nueva aproximación y un proceso de “aprendizaje” logrado mediante elementos de inteligencia artificial se abre la posibilidad de la detección automatizada. Así pues la combinación de sensores con las herramientas quimiométricas y de inteligencia artificial abre la puerta hacia los sistemas de “sensores inteligentes”, que en un futuro van a poder monitorizar e interpretar cambios en su entorno, así como corregir posibles defectos de operación. Esta área está siendo estimulada por la posibilidad de utilizar elementos de procesamiento informático muy simples, económicos y asequibles, que pueden llegar a tener un enorme poder de cálculo, como lo son los modernos procesadores digitales de señal (DSPs).

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3 Sensores amperométricos

Con este nombre, actualmente, la bibliografía especializada se refiere a los electrodos sólidos de materiales conductores relativamente inertes, como es el caso del platino, oro y carbono, en el modo de operación voltamperométrico de medida de intensidad de corriente imponiendo un potencial determinado al electrodo (i ≠ 0, E= const.). Estos materiales operan en unas ventanas de potencial anódico anchas, permitiendo la determinación de una amplia gama de compuestos oxidables, en comparación con el clásico electrodo de gotas de mercurio. Plata, níquel y cobre también se utilizan en aplicaciones más específicas. Un factor importante a tener en cuenta cuando se usan estos electrodos es la dependencia de la respuesta con el estado de sus superfície. A menudo presentan una superfície heterogénea, desde el punto de vista de la actividad electroquímica, y rugosa a escala microscópica. Necesitan muchas veces un determinado pretratamiento previo (mediante procedimientos químicos, electroquímicos, térmicos o mecánicos) para activar la superfície y así obtener unos resultados reproducibles. Por otra parte, el electrodo de gotas de mercurio, por sus características funcionales, escapa de la consideración de sensor, al ser básicamente un dispositivo de laboratorio. Por consideraciones análogas, no es habitual incluir a los electrodos de disco rotatorio dentro de la familia de los sensores. Distintos factores afectan a la velocidad de reacción en el electrodo -intensidad de corriente- entre ellos podemos considerar: a) transferencia heterogénea de electrones; b) transporte de las especies electroactivas hacia el electrodo (difusión, convección y migración); c) reacciones químicas que se producen antes o después de la transferencia electrónica (protonación, dimerización, catálisis, etc); y d) Efectos de superficie, como adsorción o desorción.

Recordemos que amperometría es el nombre habitual de la aplicación analítica de la técnica cronoamperométrica. En una configuración electródica determinada, en un proceso reversible controlado por la difusión y en soluciones quiescentes (en reposo) , y normalmente con un potencial aplicado sobre el electrodo que obliga a que concentración de la sustancia electroactiva (que se oxida o se reduce , según el caso) sobre éste sea nula [C(x=0) = 0], el flujo de sustancia electroactiva que llega al electrodo es paulatinamente menor [el espesor de la capa de difusión de Nernst (x = δ )va aumentando], y la corriente medida decae (i = k t−½), hasta llegar en un tiempo breve a un estado prácticamente estacionario, haciéndose finalmente la corriente independiente del tiempo (ecuación de Cotrell). Aunque el valor de la corriente haya

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decaído considerablemente, su medida a un tiempo prefijado tiene interés analítico, ya que es proporcional a la concentración (C) de la especie electroactiva en el seno de la solución. De todas formas, el mismo sistema en régimen de convección forzada (agitación regular) [el espesor de la capa de difusión de Nernst (x = δ ) es constante y pequeño], permite una corriente (i) estacionaria , denominada de ‘difusión’, que alcanza un valor límite cuando el flujo de sustancia electroactiva hacia el electrodo es máximo; es decir, cuando el potencial impuesto obliga a que C(x=0) = 0, y la corriente limite de difusión deviene independiente del potencial aplicado. Entonces, dicha corriente es directamente proporcional a la concentración de la sustancia en el seno de la solución [C = C(x= δ)]:

Cki ·= ( 26)

siendo esta expresión la función de respuesta del transductor amperométrico, la cual regirá las curvas de calibración de la señal del sensor (i) frente a la concentración (C) dela sustancia electroactiva (analito). El valor exprimental de la pendiente de esta curva de calibración k corresponde al factor nFAD/δ, donde n es el número de electrones en la reacción redox, F es la constante de Faraday, A el área activa del electrodo, D el coeficiente de difusión de la especie electroactiva y δ el espesor de la capa de difusión.

3.1 Electrodos modificados químicamente

De hecho, los electrodos sólidos voltamperométricos, si nos fijamos en la definición dada en § 1 sobre los sensores químicos, deben considerarse como transductores electroquímicos, ya que carecen de elementos de reconocimiento. Su selectividad, aunque limitada pero suficiente para muchas situaciones experimentales reales, se consigue mediante la selección adecuada del potencial impuesto al electrodo de trabajo, mediante el sistema potenciostático de medida, normalmente en configuración de tres electrodos (electrodos de trabajo, auxiliar y de referencia).

Los sensores amperométricos se consideran verdaderos sensores químicos cuando sobre los materiales transductores incorporan elementos que les propocionan selectividad. Este es el caso de los electrodos modificados químicamente, que comentaremos a continuación , y del electrodo de oxígeno, que comentaremos después. La modificación superficial de los electrodos sólidos voltamperométricos se realiza para propósitos analíticos muy diferentes. Por ejemplo, puede ser para la aceleración de las reacciones de transferencia heterogénea de electrones entre el electrodo y las especies electroactivas en solución o para la acumulación o permeación selectivas de los analitos.

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Es decir, se modifican los electrodos para mejorar la sensibilidad y la selectividad de los dispositivos sensores voltamperométricos, amén de mejorar su estabililidad. A continuación vamos a repasar las tres áreas conceptuales de aplicación de los electrodos modificados químicamente, teniendo presente que en muchos casos dichas áreas no están completamente deslindadas entre sí y podemos encontrar conjuntamente más de uno de dichos conceptos en muchos diseños de sensores amperométricos.

3.1.1 Electrocatálisis A menudo la especie electroactiva a detectar presenta una transferencia electrónica lenta sobre los electrodos habituales (Pt, Au o C). Por lo tanto sólo conseguiremos una señal analítica útil cuando impongamos al electrodo un potencial sustancialmente superior a su potencial redox termodinámico, con la consiguiente pérdida de calidad en la respuesta, en términos de selectividad (posible detección simultánea de especies interferentes) y de sensibilidad (peor relación señal/ruido). A partir de consideraciones de la cinética rápida de determinadas especies sobre el electrodo y de sus propiedades redox en sistemas heterogéneos, con potenciales redox no muy elevados, podemos utilizar dichas especies como electrocatalizadores, aceleradores o mediadores de reacciones electroquímicas, y así poder detectar determinadas sustancias a potenciales de trabajo más adecuados. Por ejemplo, consideremos que el proceso anódico siguiente se realiza a unos potenciales que no son analíticamente convenientes, por ser una reacción electroquímicamente lenta:

A(red) → A(ox) + n e-

Supongamos que tenemos inmovilizado sobre el electrodo un mediador electrocatalítico M(ox); es decir, una especie redox con un comportamiento electroquímico reversible, con una cinética electródica rápida en comparación con A(red), y que presenta una transferencia electrónica homogénea con esta especie en solución:

A(red)+ M(ox) → + A(ox) + M(red)

Al estar el electrodo polarizado anódicamente, la forma reducida del mediador se regenera instantáneamente a su forma oxidada inicial

M(red) → M(ox) + n e-

Siendo el resultado neto: A(red) → A(ox) + n e; es decir, gracias a la especie mediadora electrocatalítica, existe una transferencia de electrones continua entre el analito y el electrodo, governada por el potencial redox del mediador y a una velocidad

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(intensidad de señal) comparativamente mayor que la del electrodo sin modificar. Tanto mayor será la señal cuanto más cerca se encuentren los centros redox del mediador de la superfície conductora del electrodo, ya que la velocidad de transferencia decae exponencialmente con la distancia. De aquí, la importancia de los procesos de inmovilización de los mediadores sobre los electrodos, que se comentarán más adelante. Lo acabado de comentar se puede esquematizar de la siguiente forma:

De forma análoga podríamos considerar un sistema electrocatalítico para detectar una especie A(ox) actuando el electrodo como cátodo. En la literatura especializada podemos encontrar multitud de esquemas electrocatalíticos con fines analíticos, implementados en forma de electrodos modificados químicamente. Electrodos modificados con cobalto ftalocianina para determinación de tioles, con níquel ftalocianina para antioxidantes o con dióxido de rutenio para carbohidratos. A causa de su importancia como cofactor de muchas reacciones enzimáticas, la electroquímica del par NAD+/NADH ha atraído un gran interés. La oxidación del NADH se puede conseguir con electrodos no modificados, pero a grandes sobrepotenciales y dando productos que se adsorben y envenenan el electrodo. En cambio, si adsorbemos azul de Meldola (7-dimetilamino-1,2-benzofenoxazina) sobre un electrodo de grafito, por ejemplo, se reduce considerablemente el potencial a aplicar, obteniéndose una señal analítica útil.

3.1.2 Preconcentración En la determinación de trazas de especies con propiedades redox puede ocurrir que la especie a determinar se encuentre a una concentración por debajo del límite de detección de la técnica voltamperométrica a disposición. La modificación superficial de un electrodo con una capa de material que facilite la acumulación preferencial (selectiva) del analito nos permitirá, después de un tiempo de acumulación, la determinación de las trazas de analito, por reducción o oxidación mediante un barrido de potencial. De hecho, esta estrategia es análoga a una técnica de stripping o de redisolución, pero siendo el paso inicial de acumulación de naturaleza no electroquímica. Desde el punto de vista práctico es conveniente separar la etapa de preconcentración (electrodo en contacto con la muestra) de la de medida (el electrodo en un medio más

n e-M(ox)

M(red)

A(red)

A(ox)

Electrodo modificado Solución

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apropiado), ya que de esta forma ambas etapas pueden estar optimizadas por separado (pH, fuerza iónica, agitación, etc.) para una mejor determinación, especialmente eludiendo las posibles interferencias de la muestra. Los requisitos que deben poseer las superficies modificadas para una buena preconcentración son una buena estabilidad química y mecánica del recubrimiento, una inmovilización fuerte y estable de los modificadores, una elevada densidad superficial de los sitios activos a la acumulación para evitar la saturación y que estos sitios sean reversibles para una conveniente regeneración superficial. Para esta aplicación se han diseñado superficies modificadas, con materiales de intercambio iónico o ligandos formadores de complejos, soportados dentro de una fina matriz polimérica hidrofóbica o directamente enlazados sobre el electrodo. Se han utilizado recubrimientos de polielectrolitos para la determinación de metales en forma iónica o de complejos cargados, el polímero intercambiador Nafion para lantánidos, el ligando 2,9-dimetil-1,10-fenantrolina para cobre, ligandos macrocíclicos como éteres corona y criptandos para plomo y porfirinas para níquel. También se han utilizado materiales adsorbentes, como zeolitas, bentonitas o gel de sílice, para la determinación de algunos compuestos farmacéuticos, y electropolímeros (polipirrol) para productos orgánicos.

3.1.3 Permeación selectiva Una intención muy común en la modificación superficial de los electrodos estriba en aplicarles un recubrimiento para prevenir el transporte hacia el electrodo de especies interferentes electroquímicamente o que puedan pasivarlo o envenenarlo, sin restringir demasiado el transporte del analito. Evidentemente, con estos recubrimientos se gana en selectividad y en estabilidad de la señal. Para ello podemos utilizar distintas estrategias, basadas en distintos mecanismos, para discriminar el transporte hacia el electrodo de las especies en solución. Existen distintos tipos de recubrimientos que discriminan sustancias en base a sus dimensiones moleculares, cargas o polaridad. Se han empleado recubrimientos de acetato de celulosa para la exlusión de moléculas voluminosas, por ejemplo para minimizar el efecto de proteínas en la determinación de peróxido de hidrógeno. En este sentido, los recubrimientos por electropolimerización permiten controlar el espesor de la capa, habiéndose reportado detecciones amperométricas selectivas por medio de electrodos modificados con polipirrol y polianilina. La discriminación debida a las cargas de las distintas especies en la muestra se ha utilizado también para mejorar la selectividad de la detección. Así, los recubrimientos de finas películas con grupos cargados presentan diferencias notables de permeabilidad

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hacia especies iónicas de signo contrario en comparación con las especies del mismo signo. Por ejemplo, se ha descrito una exclusión efectiva de interferencias aniónicas (ácidos úrico y ascórbico) por polímeros intercambiadores aniónicos, como Nafion y poliestersulfonatos. La modificación de los electrodos con capas hidrofóbicas lipídicas o de proteínas permite la discriminación de especies hidrofóbicas con respecto a especies hidrofílicas. De esta forma se han podido detectar fármacos hidrofóbicos . Mediante la formación espontánea sobre electrodos de oro de monocapas autoensambladas de n-alquiltioles de propiedades hidrofóbicas se pueden determinar noradrenalina y dopamina en presencia de compuestos hidrofílicos como el ácido ascórbico. La integración de elementos de permeación selectiva y de electrocatalisis en la superficie de un electrodo puede ser muy interesante. Por ejemplo, se puede conseguir simultáneamente la protección de los centros electrocatalíticos (p. ej., respecto a tensioactivos) y la discriminación de las especies a catalizar con respecto a su carga o dimensiones.

