SEGUIMIENTO DEL PROCESO DE HUMIFICACIÓN EN COMPOST … · 17 Valores obtenidos por la técnica de...

SEGUIMIENTO DEL PROCESO DE HUMIFICACIÓN EN COMPOST

INOCULADO

SANDRA PATRICIA KALIL PERDOMO

PROYECTO DE GRADO Presentado como requisito parcial

para optar al título de

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá D.C

Febrero 12 de 2007

__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado

2

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona

alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.


3


INOCULADO


APROBADO

_________________________ _________________________ Jaime Augusto Casas Mateus M.Ed Maria Mercedes Martínez Salgado M.Sc Departamento de Química Departamento de Microbiología Director Codirectora

_________________________ ________________________ Aura Marina Pedroza M.Sc Gerardo Moreno M.Sc Departamento de Microbiología Departamento de Microbiología Jurado Jurado


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INOCULADO


APROBADO

__________________________ ____________________________ Ángela Umaña Muñoz M.Phill Luís David Gómez Méndez M.Sc Decana Académica Director de Carrera


5

DEDICATORIADEDICATORIADEDICATORIADEDICATORIA

José y AidéJosé y AidéJosé y AidéJosé y Aidé

…en realidad las palabras …en realidad las palabras …en realidad las palabras …en realidad las palabras no son suficientes para expresar mis mno son suficientes para expresar mis mno son suficientes para expresar mis mno son suficientes para expresar mis máááás sins sins sins sinceros ceros ceros ceros agradecimientos a mis papáagradecimientos a mis papáagradecimientos a mis papáagradecimientos a mis papás, todo lo que soy es gracias a elloss, todo lo que soy es gracias a elloss, todo lo que soy es gracias a elloss, todo lo que soy es gracias a ellos

Brian SuárezBrian SuárezBrian SuárezBrian Suárez

sencillamente, creyósencillamente, creyósencillamente, creyósencillamente, creyó en mi…. en mi…. en mi…. en mi….


6

AGRADECIMIENTOS

A Bioagrícola del Llano, empresa de aseo de Villavicencio que fue la entidad

encargada de financiar este proyecto.

A Jaime Casas, director de este proyecto, por su valiosa colaboración, apoyo y

conocimientos aportados.

A María Mercedes Martínez, codirectora de este proyecto, por su constante apoyo,

interés y paciencia.

A la Pontificia Universidad Javeriana por apoyar para el buen desempeño y desarrollo

de este proyecto.

A Viviana Gutiérrez por su constante apoyo moral, ayuda en la elaboración de este

proyecto, compañía y amistad.

Febrero 12 de 2007


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TABLA DE CONTENIDO

Número Título Página Lista de figuras 9 Lista de tablas 10 Lista de anexos 11 Resumen 12

1 Introducción 14 2 Marco teórico y revisión de literatura 16

2.1 Materia orgánica en el suelo 16 2.2 Compostaje 18

2.2.1 Factores que influyen en el proceso 19 2.2.2 Humificación de la materia orgánica 20 2.2.3 Poblaciones desarrolladas durante el compostaje 21 2.2.4 Enzimas microbianas 23

2.2.4.1 Proteasas 23 2.2.4.2 Celulasas 25

2.3 Métodos de determinación y seguimiento de humificación en suelos

27

2.3.1 Determinación de materia orgánica total en el suelo 29 3. Objetivos 31

3.1 Objetivo general 31 3.2 Objetivos específicos 31 4. Materiales y métodos 32

4.1 Recolección de muestras 32 4.1.1 Zona de muestreo 32 4.1.2 Toma de muestras de compost 32

4.1.2.1 Análisis fisicoquímicos de la muestra 33 4.1.3 Toma de muestras de suelo 34

4.1.3.1 Análisis fisicoquímicos de la muestra 35 4.2 Ensayos invitro 35

4.2.1 Preparación de las muestras 35 4.2.2 Determinación de humedad de los tratamientos 36 4.2.3 Determinación de pH en la mezcla compost:suelo 36

