Seminario de prueba de Coombs.

Preguntas.

1. Concepto de prueba de Antiglobulina.

R//. Es un análisis de sangre que puede detectar la presencia de anticuerpos en el suero que reaccionan con antígenos en la superficie de los GR.

Coombs directo: detecta anticuerpos ya unidos a la superficie de los GR

Coombs indirecto: detecta anticuerpos libres que pueden reaccionar en vitro con los GR

2. ¿Para qué se utilizó primeramente la prueba de Antiglobulina y quienes la describieron inicialmente?

R//. En 1945, Coombs, Mourant y Race; describieron una prueba para detectar en suero los anticuerpos

3. Principio de la prueba.

R//. Las moléculas de anticuerpos y los componentes del complemento son globulinas.

Al inyectar a un animal globulina humana se estimula la producción de anticuerpos frente a dicha proteína extraña. Además se usan varios reactivos incluyendo anti-IgG, anticuerpos contra el componente C3d y reactivos poliespecíficos con anti-IgG y anti-C3d.

La AGH reaccionara con moléculas de globulina humana tanto si están unidas a GR como libres en el suero. Si los Gr no son previamente lavados para eliminar completamente las globulinas libres, esta pueden neutralizar la AGH y causar falsos positivos.

Los GR recubiertos con globulina humana, una vez lavados, son aglutinados por la AGH.

4. Fragmento de la molécula de AGH que reacciona con el fragmento Fc de las moléculas de anticuerpo humano unida a cada una de las células separadas.

R//. Este es el fragmento Fab.

5. Obtención del reactivo de Coombs.

R//. Se obtiene al inmunizar animales con globulinas del suero humano, estas pueden ser inmunoglobulinas purificadas (IgG, IgM, IgA) y o fracciones de complemento (C3b, C3d), produciéndose antiproteinas humanas en el suero animal, las que se purifican tras absorción con eritrocitos humanos lavados que eliminan las aglutininas no deseadas.

Sueros antiglobulinicos se obtienen de forma policlonal y mediante la tecnología de hibridomas, pueden ser mono o poliespecíficos.

6. Tipos de reactivos, composición y características de cada SAG.R//.

Reactivo DefiniciónPoliespecífico Contiene anti-IgG y anti-C3d. puede

contener otros anticuerpos, anti-complemento y anti-inmunoglobulinas.

Poliespecífico Contiene anti-IgG humano de conejo y anti-C3b y C3d monoclonal del ratón.

Anti-IgG Contiene anti-IgG sin anti-complemento.

Anti-IgG(cadenas pesadas)

Contiene solo anticuerpos que reaccionan con las cadenas gamma humanas.

Anti-C3d y anti C3b, anti C3d Contiene solo anticuerpos que reaccionan con uno o varios componentes del complemento designado. No tiene actividad anti-globulina.

Anti-C3d (monoclonal) y anti-C3b, anti-C3d (monoclonal)

Contiene solo anticuerpos reactivos contra el componente designado del complemento, sin actividad anti-inmunoglobulina.

a) ¿Por qué el reactivo de AGH Poliespecífico debe contener anti-C3d?

Porque es muy importante en la prueba directa ya que se usa en la investigación de la anemia hemolítica autoinmune debido a que el C3d puede ser la única globulina que pueda detectarse sobre los eritrocitos en dicha enfermedad.

b) ¿A qué se debe que en algunos casos se prefiera utilizar un reactivo anti-IgG, a un reactivo AGH Poliespecífico?

Debido a que no reacciona con el complemento unido a las células mediantes autoanticuerpos fríos, que son clínicamente poco significativos.

c) ¿Para qué se utilizan los reactivos AGH monoespecíficos?

Para determinar las proteínas responsables del resultado positivo en la prueba directa de AGH con AGH poliespecífica.

7. Obtención de los reactivos AGH monoclonales.

R//. Se prepara anti-C3d monoclonal del ratón inyectando por vía intraperitoneal a ratones un hibridomas secretor de anti-C3b. se recoge y procesa el líquido ascítico para purificar el reactivo. El anti-C3b y anti-C3d monoclonal de ratón es una mezcla de líquido ascítico extraído de ratones a los que se han inyectado hibridomas secretores de anti-C3b y antiC3d.

8. Finalidad de estudio de la PAD.

R//. Detectar los anticuerpos o componentes del complemento fijados en vivo en los hematíes de un paciente.

9. Uso y aplicaciones de la prueba de Coombs Directa.

R//. Se puede aplicar el en el estudio de EHRN y anemias hemolíticas; de tipo inmune, inducidas por fármacos o por transfusiones sanguíneas, además en: mononucleosis infecciosa, sífilis, leucemia linfocítica, Lupus eritotomatosa, etc.