3.2 Electrodo de oxígeno

El electrodo para medir oxígeno en solución, debido a Clark (1956), es quizá el sensor amperométrico más utilizado, y aun se encuentra actualmente en constante modificación y perfeccionamiento. El sensor se basa en un par de electrodos que están en contacto con un pequeño volumen de solución de electrolito, estando separado este conjunto de la muestra por medio de una fina membrana hidrofóbica. Esta membrana permeable al oxígeno, normalmente de Teflon, silicona o polietileno, evita que lleguen a la superficie del electrodo indicador (cátodo) especies interferentes, ya sean electroactivas o pasivantes. El cátodo puede ser de platino, oro o plata, según los distintos diseños comerciales, y el ánodo, que a la vez actúa de electrodo de referencia, es de plata/cloruro de plata. El electrolito encapsulado consiste en una solución amortiguadora ácido-base con cloruro potásico, que fija un valor de pH adecuado para la detección de oxígeno, independiente del de la muestra, y el nivel de cloruro presente mantiene constante el potencial del electrodo de referencia (ver Figura 26).

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Figura 26. Secciones longitudinal y transversal idealizadas de un electrodo de Clark, basado en una sonda amperométrica de oxígeno recubierta con una membrana permeable a gases, y esquema de su funcionamiento voltamperométrico.

El oxígeno disuelto en la muestra se difunde a través de la membrana y se equilibra con el electrolito. El potencial aplicado (–0.6 V) produce la reducción del oxígeno en el cátodo con una corriente límite de difusión proporcional a la concentración del oxígeno en el electrolito interno y, por tanto, a la presión parcial del oxigeno en la muestra. Como todo sensor, presenta pequeñas derivas de la señal, por lo que se debe calibrar periódicamente. Usualmente por exposición en soluciones de contenido conocido de oxígeno, siendo el caso más práctico en soluciones saturadas de aire asumiendo que el 20,93 % es oxígeno. Por ejemplo, la solubilidad a 25ºC produce una disolución con un contenido de 8.4 mg O2 litro-1. Evidentemente, para que esta calibración sea funcional se necesita una corrección precisa de la temperatura.

3.3 Modificación química de los electrodos

Entendemos por modificación química la alteración, normalmente de la superficie, de un material para proporcionarle unas nuevas propiedades físico-químicas superficiales. En caso de los electrodos modificados químicamente, el proceso de modificación ha de ser capaz de inmovilizar el modificador, con la mínima pérdida de su actividad físico-química, sobre el electrodo sólido, también sin que las propiedades electroquímicas transductoras de éste se resientan excesivamente.

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Son muchas y de difícil clasificación las estrategias de modificación química, ya que, como hemos visto en § 3.1, diversos son los propósitos por los que se modifican los electrodos, implicando una gran variedad materiales modificadores. En cambio, los materiales modificados, los tipos de electrodos a modificar, son más reducidos (carbono, platino y oro). Una posible clasificación de los tipos de modificación química podría ser atendiendo al espesor de la capa o recubrimiento modificador.

Monocapas Podemos obtener monocapas sobre oro adsorbiendo proteínas, especialmente a través de los residuos de cisteína, para obtener superficie hidrofóbicas, o sobre carbono adsorbiendo compuestos orgánicos o complejos metálicos con dobles enlaces, cadenas largas hidrocarbonadas o con anillos aromáticos (como algunos electrocatalizadores, por ejemplo metilviológeno, dimetilferroceno, complejos de rutenio, osmio o hierro, complejos metálicos de bipiridilo, etc). La modificación por adsorción se consigue mediante procedimientos muy simples, siendo ésta su mayor ventaja, conjuntamente con que alteran muy poco las propiedades tanto del modificador como del transductor. Se consigue sumergiendo el electrodo en una disolución diluida del modificador o depositando unas gotas de ésta sobre la superficie del electrodo, dejando que se evapore el disolvente de forma controlada. Evidentemente, los procesos de adsorción sufren de una cierta irreversibilidad y las superficies modificadas por adsorción tiende a perder actividad con el uso, por desprendimiento del material adsorbido. Un procedimiento más elegante, pero técnicamente más complicado, es la inmovilización covalente del modificador sobre la superficie sensora. En este caso el procedimiento tiene normalmente dos estapas. La primera es la activación o funcionalización de la superficie del transductor. Por ejemplo, la oxidación química o electroquímica de grafito aumentará la densidad de grupos óxido, hidroxilo, carboxilo o anhídrido de ácido en la superficie. En la segunda etapa se trata de enlazar covalentemente el modificador sobre el transductor activado. Normalmente el modificador se trata de un electrocatalizador, ya que nos interesa que esté ‘conectado’ directamente con la superficie electroactiva. Este esquema implica que el modificador contenga grupos funcionales distintos por donde poder enlazarse a los grupos rectivos del transductor. El enlace de ambos grupos puede realizarse directamente en algunos casos, pero en la mayoría de veces se consigue normalmente con unos agentes bifuncionales (silanos, carbodiimidas, ácido cianúrico, etc ). En otros casos podemos confinar monocapas autoensambladas (de inglés, self-assembled monolayer, SAM) sobre los electrodos. Por ejemplo, los electrodos de oro se pueden modificar simplemente sumergiendo en una disolución de un n-alquiltiol determinado. De esta forma obtenemos una monocapa densa bien organizada con las cadenas alquílicas perpendiculares a la superficie, ancladas a élla a través del grupo tiol.

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Con esta estrategia, por ejemplo, se han conseguido unas superficies selectivas hacia compuestos hidrofóbicos. Bicapas autoensambladas, del tipo de las membranas bilipídicas (BLM, bilayer lipid membrane), análogas a las membranas naturales, se pueden construir fácilmente con la técnica de Langmuir-Blodgett. Una película monocapa bidimensional de una molécula tensioactiva (cabeza polar y cola lipofílica) se comprime en la superficie de una cubeta con agua, con la ayuda de una espátula rasante. La monocapa organizada en la interfície agua/aire (cabeza en el agua y cola en el aire) se transfiere fácilmente a la superficie de un electrodo sólido. Mediante una inmersión y emersión cuidadosas se consigue una monocapa; repitiendo el proceso se consigue una bicapa. Entre la primera y la segunda inmersión, se puede proceder al atrapamiento entre capas de moléculas electroactivas. Eventualmente las moléculas tensioactivas formadoras de las capas pueden estar mezcladas con otras del mismo carácter pero funcionalizadas electroquímicamente.

Multicapas Con este nombre nos referimos a recubrimientos superficiales de cierto espesor. Normalmente se efectúan con polímeros disueltos en un disolvente volátil, se aplica la disolución sobre la superficie (por deposición, inmersión o rotación [cast-, dip-, spin-coating]). También se pueden aplicar las capas poliméricas sobre los electrodos a partir de los monómeros y efectuar la polimeración vía distintas estrategias según las propiedades del monómero, por ejemplo a través de polimerización térmica, química, fotoquímica o electroquímica. La modificación multicapa, con los procedimientos acabados de comentar, es normalmente fácil de preparar. Permite el control del espesor del recubrimiento, lo cual se aprovecha para modular las características permselectivas del recubrimiento. Al ser los materiales básicos de tipo polimérico, la multicapa tiene una gran estabilidad física y química la mayoría de veces, siendo compatible con una gran variedad de modificadores electroquímicos. Esto quiere decir que fácilmente los puede atrapar en su seno, resultando un proceso general de inmovilización y, en particular, de modificación electrocatalítica, tanto en base a materiales sintéticos como biológicos. Eventualmente, los materiales poliméricos utilizados pueden incorporar grupos funcionales que sean electroactivos o que sirvan para poder enlazar o coordinarse con modificadores electroactivos. La modificación multicapa proporciona una zona confinada sobre el electrodo, con una mayor densidad de sitios activos en comparación con las monocapas, lo que ocasiona una respuesta relativamente sensible.

Polímeros intercambiadores iónicos. Estos conocidos materiales poliméricos, con grupos fijos cargados y grupos móviles intercambiables de carga opuesta, se han utilizado para modificación superficial de electrodos. Un tipo de polímeros de esta clase son los ionómeros, unos polielectrolitos lineales, más o menos ramificados, sin entrecruzamiento tridimensional. Tienen en su forma aniónica una elevada selectividad de intercambio iónico hacia cationes voluminosos hidrofóbicos en comparación a

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cationes inorgánicos comunes. El Nafion es un iónomero muy utilizado. Es un polímero perfluorosulfonato del tipo:

[CF3(CF2)n]2=CF−O−CF2−CF(CF3) −O−(CF2)2−SO3-Na+

que tiene zonas hidrofóbicas e hidrofílicas en su estructura. Puede preconcentrar en su seno, con cierta selectividad, cationes (voluminosos) electroactivos, para posteriormente proceder a su determinación voltamperométrica (voltamperometría de intercambio iónico). Adicionalmente, al ser un material con grupos fijos aniónicos (−SO3−), funciona como un apantallador de especies interferentes con carga del mismo signo. Así, por ejemplo, a un pH determinado podemos determinar el neurotransmisor dopamina en presencia de especies interferentes potenciales como el anión ascorbato. Los ionómeros no son electroactivos de por sí, pero los podemos tener con especies móviles electrocatalizadoras o mediadoras redox, por ejemplo del tipo metilviológeno, dimetilferroceno, Ru(byp)32+[byp=2,2’-bipiridilo] o Ru(NH3)42+, Fe(CN)62+ . De todas formas debemos tener presente que, aunque la especie redox retenida electrostáticamente en el sitio intercambiador sea electroactiva, ésta se encuentra aislada eléctricamente del electrodo. Por lo tanto, la capacidad (contenido) en sitios redox de estos materiales ha de ser elevadada. En este caso, la movilidad de la carga puede producirse por difusión de los grupos móviles cargados o por conducción redox; es decir, los electrones saltan entre grupos redox vecinos. Polímeros redox. Són unos polímeros funcionalizados con grupos redox (grupos coordinantes de metales de transición [Ru, Os], porfirinas o ftalocianinas de hierro(II), cobalto(II), etc.). Se han reportado uniones covalentes de estos y otros grupos redox sobre poliestireno, celulosa, etc., preservándose más o menos su actividad. Presentan también el fenómeno de conducción redox. La movilidad de la carga de los recubrimientos de electrodos con polímeros redox puede modularse con el potencial aplicado al electrodo. La conductividad es máxima en el potencial normal del grupo redox, cuando los grupos en estado oxidado y en estado reducido se igualan. De todas formas, la cinètica de transferencia electrónica con los electrodos es bastante baja, en comparación con la reacción en solución Polímeros conductores. La propiedad que fundamenta a este tipo de polímeros es la presencia de doble enlaces conjugados a lo largo de su esqueleto polimérico. Cadenas de carbonos unidos alternativamente por enlaces dobles y simples. No obstante, esta conjugación no es suficiente para que el material polimérico sea muy conductor. Por esto, se ‘dopa’ el material con portadores de carga en la forma de electrones (n) o de ‘huecos’ (p) adicionales. Cuando un hueco se llena con un electrón, que ha saltado de una posición adyacente, se crea un nuevo hueco, y así sucesivamente, permitiendo la movilidad a largas distancias de las cargas. Por el descubrimiento y desarrollo de estos materiales Heeger, MacDiarmid y Shirakawa recibieron el premio Nobel en el 2000. Actualmente, estos plásticos conductores se utilizan en muchos y variados campos, por ejemplo como inhibidores de corrosión, en la fabricación de condensadores compactos, de recubrimientos antiestáticos, en el blindaje electromagnético de los ordenadores, en vidrios inteligentes

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que pueden variar el paso de la luz, etc. Una segunda generación de estos materiales ha encontrado aplicación como transistores, diodos emisores de luz (LED) y lásers. Las ventajas principales de los polímeros conductores son su bajo precio y que pueden ser procesados fácilmente, por ejemplo en forma de película. El poliacetileno no es conductor, pero su oxidación con vapores de cloro, bromo o yodo hace que este material sea 109 veces más conductor que el material original. El poliacetileno dopado tiene una conductividad de 105 S m-1 [10-16 S m-1 (Teflon), 108 Sm-1 plata o cobre]. El poliacetileno se oxida con el oxígeno del aire y también es sensible a la humedad. Polipirrol y politiofeno son estables al aire y tienen el valor añadido que se pueden sintetizar directamente en la forma dopada. No obstante son un poco menos conductores, pero suficiente para la mayoría de aplicaciones prácticas. En el campo de los sensores, estos materiales se preparan fácilmente in situ por electropolimerización, a partir de la oxidación del monómero (pirrol, tiofeno o anilina), en modo galvanostático, potenciostático o en barridos voltamperométricos cíclicos múltiples. Se obtienen así unas películas conductoras adheridas a la superficie del electrodo, cuyas propiedades dependen del electrolito (dopante), solvente (puede ser agua) y concentración del monómero utilizados en la celda electroquímica y del potencial o intensidad aplicados y de su duración. Adicionalmente, las propiedades del polímero pueden ser moduladas partiendo de monómeros modificados con grupos con funciones específicas. Estos polímeros (pP) han atraído la atención debido la propiedad que poseen de pasar, revertiendo el potencial aplicado, de una forma oxidada (conductora) a otra reducida (aislante), a la vez que incorporan o expelen especies iónicas (A-):

oxidación

reducciónpP+· A- + epP + A-

Así, este cambio drástico y controlable en la conductividad eléctrica y el rápido intercambio del ión dopante ofrece diversas aplicaciones electroanalíticas. Por ejemplo, la posible detección de especies no electroactivas o de gases. Los polímeros conductores son materiales intercambiadores de iones, y la naturaleza del contraión dopante puede modificar profundamente sus propiedades intercambiadoras (la selectividad) del polímero. Este hecho ha sido aprovechado para desarrollar sensores potenciométricos. Los polímeros conductores han resultado útiles también en voltamperometrías de redisolución, para la preconcentración de metales en la superficie de los electrodos modificados. Finalmente, como veremos más adelante, estos polímeros pueden ser utilizados como matrices para atrapar en su seno entidades biológicas de reconocimiento molecular.

Compósitos conductores Una estrategia completamente distinta a la modificación en superficie de los electrodos es la modificación en volumen. Este tipo de modificación se consigue fácilmente con los electrodos de pasta de carbono conocidos también por su acrónimo en inglés CPE (carbon paste electrodes). Consisten en un material compósito formado por una mezcla

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del modificador con grafito en polvo y un aglomerante (Nujol, aceite de parafina, aceite de silicona, etc.), dando lugar a una pasta conductora. La pasta se introduce unos milímetros en un cuerpo tubular hasta contactar internamente con un conductor metálico por donde se efectuará la conexión exterior.