4.3 Determinación de materia orgánica en el suelo 36

4.3.1 Oxidación de materia orgánica total en el suelo por vía húmeda

36

4.4 Evaluación de la actividad enzimática cuantitativa 38 4.4.1 Extracción de proteasas 38

4.4.1.1 Ensayo de la actividad proteolítica 38

4.4.1.2 Curva patrón para la técnica del ácido tricloroacético (TCA)

39


8

4.4.2 Extracción de celulasas 39 4.4.2.1 Ensayo de actividad celulolítica 39

4.4.2.2 Curva patrón ara la técnica del ácido 3,5 dinitrosalisílico (DNS)

40

4.5 Análisis estadístico 41 5 Resultados y discusión 42

5.1 Recolección de muestras 42 5.1.1 Toma de muestras 42

5.2 Procesamiento de muestras 44 5.2.1 Determinación de características fisicoquímicas 44

5.2.1.1 Determinación de pH 46 5.2.1.2 Determinación de carbono orgánico oxidable 51

5.2.2 Cuantificación de la actividad proteolítica 53 5.2.3 Cuantificación de la actividad celulolítica 58

6 Conclusiones 69 7 Perspectivas 70 8 Referencias 71 Anexos 80


9

LISTA DE FIGURAS

Número de figura

Título Página

1 Ciclo de la materia orgánica 16

2 Crecimiento de hongos como indicadores de finalización de fase termofílica

20

3 Cambios relativos observados en poblaciones microbianas, características durante el compostaje

22

4 Mecanismos de acción de las proteasas 24 5 Estructura química de la celulosa 25 6 Disposición de pilas de compost 33 7 Cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni 34

8 Valores de pH de cada unos de los 11 tratamientos durante el primer muestreo

47

9 Seguimiento de los valores de pH durante los 90 días del proceso de humificación

49

10 Determinación de materia orgánica durante los 90 días del proceso

52

11 Coeficiente de variación Vs. Tiempo 52 12 Curva de calibración de tirosina 53 13 Actividad proteolítica del primer muestreo (tiempo cero) 55 14 Actividad proteolítica del segundo muestreo (30 días) 56

15 Seguimiento de la actividad proteolítica durante los 90 días del proceso

57

16 Curva de calibración de glucosa 59 17 Valores obtenidos por la técnica de DNS y Somogyi Nelson 60 18 Valores obtenidos por la técnica de DNS y Somogyi Nelson 61

19 Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo

62

20 Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del segundo muestreo (30 días)

64

21 Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del tercer muestreo (60 días)

65

22 Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del segundo muestreo (90 días)

66

23 Seguimiento de la actividad celulolítica durante los 90 días del proceso

67


10

LISTA DE TABLAS

Número de tabla

Título Página

1 Factores que influyen en el proceso y su influencia en el proceso de compostaje

19

2 Características generales de las celulasas 26

3 Determinación de la actividad celulolítica cuantitativa por el método de DNS

40

4 Composición fisicoquímica del compost estable en base húmeda

43

5 Composición fisicoquímica del suelo 45

6 Medias de los valores de pH de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo

48

7 Medias de pH de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.

48

8 ANOVA. Seguimiento del pH durante todos los 90 de proceso 50

9 Medias de los valores de UP/min/g de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo.

54

10 Medias de los valores de UP/min/g de cada uno de los 11 tratamientos del segundo muestreo (30 días).

55

11 Medias de la actividad proteolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.

56

12 ANOVA. Seguimiento de la actividad proteolítica durante todos los 90 de proceso

58

13 Comparación de 2 métodos de extracción y cuantificación de azucares reductores

60

14 Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento del tiempo cero

63

15 Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento del segundo muestreo (30 días)

63

16 Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento del tercer muestreo (60 días)

64

17 Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento del cuarto muestreo (90 días)

65

18 Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.

