FISH Hibridación Fluorescente In Situ

Fundamentos:

Las técnicas FISH están basadas en la detección de secuencias específicas de DNA o RNA, en objetos fijados sobre portaobjetos, utilizando sondas fluorescentes.

La detección fluorescente puede ser conseguida etiquetando las sondas directamente con nucleótidos que portan marcaje fluorescente o indirectamente mediante la visualización de nucleótidos modificado.

Una de las ventajas de las técnicas FISH es su amplia gama de aplicabilidad a diversos especímenes, los cuales puedes variar esencialmente desde las rutinarias preparaciones citológicas (núcleos interfásicos), hasta preparaciones de cromosomas de elevada pureza. El principal requisito es que el DNA de la muestra sea lo suficientemente flexible para que pueda ser desnaturalizado, y que al mismo tiempo esté lo bastante fijo como para permanecer en el sitio a lo largo de la hibridación y de los procedimientos de lavado.

La FISH puede ser realizada con una gran variedad de diferentes sondas para detectar el locus o los loci de interés. Uno de los requisitos críticos para la sonda es su capacidad de incorporar una cantidad suficiente de moléculas fluorescentes que permitan la percepción visual. Esa cantidad depende evidentemente de la longitud de la sonda, ya que cuanto más larga sea la secuencia de DNA, más sitios podrán ser normalmente etiquetados. Puesto que los proyectos de mapeo del genoma utilizan más frecuentemente sondas para la detección de un único locus, la concentración de moléculas con fluorescencia en un punto es particularmente crítica. Esta última depende tanto del nivel de marcaje, como del grado de empaquetamiento de la cromatina en el objetivo. Así pues, para los cromosomas metafásicos con el más nivel de condensación y la más baja cantidad de secuencias desempaquetadas de DNA, son preferibles las sondas que lleven grandes insertos (>10kb).

En el caso de DNA no condensado, se pueden visualizar secuencias específicas con sondas que tengan insertos considerablemente más pequeños (unas pocas kb).

Las señales de hibridación se observan y analizan por medio de un microscopio de fluorescencia. El equipo necesario para la microscopía depende mayormente de la aplicación específica de FISH.

Tipos de FISH más característicos:

FISH en metafase

En metafase se utiliza para detectar microdeleciones específicas, translocaciones o para identificar material extra de origen desconocido. Los tipos de sondas usadas son cósmidos, satélites alfas y sondas completas.

Los cósmidos son secuencias únicas que hibridan con fragmentos pequeños. Se emplean en estudios de microdeleciones.

Las sondas satélites están formadas por secuencias altamente repetidas que se encuentran cerca de lo centrómeros. En la mayoría de los casos son específicas de cada cromosoma. Se usan para determinar aneuploidías o para identificar el origen de cromosomas marcadores.

Las sondas completas consisten en la suma de varias sondas que hibridan en distintas zonas del cromosoma

FISH en interfase

No siempre es posible tener núcleos fijados en metafase para realizar el FISH. Normalmente, cuando se fija una célula sin tratar el núcleo se encuentra en interfase, con los cromosomas descondensados. A pesar de ello, es posible realizar el FISH aunque los resultados obtenidos no sean tan específicos. Se emplea sobre todo para la detección de aneuploidías o grandes deleciones, duplicaciones o translocaciones en células fetales o tumorales.

Visualización

El paso final de la hibridación in situ es la detección de la sonda marcada que hibridó con las células. Se requiere de un microscopio de epifluorescencia equipado con diferentes filtros para los diversos espectros de color, en este caso se debe tener en cuenta el tipo de fluorocromo con el que fue marcada la sonda y de esta manera emplear la longitud de onda adecuada que excitará el fluorocromo y emitirá la fluorescencia. La tecnología de procesamiento digital de imágenes mejora la detección de la señal mediante la aplicación de técnicas, que en últimas, busca procesar una imagen con el fin de hacerla más adecuada para una determinada aplicación o procesamiento posterior. El sistema más sensible utilizado en FISH es mediante el empleo de la cámara CCD (Charge Coupled Device), la cual detecta fotones con una alta eficacia sobre rangos de amplio espectro de longitud de onda y que además, mediante un paquete informático apropiado para el análisis de imágenes, permite la digitalización y manipulación de las mismas.

