Seminario y trabajo práctico nº 1 2014

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  • 1. 1Seminario y trabajo prctico N 1: Monxido de carbono -cido cianhdrico y cianuros alcalinosSeminario y trabajo prctico N 1Monxido de carbono -cido cianhdrico ycianuros alcalinosEditor: Prof. Dra. Edda C. Villaamil LeporiAutores: Prof. Bioq. Adriana Ridolfi; Bioq. Gloria lvarez2014

2. 2Seminario y trabajo prctico N 1: Monxido de carbono -cido cianhdrico y cianuros alcalinos1.1 MONXIDO DE CARBONO1.1.1 -IntroduccinEl monxido de carbono (CO) es un gas txico, inodoro, incoloro, no irritante, msliviano que el aire.Es la causa principal de muerte por intoxicacin en los Estados Unidos y en Argentinaocurren alrededor de 3000 casos de intoxicaciones anuales siendo fatales entre 250 y300 casos.Fuentes de monxido de carbono:Se produce por la oxidacin incompleta durante la combustin de gas, carbn o dequerosn, en hornallas, braceros, estufas de gas y en los calentadores porttiles sinrespiraderos, lo puede generar emanaciones con concentraciones altas de monxido decarbono en el medio ambiente interior.Se combina con la hemoglobina para formar carboxihemoglobina, que es incapaz detransportar oxgeno, por lo que se produce anoxia tisular.Las muestras que se utilizan en el anlisis de CO pueden ser:a) Biolgicas: sangre entera. Se emplea para control laboral o de una posibleintoxicacin (accidental o intencional) y tambin en el mbito forense como posiblecausa de muerte.b) No biolgicas: muestras de aire para controles en el ambiente de trabajo y parainvestigar la calidad del aire ambiental en las ciudades.1.1.2 - Mtodos analticosExisten variados mtodos analticos para la investigacin cualitativa y cuantitativa delmonxido de carbono en sangre. Se pueden clasificar en mtodos fsicos y mtodosqumicos.Algunos mtodos fsicose basan en la mayor estabilidad de la carboxihemoglobina(COHb) respecto de los dems pigmentos hemticos y otros investigan la presencia deCO gas. A su vez comprenden mtodos no-instrumentales e instrumentales. Dentro delos primeros se encuentra el Ensayo de dilucin y el Ensayo alcalino.Las tcnicas instrumentales incluyen varias metodologas como las espectroscpicas,espectrofotomtricas, gasomtricas, calorimtricas, absorcin al IR y cromatografagaseosa.Los mtodos qumicos se basan en el poder reductor del CO. Esta caractersticapermite emplear sales de Pd2+ o el I2O5.De todos los mtodos que se disponen hoy en da para la determinacin de monxidode carbono, el mtodo fsico instrumental cooximtrico es el mayormente utilizado enlos laboratorios toxicolgicos, clnicos y forenses. Esto se debe a la facilidad deoperacin del instrumental, la poca muestra necesaria (sangre alrededor de 0,1 ml) ypor la rapidez de la obtencin de los resultados.Mtodo de referencia para la determinacin de CO en aireSe basa en la absorcin de radiacin infrarroja (RI) por el CO, en un fotmetro nodispersivo. La radiacin IR producida pasa por 2 celdas iguales, una conteniendo undetector selectivo y la otra CO. El CO en la celda absorbe RI en sus frecuenciascaractersticas y el detector es sensible a esas frecuencias. Con un gas diferente queno tenga CO en la celda de muestreo las seales estn balanceadas electrnicamente.Si se introduce CO en la celda de muestreo absorber RI la cual ser detectadaelectrnicamente y produce una seal de salida. 3. 3Seminario y trabajo prctico N 1: Monxido de carbono -cido cianhdrico y cianuros alcalinosExisten en el mercado instrumentos manuales para medir CO en el aire como el que semuestra en la figura 1.Figura 1.- Instrumento de medicin de 0 a 2000 ppm de CO1.1.2.1- Mtodos Fsicosa)- Mtodos no instrumentales (Cualitativos)Ensayo de dilucin (Haldane)El mtodo consiste en la comparacin a simple vista de la coloracin de la muestra desangre sospechosa diluda con otra normal en igual dilucin. Una alcuota de sangrenormal y otra de la muestra en estudio se diluyen con agua, generalmente al 1%, y secomparan los colores. La sangre normal tiene habitualmente un color rojo amarillentomientras que si la muestra desconocida tiene COHb, el color sercarminado rosadotpico indicador de la presencia de COHb Es un mtodo de baja sensibilidaddetectndose diferencia de color cuando la saturacin de la hemoglobina con CO esmayor del 30%.Ensayo alcalinoSe basa en la mayor estabilidad de la COHb, dentro de ciertos lmites, con respecto ala labilidad del pigmento hemtico normal (Hb) en un medio alcalino.Una muestra de sangre normal y la muestra de sangre en estudio se diluyen con agua,se agrega a ambas muestras NaOH y se observa el color.La sangre normal adquiere color castao por transformacin de la Hb en hematinaalcalina. La hematina es la globina desnaturalizada que tiene el Fe como Fe3+.La sangre con COHb mantiene por unos minutos su color carminado, porque la COHbes ms resistente y ms estable al tratamiento por lcalis. Luego de varios minutostambin se transformar en hematina, por lo tanto es importante la observacininmediata.Este ensayo tiene como interferencia la sangre fetal o de recin nacido ya que la Hbfetal es resistente al tratamiento con lcalis y por lo tanto se comporta como laCOHb.La sensibilidad de este ensayo es superior a la del mtodo anterior, ya que con unporcentajede saturacin de la Hb con CO superior al 10%, se puede diferenciar de unanormal.b)- Mtodos instrumentalesMtodos EspectrofotomtricosSe basan en la determinacin de la Absorbancia a longitudes de onda caractersticasdentro del espectro visible. Estas Absorbancias son generalmente mximas, mnimas opuntos isosbsticos. De esas diferencias de absorbancia a distintas longitudes de onda,se obtiene la concentracin de COHb de la muestra. Existen distintas tcnicas con grancantidad de interferencias: se debe trabajar en condiciones estrictas de pH y 4. 