Seminario (1)
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Laura V. Ceballos Naranjo
María Antonia Correa Saavedra
Tercer semestre
CANDIDA ALBICANS
Family: Debaryomycetaceae Genus: Candida Species: albicans
Dimorphic fungus that grows both as yeast and filamentous cells and one of the few species of the Candida that cause the infection candidiasis in humans C. albicans is a common member of human gut flora and is detectable in the gastrointestinal tract in 40% of healthy adults
INTRODUCTION CANDIDA ALBICANS It is usually a commensal organism, but can become pathogenic in immunocompetent individuals under a variety of conditions. Overgrowth of the fungus results (candidosis) Candidiasis is often observed in immunocompromised individuals, including HIV-infected patients
INTRODUCTION Heat Shock proteins
Heat shock proteins (HSPs) are proteins found in plant and animal cells
They originally were described in relation to heat shock but are now known to be induced by a wide variety of stresses, including exposure to cold, UV light, wound healing, tissue remodeling or biotic stresses
HSPs are essential components contributing to cellular homeostasis under optimal and detrimental growth conditions in prokaryotic and eukaryotic cells
INTRODUCTION Heat Shock proteins They are responsible for protein folding, assembly, translocation, and degradation during ordinary cellular growth and development HSPs also function in the stabilization of proteins and assist protein refolding under stress conditions Many chaperones, but by no means all, are heat shock proteins because the tendency to aggregate increases as proteins are denatured by stress Heat-shock proteins are named according to their molecular weight. For example, Hsp60, Hsp70 and Hsp90 (kDa)
INTRODUCTION
HSP90 ATP-dependent molecular chaperone which is essential in eukaryotes Hsp 90 assists other proteins to fold properly, stabilizes proteins against heat stress, and aids in protein degradation
It affects numerous physiological processes such as signal transduction, intracellular transport, protein degradation and also stabilizes a number of proteins required for tumor growth, whence it became an interesting target for cancer therapy
Hsp90 and C. albicans
The chaperone Hsp90 orchestrates
regulatory circuitry governing fungal
morphogenesis, drug resistance, and
virulence
Sgt1 physically interacts with Hsp90, and that it governs C.
albicans morphogenesis and
drug resistance
Genetic depletion of Sgt1 phenocopies
depletion of Hsp90, inducing yeast to
filament morphogenesis and
invasive growth.
global regulator of morphogenesis and
drug resistance, providing a new
target for treatment of life-threatening fungal infections
Objective The purposes of this study were to assess the expression
of Hsp90 gene in clinical and control isolates of C.
albicans obtained from different geographical regions
(Malaysia and Iran), different temperatures (25ºC, 37ºC
and 42ºC) and mice with candidiasis.
Métodos
Aislamientos fúngicos Objetivo: Evaluar la expresión del gen Hsp90 en
pacientes de Irán y Malasia que padecen candidiasis
sistémica Vs. pacientes sanos.
El estudio grupo estaba formado por 32 pacientes (16
varones y 16 mujeres) y 16 individuos de control
emparejados por sexo y edad (16 varones y 16
mujeres).
Media de edad: 35.9 años (pacientes entre 18 y 60
años).
Aislamientos fúngicos Los aislados clínicos se obtuvieron de la sangre de
pacientes inmunocomprometidos con candidiasis
sistémica, que representan los factores de riesgo tales
como:
cáncer, diabetes mellitus, antibióticos y tratamientos con
esteroides.
Los aislamientos de control fueron tomados de la piel
de las personas que eran inmunocompetentes.
El protocolo de estudio fue aprobado por los comités de ética de
University of Malaya Medical Center (UMMC), Malasia y la Universidad
de Tehran University of Medical Sciences, Irán. Un consentimiento
informado, se obtuvo de todos los sujetos antes de entrar en el
estudio.
Aislamientos fúngicos
1 • Cultivo de células de levadura en SDA a 37ºC durante 24 horas
• Cultivo de células de levadura en SDA a 37ºC durante 24 horas
2
• Identificación de levaduras basada en:
Prueba de germen de tubo, CRHOM agar, test de B-glucosidasa, test de ureasa, cornmeal Tween-80 para la producción de clamidosporas, fermetación de azúcares y pruebas de asimilación utilizando Rap ID Rap ID Yeast Plus System.
3
• Las células de Candida se cultivaron en SDA durante la noche a 25 ° C, y después se transfirieron a sabouraud dextrose broth (SDB) en dos tubos diferentes en un baño de agua con agitación a 110 oscilaciones por minuto a 25 ° C y 42 ° C por 45 min.
Después de la incubación, las células de Cándida fueron cosechadas por
centrifugación a 3000 × g para el paso subsiguiente.
Evaluación de la expresión
del gen Hsp90 en ratones Obejetivo: Investigar y comprender la expresión del
gen Hsp90 haciendo un comparativo entre humanos y ratones; estos últimos proporcioando un modelo in vivo.
48 ratones hembra BALB / C de 6 semanas de edad (25-30 g) se compraron en el Razi Institute, Karaj, Irán.
8 aislados clínicos y 8 cepas de control de C. albicans (4 cepas de Malasia y 4 de Irán c/u) fueron seleccionados en este estudio
Se consideraron tres ratones para cada aislamiento.
Evaluación de la expresión
del gen Hsp90 en ratones
Las levaduras se cultivaron en SDA y se incubaron a 37ºC
durante 24 h.
Las colonias de levadura se retiraron y se lavaron
dos veces con PBS.
La suspensión de levadura se ajustó
aproximadamente a 500 × 103 células / ml usando
un hemocitómetro.
Los ratones fueron infectados por
inoculación de 0,1 ml de suspensión de C. albicans a través de
la vena caudal.
