SEMINARIO CIENTFICOSEMINARIO CIENTFICO

HORMONA HORMONA ANTIDIURTICA yANTIDIURTICA yANTIDIURTICA yANTIDIURTICA y

ACUAPORINASACUAPORINASIntegrantes:Carolina Bonti

Luccianna Bruschi

Emiliano Buscarons

Matilde Cabral

Agustn Cabrera

Beatriz Camacho

Esteban Cantero

Stefana Castelnovo

Juan Ignacio Luna

Sofa Marta

Camila Prez

Valentina Snchez Prof.: Vernica AbudaraGrupo: AQP H1/A

ARTCULO CIENTFICOARTCULO CIENTFICO::

Efectos del antagonista del Efectos del antagonista del

receptor V2 de ADH en la expresin

de acuaporinas y su distribucin

subcelular en el rin.

GeneralidadesGeneralidades

Etimologa: Acua=agua. Porina=poro.

Conformacin: Protena transmembrana con 6 alfa-hlice.

Tipos: Tipos:

- Acuaporinas: slo agua (AQP 0-8).

- Acuagliceroprotenas: Agua-Urea-Glicerol (AQP 9-10)

- Sin clasificacin: AQP 11 y 12.

Localizacin de AQP2: Membrana apical y vesculasde clulas del tbulo colector.

DescubrimientoDescubrimiento

Peter Agre - Roderick Mac Kinnon.

Hiptesis de existencia y comienzo de trabajos en

1991.

Primera descubierta en 2003. Premio Nobel.

Receptor V2Receptor V2

Receptor para vasopresina/ADH.

Tiene un solo sitio en el extracelular amino-terminal

a diferencia del resto.

AMPc/Adenilato ciclasa/PKA. AMPc/Adenilato ciclasa/PKA.

La va activa la fusin de vesculas.

Expresin del ARNm de la AQP2.

Inhibido por OPC-31260 (principal uso en esta

investigacin).

Mecanismos de regulacin de la Mecanismos de regulacin de la reabsorcin de agua por ADHreabsorcin de agua por ADH::

A corto plazo Translocacin hacia la membrana apical de los canales de AQP2 ya sintetizados.los canales de AQP2 ya sintetizados.

Nueva sntesis de canales de AQP2.A largo plazo

IMPORTANCIAIMPORTANCIA CLNICACLNICA::

RELEVANCIARELEVANCIA::Reabsorbe 99% del filtrado.

Por da: 170 litros 1.5 litros aprox.

IMPORTANCIAIMPORTANCIA CLNICACLNICA:: Falta de AQP2: Se excreta gran cantidad de agua

- Severa diabetes inspida nefrognica

primaria o central.

Exceso de AQP2: Expansin del fluido extracelular

- Insuficiencias cardacas congestivas

- Cirrosis heptica

INTRODUCCIN AL ARTCULOINTRODUCCIN AL ARTCULO

Objetivo:Demostrar la participacin del receptor V2 en la

regulacin de la expresin de AQP2.

Estrategias:Estrategias: Observar los cambios de localizacin de AQP2

luego del tratamiento con OPC.

Observar si el tratamiento con OPC sobre el

receptor V2 disminuye los niveles de ARNm de la

AQP2.

MATERIALES Y MTODOS

Protocolo 1 (48 horas)

-Sin agua (sedientas).-Sin agua (sedientas).

-Sobrecargadas con agua usando 300 mM de sacarosa

en el agua.

- Libre acceso al agua (control).

Protocolo 2 (15 min)Protocolo 3 (30 min)Protocolo 4 (60 min)

- Administracin OPC por va intravenosa.

-Suero fisiolgico por va intravenosa (control).-Suero fisiolgico por va intravenosa (control).

Protocolo 5 (6 das)

- Ratas con dieta normal durante 5 das y luego se suministr

OPC a la comida por 24 horas.

- Ratas con dieta estndar durante todo el estudio (control).

RESULTADOSRESULTADOS

1) Efectos a corto plazo del tratamiento con antagonista del receptor V2 sobre la distribucin celular de AQP2 en la

clulas principales del tbulo colector.

2) Expresin del ARNm y de la protena de AQP2 en la mdula interna del rin de ratas sedientas y ratas con

sobreingesta de agua.

3) Expresin del ARNm de AQP2 en mdula interna del rin de ratas tratadas con el antagonista del receptor V2,

OPC-31260.

1) Efectos a corto plazo del tratamiento conantagonista del receptor V2 sobre la distribucincelular de AQP2 en la clulas principales del tbulocolector.

Resultado esperado

Resultado esperado

Cuatro ratas tratadas con OPC intravenoso.

Rpido aumento de la produccin de orina.

Protocolos utilizados: 2, 3 y 4

Localizacin de AQP2:

A: ratas control tratadas con 0,2 mL de solucin salina intravenosa.

Situacin control

Se observa que las AQP2 se

encuentran principalmente asociadas

a la membrana plasmtica apical y en

vesculas subapicales.

Inmunofluorescencia

Tratamiento con OPC por 15 min

B: Ratas tratadas con OPC intravenoso durante 15 minutos.

Se observa una disminucin de la

presencia de AQP2 en la

membrana plasmtica apical con

un concomitante aumento de

vesculas subapicales.

Tratamiento con OPC por 30 min

C: ratas tratadas con OPC intravenoso durante 30 minutos.

Casi no se observan dominios en

la membrana plasmtica apical y

sigue aumentando en las

vesculas internas.

Localizacin de AQP2

Ratas del grupo

control:

vemos el marcado de

AQP2 que en su gran

mayora se

encuentran en la

membrana apical y

una porcin se

Micrografa electrnica marcada con inmunogold

una porcin se

encuentra en

vesculas subapicales.