10.Fuentes de error de la PAD: falsos positivos y falsos negativos.

Fasos positivos Falsos negativosContaminación bacteriana de las muestras o reactivos.

Células viejas no permiten una buena actividad entre antígenos y anticuerpos.

Exceso de centrifugación. Contaminación de las células con proteínas.

Reticulocitosis. Elución del anticuerpo cuando el procedimiento no es continuo

11.Significado de una PAD positiva.

R//. Significa que ocurrió una reacción antígeno anticuerpo in vivo, el paciente tiene fijados anticuerpos o complemento en los GR.

12.Finalidad de estudio de la PAI.

R//. Se utiliza para comprobar in vitro el recubrimiento de los hematíes con anticuerpos o complemento.

13.Uso y aplicaciones de la prueba de Coombs indirecta.R//.

Prueba de compatibilidad: detecta anticuerpos irregulares en el suero del receptor que reaccionan con GR del donante.

Rastreo de anticuerpos. Prueba de identificación de anticuerpos Detección de antígenos eritrocitarios.

14.Fases de la PAI: explique en que consiste cada una de ellas.

Fase Salina:

Fase albumina:

Fase de Coombs:

15.Elución: concepto, cuando se produce, que resultados se obtiene con esta y de qué forma se puede evitar.

R//. Es la causa error que se produce en la realización de la prueba cuando no se lleva la secuencia correcta de la misma. Esta se evita realizando de manera continua el procedimiento técnico.

16.Fuentes de error de la PAI: falsos positivos y falsos negativos.

Fasos positivos Falsos negativosContaminación bacteriana de las muestras o reactivos.

Contaminación del reactivo con suero humano.

Exceso de centrifugación. Elución del anticuerpo cuando el procedimiento no es continuo.Escasa o falta de incubación en la etapa de sensibilización.Lavado incorrecto e insuficiente de los GR.Suspensión de células muy fuerte o muy débil.Uso de suero viejo o plasma.

17.Significado de una PAI positiva

R//. Indica que el paciente tiene anticuerpos incompletos libres en el suero.

18.Diferencias entre la PAD y la PAI.

R//. La diferencia radica en que el PAD detecta anticuerpos que fueron fijados in vivo en los eritrocitos del paciente mientras la PAI detecta los anticuerpos fijados in vitro.

19.Factores que afectan la sensibilidad de la prueba.

R//. Temperatura: los GR y el suero se deben incubar a 37oC

a) Diga a cuál de las dos afecta y explique brevemente cada uno

Fuerza iónica: los GR pueden suspenderse en varios medios (sol Salina, Albumina, Reactivos de baja fuerza iónica “LISS”).

Proporción suero/hematíes: si se aumenta la proporción suero/hematíes, aumenta la cantidad de anticuerpos que recubren las células. Se aconseja una proporción de 2 gotas de suero por 1 gota de suspensión de 2-5% de GR.

Tiempo de incubación: en las técnicas con sol. Salina o Albumina se debe incubar por 30 minutos para detectar la mayoría de anticuerpos.

b) ¿Por qué no debe tapar el tubo con la punta del dedo para mezclar o resuspender los eritrocitos?

Porque pone en peligro la salud del técnico y además se pueden introducir globulinas en la suspensión si las manos están contaminadas con suero o sangre.

c) ¿Por qué para realizar la prueba no debe utilizarse plasma?

Por la presencia de proteínas en este derivado sanguino.

20.¿Qué es el Control Coombs y para que se utiliza?

R//. Son células sensibilizadas con anticuerpos anti-D de tipo IgG y se utiliza para validar todas las pruebas negativas.

21.¿Cuál es el papel del complemento en las reacciones de Antiglobulina?

R//. Los complemento pueden recubrir los hematíes, tanto in vivo como in vitro mediante dos mecanismos.

Los anticuerpos fijadores del complemento unen a este a la superficie celular cuando reaccionan con los antígenos de los GR.

Los complejos inmunes presentes en el plasma pueden activan a los componentes del complemento que pueden fijarse a los GR de forma no especifica.

22.Anticuerpos de grupos sanguíneos que fijan el complemento a la membrana eritrocitaria. Haga una lista de anticuerpos y a la par escriba el nombre del grupo sanguíneo al cual pertenecen.R//.

Sistema AnticuerpoABO Anti-A, anti-BMNNS anti-S, anti-sP anti-P1, anti-Pk, anti-PKell anti-KDuffy anti-Fya, anti-FybKidd anti-Jka, anti-JkbIi anti-I, anti-iLewis anti-Lea, anti-Leb