Ejemplos de FISH de metafase 

Éste es un ejemplo de una célula en metafase que se ha hibridado con una sonda para la deficiencia de esteroide-sulfatasa, causada por una microdeleción en el cromosoma X. En este caso particular, se emplea una mezcla de dos sondas independientes para el cromosoma X, ambas con color rojo. La señal "X cen" de la sonda es un control interno localizado en el centrómero de X, que permite la identificación rápida del (o los) cromosoma(s) X. La señal "Xp22.3" de la sonda está localizada en la región de la esteroide-sulfatasa, en Xp22.3. Puesto que hay dos cromosomas X y sólo uno tiene la señal del gen de la esteroide-sulfatasa, este individuo es una mujer portadora de la deficiencia genética de esteroide-sulfatasa.

En el caso anterior la deficiencia de la enzima esteroide sulfatasa determina la enfermedad de Ictiosis recesiva ligada al cromosoma X:

Las ICTIOSIS son un grupo de enfermedades que se   producen en gran parte de la superficie de la piel, dándole la apariencia de una piel de pescado. Pueden ser congénitas o adquiridas, se clasifican en: vulgar, laminar, ligada a cromosoma X y eritrodermia ictiosiforme congénita. En la mayoría de los casos hay antecedentes familiares de la enfermedad o de consanguinidad. 

Esta variedad de ictiosis es debida al déficit congénito de una enzima (esteroide sulfatasa) imprescindible para eliminar los sulfatos de colesterol. De esta manera, los sulfatos de colesterol están elevados en la epidermis, el suero, y las escamas. Y se acumulan.

Ejemplos de FISH de interfase

Esta otra prueba de aneuploidía muestra un feto femenino con trisomía 21. El núcleo de la izquierda se ha hibridado con sondas diseñadas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo), y tiene claramente tres señales rojas. El núcleo de la derecha se ha hibridado con sondas diseñadas para los cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y (rojo). Puesto que muestra dos señales verdes y ninguna roja, es femenino.

Este es un síndrome de Down, en donde determina q la persona tenga su fenotipo conocido, pliegue palmar, deficiencia mental entre otras.

Ejemplos síndromes de microdeleción actualmente diagnosticables mediante FISH

Síndrome del maullido (cri-du-chat) deleción autosómica terminal o intersticial del brazo corto del cromosoma 5

Síndrome de Miller-Dieker donde el cerebro no tiene lóbulos o circunvoluciones

Síndrome de Smith-Magenis distracción en el niño, ansiedad, problemas de sueño

Deficiencia de esteroide-sulfatasa ictiosis explicada

DEFINICIÓN DE HIBRIDACIÓN

La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases complementarias en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm), la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energía, están totalmente expuestos a la fuente emisora de energía.

HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA (CGH).

Un desafío para los genetistas fue la posibilidad de realizar exploraciones a todo el genoma para identificar regiones cromosómicas asociadas a la pérdida o ganancia de información genética. Con el fin de satisfacer esa necesidad, se desarrolló una técnica llamada Hibridación genómica comparativa (CGH). Esta técnica implica el aislamiento y fragmentación de adn genómico de un sujeto control y un sujeto experimental. La muestra control de adn fragmentado se marca con fluorescencia roja, y la muestra experimental de adn fragmentado se marca con fluorescencia verde.

Las dos muestras de adn usan juntas como sondas de adn en experimentos de hibridación con cromosomas metafásicos normales, generalmente de un individuo 46 XY para tener todos los tipos de cromosomas. Las sondas verdes y rojas compiten para unirse a los cromosomas.