66

19 ANOVA. Seguimiento de la actividad celulolítica durante todos los 90 de proceso

67


11

LISTA DE ANEXOS

Número de anexo

Título Página

1 Sal ferrosa (Mohr) 80 2 Preparación de buffer fosfato 0,1M 81

3 Preparación de la solución de caseína hidrolizada Preparación del ácido tricloroacético (TCA) al 15% m/v

82

4 Preparación de la solución stock de tirosina 100 µmol/mL 83

5 Promedio de absorbancias para la determinación de la curva patrón de tirosina

84

6 Preparación de carboximetilcelulosa al 1,0% m/v en buffer fosfato 0,1M

85

7 Preparación de la solución stock de glucosa 2 g/L Preparación de la solución stock de glucosa (0,5 – 2 g/L)

86

8 Preparación del reactivo de DNS 87

9 Medias y desviación estándar de los valores de pH obtenidos de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo

89

10 Promedio de absorbancias a 540 nm para la determinación de azucares reductores por el método de DNS

90


12

RESUMEN

La degradación de residuos orgánicos es una herramienta fundamental para disminuir

el impacto ambiental que estos tienen sobre el planeta, es por esto que se utiliza el

proceso de compostaje para este fin, además de obtener un producto con interés

agroindustrial.

En esta investigación se llevó a cabo el monitoreo de la actividad enzimática

proteolítica y celulolítica cuantitativamente, en respuesta a diferentes cantidades de

compost:suelo en el transcurso de 90 días y relacionado con la materia orgánica, esto

con el fin de realizar el seguimiento como medida indirecta del proceso de

humificación. Los tratamientos se realizaron con diferentes relaciones de

compost:suelo medido en gramos, obtenidos de la siguiente manera: T1 100:0; T2

90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10

10:90; T11 0:100 y montados a partir de muestras obtenidas de pilas de compostaje

con la fracción orgánica de los residuos sólidos de la ciudad de Villavicencio (Meta)

y suelo proveniente de un cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni ubicado en Puerto

López – Meta. En buffer fosfato 0,1M fueron suspendidos 5 g de muestra de cada uno

de los 11 tratamientos centrifugados a 16 000 g por 30 minutos y el sobrenadante

producido, fue resuspendido en acetona a -15°C centrifugado de nuevo por el mismo

tiempo. A los sobrenadantes obtenidos se les determinó y cuantificó las actividades

proteolítica y celulolíticas utilizando la técnica del ácido tricloroacético (TCA) y la

técnica del ácido 3,5 dinitrosalisílico (DNS), respectivamente. Además se relacionó

con estas actividades el porcentaje de materia orgánica medido por el método de

Walkley y Black y usando herramientas estadísticas como ANOVA para determinar

diferencia de medias entre diferentes tiempos de muestreo. Los resultados mostraron

gran actividad celulolítica durante los 90 días, sin embargo, en los primeros 60 días

fue mas notable la actividad que tiene este complejo enzimático frente a este tipo de

sustrato, de la misma manera sucedió con la actividad proteolítica ya que se mantuvo

constante durante todo el proceso presentando una actividad enzimática bastante alta

a los 30 días, relacionando estas dos actividades con el comportamiento del pH y de


13

la materia orgánica, presentando así una disminución esperada mediante la oxidación

con dicromato de potasio.


14

1. INTRODUCCIÓN

El término de materia orgánica en suelos (MOS), se refiere al conjunto de substancias

orgánicas que contienen carbón. Química y físicamente, consiste en una mezcla de

residuos de plantas y animales en varios estados de descomposición, substancias

sintetizadas microbiológica y/o químicamente, de productos desmenuzados, de

cuerpos vivos y muertos de microorganismos y pequeños animales que permanecen

descompuestos. Sin embargo se emplea como fertilizante, ya que es una práctica que

se ha constatado beneficiosa desde los inicios de la agricultura. Ya en el año 900

A.C., Homero cita en la Odisea que el padre de Ulises añadía estiércol a sus viñas y

Jenofonte, en el año 400 A.C., mencionaba el uso de abonos verdes y estercolados.