Flechas: AQP2 en membrana

plasmtica.

Cabezas de flechas: vesculas.

Luego de 15 min de

tratamiento con OPC: se

sugiere internalizacin

de AQP2 desde la

membrana apical hacia membrana apical hacia

las vesculas

citoplasmticas.

Cabezas de flechas

pequeas: vesculas.

Luego de 30 min de

tratamiento con OPC: vemos

las AQP2 internalizadas en las

vesculas citoplasmticas y

conformando cuerpos

multivesiculares (B y C).

Cabezas de flechas pequeas:

vesculas.

Cabezas de flechas grandes:

cuerpos multivesiculares.

Estudio semicuantitativo a partir de inmunogold: comparacin de partculas de oro adheridas a AQP2 entre ratas

control (sham) y ratas luego de 30 min de tratamiento de OPC.

2) Expresin del ARNm y de la protena de AQP2en la mdula interna del rin de ratas sedientas yratas con sobreingesta de agua.

Northern blot

Northern blot

Anlisis de densidad

Anlisis densitomtrico de ARNm de AQP2

La expresin de ARNm de AQP2 en las ratas sedientas

aumenta y en las ratas con sobreingesta de agua disminuye.

Inmunoblot (western blot)

Tcnica utilizada para la deteccin de protenas especficas.

Es un estudio cuantitativo que informa sobre la cantidad de protenas, a

diferencia de la tcnica de inmunofluorescencia que permite visualizar

la distribucin celular de la protena.

AQP2

glicosiladas

Se compara la expresin de la protena AQP2 en ratas

sedientas y ratas con sobreingesta de agua.

Inmunoblot

AQP2 no

glicosiladas

Ratas con

sobreingesta de aguaRatas con

sed

La expresin de la protena AQP2 aumenta

significativamente en las ratas sedientas en

comparacin con las ratas con sobreingesta de comparacin con las ratas con sobreingesta de

agua.

3) Expresin del ARNm de AQP2 en mdulainterna del rin de ratas tratadas con elantagonista del receptor V2, OPC-31260.

Objetivo: investigar el rol del receptor V2 en la regulacin de laObjetivo: investigar el rol del receptor V2 en la regulacin de la

expresin de ARNm de AQP2.

Protocolos utilizados: 2, 3, 4 y 5.

Efectos en la expresin de ARNm de AQP2 en 15 minutos de tratamiento con OPC

No se constat reduccin significativa del ARNm de AQP2.

Efectos en la expresin de ARNm de AQP2 en 30 minutos de tratamiento con OPC

Northern blotAnlisis de densidad

Se observa una reduccin significativa del ARNm de AQP2.

Efectos en la expresin de ARNm de AQP2 en 60 minutos de tratamiento con OPC

Northern blotAnlisis de densidad

Reduccin del ARNm de AQP2 persiste luego de 60 minutos.

Efectos en la expresin de la PROTEINA de AQP2 en 60 minutos de tratamiento con OPC

protena glicosilada

Inmunoblot

protena glicosilada

protena sin

glicosilar

No se observan cambios significativos en la cantidad de protena.

Efectos en la PRODUCCIN DE ORINA en 60 minutos de tratamiento con OPC

Gran aumento de la produccin de orina.

Reduccin de la osmolalidad.

Efectos en la expresin de ARNm de AQP2 en 24 horas de tratamiento con OPC

Se mantiene reduccin.

Efectos en la PRODUCCIN DE ORINA en 24 horas de tratamiento con OPC

Produccin de orina 5 veces mayor.

Reduccin de la osmolalidad.

Receptor V2 importante en la modulacin de losniveles de ARNm de AQP2.

Tratamiento con OPC posee la capacidad de reducirlos niveles de ARNm de AQP2. Corroborando laparticipacin del receptor V2 en la expresin de AQP2.

Mecanismos independientes de ADH involucrados enla regulacin a largo plazo de la expresin de AQP2.

DISCUSIN Y CONCLUSIONES

La inmunofluorescencia y la microscopa inmunoelectrnica demostraron que el

tratamiento in vivo con antagonista del receptor V2 de la vasopresina caus una rpida

recuperacin de AQP2 de la membrana plasmtica apical en las vesculas y cuerpos

multivesiculares.

Tratamiento con OPC se asocia con poliuria y reduccin de osmolalidad.

Tratamiento con OPC induce una reduccin de los niveles de ARNm de AQP2.

El balance del agua corporal est regulado por la vasopresina, la cual incrementa la

permeabilidad al agua del tbulo colector.

No toda la AQP2

intracelular est

disponible para el

reciclaje.

Todas son Todas son internalizadas en

respuesta al tratamiento con

OPC.

La mayora van a las vesculas para luego

ser reutilizadas.

Externalizacin

Fosforilacin

Se da por endocitosis, puede

requerir una desfosforilacin.

Internalizacin

Ratas Brattleboro

No tienen ADH. Pero igual

reabsorben agua.

Sugiere la existencia de

mecanismos independientes de

ADH.

En suma:

A pesar de la participacin del receptor V2 en la regulacin

El receptor V2 est crticamente involucrado en la va de

sealizacin (a corto plazo) que regula la expresin de ARNm

de AQP2.

A pesar de la participacin del receptor V2 en la regulacin

a largo plazo (24 horas) en la expresin de ARNm de AQP2, la

ausencia de una mayor reduccin de ste mas all de las 24

horas, es consistente con la existencia de mecanismos de

modulacin a largo plazo independientes del receptor V2.

Y cules son esos mecanismos?

GRACIAS!!GRACIAS!!