Se realiza un análisis mediante un microscopio de fluorescencia cuantificando las proporciones de colores verde y rojo en los cromosomas:

Para regiones cromosomales inalteradas, las sondas verdes y rojas deben enlazar igualitariamente, lo que resulta en un color naranja/amarillo.

Si una región cromosómica fuera eliminada (pérdida de ADN) en el grupo experimental, dicha región aparecerá de un color más rojo bajo el microscopio, ya que la proporción verde/rojo se hace menor a 1.

Si una región cromosómica fuera amplificada en el grupo experimental, la región cromosomal correspondiente aparecerá más verde bajo el microscopio, porque la proporción verde/rojo se hace mayor a 1.

Luego de esto los investigadores pueden escanear a lo largo de los cromosomas para identificar alteraciones genómicas. , viendo las diferencias en la intensidad de la fluorescencia a lo largo de ellos.

Por ejemplo, con esta técnica pudo descubrirse que el gen que codifica para la subunidad catalítica de la fosfatidilinositol-3-kinasa (PIK3CA) fue amplificado en el cáncer de ovario. Por lo tanto se identificó a este gen como un oncogen asociado con el cáncer de ovario.

Además de ser de utilidad en analizar células tumorales, la CGH está indicada en la evaluación de niños con dismorfismo facial y corporal, malformaciones múltiples congénitas, retardo mental y del desarrollo de causa no especificada, autismo y en la definición detallada de alteraciones cromosómicas como deleción o duplicación previamente observadas en el cariotipo convencional, dado que permite, junto con el análisis bioinformático, evaluar los genes y las regiones cromosómicas involucradas.

Ventajas:

-No requiere el cultivo de células (ADN del tumor puede ser extraído de muestras de tejido fresco o de archivo)

-Requiere poco ADN

-No se necesita definir a priori qué cromosomas se quieren evaluar, porque se evalúa la totalidad del ADN de la célula.

-Tasa de detección alta

Desventajas:

-Requiere de cromosomas metafásicos y tiene una resolución limitada de 3 a 10 Mb.

-La técnica de CGH requiere de mayor tiempo de procesamiento.

-No detecta: inversiones, traslocaciones, mutaciones puntuales

Array CGH

Un método más reciente de CGH basado en “Microarray” (micromatrices), no requiere el uso de cromosomas en metafase. Este método utiliza matrices que contienen miles de fragmentos de pares de bases del genoma humano adheridos a un microchip. Cada fragmento de ADN individual, los cuales se encuentran en una posición específica en el chip, corresponde a una secuencia de adn conocida que ha sido mapeada en una región cromosómica específica. Los mismos códigos de color (rojo para el grupo control y verde para el grupo experimental) son usados en experimentos de hibridación con la plataforma de microarray-CGH, los cuales pueden ser escaneados usando un sistema automatizado. Como se describe para los experimentos CGH estándares, regiones cromosómicas inalteradas muestran una fusión de las sondas verde y roja, con un color Naranja/amarillo resultante, mientras que las regiones amplificadas y eliminadas en el grupo experimental aparecerán verdes y rojas, respectivamente.

Mediante el uso de matrices, los investigadores pueden determinar precisamente las regiones cromosomales y los genes que son amplificados o faltan. La información obtenida de un único experimento de Array-CGH es igual a la obtenida de miles de experimentos de FISH.

La poderosa combinación de la citogenética y la secuencia del genoma humano ha permitido una nueva visión acerca de la enfermedad genética humana. El futuro de la citogenética molecular parece ser brillante, y este campo, con toda seguridad, seguirá descubriendo ideas nuevas e inesperadas.