4Seminario y trabajo prctico N 1: Monxido de carbono -cido cianhdrico y cianuros alcalinostemperatura. Los picos de Absorbancia de la OHb y COHb son cercanos, laconcentracin de COHb debe ser elevada para que no interfiera la OHb.Sensibilidad: alrededor del 5% de saturacin de COHb en la muestra de sangre. Hastaun 5% de saturacin se puede detectar trabajando en condiciones preestablecidas.CooximetraEl Cooxmetro (figura 2) es un analizador semiautomtico capaz de medir laconcentracin de Carboxihemoglobina (COHb) y otras hemoglobinas en muestras desangre entera. Bsicamente estos equipos son fotmetros para mltiples longitudes deonda. Realizan la lectura de la absorbancia a 4 o 5 longitudes de onda para unamuestra de sangre hemolizada y mediante algoritmos programados calculan laproporcin de cada componente de la hemoglobina total. Las fracciones analizadasson: desoxihemoglobina, oxihemoglobina, sulfohemoglobina, metahemoglobina ycarboxihemoglobina.Emplean filtros de interferencia para seleccionar una lnea dada del espectro deemisin de una lmpara de ctodo hueco de Tl-Ne. No requieren calibracin habitualde la longitud de onda.Los clculos son realizados por un microprocesador incorporado el cual a partir de lasmediciones de la absorbancia y las constantes de absortividad de las distintasfracciones calcula su concentracin y, cada fraccin es sumada para obtener laconcentracin de hemoglobina total.La muestra utilizada es sangre entera anticoagulada con heparina. El volumen desangre utilizado vara segn los distintos modelos de cooxmetros, hay equipos en loscuales se inyectan muestras directamente de capilares heparinizados. La muestra sepuede conservar hasta 24 horas a 4C. Pueden interferir en la determinacin elevadosniveles de bilirrubina y muestras lipmicas.Figura 2 - CooxmetroAbsorcin al IREl CO tiene una absorcin caracterstica en el infrarrojo (IR). El CO se libera de lasangre por agregado de ferricianuro de potasio. El gas liberado absorbe al IR estandolos picos entre 2120 2170 cm1 5. 5Seminario y trabajo prctico N 1: Monxido de carbono -cido cianhdrico y cianuros alcalinosCromatografa gaseosaEs el mtodo de eleccin cuando hay otros gases interferentes. Tiene gran sensibilidady puede detectar hasta 0,5% de saturacin de CO en sangre.1.1.2.2- Mtodos QumicosMicrodifusinFundamento de la microdifusinLa cmara de Conway (Figura 3) consiste en un receptculo con dos compartimientosconcntricos, generalmente de porcelana, y una tapa de vidrio esmerilada.Se utiliza para la separacin de compuestos voltiles o gaseosos, fijndolos en unasolucin apropiada para luego cuantificarlos.La tapa de vidrio permite un cierre hermtico, cuando se le aplica el sellador en susbordes (vaselina slida, etc.)Figura 3. Cmara de ConwayEn el compartimiento externo se coloca el material, el cual contiene el txico voltil ogaseoso y en el compartimiento interior una solucin fijadora del txico apropiada paracada caso. El principio en el cual se basa el aislamiento de los compuestos voltiles ogaseosos es el siguiente:Cuando una solucin de un gas o compuesto voltil A, al colocarla en un recipientehermtico se establece el siguiente equilibrio:Recin colocada la solucin en el recipiente, el equilibrio se desplaza hacia la derecha,o sea:Luego de cierto tiempo se llega al punto de equilibrio y se tiene:Si se repite la experiencia, pero se coloca la solucin del compuesto A en elcompartimiento externo de la cmara de Conway y en el compartimiento interno una 6. 6Seminario y trabajo prctico N 1: Monxido de carbono -cido cianhdrico y cianuros alcalinossustancia o solucin fijadora del compuesto A, lo que ocurre es un nuevodesplazamiento hacia la derechaEsto ocurre hasta que se agote el compuesto A en la solucin inicial. Para ayudar ymejorar la liberacin se agrega a la muestra a investigar un reactivo liberador, porejemplo cido sulfrico diludo en el caso de CN-:El tiempo de difusin depender de la temperatura y de cada tipo de sustancia. Amayor temperatura menor tiempo de difusin. No se aconseja elevar la temperatura(colocando en estufa por ejemplo), ya que aumentan las probabilidades de prdida delcompuesto voltil o gaseoso. Para cada tipo de microdifusin est estandarizado eltiempo de difusin a temperatura ambiente.Los mecanismos por los cuales se fijan los compuestos a los reac