Este simple procedimiento de modificación, debido a Adams (1969), encierra varias ventajas desde el punto de vista del desarrollo de sensores, especialmente si lo comparamos con algunos de los procedimientos complejos señalados más arriba de modificación en superficie. Es un procedimiento que se lleva a cabo mediante operaciones simples de ‘vía seca’. Permite unas superficies electroactivas muy reproducibles, ya que se tiene un control total de los componentes de la mezcla en volumen y, por tanto, en superficie. El seno del material funciona como reservorio de los componentes modificadores; cuando la superficie se desactiva con el uso o por otro motivo, se puede renovar fácilmente con un simple pulido. Por contra, las pastas de carbono poseen limitadas propiedades mecánicas que no las hacen muy idóneas para dispositivos comerciales. Además no son compatibles con la mayoría de solventes no acuosos.

En este sentido, se han desarrollado compósitos rígidos conductores, análogos a las pastas blandas de carbono, pero sustituyendo el aglomerante líquido por un material polimérico (resina epoxy, silicona, metacrilato, etc) que permite que, una vez efectuada la mezcla, el compósito se endurezca en un tiempo de curado determinado. Estos materiales rígidos conductores modificados en volumen poseen unas buenas propiedades mecánicas (se pueden tornear, perforar, pulir, etc.; se pueden utilizar con fluidos en movimiento) y químicas (son compatibles con medios no acuosos). Además, ocluyen a los modificadores de forma muy estanca, preservándolos de su alteración por el ambiente, obteniéndose una superficie activa al cabo de años, en algunos casos, con un simple pulido. Finalmente, los compósitos rígidos conductores, antes de curar, modulando su fluidez, se pueden utilizar en la fabricación de sensores por tecnologías planares (thick-film technologies).

Los compósitos acabados de comentar son conocidos como compósitos dispersos, por su forma de preparación. Son menos utilizados en electroanálisis los compósitos consolidados, obtenidos por compresión de la mezcla homogénea de los componentes electroactivos, generalmente con material polimérico (como Teflon) para dar consistencia.

Los electrodos compósitos presentan intensidades de corriente significativamente altas. Esto es debido a que su superficie es una dispersión aleatoria de regiones conductoras y regiones aislantes, similar a un haz de microelectrodos. Por tanto, cuando operan, mientras es despreciable la superposición de las capas de difusión entre los sitios conductores adyacentes, la señal es la suma de las intensidades de corriente de cada sitio individual, intensificada por el efecto de microelectrodo. Además, proporcionan una corriente con una mejor relación señal/ruído, en comparación con una superficie conductora continua, y son insensibles al caudal de los flujos continuos cuando se usan en detectores de flujo. En definitiva, los electrodos compósitos permiten trabajar con una señal con propiedades de microelectrodo con instrumentación convencional.

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4 Biosensores electroquímicos Los biosensores electroquímicos son electrodos modificados biológicamente. Combinan el poder analítico de los transductores electroquímicos, ya comentado en § 1.1, y la selectividad de los biorreceptores (ver Cuadros 6A y 6B).

4.1 Biosensores basados en enzimas

La transducción electroquímica es muy indicada para el desarrollo de biosensores enzimáticos, como veremos más adelante, ya que se acopla muy bien con dichos biocatalizadores. La mejor integración se consigue con transductores amperométricos y enzimas que catalizan reacciones redox. No nos debe de extrañar, pues, que la mayoría de implementaciones comerciales actuales de dispositivos biosensores se basen en esta forma de transducción. El Cuadro 6A nos introduce a las propiedades generales de las enzimas y la Tabla 12 nos resume las ventajas principales de la utilización de estos materiales como elementos de reconocimiento molecular en el desarrollo de biosensores y , en particular, de los de tipo electroquímico.

Tabla 12. Propiedades de las enzimas como elementos de biorreconocimiento en el desarrollo de biosensores electroquímicos

Propiedades de las enzimas en los biosensores Alta selectividad para un substrato (o familias de substratos) Mecanismo de acción bien caracterizado Mecanismo catalítico rápido y sensible, amplificador de la señal Posibilidad de integración a distintos modos de transducción Posibilidad de transducción directa y continua Disponibilidad de materiales enzimáticos de distinta clase, origen, actividad

y estabilidad Posibilidad de determinar grupos de sustancias mediante enzimas selectivas

a dichos grupos o mediante la inhibición enzimática que producen determinados grupos sobre algunas enzimas

Procedimientos de inmovilización bien establecidos Reutilizables Precio moderado Producción masiva

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4.1.1 Biosensores potenciométricos Este tipo de biosensor generalmente integra material enzimático con electrodos selectivos de iones o electrodos potenciométricos de gases. Las enzimas utilizadas, hidrolasas o de otro tipo, producen productos de reacción idóneos para ser detectados con este tipo de electrodos; es decir, H+, NH4+, NH3, CO2, CN-, etc. La Figura 27, ilustra el mecanismo de respuesta de un biosensor de esta clase. A causa de la cinética enzimática sobre la respuesta termodinámica del electrodo interno potenciométrico, la sensibilidad de estos dispositivos no sigue la ley de Nernst. Además, hay que tener en cuenta la capacidad amortiguadora del medio de trabajo, que compite con el equilibrio ácido-base del producto detectado y que también modula la actividad enzimática, interviniendo ambos aspectos en el intervalo de respuesta. Normalmente las curvas de calibrado tienen una forma sigmoidal. Como todos los biosensores electroquímicos, los biosensores potenciométricos son de coste moderado. Además, hay que tener en cuenta que el aparato de medida (pH/mV metro) está presente en todos los laboratorios. Con respecto a los biosensores amperométricos, que se comentarán a continuación, los de tipo potenciométrico presentan un perfil muy bajo de interferencias, gracias a la selectividad del sensor interno. El inconveniente que presentan, fácilmente deducible de la observación de la Figura 27, es su dilatado tiempo de respuesta, de varios minutos.

Figura 27. Mecanismo de respuesta idealizado de un biosensor enzimático basado en un electrodo potenciométrico de gases. 1) El substrato (S) es transportado (por convección) a la superfície sensora. 2) S difunde a través de la membrana permselectiva hacia la membrana enzimática (la enzima está retenida por una membrana permselectiva.3) S reacciona con un sitio activo de la enzima. 4) Parte del producto (P) de la reacción, que es gaseoso, difunde hacia la membrana selectiva de iones, a través de la membrana permeable a gases 5) P genera un potencial de membrana, y 6) P difunde a la solución a través de la membrana permselectiva. La respuesta de potencial es estacionaria, en la práctica controlada por la difusión de S, y depende pseudonernstianamente de la concentración de S en la solución

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La Tabla 13 nos muestra distintas configuraciones de biosensores potenciométricos. Cabe destacar que en algunos casos, dependiendo del tipo de reacción catalizada, existen distintas alternativas de sensores potenciométricos internos. Este es el caso del biosensor de urea, cuya reacción en la membrana sensora es:

CO(NH2)2 + 2 H2O + H+ → HCO3- + 2 NH4+

conllevando la aparición de especies CO2/HCO3- y NH3/ NH4+, y cambios de pH, que pueden ser detectados por diferentes tipos de electrodos selectivos de iones. Un caso similar son los biosensores de aminoácidos que se pueden implementar en base a sensores potenciométricos de pH, NH3 o NH4+. Cuando se utilizan enzimas de selectividad reducida, como la L-aminoácido oxidasa o D-aminoácido oxidasa, entonces el biosensor detecta aminoácidos levógiros o dextrógiros según la variante utilizada.

Tabla 13. Ejemplos de biosensores potenciométricos para diferentes tipos de substratos. El correspondiente biosensor integra una enzima que cataliza la descomposición del substrato produciendo un producto que activa el sensor potenciométrico interno (ESI)

Biosensores potenciométricos Substrato Enzima ESI

Urea L-Fenilalanina Glutamina Creatinina Adenosina Aspartamo

Ureasa Fenilalanina amoníaco liasa Glutaminasa Creatina iminohidrolasa Adenosina desaminasa L-aspartasa

NH3

NH4+

Urea Oxalato Tirosina

Ureasa Oxalato descarboxilasa L-Tirosina descarboxilasa

CO2

Urea Glucosa Penicilina Acetilcolina

Ureasa Glucosa oxidasa Penicilinasa Acetilcolinesterasa

pH

Amigdalina β-glucosidasa CN-

Como veremos en el apartado siguiente, algunas enzimas catalizan reacciones redox, como las oxidasas, que transfieren dos hidrógenos desde el substrato al oxígeno molecular, produciendo peróxido de hidrógeno, y como las peroxidasas que catalizan la oxidación de un substrato por el peróxido de hidrógeno. Así pues, inmovilizando conjuntamente ambos tipos de enzimas en un electrodo selectivo de ioduro podemos determinar cualquier substrato de una oxidasa en un medio con presencia de ioduro. Por ejemplo, la detección de L-fenilalanina seguiría el siguiente esquema bienzimático:

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L-fenilalanina H2O2

L-aminoácido oxidasa

peroxidasaH2O2 + 2 H+ + 2 I- I 2 + 2 H2O

Con un esquema análogo, podríamos preparar un biosensor de glucosa, inmovilizando conjuntamente glucosa oxidasa y peroxidasa. De todas formas, este tipo de estrategias que implican añadir un reactivo (en este caso un nivel constante de ioduro en el medio, para que el electrodo de ioduro detecte la disminución de este anión provocada por la presencia de la fenilalanina) se van abandonando, ya que la tendencia actual es la total inmovilización de los sistemas de reconocimiento sobre los transductores, lo que se conoce como ‘sensores sin reactivos’ (en inglés, reagentless sensors). BioFET. Los transistores de efecto de campo sensibles a iones (ISFET) (ver § 2.3.8), en su variante de sensores de pH, han encontrado aplicación en el desarrollo de biosensores enzimáticos, en configuraciones análogas a las comentadas anteriormente para los biosensores enzimáticos basados en electrodos selectivos de iones (ver Tabla 13). La literatura muestra varios ejemplos de EnFET (‘FET modificado con enzimas’), la mayoría modificados con penicilinasa, ureasa y glucosa oxidasa, para la determinación de los respectivos substratos a partir de los cambios de pH experimentados en la parte sensible del transductor modificada biológicamente. Las distintas versiones de cada uno de ellos son debidas principalmente al método de inmovilización de la enzima utilizado.

4.1.2 Biosensores amperométricos

Estos dispositivos sensores combinan la selectividad de los distintos tipos de enzimas como materiales de reconocimiento molecular (ver Cuadro 6A) con la simplicidad de los transductores amperométricos, constituídos por materiales conductores como grafito, platino, oro, etc, modificados químicamente o no.

El mecanismo de reconocimiento es catalítico. La Figura 28 muestra un posible mecanismo de respuesta para un biosensor enzimático amperométrico . En este tipo de dispositivos la señal transducida (intensidad de corriente) estará limitada por tres tipos principales de procesos: a) la difusión del substrato desde el seno de la solución, b) la difusión del substrato dentro de la membrana enzimática y c) la cinética de la reacción enzimática

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Figura 28. Mecanismo de respuesta esquematizado de un biosensor enzimático amperométrico. 1) El substrato (S) es transportado (por convección) a la superfície sensora. 2) S difunde a través de la membrana enzimática .3) S reacciona con un sitio activo de la enzima. 4) Parte del producto electroactivo (P) de la reacción difunde hacia la superficie transductora amperométrica, que tiene impuesto un potencial determinado. 5) P es transformado electroquímicamente en Pox. 6) Pox difunde a la solución a través de la membrana enzimática. La respuesta de intensidad de corriente es estacionaria, en la práctica controlada por la difusión de S o por la actividad de la enzima, dependiendo de distinta forma de la concentración de S en la solución.

De la observación de la Figura 28, para el mecanismo descrito, se deduce que la respuesta es una transducción directa de la velocidad de reacción enzimática aunque presupone necesariamente un producto electroactivo. Además, dicha respuesta estará controlada, según el caso, por la difusión del substrato (S) o por la cinética de la catálisis enzimática. Empíricamente, utilizando enzimas de poca actividad, el biosensor se encuentra bajo un control cinético, siguiendo la señal la ecuación de Michaelis-Menten (Cuadro 6A), y, por tanto, el rango de respuesta útil queda limitado a [S] < KM.

Si utilizamos enzimas de gran actividad, la respuesta estará bajo control difusional, aun a concentraciones de S del orden de KM. Debemos de tener en cuenta que, en la práctica, la propia membrana enzimática es una barrera difusional, de espesor constante, que nos impondrá un control difusional aun a altas concentraciones de S. En estas condiciones, la respuesta lineal del biosensor se extenderá a [S] > KM. Tanto más amplio será el rango de respuesta cuanto más espesor tenga la membrana, pero , en contra, la sensibilidad disminuirá y el tiempo de respuesta se alargará. Las enzimas conocidas como oxidorreductasas catalizan reacciones de oxidación o reducción transfiriendo hidrógenos o electrones. Son el candidato ideal para acoplar biocatalizadores con transductores amperométricos. Han encontrado aplicación en el desarrollo de biosensores los siguientes tipos de enzimas redox : oxidasas, deshidrogenasas, peroxidasas y oxigenasas. A continuación comentaremos las principales configuraciones desarrolladas de biosensores amperométricos basados en cada uno de estos tipos de enzimas.