La humificación es el paso final en la degradación de la materia orgánica, la cual es

básicamente el clivaje de moléculas de gran peso molecular en complejos coloides

amorfos que contienen grupos fenólicos.

En relación a esto, científicos como Pasteur, revelaron que la formación del humus

representa un ciclo biológico que se debe a la actividad de diferentes micro y

macroorganismos, y con ayuda de otros investigadores como Schloesing, Kostichev,

Wollny, Deherain, entre otros, concluyeron que parámetros como la temperatura,

humedad, aireación, etc., influyen sustancialmente en la producción de estos

compuestos, en especial cuando se reconoce que la evolución de la materia orgánica

está estrechamente ligada a la estructura y conformación del suelo y su degradación

genera beneficios como el incremento de la fertilidad física, química y biológica del

suelo, además de intervenir en la capacidad de intercambio catiónico y en la retención

de productos xenobióticos y plaguicidas.

Sin embargo, organismos y microorganismos presentes en el suelo son los

responsables de esta actividad, ya que descomponen esta materia orgánica con la

ayuda de factores ambientales, para producir sustancias húmicas donde se incluyen


15

los ácidos húmicos, ácidos fúlvicos y huminas residuales que son moléculas que se

diferencian por su composición molecular y .la solubilidad a diferente pH. Estas

sustancias aportan las propiedades ideales a los suelos y se consideran fertilizantes

por excelencia, puesto que son agentes quelantes que ayudan a atrapar los cationes y

hacerlos disponibles para la raíz de las plantas, este importante papel lo desarrollan

los grupos carboxilos e hidroxilos fenólicos de los que están formados los ácidos

húmicos y fúlvicos respectivamente. Por otro lado, aumenta la permeabilidad celular

y el proceso respiratorio y de esta manera, se induce la proliferación de la raíz.

El presente trabajo tiene como finalidad realizar un seguimiento del proceso de

humificación de compost aplicado en suelo agrícola, bajo condiciones de laboratorio,

evaluar el método para la determinación de materia orgánica por vía húmeda y hacer

el seguimiento de la evaluación de la actividad enzimática (proteolítica y celulolítica)

en compost inoculado como medidas indirectas del proceso de humificación de este

tipo de materia orgánica, ya que presenta diversas moléculas como proteínas y

azucares, entre otros, que permiten verificar el proceso desarrollado en esta matriz.


16

2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Materia orgánica en el suelo

La materia orgánica desempeña un papel fundamental en la estructura del suelo, ya

que proporciona una función insustituible en el mantenimiento de las propiedades

físicas, químicas y biológicas del mismo. La fuente original de materia orgánica en

los suelos de cultivo proviene de la incorporación de restos vegetales y animales en

diferentes estados de descomposición, así como de la biomasa microbiana. Estos

restos tan dispares se suelen denominar materia orgánica fresca y, bajo la acción de

factores edáficos, climáticos y biológicos se encuentran sometidos a un constante

proceso de transformación. Hay que destacar pues, la naturaleza dinámica de la

materia orgánica del suelo, ya que no es un componente fijo y homogéneo, sino que

va transformándose y evolucionando sin cesar (Figura 1) (Ribó, 2004).

Figura 1. Ciclo de la materia orgánica. Transformación de la materia orgánica fresca y sus diferentes

productos finales (Ribó, 2004).

MINERALIZACIÓN SECUNDARIA

celulosa hemicelulosa

taninos

lignina taninos

COMPUESTOS SIMPLES

precursores fenólicos

azúcares aminoácidos

COMPUESTOS MINERALES

BIOMASA MICROBIANA

COMPUESTOS HÚMICOS

núcleo polimerizado

compuestos aromáticos

HUMIFICACIÓN

AF

AH

oxidación +

polimerización

Polimerización +

condensación con compuestos nitrogenados

suministro cadenas alifáticas

DESCOMPOSICIÓN

MINERALIZACIÓN PRIMARIA

MATERIA ORGÁNICA FRESCA

Soporte energético

para microorganismos

compuestos alifáticos


17

Es por esto, que esta materia orgánica constituye no solo la fuente de energía y

nutrientes para los microorganismos del suelo, sino que también es la fuente de

materia para la humificación posterior o sea, el humus duradero, el cual es difícil

descomponer (Mayea et al., 1982).