Luego de 3 días, los ratones fueron
anestesiados con cloroformo para retirarles
los riñones.
El tejido se trituró en suero fisiológico y 0,2 ml del filtrado se cultivaron en SDA a 37ºC durante
24 h.
Las células de Candida fueron
cosechadas a partir de medios de SDA.
Evaluación de la expresión del gen Hsp90
mediante
RT-PCR.
Experimentos realizados en base a la Ética de la
Investigación Veterinaria y este estudio fue aprobado sobre la
protección de la SPCA.
*PBS: Solución salina tamponada con fosfato; SCPA Sociedad de Protección
contra la Crueldad Animal.
PCR qRT Objetivo: Amplificación del RNA a través de la síntesis
previa de su cDNA (DNA copia), utilizando una
transcriptasa inversa, siguiendo varios ciclos de PCR
convecional.
Los aislados de C. albicans se utilizaron para el
aislamiento del ARN total según el protocolo del kit
seleccionado para el experimento (RNeasy Mini kit,
Qiagen, Hilden, Alemania).
PCR qRT
1
• Tres microgramos de ARN se trataron con DNasa I basándose en el protocolo Quanti Tect Reverse Transcription Qiagen Company (Hilden, Alemania)
• Se utilizaron para la síntesis de ADNc utilizando el Taq Man Reverse Transcription kit.
2
• La qRT-PCR se realizó en un volumen total de reacción de 25 l incluyendo PCR Master Mix 12,5 l power SYBR Green ®, 1 l de cebador directo (400 nM), 1 l de cebador inverso ( 400 nm), 5 l de ADN complementario (300 ng) como plantilla y 5,5 l de agua doblemente destilada en Micro Amp óptica de placas de 96 pocillos en un ABI 7300 Real-Time-PCR instrument.
3
• Las condiciones fueron las siguientes; ciclo 1 se repitió 40 veces: 95 ° C durante 10 min, 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min y el ciclo 2 que representa el nivel de disociación se llevó a cabo una vez: 95 ° C durante 15 s, 60 °C por 15s, 95°C por 15s.
PCR qRT
1
• Para mostrar las bandas de cDNA de los genes de la Hsp90 y el rRNA 18S, los productos de la PCR fueron puestos en gel de agarosa al 1.5% (w/v).
• Una escala de 1 kb de AND fue utilizada como marcador durante este procedimiento.
2
• Los datos para el gen Hsp90 se calcularon y se expresaron como una regulación en comparación con el gen rRNA 18S de referencia para cada condición de prueba, utilizando el método de la curva estándar de cuantificación.
3
• Las secuencias de los cebadores de genes de referencia se obtuvieron del estudio de Manolakaki et al. (Tabla 1)
• El ensayo de QRT-PCR se realizó de forma independiente por triplicado.
PCR qRT
Análisis estadístico Objetivo: Comparar la diferencia en los valores de la
expresión del gen Hsp90 medias de entre los grupos
analizados. Las diferencias se consideraron
significativas a P-valor <0,05.
El análisis de los datos se realizó utilizando el paquete
estadístico para Ciencias Sociales (SPSS, versión 17,
Chicago, IL, EE.UU.). Las pruebas t independiente y U
de Mann-Whitney fueron las seleccionadas.
Resultados
Resultados
Discussion Authors What they said Agree/Disagree
Swoboda et al.
Candida Hsp90 gene was heat
shock inducible and its expression
was strongly induced at higher
temperature, such as 45°C (about
nine folds), but a change in
temperature to 37°C had lower
effect on the level of Hsp90 mRNA.
Agree
O’Connor,
Essmann &
Larsen et al.
The expression of Hsp90 gene was
increased under treatment with 39°C
and 17-β-estradiol up to 50% and
75%, respectively.
Agree
Discussion
Authors What they said Agree/Disagree
Shapiro et al.
A medium induction of Hsp was
observed with changes in
temperature from 30°C to 37°C or
exposure to serum at 30°C, but a
higher stimulation was seen in
response to the combination of
serum and elevated temperature.
Agree
Carper, Duffy &
Gerner and
LaFayette et al.
Demonstrated the existence of
differences in the expression of C.
albicans Hsp90 gene between in
vitro (37°C) and in vivo (mice body)
in both systemic and non-systemic
isolates.
Agree
Discussion Authors What they said Agree/Disagree
Jenkins,
Schultz &
Matin et al.
The oxidative stress responses were
the most important factors in the
development of experimental
systemic infections.
Agree
Enjalbert et al.
Reported a reduction in virulence of
C. albicans by compromising of
Hsp90 function or expression in mice
with systemic candidiasis.
Agree
Hodgetts et al.
The over-expression of Hsp90 gene
in S. cervisiae increased the
virulence of this fungus and therefore
Hsp90 appears to be a virulence
factor of C. albicans .
Agree
Conclusions
1. Based on this study, it was possible to find out that hsp90 is not only
expressed at high temperatures but also under stress conditions that can
lead the gene expression encoding hsp90 in C. albicans.
2. Authors could confirm that hsp90 gene expression in C. albicans is
different in several geographical locations and with different temperatures.
With this finding it was possible to conclude that both, genetics and
environmental changes, play an important role in the expression of this
gene.
3. C. albicans has high adaptability even in different races, geography, pH,
nutrient availability and temperature because it can change its gene
expression in response to all these variables; although a previous study
showed that candidiasis is predominant in black populations by a 4: 1ratio. 4. This study compared the hsp90 expression in Malaysian and Iranian
patients and it found that gene expression was greater at higher
temperatures, which means hps90 gene expression in C. albicans can be
induced by heat shock.
Cmaptools
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