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Oxidasas Estas enzimas catalizan la transferencia de hidrógeno desde el substrato hacia el oxígeno molecular. Contienen un grupo prostético fuertemente enlazado al apoenzima, derivado de la flavina, constituido por el mononucleótido de flavina (FMN) o por el dinucleódido de flavina y adenina (FAD), que son los grupos que confiere propiedades redox al centro activo de las diferentes enzimas de esta clase. Catalizan reacciones del siguiente tipo, según la capacidad de la enzima de transferir cuatro o dos electrones al oxígeno molecular:

S + ½ O2 → P + H2OS + O2 → P + H2O2

Es práctico visualizar la catalisis de una oxidasa de la siguiente forma:

En la que vemos el papel biocatalítico del grupo prostético FAD, que oxida S, y cuya forma reducida (FADH2) es reoxidada a su forma nativa por el oxígeno presente, que hace el papel de aceptor (colector) natural de electrones, transformándose en H2O2 oH2O. Por lo tanto, estos sistemas enzimáticos son dependientes del oxígeno, que es un cosubstrato esencial en los sistemas biológicos naturales donde actúan estas enzimas. Transducción de O2 o H2O2. Precisamente, el primer biosensor histórico (Clark y Lyons, 1953), el «electrodo enzimático de glucosa» se basó en la glucosa oxidasa (GOD), siguiendo la siguiente reacción:

Glucosa + O2 ácido glucónico + H2O2GOD

Estos investigadores montaron sobre la membrana permeable a gases de un electrodo amperométrico de oxígeno (ver §3.2) una película de disolución amortiguada de GOD, retenida por una membrana de diálisis. Cuando el biosensor se introduce en una muestra, el substrato y el cosubstrato (glucosa y oxígeno en exceso) atraviesan la primera membrana permselectiva y reaccionan con la enzima. Solamente el oxigeno no consumido atravesará la membrana permeable a gases y será medido por el electrodo. Por lo tanto, la señal catódica transducida será indirectamente proporcional a la concentración de glucosa en la solución, para concentraciones por debajo de KM y en un exceso de oxígeno. Este biosensor tiene el inconveniente que la respuesta está limitada por el oxígeno presente en la muestra, especialmente grave cuando se encuentra a una concentración por debajo de la de substrato. Además este biosensor no es muy sensible y tiene unos tiempos de respuesta dilatados. Ahora bien presenta muy pocas

H2O2 o H2O

O2

FAD

FADH2

S

POxidasa

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interferencias. Con todo versiones más modernizadas de estos biosensores se comercializan actualmente especialmente para aplicaciones biotecnológicas. Por otro lado, un biosensor de glucosa también puede operar en modo anódico, inmovilizando la enzima GOD sobre un transductor de grafito o platino, y aplicando el potencial adecuado para detectar H2O2 . En este caso, la señal será directamente proporcional a la concentración de glucosa en el seno de la solución. De todas formas la detección anódica de peróxido, aunque es más sensible que la detección catódica de oxígeno con el electrodo de Clark, presenta varios inconvenientes analíticos. La reacción electroquímica depende del pH

H2O2 → O2 + 2 H+ + 2 e-

y, además, el potencial a aplicar es muy extremo; entre 0.6 y 0.7 V (vs.Ag/AgCl, a pH 7.0) si utilizamos electrodos metálicos y más superiores aun si utilizamos electrodos de carbono. Este hecho, hace que este modo de operación no sea adecuado para muestras biológicas, ya que el electrodo, a dichos sobrepotenciales, también detectaría otras sustancias oxidables presentes en la muestra (ascorbato, urato y paracetamol, por ejemplo). Esta inconveniencia ha sido parcialmente paliada, en multitud de diseños, en base a membranas permselectivas en contra de las especies interferentes Mediación electrónica. Una forma de eludir los problemas acabados de citar, ligados a la dependencia de las oxidasas al cosubstrato natural O2, es sustituir a éste en su acción regeneradora de la enzima por un mediador artificial. Los mediadores son pares redox de bajo peso molecular que transportan electrones desde el centro redox de la enzima a la superficie del transductor. Durante el ciclo catalítico, la forma oxidada del mediador primero reacciona con la forma reducida de la enzima y después difunde hacia el electrodo indicador donde es rápidamente reoxidado. Dicha estrategia, basada en un mecanismo de «difusión del mediador» se puede esquematizar de la siguiente forma:

en donde el mediador (M) y la enzima oxidasa modifican la superficie de un transductor amperométrico. De la observación del esquema anterior, se puede deducir que para que este sistema bioelectrocatalítico propuesto tenga propiedades biosensoras es necesario que el mediador posea las siguientes propiedades: a) Que reaccione rápidamente con la enzima. b) Que posea una transferencia heterogénea de electrones reversible (rápida).c) Que necesite un bajo sobrepotencial para ser regenerado en el electrodo, para reducir el efecto de las interferencias. e)Que sea independiente del pH, f) Que sea estable tanto en su forme oxidada como reducida. g) Que no reaccione con el oxígeno, y h) Que no sea tóxico.

n e-

M(red)

M(ox)

FAD

FADH2

S

POxidasa

63

El mediador 1,1’-dimetilferroceno adsorbido sobre carbono y posteriormente la enzima GOD inmovilizada covalentemente es una configuración, insensible al oxígeno, que opera a 165 mV vs. SCE, y que ha sido comercializada con éxito como biosensor de glucosa en sangre entera para autocontrol de pacientes diabéticos. Han sido preparados derivados del ferroceno funcionalizados con pirrol monomérico, con el que se pueden preparar sobre un transductor capas electropolimerizadas, que ocluyen GOD, y que actuan de mediadoras electrónicas. El tetratiafulvaleno (TTF) es otro mediador que compara favorablemente con el ferroceno.

Recientemente, han sido propuestos unos ‘cables redox’ (redox wires), por ejemplo, el complejo de poly-4-vinilpiridina y [Os(bpy)2Cl2], que sirven para mediar entre los centros redox de la enzima y el transductor mediante un mecanismo de «salto de electrones».

CH3CH3Fe2+

S

S

S

S(a) (b)

Figura 29. Ejemplos de mediadores electrónicos artificiales: 1,1’-dimetilferroceno (a) y tetratiafulvaleno (b).

Transferencia electrónica directa. El centro redox de una enzima esta rodeado de una cubierta de proteína, que dificulta la transferencia electrónica directa hacia o desde el electrodo. Normalmente no es posible, o es lenta e irreversible, ya que la velocidad de transferencia electrónica entre moléculas y electrodos decrece exponencialmente con la distancia, y además las proteínas tienden a desnaturalizarse por las zonas de contacto con una superficie Pero se puede conseguir una transferencia directa si la macromolécula enzimática se orienta adecuadamente sobre el electrodo. Uno de los primeros ejemplos de transferencia directa reportados se basa en la adsorción conjunta de citocromo c y el promotor 4,4’-bipiridil sobre un electrodo de oro. Los anillos de piridina del promotor adsorbido reconocen los grupos de lisina del borde del grupo hemo de la proteína, orientando a ésta para una rápida transferencia de carga.

Las sales orgánicas conductoras (metales orgánicos) son unos buenos materiales electródicos que permiten la transferencia directa. Estos materiales son complejos estables de transferencia de carga, formados por la transferencia parcial de un electrón entre una molecula dadora y otra aceptora. Ambas moléculas orgánicas son planas, con sistemas de electrones π, y se disponen en forma de capas segregada dadoras y aceptoras, alternadamente. Las sales orgánicas conductoras presentan unos bajos potenciales operacionales, con una buena cinética de transferencia electrónica, una respuesta rápida y una buena estabilidad. Estos materiales conductores son atractivos, no sólo desde el punto de vista electroquímico, sino por su fácil preparación.

Han sido reportados biosensores de glucosa basados en una mezcla de glucosa oxidasa y una sal conductora en polvo, comprimida en forma de disco para ser adaptado a un electrodo. Las sales más utilizadas para GOD y otras oxidasas (xantina oxidasa ,colina oxidasa, etc.) son del tipo NMP+TCNQ- o TTF+TCNQ- .

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CN

NC

NC

CN

S

S

S

S

N

N

CH3

(a) (b) (c)

Figura 30. Ejemplos de moléculas dadoras, tetratiafulvaleno (a) y N-metilfenacinio (b) y aceptoras, tetracianoquinodimetano (c) utilizadas en la preparación de sales orgánicas conductoras.

La Tabla 14 recoge algunos ejemplos de biosensores amperométricos que utilizan oxidasas.

Tabla 14. Ejemplos de biosensores amperométricos basados en enzimas.

Biosensores amperométricos enzimáticos Substrato Enzima Transducción Observaciones Glucosa GOD

GOD/HRP

O2H2O2[Fe(CN)6]3- Ferroceno TTF,TCNQ ferroceno

Analytical Instruments (Japón) Yellow Springs (USA) ZWG(Alemania) Hofmann-LaRoche (Suiza) Exactech (USA)

Peróxidos orgánicos HRP o-fenilendiamina Alimentación Aminoácidos D-AOx

L-AOx H2O2H2O2

Selectividad enantiomérica

Lactosa β-Gal/GOD Leche Glutamato GlOD Biofermentadores Lactato LDH

Citocromo b2LOD

NADH [Fe(CN)6]3-

H2O2

Vinos, leche, medicina deportiva ZWG (Alemania)

Fructosa FDH NADH Miel, zumos Malato MDH NADH Vinos Alcohol ADH, NADH

AOD

Azul de Meldola NMP,TCNQ H2O2

Vinos

Yellow Springs (USA) Metano MMO NADH NADH Diaforasa [Fe(CN)6]3- Hipoxantina XOD/HRP Ferroceno Calidad del pescado Bilirrubina BOD/HRP Fe(CN)6]3- Acetiltiocolina AChE Producto de la

reacción Determinación de pesticidas por inhibición enzimática

Fenoles Laccasa Tirosinasa Polifenol oxidasa

Producto de la reacción

Control ambiental

Colesterol COD COD/HRP

H2O2ferroceno

Colesterolemia

Acido úrico Uricasa H2O2 Uriquemia Nitrato Nitrato

reductasa Metil viológeno Control ambiental

Nitrito Nitrito reductasa

Metil viológeno Control ambiental

Sulfito Sulfito oxidasa H2O2 Pasta de papel

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Deshidrogenasas Estas enzimas catalizan la transferencia de hidrógeno desde el substrato S hacia un aceptor redox A (que no es oxígeno molecular) o viceversa. Catalizan reacciones del siguiente tipo:

S + A P + AH Un grupo de unas 250 deshidrogenasas requieren de la misma coenzima NAD+

(dinucleótido de nicotinamida y adenina) o NAD(P)+ (con un fosfato adicional) para funcionar catalíticamente. Así pues, a causa de la importancia de este cofactor redox, su electroquímica ha atraído una atención muy considerable para poderla implementar en un electrodo para poder detectar substratos según el siguiente esquema:

El NAD+ no se encuentra unido a la estructura proteica de la respectiva deshidrogenasa, es una especie soluble que se manipula analíticamente como un reactivo adicional. Este cofactor es caro y no muy estable, y difícil de inmovilizar en un electrodo, para conseguir un biosensor «sin reactivos». La oxidación del NADH es la vía utilizada para el diseño de estos biosensores. Desafortunadamente el comportamiento del par NAD+/NADH es más bien irreversible en el electrodo. Se puede llevar a cabo la oxidación con electrodos no modificados, pero a un elevado sobrepotencial, y además dando un producto que se adsorbe y pasiva el electrodo, degradando la respuesta. En efecto, los primeros biosensores de lactato, basados en lactato deshidrogenasa (LDH) coinmovilizada con NAD+ sobre carbono vitrificado, permitían detectar el substrato a 0.75 V vs. Ag/AgCl (muy por encima del potencial redox del cofactor: –0.32 V) , según la siguiente reacción:

CH3CHOHCOO- + NAD+ CH3COCOO- + NADH + H+LDH

pero la estabilidad del dispositivo era muy reducida. La estrategia que se ha seguido, en general, para superar estas dificultades y mejorar la transferencia electrónica es la modificación del electrodo, para operar a potenciales más convenientes. Se han utilizado modificadores electrocatalíticos como hexacianoferrato(III), hidroquinona, catecoles, etc. Los mejores resultados se obtienen con mediadores que funcionen también como aceptores de protones. Un mecanismo de funcionamiento distinto tiene el azul de Meldola (7-dimetilamino-1,2-benzofenoxazina).

S

P

NAD +

Deshidrogenasa

NADH + H+

n e-

66

Este colorante, que se adsorbe bien sobre grafito, reduce el sobrepotencial de la transferencia electrónica (0.0 mV vs. SCE), a través de un complejo de transferencia de carga entre el cofactor y el modificador, que permite la mediación electrónica por transferencia intermolecular (saltos de electrones). El problema encontrado en todos estos sistemas es su pobre estabilidad, debida a la pérdida de mediador adsorbido en la superficie del electrodo. Las sales orgánicas conductoras han resultado particularmente útiles para la reoxidación del NADH (a -0.2 V vs. Ag/AgCl) y han permitido desarrollar biosensores basados en un gran número de deshidrogenasas ( para glucosa, alcohol, colesterol, etc) Como que este tipo de catálisis es reversible se puede utilizar el esquema anterior en dirección contraria para detectar piruvato a pH < 7, a partir de la reducción de NAD+ en el electrodo. Aunque la reducción de NAD+ en el electrodo ocurre fácilmente, no se recicla el NADH sino que pasa por una especie dimérica que se adsorbe. Por otro lado, los mediadores que se utilizan para rebajar el potencial de oxidación del NADH, como los acabados de comentar, no funcionan muy bien en la dirección reversa de reducción del NAD+.