La descomposición de la materia orgánica es el resultado de varios procesos que

actúan simultáneamente, como la mineralización y la humificación microbiana de la

lignina, celulosa y otros componentes y el lavado hacia horizontes mas profundos del

suelo, de componentes solubles, cuyo C y N son progresivamente mineralizados e

inmovilizados (Coûteaux et al., 1995). Autores como Heal et al. (1997) mencionan

que se puede distinguir tres fracciones principales con respecto a la composición

química y a la calidad de la materia orgánica: una de fácil descomposición, soluble,

que se pierde rápidamente; otra insoluble, pero fácilmente degradable, que se

compone principalmente de celulosa y hemicelulosa y una tercera que persiste

durante más tiempo y que está compuesta principalmente por ceras, lípidos, ligninas y

carbohidratos lignificados

Esta descomposición de la materia orgánica tiene lugar gracias a poblaciones de

microorganismos. Inicialmente, las moléculas de bajo peso molecular son

descompuestas principalmente por levaduras saprófitas que son los colonizadores

primarios, los colonizadores secundarios utilizan materiales más complejos como los

polisacáridos y por último, los colonizadores terciarios metabolizan los polímeros

más complejos como la lignina. Su tasa dependerá en la eficiencia de las bacterias y

en la capacidad del suelo para proporcionar donantes de electrones. Los

microorganismos necesitan desarrollarse en un medio húmedo por lo tanto, la

humificación y la mineralización tendrán lugar esencialmente en presencia de agua.

Si el suelo se halla muy seco, los procesos se detienen hasta que vuelva a hidratarse,

por lo que los ciclos de humectación y desecación del suelo influyen sobre la

evolución de la materia orgánica sobre el mismo (Rueda et al., 2001).


18

Otros factores indispensables, son las variables climáticas que condicionan las

características que rodea la materia orgánica como la temperatura, el pH, el oxígeno,

humedad y que afectan a la comunidad que lleva a cabo la degradación de la materia

orgánica, formada por microorganismos del suelo que la degradan enzimáticamente y

por la micro, meso y macrofauna edáfica, que contribuye a estas oxidaciones (Oliver

et al., 2002).

Tanto en las reacciones abióticas como en las relacionadas con la actividad

microbiana aumentan su tasa con la temperatura. A temperaturas muy bajas se

detienen los procesos de humificación y mineralización, creciendo a medida que

suben las temperaturas (Ruiz et al., 1997); ayudando además factores como el pH, ya

que debe ser ligeramente ácido o neutro para aumentar la degradación (Rueda et al.,

2001).

Las anteriores características son primordiales a la hora de determinar la calidad de

un suelo, sin embargo autores como Karlen et al. (1997), definen la calidad del suelo

como “la capacidad de un suelo específico, dentro de los límites de un ecosistema

natural o controlado, para mantener la productividad animal y a nivel de plantas,

sosteniendo o aumentando la calidad del aire y del agua y así mismo, mejorando la

salud humana y su entorno”.

2.2 Compostaje

El compostaje es un proceso en el que intervienen microorganismos aerobios y en el

cual se descompone la materia orgánica, este conjunto de materiales hace que se

mantenga el calor internamente y además, de la generación de energía propia

producto del metabolismo de los microorganismos, esta producción de calor hace que

se aumente la temperatura. Este proceso, es totalmente aerobio (Palmisano y Barlaz,

1996).


19

2.2.1 Factores que influyen en el proceso

Un sistema de compostaje ideal y con características únicas se ve determinado por

factores diversos como temperatura, aireación y relación C/N, como se describe en la

Tabla 1.