Fuente:

Chial, H. (2008) Cytogenetic methods and disease: Flow cytometry, CGH, and FISH. Nature 

1) MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

Múltiple ligadura-dependiente de sonda de amplificación

- QUÉ ESMLPA es una técnica de biología molecular, mediante múltiple PCR, que permite que en una misma reacción se pueda detectar copias anormales de hasta 50 secuencias genómicas diferentes de ARN o ADN, pudiendo ser capaces distinguir secuencias que difieren en un solo nucleótido. La técnica de MLPA es fácil de hacer y puede ser desarrollada en muchos laboratorios. Se basa en una primera reacción de unión-ligación de sondas con la zona homóloga de interés; sólo las sondas que hayan hibridado podrán ser ligadas, y posteriormente amplificadas por PCR. Mediante un análisis de fragmentos y aprovechando la diferencia de tamaño de cada una de las sondas, se podrán identificar aberraciones en el número de copias genómicas.

- FUNDADORTécnica descrita por primera vez por Jan Schouten y sus colegas en 2002.

- FUNCIONAMIENTOSolo las sondas que se hibridan con ADN o ARN problema se amplifican por PCR.

Cada sonda tiene un “primer” (cebador) único y universal para la posterior amplificación por PCR.

La reacción de MLPA puede ser dividida en 5 grandes pasos:

1. Denaturación del ADN e hibridación con las múltiples sondas MLPA.

2. Reacción de ligación.3. Reacción PCR.4. Separación de productos amplificados por electroforesis.5. Análisis de datos.

(1) La primera etapa, el ADN es denaturado e incubado durante una noche con una mezcla de sondas MLPA.

(2) MLPA utiliza, para cada gen, dos sondas consistentes en secuencias de oligonucleótidos. Una de ellas es complementaria a la secuencia que se quiere estudiar (21-30 nucleótidos), a la que se añade la secuencia de un cebador universal en el extremo 5'; la otra sonda de la pareja tiene otra secuencia complementaria a la diana, un ADN de relleno que puede ser de distintos tamaños y la secuencia de otro

cebador universal en el extremo 3'. Ambas sondas hibridan a ambos lados de la secuencia diana, y son ligadas por una ligasa termoestable. Con un solo cebador se pueden amplificar exponencialmente las sondas que se han ligado correctamente mediante un PCR. Utilizando secuencias de relleno de distintos tamaños para cada gen, podemos amplificar en una misma reacción muchos fragmentos distintos, lo que ahorra mucho tiempo y reactivos.

(3) La amplificación de los productos son separadas usando una cámara de electroforesis. Las sondas que no son ligadas solo contienen una secuencia primer. Como consecuencia, ellas no pueden ser exponencialmente amplificadas y no generarán una señal.

- UTILIDAD CLÍNICALa técnica está diseñada y usada por laboratorios para detectar problemas genéticos de delecciones, duplicaciones y expansiones de genes, utilizando bases de datos internacionales de los pares de bases para determinar si las porciones de genes han cambiado o mutado.Demuestra una alta sensibilidad y especificidad en la detección de microdeleciones, duplicaciones no objetivables por las técnicas citogenéticas convencionales y FISH.

La técnica MLPA posee muchas aplicaciones, incluyendo la detección de mutaciones, el análisis de perfiles de metilación, la cuantificación relativa de ARNm, la caracterización cromosómica de líneas celulares y muestras de tejido, la detección de variaciones en el número de copias del genoma, la detección de duplicaciones y deleciones en genes relacionados con la predisposición al cáncer humano y determinación de aneuploidias. Asimismo, MLPA posee un gran potencial para el diagnóstico prenatal

- COSTOCosto bajo, se necesita termorregulador y una cámara de electroforesis y el kit de sondas. Y requiere alrededor de 20 ng de ADN (3000 celuluas)

- VENTAJAS Y DESVENTAJASV: permite detectar únicas aberraciones en genes las cuales son muy pequeñas para ser detectadas por FISH. Es de bajo costo y una técnica no complicada. No se necesita un lavado para eliminar sondas no hibridadas.

D: no recomendable para hacer screening de genomas por la cantidad de sondas que se requieren utilizar. Acceso a la compra de sets de sondas.