Finalmente, una estrategia que permite controlar reversiblemente las propiedades electroquímicas del NAD+ es mediante una regeneración enzimática mediada. Se emplea una enzima (diaforasa) capaz de reducir el cofactor, mientras que el mediador (metil viológeno) transferirá los electrones al electrodo a un bajo potencial aplicado (-0.45 V):

El esquema anterior también podría funcionar en sentido contrario, para medir substratos tipo P a partir de la corriente catódica obtenida disminuyendo adecuadamente el valor del potencial aplicado. Además del grupo de deshidrogenasas acabadas de comentar que funcionan con el cofactor lábil NAD+ , existen las deshidrogenasas que contienen el grupo prostético PQQ (2,7,9-tricarboxi-1H-pirrolo[2,3]quinolin-4,5-diona o pirroloquinolinquinona)fuertemente unido al apoenzima.. Forman la clase de enzimas conocidas como quinoproteínas. Este tipo de deshidrogenas, en principio, nos facilitan las configuraciones de biosensores reagentless, ya que nos simplifican su diseño porque no precisan de la inmovilización adicional del cofactor, por tenerlo ya incorporado. La glucosa deshidrogenasa–PPQ cataliza la oxidación de la glucosa en presencia de aceptores de electrones como NMP+ o ferrocinio, pero no funciona en presencia de O2.O sea , esta enzima nos permite preparar biosensores de glucosa independientes del

(red)

Diaforasa

(ox)

S

P

n e -(ox)

viológeno

NAD +

NADH + H+

67

oxígeno que pueda contener las muestras. La Tabla 14 también recoge algunos ejemplos de biosensores amperométricos basados en deshidrogenasas.

Peroxidasas

Estas enzimas catalizan la oxidación de un substrato por el peróxido de hidrógeno, siguiendo reacciones simbolizadas por

S + H2O2 → P + H2O

En la reacción con el cosubstrato peróxido de hidrógeno, la forma nativa de la enzima se oxida en una etapa en que intervienen dos electrones (compuesto I). La regeneración a la forma nativa se lleva a cabo mediante dos etapas de reducción de un electrón cada una, pasando por un intermediario (compuesto II). El interés analítico de este sistema enzimático es para la determinación de peróxido de hidrógeno (y de algunos peróxidos orgánicos). Para ello se utilizan como substratos dadores de electrones con propiedades electroquímicas reversibles, tales como hexacianoferrato(II), ferroceno, aminas aromáticas, compuestos fenólicos, ascorbato, yoduro, etc., haciendo el papel de mediadores electrónicos entre la enzima y el electrodo, según el esquema siguiente:

También ha sido descrita la transferencia directa de electrones entre la enzima y el electrodo, a potenciales inferiores a 0.6 V vs. SCE. La corriente medida es debida a la reducción directa bioelectrocatalítica de los compuestos I y II. Dicha reacción electródica, no obstante es más bien lenta en la mayoría de materiales electródicos. Por esta razón, aparte de utilizar los mediadores ya comentados, también se han ensayado electrodos modificados con polímeros conductores, tanto redox como electrónicos, para facilitar la transferencia electrónica. Hemos visto que el peróxido de hidrógeno es un producto de las reacciones enzimáticas catalizadas por las oxidasas. Por lo tanto, si coinmovilizamos una oxidasa y una peroxidasa podremos detectar el substrato de la oxidasa utilizando los sistema de detección de peróxido comentados anteriormente Así, por ejemplo, la glucosa se puede determinar a potenciales mucho más bajos que los de oxidación de H2O2, a partir de la reducción catódica del cosubstrato mediador de la peroxidasa coinmovilizada con la glucosa oxidasa sobre grafito, según las siguientes ecuaciones:

S(red)

P(ox)

I

Peroxidasa II

0

H2O2

H2O

n e -

68

Glucosa + O2 → ácido glucónico + H2O2H2O2 + M(red) → H2O + M(ox)

M(ox) + ne → M(red)

La Tabla 14 también muestra algunos ejemplos de biosensores amperométricos basados en peroxidasas.

4.2 Biosensores electroquímicos basados en células

Los biosensores enzimáticos acabados de comentar en la sección anterior utilizan enzimas purificadas, separadas de diferentes tipos de materiales biológicos (microorganismos y tejidos de plantas y animales). Aunque las enzimas puras presentan un mayor grado de selectividad que los preparados enzimáticos crudos, ya que estos contienen generalmente varios materiales bocatalíticos, hay que tener en cuenta que las enzimas conservan toda una serie de propiedades cuando se encuentran en su medio celular, optimizado de una forma natural. Este hecho hace que, a causa de las propiedades potenciales de los materiales celulares (ver Cuadro 6A y Tabla 15) y de su facilidad de integración con los transductores electroquímicos, se haya explorado intensamente el desarrollo de biosensores basados en células enteras. Los biosensores basados en microorganismos (bacterias y levaduras) se construyen fácilmente. Se aplica sobre el transductor electroquímico una biocapa ( paté de células) preparada por filtración de un volumen determinado de un medio de cultivo en donde se ha efectuado el crecimiento de las células, inmovilizándola físicamente a través de una membrana semipermeable. De forma análoga podemos retener sobre el transductor finos cortes (0.2-0.5 mm de espesor) de tejidos animales, de hongos, pulpa de frutos, triturados de tallos y estructuras intactas de plantas (pétalos, hojas, etc). Aunque hay algún material celular con actividad enzimática muy selectiva en conjunción con el transductor adecuado (por ejemplo, células de mucosa de intestino pequeño de ratón para la adenosina, Bacillus subtilis para α-amilasa, Methylomonas flagellata para metano ) no es la situación habitual. Uno de los problemas de estos biosensores es su escasa selectividad, pero esta limitación se puede solventar en algunos casos fijando muy bien las condiciones operacionales. De todas formas, la investigación en este campo dispone de diferentes y variadas herramientas citológicas, microbiológicas y electroquímicas que dotan de selectividad (y sensibilidad) a las medidas efectuadas con estos dispositivos. A modo de ejemplo citaremos: uso de cepas manipuladas genéticamente, permeabilización de las membranas celulares y prevención del transporte de interferentes a través de ellas, inducción de síntesis enzimática en células microbianas, inhibición enzimática de rutas metabólicas interferentes, regulación del medio de trabajo, uso de membranas para prevenir de interferencias el transductor o

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el material celular, uso de mediadores redox cuando intervienen sistemas biocatalíticos de este tipo y, finalmente, siempre es necesario realizar una selección racional del transductor.

Tabla 15. Propiedades de los materiales celulares, en comparación con las enzimas aisladas, como elementos de biorreconocimiento en el desarrollo de biosensores electroquímicos.

Propiedades de los materiales celulares en los biosensores Los microorganismos y los tejidos de plantas y animales son una fuente muy

accesible de enzimas no alteradas La rutas enzimáticas inherentes a las células son de difícil reproducción al exterior

de ellas Las reacciones enzimáticas ya están optimizadas en el interior de las células Cofactores, activadores, etc., necesarios para la reacción enzimática se encuentran

ya en el interior de las células La estabilidad enzimática frente a cambios del medio es mayor que en las

enzimas purificadas Bajo coste, ya que no necesitan de procesos purificación ni de aditivos (cofactores,

estabilizadores, etc.). El cultivo de células microbianas y la preparación de cortes finos de tejidos es fácil y barato.

Permiten la detección de efectos de una sustancia o grupos de sustancias sobre un paso metabólico determinado o sobre el metabolismo global de la célula

Buena integración con los sistemas electroquímicos Posibilidad de transducción directa y continua, y de otros principios de medida a

partir de la actividad respiratoria de la células vivas. Inmovilización más simple que la que precisan las enzimas aisladas Tiempo de vida largo, especialmente el material celular, ya que es regenerable Tiempo de respuesta largo, a causa de la resistencia a la difusión de las

membranas celulares Menor selectividad que las enzimas aisladas

Se han desarrollado dos clases principales de biosensores basados en células, si atendemos a su diferente principio de funcionamiento. A continuación se comentan brevemente. Detección de un producto de la reacción enzimática. El elemento transductor del biosensor detecta una sustancia que proviene del substrato transformado dentro de la célula. El producto medido puede ser amoníaco, dióxido de carbono, iones hidrógeno, peróxido de hidrógeno, sulfuro de hidrógeno, etc. (ver Tabla 16). Estos productos pueden provenir de uno o varios pasos enzimáticos. En la mayoría de casos se detectan con los correspondientes electrodos selectivos de iones. En el caso de reacciones enzimáticas redox también se pueden hacer la detección a través de mediadores electrónicos (iones ferrocinio, hexacianoferrato(II), etc.) Cambios en la respiración microbiana. Cuando las células no convierten el substrato en un producto adecuado para su detección selectiva con un transductor, los

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microorganismos se pueden inmovilizar directamente sobre la membrana permeable a gases de un electrodo de oxígeno (§3.2). El electrodo registra la actividad respiratoria de las células vivas como una disminución de la concentración de oxígeno cerca del transductor. Este tipo de electrodo, llamado electrodo respirométrico, ha sido aplicado a la determinación de glucosa y otros azúcares, etanol, metanol, acido acético y otros compuestos (ver Tabla 16). Ya que el consumo de oxígeno va asociado a la producción de dióxido de carbono, también puede ser utilizado un sensor potenciométrico de CO2como transductor. La detección de O2 o CO2 puede estar relacionada con la asimilación de varios substratos; por esta razón, este principio de medida se ha utilizado en la estimación de la contaminación de las aguas por sustancias orgánicas, expresada en forma del conocido parámetro «demanda biológica de oxígeno» (DBO).

Tabla 16. Ejemplos de biosensores electroquímicos basados en células.

Biosensores basados en células Substrato Tipo de célula Transducción Ácido acético Adenosina Aminoglicósidos DBO Catecolaminas Cefalosporinas Dopamina Etanol Glutamina Azúcares reductores

Trichosporon brassicae Mucosa del intestino de ratón Escherichia coli Bacillus subtilis Hoja de espinaca Citrobacter feundii Pulpa de plátano Saccharomyces cerevisae Riñón de cerdo o pétalo de magnolia Bacterias de la placa dental

O2NH3CO2O2O2H+

O2[Fe(CN)6]3-

NH3H+

Otra interesante aplicación de los electrodos respirométricos es en la determinación de vitaminas. El aumento en el consumo de oxígeno en la respiración de la levadura Saccharomyces cerevisiae es proporcional a la concentración presente de tiamina (vitamina B1). De forma contraria, la presencia de sustancias inhibidoras disminuye el consumo de oxígeno (o la producción de dióxido de carbono). De esta forma se han empleado biosensores con distintos tipos de cepas sensibles para la determinación de antibióticos como tetraciclinas, gentamicina, nistatina, etc. Con el mismo fundamento estos biosensores se pueden utilizar como sensores de grupos de sustancias tóxicas en aguas (pesticidas, metales pesados, etc.). O pueden ser utilizados en el screening de mutágenos, como en el caso de la utilización de una cepa de Bacillus subtilis deficiente genéticamente que reduce la respiración en presencia de una sustancia mutagénica, mientras que no se altera la misma cepa salvaje utilizada de control, ya que es capaz de reparar la molécula de DNA dañada.

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4.3 Inmunosensores

Los inmunosensores representan una estrategia de integración de los procedimientos convencionales de inmunoensayo, con el valor añadido que conlleva la configuración de sensor (pequeñas dimensiones, bajo coste y utilización amigable). En el formato clásico de sensor y utilizando transducción electroquímica, los inmunosensores, por utilizar una reacción de reconocimiento de afinidad, como es la interacción anticuerpo-antígeno (ver Cuadro 6B), no pueden generar la información en tiempo real, la tienen que efectuar indirectamente a través de marcadores del evento de reconocimiento. En este sentido no son verdaderos sensores, sino más bien unas ‘sondas inmunoquímicas’ (immunochemical probes). La especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno se puede utilizar para separar, identificar y cuantificar cualquier sustancia que tenga propiedades inmunoquímicas. Así, pues, los anticuerpos han encontrado aplicación como potentes herramientas analíticas cualitativas y cuantitativas. Han sido usados en procedimientos de diagnóstico y cuantificación, en donde el analito es el antígeno o el propio anticuerpo, no únicamente en el campo clínico y veterinario, sino también en muestras ambientales, de alimentos y en monitoreo de bioprocesos industriales. El desarrollo de metodologías químicas para conjugar (enlazar) enzimas a los anticuerpos, sin que unas y otros pierdan su actividad biológica, conjuntamente con la posibilidad de inmovilizar el material inmunológico sobre fases sólidas, representó un paso importante en la consolidación de las técnicas de inmunoensayo, gracias al concepto ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). En esta metodología, la cuantificación de un antígeno se facilita por el marcaje enzimático de una de las especies del par inmunológico (antígeno o anticuerpo), ya que una vez formado el inmunocomplejo sobre una fase sólida, y una vez lavado el exceso de reactivos, la enzima fijada en la superficie se pueda cuantificar mediante la adición del substrato en exceso. Inmunosensores amperométricos. Implementan las técnicas ELISA en un formato de biosensor amperométrico. Permiten detectar la interacción anticuerpo-antígeno a partir de reactivos inmunológicos, por un lado, marcados enzimáticamente y, por el otro, inmovilizados sobre un transductor amperométrico, Es decir, integran la selectividad y otras importantes propiedades de las reacciones inmunológicas (ver Tabla 17), la sensibilidad y otros atributos de las reacciones enzimáticas (ver Tabla 12) y la simplicidad de la detección amperométrica (ver §3).

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Tabla 17. Propiedades de los anticuerpos como elementos de biorreconocimiento en el desarrollo de biosensores electroquímicos.

