SEMANA 13REPLICACIÓN DEL ADN. REPARACIÓN DEL ADN.

1. Describir el mecanismo de acción de las ADN polimerasas que operan en las dos hebras del ADN y el efecto que esto tiene en la síntesis de la hebra rezagada en comparación con el hebra principal.La enzima ADN polimerasa se encarga de sintetizar ADN nuevo utilizando una de las cadenas antiguas como un molde.En células procariotas: ADN polimerasa III es la principal polimerasa responsable.En células eucariotas: α, β, ε: ADN polimerasa en replicación nuclear. γ: ADN polimerasa presente en la replicación mitocondrial.

Komberg: Descubrió el primer ADN polimerasa (ahora llamado ADN polimerasa I) que requería presencia de ADN y cuatro trifosfatos de desoxirrionucleósido (dTTP, dATP, dCTP, dGTP).

Requerimientos básicos para la replicación:a. Una cadena de ADN plantilla para copiar.b. Una cadena iniciadora (provee el hidroxilo -

OH- 3’ terminal) en la cual pueden agregarse nucleótidos.

Características comunes:a. Sintetizan ADN solo en la dirección 5’ a 3’, y añaden un dNTP al grupo 3’ hidroxilo de

una cadena creciente.b. Pueden añadir un nuevo desoxirribonucleótido solo a una hebra cebadora ya

existente que se encuentra unida mediante puentes de hidrógeno de una hebra molde.

2. Suponga que usted es incapaz de reparar el daño en el ADN causado por la pérdida de bases de purina. Este defecto causa la acumulación de unas 5 000 mutaciones por día en el ADN de cada una de sus células. Como la diferencia promedio en las secuencias de ADN entre humanos y chimpancés es de aproximadamente 1%, es solo cuestión de tiempo hasta que te conviertes en un chimpancé. ¿Qué es lo incorrecto en este argumento?El argumento es muy deficiente. No se puede transformar una especie en otra simplemente al introducir el 1% de cambios al azar en el ADN. Es por demás improbable que las 5 000 mutaciones que se acumularían por día en la ausencia del sistema de reparación de ADN se encuentren en las posiciones en donde las secuencias de ADN humanas y hominoideas son diferentes. También es improbable que a esa frecuencia alta de mutación muchos genes esenciales no sean inactivados, conduciendo a la muerte. Además, nuestro cuerpo está constituido por alrededor de 1013 células. Para convertirse en chimpancé, se necesitaría cambiar no solo una célula, sino muchas. Incluso, muchos de estos cambios ocurrirían durante el desarrollo afectando cambios en su plan corporal (haciendo sus brazos más largos que sus piernas, por ejemplo).

3. ¿De qué manera las dos actividades de exonucleasa de ADN polimerasa I se diferencian unas de otras? ¿Cuáles son sus respectivas funciones de replicación?Actividades de exonucleasa: Capacidad de degradar polímeros (hidrolizar) de DNA al eliminar uno o más nucleótidos del extremo de la molécula.Exonucleasa de 5’ a 3’: Elimina ribonucleótidos de los extremos 5’ de los fragmentos de Okazaki, permitiendo su sustitución con desoxirribonucleótidos para dar lugar a fragmentos constituidos completamente por ADN. Esta actividad tiene una función clave para remover los iniciadores de ARN.Exonucleasa de 3’ a 5’: Desplaza los nucleótidos mal apareados (alrededor de 99 de cada 100 bases) del extremo 3’ de la cadena en crecimiento del ADN. Esta actividad tiene una función clave en el mantenimiento de la precisión de la síntesis de ADN.Enzima ARNasa H: Elimina los cebadores de ARN a través de la degradación de la hebra de ARN de los híbridos de ARN-ADN.

4. Contraste los acontecimientos de la reparación por escisión de nucleótidos y la reparación por escisión de base.

Reparación por escisión de nucleótidos (NER, nucleotide excision repair):Opera por un mecanismo de corte y pegado que elimina diversas lesiones voluminosas, incluidos los dímeros de pirimidina y los nucleótidos en los cuales distintos grupos químicos se unen. Presenta 2 vías de NER: Una vía acoplada a la transcripción en la cual las cadenas de ADN plantilla de los genes que se transcriben de forma activa se reparan de manera preferencial.

Una vía genómica global (mecanismo lento y menos eficiente) que corrige las cadenas de ADN en el resto del genoma.

Paso 1: Reconocimiento del daño: en la vía global mediado por una proteína XPC, y en las vías acopladas a la transcripción mediado por un ARN polimerasa en conjunción con una proteína CSB.Paso 2: Proteínas XPB y XPD (dos subunidades de helicasa de TFIIH) separan las dos cadenas del dúplex, en la preparación para la eliminación de las lesiones.Paso 3: Un par de endonucleasas corta la cadena dañada en ambos lados de la lesión.

Paso 4: El segmento de ADN dañado se elimina.Paso 5: Reparación del ADN por medio de la síntesis por medio de un ADN polimerasaPaso 6: La cadena se liga por medio de un ADN ligasa 1.

Reparación por escisión de bases (BER, base excision repair):Elimina los nucleótidos alterados generados por los reactivos químicos presentes en la dieta o por el metabolismo.* Un buen ejemplo de este proceso es la reparación de ADN que contiene uracilo, la cual está catalizada por la ADN glicosilasa (enzima que rompe el enlace de unión de la base de uracilo con el esqueleto de desoxirribosa del ADN).PROCEDIMIENTO:Paso 1: Un ADN glucosidasa reconoce la alteración.Paso 2: Remueve la base por medio del corte del enlace glucosídico que une la base al azúcar de desoxirribosa.Paso 3: Ocurre la detección de daños:

a) Un ADN glucosidasa inspecciona la base pareada con citosina.

b) La base es proyectada fuera del dúplex del ADN.

c) La 8-oxoguanina embona en el sitio activo de la enzima en el punto en que se escinde de su azúcar acompañante.

d) El azúcar extruido es una guanina normal que no embona en el sitio activo de la glucosilasa y es devuelta a la pila de bases.

e) La purina o la pirimidina alteradas se eliminan y el remanente “decapitado” de la fosfato desoxirribosa en el sitio se suprime por la acción combinada de una endonucleasa especializada (AP) y un ADN polimerasa. La AP corta el esqueleto de ADN.

Paso 4: La actividad de fosfodiesterasa de la polimerasa β elimina el azúcar-fosfato remanente que estaba unido a la base eliminada.Paso 5: La polimerasa β ocupa el espacio al insertar un nucleótido complementario a la cadena no dañada.

Paso 6: La cadena se liga por medio de un ADN ligasa III.

5. ¿Por qué es importante en la reparación de genes que la célula distinga las cadenas parentales de las cadenas recién sintetizadas? ¿Cómo se logra esto?El sistema de reparación de los apareamientos erróneos debe eliminar solamente la cadena de ADN recién sintetizada, pero si se elimina uno de los nucleótidos al azar, hay una probabilidad de cometer error en el 50% de las veces, lo que crearía una mutación permanente en el sitio, al escindirse la cadena progenitora que contiene el nucleótido correcto. En la E. coli, las dos cadenas se distinguen por la presencia de residuos de adenosina metilados en la cadena parental. Pero esto no ocurre en las eucariotas, lo que descarta esta idea en este tipo de células y por lo tanto, aún no se conozca su mecanismo de detección.