Propiedades de los anticuerpos Elevada selectividad y sensibilidad Disponibilidad potencial de anticuerpos anti cualquier tipo de sustancia química Amplio intervalo de respuesta Procedimientos de inmovilización bien establecidos Más estables que las enzimas Mecanismo de acción relativamente rápido pero de difícil transducción Transducción indirecta y discontinua Adsorción inespecífica sobre las superficies de trabajo Precio alto Difícil reutilización Producción masiva

Las determinaciones inmunológicas con inmunosensores se llevan a cabo normalmente en formato competitivo o no competitivo (sandwich) (ver Figura 31) En el ensayo no competitivo, el analito compleja a su contraparte, que está inmovilizada sobre el transductor. Se añade un segundo anticuerpo marcado enzimáticamente anti un epítopo del analito distinto del interviene en la formación del complejo. Finalmente, se adiciona substrato en exceso y se mide la actividad de la enzima en la superficie del transductor. El valor de la intensidad de corriente es proporcional a la cantidad de analito en la muestra. En el ensayo competitivo, se basa en un equilibrio competitivo entre un exceso de conjugado enzimático (antígeno o anticuerpo, según así sea el analito) y el analito en la solución muestra y su contraparte inmovilizada sobre el transductor. Se adiciona substrato en exceso y se mide la actividad de la enzima en la superficie del transductor. El valor de la intensidad de corriente es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra. Para la mayoría de aplicaciones, la información requerida es del tipo ‘sí o no’, especialmente si o no el antígeno está presente en la muestra o por encima de una cierto valor umbral. En los ensayos deben incluirse referencias con controles positivos y negativos para validar los resultados. Para cuantificación de un antígeno o un anticuerpo se debe preparar una curva de calibrado con varios puntos ya que no son lineales.

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S

P

a

b

c

d

(B)

S

P

(A)

Figura 31. Determinación de especies inmunológicas mediante inmuno-sensores amperométricos. a) Se bloquea los sitios de enlace inespecífico de la superficie del inmunosensor con una proteína inespecífica; por ejemplo, con albúmina de suero bovino .(A) Formato no competitivo: b) Se incuba el inmunosensor en la muestra durante un tiempo prefijado. Se lava el material adsorbido inespecíficamente en la superficie del transductor modificado. c) Se añade un anticuerpo marcado enzimáticamente anti analito, que se une a éste por otro epítopo distinto al que ha utilizado el anticuerpo inmovilizado. Se lava la superficie para remover el conjugado enzimático que no se ha adsorbido específicamente. d) Se adiciona el substrato en exceso y se mide la intensidad de corriente, que corresponde a la velocidad máxima de la reacción enzimática (saturación por el substrato) y, por tanto, proporcional a la actividad enzimática en superficie y a la concentración del analito en la muestra. (B) Formato competitivo. b) Se incuba el inmunosensor en presencia del analito y de un conjugado enzimático de la misma estructura que el analito. c) Durante un tiempo prefijado, el analito y el conjugado enzimático compiten por los sitios de enlace del anticuerpo inmovilizado sobre el transductor amperométrico. Se lava la superficie del inmunosensor de especies adsorbidas inespecíficamente. d) Se añade el substrato en exceso y se mide la intensidad de corriente, que es inversamente proporcional a la concentración del analito en la muestra.

Algunos inmunosensores utilizan un electrodo de Clark como transductor . En este caso los marcadores enzimáticos son la glucosa oxidasa (consumo de O2) o la catalasa (producción de O2). Se ha descrito un inmunosensor de hCG (gonadotropina coriónica humana) en donde el anticuerpo está inmovilizado en la cara exterior de la membrana permeable al oxígeno y compite con hCG analito y hCG conjugado con catalasa.

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CatalasaH2O + ½ O2H2O2

Después de un tiempo de incubación del inmunosensor en la muestra, se mide la actividad de catalasa presente en la membrana a partir de la señal del oxígeno. Otras configuraciones que inmovilizan el material inmunológico directamente sobre el transductor amperométrico (carbono o platino), utilizan como marcador la fosfatasa alcalina (ALP). Esta enzima cataliza la hidrólisis de ésteres fosfóricos para producir fosfato inorgánico y un derivado fenólico:

ALP Ph-OH + HPO42- H2O2Ph-OPO3

2- + H2O

Se ha utilizado el fenilfosfato como substrato, que permite detectar el fenol producido a 750 mV vs. Ag/AgCl, pero el electrodo se va pasivando a causa de la electropolimerización del radical fenoxi formado. Mejores resultados proporciona el 4-aminofenil fosfato debido a la electroquímica reversible que presenta el producto de la reacción enzimatica, el 4-aminofenol a 100 mV vs. Ag/AgCl. Otros marcadores enzimáticos utilizados son la glucosa oxidasa y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Finalmente, las ventajas de un ensayo con un inmunosensor amperométrico sufren de la necesidad de remover los materiales adsorbidos no específicamente (analito, conjugado enzimático, etc) antes de efectuar la medición de la actividad enzimática del marcador enlazado correctamente. Esto conlleva una serie de precauciones y de lavados repetidos, que hace que la técnica pierda en parte su propiedad potencial de ser usada en diagnóstico no centralizado, fuera del laboratorio. Por esto las investigaciones actuales van en la dirección de métodos más simples y rápidos sin necesidad de separación. Inmunosensores potenciométricos. Pocos ejemplos existen en la literatura sobre la detección directa de reacciones inmunoquímicas basadas en transductores electroquímicos. Una posibilidad es la modulación del potencial de membrana a través de reacciones inmunoquímicas, y su posible implementación como dispositivos sensores. Si en un electrodo selectivo de iones basado en una membrana de portador móvil, funcionalizamos el portador (ionóforo) responsable del reconocimiento con una molécula de antígeno, convertimos el electrodo en un sensor del correspondiente anticuerpo. En efecto, la respuesta del electrodo frente a un nivel de referencia del ion principal, se modificará en presencia del anticuerpo, ya que, en la interficie de la membrana, la interacción anticuerpo-antígeno causará un reequilibrio del portador con el ion principal, provocando un cambio de potencial. ImFET. Los transistores de efecto de campo sensibles a iones (ISFET) (ver § 2.3.8) han encontrado aplicación en el desarrollo de biosensores, en configuraciones análogas a las comentadas anteriormente para los EnFET (ver § 4.1.1).La aportación potencialmente más interesante de estos dispositivos de estado sólido es en configuración de ImFET (‘FET modificado con material inmunoquímico’). Los ImFET pueden seguir de forma directa las interacciones anticuerpo-antígeno. En efecto, un FET puede ser considerado como un dispositivo que responde a cambios de la

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distribución de carga interfacial. La inmovilización covalente de un anticuerpo en la capa sensible de dieléctrico de un FET hará que el material biológico de reconocimiento forme parte de la doble capa existente en la superficie sensora. Los anticuerpos son polielectrolitos cuya carga neta depende de las condiciones del medio. La interacción del anticuerpo con un antígeno (tanto si éste es iónico como neutro) provocará un cambio en la distribución de cargas en la doble capa, que será transducida por el dispositivo según su modo de operación.

4.4 Genosensores

El análisis del DNA se ha convertido en un área de estudio que ha trascendido la

biología molecular. La detección de una secuencia específica de bases nitrogenadas en ácidos nucleicos de personas, animales, vegetales, virus y bacterias (ver Cuadro 6B) nos permite tratar problemas de naturaleza muy diversa. Por un lado poder determinar las causas de enfermedades hereditarias e infecciosas, e investigar diversas cuestiones relativas a muestras forenses. Por otro lado, muchos problemas que tradicionalmente sólo se podían abordar mediante técnicas microbiológicas clásicas, actualmente se pueden estudiar a través del análisis del DNA, con técnicas de biología molecular y, en último término, con unas herramientas bioquímicas, como es el caso de problemas de contaminación por microorganismos de alimentos y aguas potables, y de muchos otros aspectos medioambientales. A medida que avanza la revolución biotecnológica, animales, plantas y microorganismos son modificados genéticamente para proporcionar nuevos productos, cuya detección y control necesita de herramientas analíticas de tipo génico. Las técnicas convencionales de análisis de una secuencia génica específica se basan en la secuenciación directa o en la hibridización del DNA. En general, debido a su simplicidad, las técnicas de hibridización son cada vez más utilizadas para fines diagnósticos. En dichas técnicas, la secuencia de interés (analito) es identificada por una hebra de DNA (ssDNA), cuya secuencia es complementaria; es decir, forma una doble hélice (dúplex , híbrido o dsDNA) con el analito. La reacción de hibridización ocurre con gran especificidad y afinidad; tengamos en cuenta que la formación del híbrido se produce en muestras reales en presencia de una gran diversidad de otros DNA no complementarios. El desarrollo de técnicas de ensayo que permitan la hibridización en fase sólida y que además sean rápidas, sensibles y que se puedan multiplexar, es una demanda acuciante en diagnóstico genómico. Los genosensores, en especial los de tipo voltamperométrico (ver Tabla 18) pueden dar una respuesta a dicha demanda. Representan una estrategia de integración de los procedimientos convencionales de análisis de DNA por hibridización, con el valor añadido aportado por la configuración de sensor (pequeñas dimensiones, bajo coste y utilización amigable). No obstante, en el formato clásico de sensor y utilizando transducción electroquímica, los genosensores, por utilizar una reacción de reconocimiento de afinidad, como es la interacción DNA-DNA, muy difícilmente pueden generar la información en tiempo real, lo hacen

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indirectamente a través de marcadores del evento de reconocimiento. En este sentido no son verdaderos sensores, sino más bien unas ‘sondas’ (probes).

Tabla 18. Propiedades de los ácidos nucleicos como elementos de biorreconocimiento en el desarrollo de biosensores electroquímicos.

Propiedades de los ácidos nucleicos Especificidad y sensibilidad Disponibilidad de las sondas de DNA mediante síntesis química Amplio intervalo de respuesta Posibilidad de amplificación del DNA por PCR (polymerase chain reaction) Procedimientos de inmovilización bien establecidos Más estable que las enzimas y los anticuerpos a los cambios de fuerza iónica,

temperatura y solventes orgánicos. Mecanismo de acción relativamente rápido pero de difícil transducción Reversibilidad de la hibridización Transducción indirecta y discontinua Adsorción inespecífica sobre las superficies de trabajo Precio bajo Producción masiva

Los genosensores amperométricos integran, como elemento de reconocimiento, biológico una simple hebra de DNA (sonda), que confiere selectividad, y un transductor amperométrico, que aporta sensibilidad y nos permite disponer de una señal del dominio eléctrico. Para implementar esta integración han sido ensayadas distintas estrategias, algunas parecidas a las ya comentadas de inmunoensayo, otras más específicas de la molécula de DNA. La Figura 32 ilustra dichas estrategias. Amplificación. En principio, las sondas génicas permiten detectar picogramos de ácido nucleico. En muchos casos este límite de detección no es suficiente y, a diferencia de todos los analitos que hemos tratado en las secciones precedentes, el material genético se puede amplificar. Un procedimiento muy potente se basa en la amplificación enzimática de una secuencia de DNA determinada con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polimerase chain reaction), por la que K. Mullis recibió el premio Nobel (1993). La secuencia en cuestión es amplificada por esta enzima termoestable en ciclos repetidos de calentamiento (deshibridización de la sonda y el analito) y enfriamiento (hibridización), pasando por un temperatura intermedia en la que la polimerasa replica la secuencia del analito y la sonda, o sea que se doblan las copias de DNA en cada ciclo, aproximadamente 106 copias en 20 ciclos (220). Detección cronopotenciométrica. . Esta estrategia se basa en la detección directa de la hibridación a partir de las propiedades electroquímicas de la guanina. Si adsorbemos una sonda génica sobre un electrodo de grafito, presenta un pico cronopotenciométrico (dt/dE vs. E) de oxidación a 1.03 V vs. Ag/AgCl, debido a la guanina. Dicho pico disminuye en presencia de una secuencia complementaria de analito. Esto es debido a

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que con la hibridación las bases de un dsDNA se disponen en el interior de la doble hélice, rodeadas exteriormente por los azúcares, siendo su detección más impedida en comparación con la de una sonda de ssDNA. Este método tiene la limitación que no se puede utilizar para un ssDNA analito que contenga muchas bases de guanina, ya que podría interferir en la señal de referencia de la sonda. Una posibilidad para soslayar este problema es utilizar sondas que contengan inosina en vez de guanina, ya que el pico de la inosina está separado del de la guanina y, por tanto, podremos detectar en este caso la hibridización a través únicamente de los residuos de guanina provenientes del DNA analito.

(D)(C)

(B)(A)

(D)(C)

(B)(A)

(C)

(B)(A) (B)(A) (B)(A) (B)(A)(A)

Figura 32. Algunos formatos asociados a la utilización de genosensores electroquímicos. La sonda no marcada se adsorbe sobre el transductor y la hibridización se detecta a través de los residuos de guanina del dúplex (A) o de un reactivo electroactivo (intercalador) (B). El analito se inmoviliza sobre el transductor y la sonda conjugada con una enzima se encuentra en solución (C). Una sonda de captura está inmovilizada sobre el transductor y otra sonda conjugada con una enzima se encuentra en solución, las cuales reconocen dos secuencias distintas del analito (D). Los formatos A y B utilizan técnicas de redisolución cronopotenciométrica como sistema de medida. Los formatos C y D también se pueden realizar con las respectivas sondas adsorbidas sobre el transductor , aunque la inmovilización covalente de ssDNA por uno de sus extremos proporciona una hibridización más eficiente. Los formatos C y D, con marcadores enzimáticos, permiten la utilización de técnicas amperométricas

Una estrategia muy productiva para detectar si se ha formado un dúplex (dsDNA) en la superficie de un electrodo, se basa en el uso de indicadores electroactivos de hibridización, tales como complejos metálicos catiónicos del tipo Co(phen)33+ o Co(bpy)33+ y análogos de Ru(II), Fe(II) , Cu(II), etc, o compuestos orgánicos como daunomicina, naranja de acridina, antraciclinas, fenotiazinas,etc. Estos compuestos, conocidos como intercaladores, interaccionan de una forma distinta con el ssDNA o

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con el dsDNA, pero lo hacen preferencialmente con el dsDNA, ya sea a través de interacciones electrostáticas dentro de los surcos mayores o al interior de la hélice en posiciones planares paralelas, intercaladas con las de las bases. El método adolece de que necesita una cantidad elevada de dsDNA sobre el electrodo, para poder obtener una señal voltamperométrica significativa del intercalador electroactivo acumulado. La técnica de elección es la de análisis por redisolución cronopotenciométrica. Detección amperométrica. La utilización de este tipo de transducción va ligada al uso de marcadores enzimáticos conjugados con las sondas de DNA. El poder de amplificación del efecto catalítico hace que el evento de hibridación pueda ser detectado mediante transducción amperométrica, en formatos no muy alejados conceptualmente a los usados para detectar las interacciones anticuerpo-antigeno (ver la Figura 32) Finalmente, otro modo de utilización de los genosensores es como biosensores de productos electroactivos como fármacos, carcinógenos, contaminantes, etc., que tienen la propiedad de intercalarse o enlazarse electrostáticamente con dsDNA, siendo utilizado éste como elemento de reconocimiento molecular inmovilizado sobre el transductor.. La transducción se realiza como ya se ha comentado anteriormente por CPSA (análisis por redisolución cronopotenciométrica). Hay también esquemas en la bibliografía para transducir en una señal electroquímica la acumulación de un analito no electroactivo : a) desplazamiento competitivo de un intercalador electroactivo previamente acumulado , y b) cambios en la señal intrínseca asociada a la oxidación de la guanina, ocasionados por los cambios químicos, estructurales o conformacionales en el complejo dsDNA-analito.

4.5 Inmovilización de material biológico

El concepto de biosensor implica que el elemento de reconocimiento biológico esté en íntimo contacto con el elemento transductor. Este contacto debe ser permanente, por lo que los materiales biológicos tienen que estar fijados de alguna forma en la superficie del transductor. El proceso de fijación de material biológico se denomina inmovilización. Conceptualmente es análogo al ya comentado de modificación (ver § 3.3), utilizándose uno o otro término cuando se quiere hacer énfasis sobre el material que se inmoviliza o sobre el substrato que se modifica. En relación al campo de los biosensores, tal como se comentó en el apartado referido a los electrodos modificados químicamente, y ahora también para la modificación biológica, los procesos de inmovilización, que pueden ser en superficie o en volumen, no deben dañar la actividad del material biológico ni al material transductor. Cualquiera que sea el método de inmovilización tiene que tener en cuenta una serie de extremos que son descritos en la Tabla 19.

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Tabla 19. Factores a tener en cuenta en los procesos de inmovilización de material biológico sobre transductores electroquímicos.

Factores para la inmovilización Preservación de la actividad y de la selectividad de la biomolécula Preservación o incremento de la estabilidad de la biomolécula, durante la

utilización, reutilización y almacenamiento del biosensor Preservación de la superficie activa del transductor No introducir sustancias extrañas con los procesos de inmovilización Reproducibilidad y simplicidad de los métodos de inmovilización, para poder

fabricar los biosensores en serie Deben de evitarse condiciones extremas ( pH, temperatura, fuerza iónica, etc.).

Existe un arsenal de metodologías de inmovilización de material biológico sobre las superficies de los transductores. Recordemos que dichas superficies son de carbono, platino, oro o sílice (dispositivos de estado sólido). A continuación clasificamos y comentamos, de una forma muy general, las distintitas metodologías de inmovilización, sin pretender ser exhaustivos, remitiendo al lector a la bibliografía más especializada. Adsorción física La adsorción de biomoléculas sobre los transductores es el procedimiento más simple y menos agresivo de inmovilizar. No se necesitan reactivos especiales. Los materiales biológicos adsorbidos prácticamente guardan intacta su actividad. Pero la adsorción no es muy reproducible ni estable, y los biosensores resultante presentan problemas de pérdida de sensibilidad con el uso, debido al desprendimiento del material inmovilizado. Las proteínas (enzimas y anticuerpos) y los ácidos nucleicos se adsorben bien sobre distintos materiales, vía fuerzas de van del Waals, puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, interacciones electrostáticas, etc. Dichas fuerzas son reversibles y se interrumpen fácilmente con cambios de pH, temperatura, y fuerza iónica. Un exceso de material proteico puede formar múltiples capas y bloquear la superficie del transductor. De hecho, la inmovilización por adsorción se reserva para trabajos exploratorios. Entrecruzamiento Se puede conseguir una estabilización adicional de las proteínas adsorbidas sobre los transductores mediante el enlace intermolecular con reactivos bifuncionales de entrecruzamiento (crosslinking), tales como glutaraldehido, diisocianato de hexametileno, etc. El entrecruzamiento puede alterar los centros activos de la enzima, por esto es aconsejable mezclarla con una proteína no activa, como la albúmina de suero bovino (BSA), para que ambas se entrecrucen y se repartan el efecto indeseable del agente bifuncional, preservándose más la actividad enzimática. Aunque se puede controlar el grado de entrecruzamiento con la cantidad de agente bifuncional utilizado,

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la capa resultante de material inmovilizado introduce restricciones en la difusión de los substratos, que pueden ser moduladas para extender el intervalo de respuesta del biosensor. Este es un método simple para inmovilizar biomoléculas, especialmente enzimas, pero altera la actividad biológica e introduce barreras difusionales a los substratos. Atrapamiento La inmovilización de biomoléculas mediante su atrapamiento físico en matrices de geles, como poliacrilamida, goma de silicona o gelatina, por ejemplo, es un método que preserva bien la actividad biológica. El polímero más utilizado es la poliacrilamida, preparado por copolimerización de acrilamida con N,N’-metilenbisacrilamida. La polimerización, en presencia del material biológico, se puede llevar a cabo bajo radiación UV in presencia de vitamina B1 como fotosensibilizador. Hay que optimizar el procedimiento para que la biomolécula no se libere con facilidad y los biosensores pierdan sensibilidad. Los microorganismos se inmovilizan a menudo con este tipo de técnicas. Corresponde también a este apartado el atrapamiento de material biológico, básicamente enzimas, en polímeros conductores (ver § 3.3). Los métodos de atrapamiento son muy utilizados porque preservan la actividad biológica, pero no retienen bien a la biomolécula e introducen barreras difusionales, limitando el transporte del substrato y alargando la respuesta del biosensor. Retención con membranas El uso de membranas semipermeables de varias porosidades permite retener sobre el transductor el material biológico sin necesidad de reactivos de ningún tipo, dejando permear el substrato más o menos libremente. Así por ejemplo, las membranas de acetato de celulosa (membrana de diálisis) retienen a las proteínas y retardan la difusión de algunos iones interferentes, las de policarbonato (Nucleopore® ) son microporosas, las de PTFE (Teflon® ) son permeables a gases, las de Nafion excluyen aniones, etc. Las membranas de polímeros conductores se pueden considerar por analogía permeables a electrones. . La utilización de membranas permite un buen contacto entre el material biológico y el transductor, Es un método muy adaptable , que preserva las propiedades del material biológico. Limita la contaminación y la biodegradación. Es estable a los cambios de pH, temperatura, fuerza iónica y composición del medio. Unión covalente El enlace químico de una biomolécula a un transductor proporciona superficies sensoras muy estables a los cambios de pH, temperatura y fuerza iónica. Tal como ya se ha comentado en § 3.3, este tipo de inmovilización no es trivial y comporta el uso de procedimientos tediosos y de difícil reproducibilidad. Normalmente se parte de la activación de grupos funcionales en la superficie sensible del transductor (carbono,

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platino o sílice) para posteriormente, mediante agentes bifuncionales (como el glutaraldehído), poder unir covalentemente la proteína o los ácidos nucleicos, a través de sus grupos funcionales (-NH2, -COOH, -OH,-SH, -Ph-OH, etc.), los cuales no han de ser esenciales para la acción catalítica o el reconocimiento por afinidad. Muchas veces, el enlace covalente daña la actividad biológica. Este método de inmovilización disminuye la actividad biológica, pero permite obtener superficies estables modificadas biológicamente, que proporcionan unos biosensores de largo tiempo de vida. Biocompósitos Los métodos anteriores son procedimientos de modificación superficial de los transductores. En el caso de los biosensores amperométricos, de forma análoga a la que se comentó para los compósitos conductores (ver § 3.3), es posible preparar un material biocompósito que integra en su seno el transductor (grafito en polvo), la enzima, los posibles mediadores o cofactores, y un material aglomerante que hace la función de matriz de soporte. Según las propiedades de esta matriz, los biocompósitos pueden ser blandos o rígidos, presentando unos propiedades muy atractivas como materiales para el desarrollo de biosensores enzimáticos e inmunosensores, análogas a las comentadas anteriormente para los compósitos conductores.

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5 Bibliografía seleccionada

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3. D. Diamond (Ed). Principles of chemical and biological sensors. Wiley, Nueva York (1998).

4. Ll. Godé. Los electrodos selectivos en el análisis de aguas. Colección Temas Ambientales, GPE SA, Barcelona (1996).

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Revistas especializadas Sensors and Actuators, serie B, Elsevier, Amsterdam Biosensors and Bioelectronics, Elsevier, Amsterdam Materials Science & Engineering: C (Biomimetic Materials, Sensors and Systems), Elsevier, Amsterdam Sensors, http://www.mdpi.net/sensors/ (revista digital) IEEE Sensors Journal, IEEE, USA.

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CUADRO 6A. BIORRECEPTORES Y BIOSENSORES: Biorreceptores catalíticos.

Los biosensores son sensores químicos cuya parte receptora está formada por material biológico de reconocimiento molecular. En primer lugar se realiza un sucinto repaso a los distintos materiales metabólicos, enzimas y células, utilizados en la construcción de biosensores; para una información más detallada remitidos al lector a una obra general de bioquímica o de biología. Enzimas. Combinan el reconocimiento molecular con la transformación molecular. Son unos catalizadores, específicos y eficientes, que hacen posible la coexistencia de un elevado número de reacciones químicas en la célula. En algunas enzimas, los grupos funcionales se completan con metales o moléculas orgánicas (cofactores) que contribuyen a ampliar la gama de reacciones a catalizar. Los metales pueden actuar de catalizadores, estabilizadores de estructuras transitorias o transportadores de electrones. Las moléculas orgánicas con función de cofactor pueden estar unidas permanentemente (grupo prostético) o no (coenzima) al resto de la molécula enzimática. El centro activo de una enzima (E) es una región tridimensional donde se une el substrato (S) –y el cofactor si participa–, formada por un clúster de grupos funcionales que determinan la afinidad, la especificidad y la capacidad de transformación química de S en P (producto de la reacción). Generalmente los centros activos son unas cavidades hidrofóbicas que excluyen casi totalmente las moléculas de agua. La unión entre S y E se realiza mediante fuerzas débiles (enlaces electrostáticos, de van der Waals, hidrofóbicos, puentes de hidrógeno, etc.). La complementariedad entre E y S determina el número y la dirección de estos enlaces y, en último término, es la causa de la especificidad y de la afinidad de la interacción entre S y E. Las enzimas catalizan las reacciones acercando los substratos a sus cavidades hidrofóbicas y obligándolos a adquirir orientaciones y geometrías reactivas. Los centros activos son una réplica complementaria de la geometría del estado de transición (Pauling, 1948). Éste es un estado postulado, difícil de conseguir, en el cual la molécula tiene que pasar durante su transformación de S en P. Pero las enzimas ofrecen una cavidad complementaria a la estructura del estado de transición, estabililizándolo, y haciendo más fácil la consecución de una determinada geometría molecular que sería improbable de otra manera, cuya geometría conlleva una disminución de la energía de activación y, consecuentemente, una aceleración de la reacción. Por esto si existe la presencia de compuestos análogos estructurales al estado de transición, estas moléculas se comportarán como poderosos inhibidores enzimaticos competitivos o, por otro lado, si obtenemos anticuerpos monoclonales ‘anti-análogos del estado de transición’, estos presentarán propiedades catalíticas (anticuerpos catalíticos o abzimas). Como que el estado de transición implica la complejación entre S y E, habrá un máximo de concentración de substrato que se puede procesar a la vez. Para explicar este fenómeno de saturación, que no presentan los catalizadores no biológicos, en donde la velocidad de reacción tiende a un límite (velocidad máxima, Vmax) independiente de S, se postuló la existencia de un complejo específico entre E y S (ES). El mecanismo más simple que da una interpretación de la saturación puede ser:

E + S ES E + P k 1

k -1

kcat

Para expresar la ecuación de la velocidad inicial (vo) en términos de magnitudes conocidas, como [S] y [E]o (concentración estequiométrica total de los centros activos, siendo [E]o = [E]+[ES]) se aplica el concepto de estado estacionario. Al cabo de poco tiempo (ms) de mezclar E y S, la velocidad de formación de ES (k1[E][S]) se iguala a la velocidad de descomposición de ES (k-1 + kcat[ES]).De esta manera, la concentración del complejo ES se mantiene constante con el tiempo, Con esta hipótesis se llega a la ecuación de Michaelis-Menten:

[ ][ ]SKSVv

M

maxo +

=

donde Vmax = kcat[E]o y KM =( k-1 + kcat )/ k1 . La representación gráfica de vo frente [S] es una hipérbole rectangular (ver Fig. C2). A concentraciones bajas de substrato, [S]<< KM , la velocidad de reacción vo es directamente proporcional a la concentración de substrato (reacción de primer orden). En cambio, a altas concentraciones de substrato, [S]>> KM, la asíntota vo tiende a Vmax , la reacción es de orden cero, la velocidad es independiente del substrato, sólo depende de la actividad de la enzima (todos los centros activos están ocupados por S, es decir [ES]=[E]o); es lo que explica el fenómeno de saturación. KM es conocida como constante de Michaelis y operativamente corresponde a la concentración de substrato en que vo = Vmax/2 . Además de KM y Vmax, la constante catalítica o número de recambio (kcat) y la actividad específica([E]o)son importantes parámetros que caracterizan las reacciones enzimáticas y, desde el punto de vista de los sensores, su poder de amplificación de la señal. Cada enzima tiene un valor de pH óptimo característico, en el cual su actividad es máxima. Este valor depende de la composición del medio, la temperatura y la estabilidad de la enzima en el medio. Como todas las reacciones enzimáticas, la velocidad de las recciones enzimáticas aumenta con la temperatura. Ciertas sustancias (inhibidores) rebajan la velocidad de las reacciones enzimáticas y pueden actuar

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reversiblemente o irreversiblemente. Entre los mecanismos cinéticos de inhibición reversible, se pueden citar la inhibición competitiva, la no competitiva y la mixta (también llamada acompetitiva).

Vmax

0.5 V max

KM[S]

Comportamiento hiperbólico de la velocidad inicial (en escala relativa a la velocidad máxima) frente la concentración de substrato para una reacción enzimática monosubstrato.

Células. Una alternativa a las enzimas purificadas es la utilización de material celular. Son una fuente de enzimas más barata que las enzimas aisladas y purificadas. Varios tipos de células se han utilizado en la construcción de biosensores. Las más comunes son células bacterianas y levaduras. También se han utilizado organismos multicelulares como tejidos de plantas y animales superiores, normalmente preparados en forma de finos cortes de determinados órganos. Algunas enzimas pierden parte de su actividad cuando se inmovilizan; este riesgo se minimiza utilizando células enteras, ya que de hecho inmovilizan de forma natural a las enzimas que contienen. Además las enzimas en el interior de la célula se encuentra en su medio natural, lo que conlleva una mayor estabilidad en comparación con las enzimas aisladas. Son más tolerantes a los cambios de temperatura y pH, y más insensibles a la inhibición. A menudo, las células presentan coenzimas y activadores, por lo que no hace falta añadirlos a los medios de trabajo. El cultivo de células microbianas o la preparación de cortes de tejidos es fácil y barato. Los microorganismos pueden regenerar o modular su actividad enzimática utilizando los nutrientes adecuados. De todas formas la utilización de microorganismos y de tejidos de animales o plantas para catalizar reacciones presenta unos tiempos de respuesta y de recuperación más largos, debido las barreras difusionales introducidas por las membranas celulares. Generalmente presentan una multiplicidad de enzimas y esto hace que la selectividad de las reacciones sea menor. Las mitocondrias son estructuras subcelulares que contienen componentes biocatalíticos. Su utilización puede, en algunos casos, mejorar la selectividad.

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CUADRO 6B. BIORRECEPTORES Y BIOSENSORES: Biorreceptores de afinidad.

Como segundo grupo de materiales, se repasan los conceptos biológicos relacionados con los biorreceptores de afinidad: anticuerpos, receptores celulares y ácidos nucleicos; para una información más detallada remitidos al lector a una obra general de bioquímica o de biología. Anticuerpos. Son proteínas plasmáticas de elevado peso molecular (inmunoglobulinas) producidas por el sistema inmune de los organismos en respuesta a sustancias extrañas (antígenos). Un antígeno es cualquier tipo de macromolécula capaz de inducir una respuesta inmune. A diferencia de las enzimas, los anticuerpos no son catalizadores. Las inmunoglobulinas (Ig) pueden dividirse en varias clases, de distintos peso moleculares y propiedades (IgG , IgM, IgA, IgD e IgE). Cada inmunoglobulina consiste de dos cadenas peptídicas ‘ligeras’(L) y de dos cadenas ‘pesadas’ (H) enlazadas entre sí por puentes de disulfuro e interacciones no covalentes entre los residuos de aminoácidos. Las cadenas H son casi el doble de largas que las L. La molécula de anticuerpo se puede describir como una estructura en forma de Y, teniendo en el extremo de cada brazo un sitio específico para enlazarse en una parte de la molécula del antígeno, llamada epitopo.. La interacción anticuerpo-antígeno se efectúa a través de enlaces débiles no covalentes (puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, hidrofóbicas, electrostáticas, etc), reconociéndose mutuamente la estructura complementaria de ambas moléculas. El resultado de la reacción de bioafinidad entre un anticuerpo (Ab) y un antígeno (Ag) es un complejo de reconocimiento molecular (AbAg) de una elevada estabilidad, gobernado por la constante de afinidad K

[ ][ ][ ]AgAb

AbAgK =

Los valores de K están comprendidos entre 104 y 1012 litro·mol-1.Aunque estos biorreceptores se pueden considerar muy atractivos por su selectividad y sensibilidad, al no poseer efecto catalítico, es decir, al no ir acompañado el reconocimiento de transformación, el seguimiento de la interacción anticuerpo-antígeno mediante transductores electroquímicos debe efectuarse mediante métodos indirectos, generalmente utilizando marcadores enzimáticos en alguna de las especies del par inmunológico. Mientras que las enzimas sólo cubren un número determinado de substratos, ligados a las rutas metabólicas de los organismos, optimizadas evolutivamente, en base a la regulación enzimática, se pueden preparar anticuerpos contra una amplia gama de sustancias, naturales o sintéticas, siempre que provoquen la respuesta del sistema inmune del animal huésped. La molécula debe de poseer un cierto tamaño (> 5000 D) y complejidad. Sustancias de bajo peso molecular, como fármacos, lípidos, esteroides, hormonas, péptidos y antibióticos, no inducen respuesta inmune por sí mismas, pero sí que lo hacen si se conjugan a una molécula grande inmunogénica (por ejemplo, una proteína). Dicho tipo de sustancias se llaman haptenos.Cuando un animal se inmuniza con una sustancia inmunogénica se produce una mezcla de moléculas de anticuerpo (anticuerpos policlonales). En efecto, normalmente una molécula inmunogénica posee varios epitopos distintos (determinantes antigénicos) susceptibles de inducir sus respectivos anticuerpos. La producción in vivo de suero policlonal y la consiguiente separación del material inmumológico es un procedimiento bien establecido. En la práctica, en los procedimientos de inmunoensayo, puede que un anticuerpo policlonal no sea adecuado para algunas aplicaciones analíticas. Actualmente también existe la producción in vitro de anticuerpos monoclonales (tecnología del hibridoma) o de fragmentos de anticuerpos (tecnología del DNA recombinante), que proporciona material inmunológico idéntico, que se une a un mismo epitopo de la molécula de antígeno. Aunque estos reactivos inmunológicos son cada vez más accesibles, su precio es elevado en comparación con las enzimas. Conviene seleccionar bien el tipo de material a utilizar para una aplicación concreta, ya que los precios son muy dispares (antisuero < fracciones de inmunoglobulinas < policlonales intactos purificados por afinidad = monoclonales intactos < fragmentos). Receptores. Son proteínas que muestran una bioafinidad específica hacia hormonas, neurotransmisores, neurotoxinas, etc. (agonistas). Generalmente están localizadas en las membranas celulares. La unión receptor-agonista es estereoespecífica y no covalente. Cuando acontece dicha unión se dispara un efecto biológico amplificado (de varios órdenes de magnitud) en el interior de la célula, como puede ser la apertura de un canal iónico que altera el potencial de transmembrana, la activación de un mensajero secundario o de un sistema enzimático. La utilización de este concepto pasa por la incorporación del receptor en una membrana artificial; en otros casos se han utilizado estructuras biológicas ‘intactas’, por ejemplo antenas de cangrejo, que son unos

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órganos quimisensores olfativos adaptados evolutivamente en medio acuoso para detectar trazas de sustancias vitales. De todas formas, la integración de este tipo de reconocimiento sobre transductores, para su posterior desarrollo práctico de biosensores, está aun en sus estadios iniciales, pero sus aplicaciones potenciales son muy interesantes. Acidos nucleicos. La información del genoma requerida por los organismos para mantenerse vivos, reproducirse y hacer posible su diversidad está codificada por los ácidos nucleicos. Los ácidos desoxirribonuclico (DNA) y ribonucleicos (RNA) son polinucleótidos transportadores de información biológica, codificada en secuencias determinadas de nucleótidos derivados de sólo cuatro bases nitogenadas –adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T) para el DNA o uracil (U) para el RNA–. Los nucleótidos son ésteres fosfóricos de los nucleósidos, los cuales, a su vez, están formados por la unión de una base nitrogenada y una pentosa (2’-desoxi-β-D-ribosa o β-D-ribosa), mediante un enlace N-glicosídico. Todas las moléculas de DNA muestran básicamente una estructura de doble hélice. Las dos cadenas de polinucleótidos son complementarias y antiparalelas, se mantienen juntas principalmente por puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas adenina y timina y entre guanina y citosina. El reconocimiento entre ambas cadenas es altamente selectivo. Una sola alteración en una base de una secuencia con respecto a la secuencia complementaria hace que no se lleve a cabo o se desestabilice el apareamiento o reconocimiento (hibridización). Así, pues, esta especificidad del proceso de hibridización ha sido explotada para fines diagnósticos y analíticos, especialmente por la facilidad en obtener secuencias sintéticas (sondas génicas) complementarias a las secuencias de los analitos. No obstante, la identificación de este reconocimiento no es trivial, a menudo se realiza a través de marcadores, de forma parecida a las metodologías inmunoquímicas.

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CUADRO 7. SENSORES: LA PRÓXIMA OLA EN TECNOLOGÍAS DE LA INFORMACIÓN

Llevamos aproximadamente cincuenta años de revolución de la información, desde la llegada de la radio y televisión a todos los hogares, hasta la multidifusión del PC. Nuestros abuelos quedarían perplejos de cómo los ordenadores se han introducido en el trabajo, los hogares, el ocio, etc. abriendo una senda que todavía no queda claro donde nos puede llevar. Si analizamos la época reciente de las tecnologías de la información se observa que aproximadamente cada década surge un paradigma diferente, que lleva asociados sus dispositivos y operaciones. Los años 80 fueron la década del microprocesador, que vivió su explosión desde los centros informáticos hacia los hogares. Esta fue llamada la “Revolución del Ordenador Personal”, pero en realidad lo que significó es que comenzó a procesarse mediante ordenadores una cantidad de información y de procesos hasta entonces no imaginada. A finales de los 80 una segunda tecnología sufrió una difusión masiva parecida, que fue la disponibilidad de lasers baratos y adaptados a las comunicaciones. Este punto supone el paso de una capacidad ingente de procesamiento a una capacidad enorme de acceso a información procesada, que está teniendo su culminación en el la red global actual, Internet. Dicha red accede a información por medios ópticos (el CD-ROM) y también por medios ópticos es como la transmite a la máxima velocidad (la fibra óptica). Dicho sea de paso, dicho acceso universal presupone también una interconexión universal de millones de ordenadores. En esta visión cada nuevo escalón no hace obsoleta la anterior tecnología, sino que la potencia. La llegada de Internet no hizo anticuados los ordenadores, quizás únicamente el modelo concreto del que disfrutábamos, pero supuso la necesidad de mas ordenadores en lugares donde hasta aquel momento no se habían necesitado. ¿Así pues, cual es la tecnología que nos espera en la primera década del siglo XXI? Algunos futurólogos ya están afirmando que lo que representará la nueva revolución será precisamente la incorporación de los sensores al esquema ya existente de millones de ordenadores con una vasta capacidad de procesamiento y con acceso remoto a cantidades ingentes de información. Lo nuevo será la generación puntual de esa información gracias a los sensores con los que habremos dotado a los ordenadores, lo cual significará un incremento exponencial de la información de nuestro entorno. Para ello se necesitan sensores baratos, ubicuos y de altas prestaciones. Y su forma, la implementación en pequeños ingenios, inteligentes e interconectados, que recogen la información de su entorno. El comienzo estará en el uso de sensores físicos, pero el reto está en lograr lo mismo con sensores químicos y biosensores, los cuales podrán suministrar información valiosa en el campo agrícola, de producción industrial, ambiental, clínico, etc. Y la acción característica de la tercera época será, tras el procesamiento y el acceso a la información, la interacción, esperemos que inteligente, maquina-maquina, hombre-maquina y hombre-hombre (mediada por ordenador). Es decir, la revolución cibernética.

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6 Índice 1 Sensores químicos ................................................................................................... 1

1.1 Sensores electroquímicos ............................................................................... 3

2 Sensores potenciométricos ..................................................................................... 8

2.1 Electroquímica de los sensores potenciométricos ........................................ 8

2.1.1 Puente salino........................................................................................... 14

2.2 Potencial de membrana................................................................................ 15

2.3 Los diferentes sensores potenciométricos................................................... 18

2.3.1 Una primera clasificación....................................................................... 18 2.3.2 Electrodos cristalinos.............................................................................. 18 2.3.3 Electrodos no cristalinos......................................................................... 21 2.3.4 Electrodos de portador móvil ................................................................. 22 2.3.5 Electrodos selectivos miniaturizados ..................................................... 28 2.3.6 Electrodos sensibles a gases ................................................................... 29 2.3.7 Biosensores potenciométricos ................................................................ 31 2.3.8 Sensores potenciométricos basados en FETs ......................................... 33

2.4 Aspectos prácticos en el trabajo con sensores potenciométricos.............. 36

2.4.1 Expresiones de trabajo............................................................................ 36 2.4.2 Caracterización de la selectividad .......................................................... 38 2.4.3 Actividad y concentración ...................................................................... 39 2.4.4 Procedimientos y aplicaciones................................................................ 40

3 Sensores amperométricos .................................................................................... 44

3.1 Electrodos modificados químicamente ....................................................... 45

3.1.1 Electrocatálisis........................................................................................ 46 3.1.2 Preconcentración .................................................................................... 47 3.1.3 Permeación selectiva .............................................................................. 48

3.2 Electrodo de oxígeno .................................................................................... 49

3.3 Modificación química de los electrodos ...................................................... 50

4 Biosensores electroquímicos ................................................................................ 56

4.1 Biosensores basados en enzimas.................................................................. 56

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4.1.1 Biosensores potenciométricos ................................................................ 57 4.1.2 Biosensores amperométricos .................................................................. 59

4.2 Biosensores electroquímicos basados en células ........................................ 68

4.3 Inmunosensores ............................................................................................ 71

4.4 Genosensores................................................................................................. 75

4.5 Inmovilización de material biológico .......................................................... 78

5 Bibliografía seleccionada ..................................................................................... 82

6 Índice ..................................................................................................................... 88