Cuando los materiales tienen alto contenido de carbono, se requiere adicionar

nitrógeno para reducir la relación C/N a un rango óptimo. Cegarra en 1994 manifiesta

que los microorganismos, generalmente utilizan 30 partes de carbono por una de

nitrógeno; valores bajos originan pérdidas de nitrógeno en forma de amoniaco,

especialmente con valores altos de pH y temperatura. Si la relación C/N es mayor de

35, la duración del proceso puede prolongarse.

Tabla 1. Factores que influyen en el proceso y su influencia en el proceso de compostaje.

Factor Influencia

Temperatura

- Temperatura mesofílica I: Mayor tasa de crecimiento en el inicio del proceso. - Temperatura termofílica: Produce muerte de microorganismos mesófilos por temperaturas superiores a 45°C. Se presenta una máxima sanitización como también, tasa de degradación en el proceso (Palmisano y Barlaz, 1996; Bertoldi et al., 1996). - Temperatura mesofílica II: La población de actinomicetos y hongos aumenta y las moléculas complejas son degradadas por enzimas extracelulares por descenso de temperatura inferior a 35°C (Figura 2) (Palmisano y Barlaz, 1996). Se presenta una máxima diversidad microbial, para que se obtenga un producto con condiciones estables (Bertoldi et al., 1996).

Aireación

- La temperatura normal en esta etapa es de 50ºC, sin la sobrevivencia de ningún tipo de hongo ni de actinomiceto (Palmisano y Barlaz, 1996). - Control de la temperatura del proceso. - Suministro de oxígeno (Henao, 1996).

Relación C/N

- El carbono es una fuente de energía y constituye alrededor del 50% del contenido celular microbiano. - El nitrógeno es un componente crucial de proteínas, además de ser esencial para brindar un buen crecimiento y desarrollo de los microorganismos. - Cuando hay muy poco nitrógeno, la población microbiana no crece y la rata de transformación es muy lenta. - Cuando hay mucho nitrógeno prolifera el crecimiento de la microbiota y se acelera la rata de descomposición, lo cual puede crear problemas de olor y alta demanda de oxígeno lo que conlleva a producir condiciones anaeróbicas en la pila. - El exceso de nitrógeno genera amonio en forma de gas, lo que ocasiona los malos olores (Mayea et al., 1982). - Cegarra (1994) manifiesta que los microorganismos, generalmente utilizan 30 partes de carbono por una de nitrógeno; valores bajos originan pérdidas de nitrógeno en forma de amoniaco, especialmente con valores altos de pH y temperatura. - Si el índice C/N es mayor de 35, la duración del proceso puede prolongarse. - Finalmente, como el carbono se convierte en anhídrido carbónico esta relación decrece durante el proceso, la cual debe alcanzar un valor alrededor de 10/1, al concluir el proceso (Ballesteros, 2001).


20

Se requiere conocer los valores de la relación C/N en los diferentes materiales a

compostar con el ánimo de iniciar el llenado de la pila con una mezcla adecuada el

valor que se recomienda es 30/1. Como el carbono se convierte en anhídrido

carbónico esta relación decrece durante el proceso, la cual debe alcanzar un valor

alrededor de 10/1, al concluir el proceso (Ballesteros, 2001).

Figura 2. Crecimiento de hongos como indicadores de finalización de la fase termofílica

Fuente: Autor 2006

2.2.2 Humificación de la materia orgánica

La humificación es el paso final en la degradación de la materia orgánica, la cual es

básicamente el clivaje de moléculas de gran peso molecular en complejos coloides

amorfos que contienes grupos fenólicos. La mayoría de los procesos de humificación

es debido a los microorganismos del suelo, sin embargo es acentuado por actividades

de invertebrados como los nemátodos y artrópodos. (Magdoff y Weil, 2004).

Según Mayea et al, 1982, el humus es una mezcla de compuestos complejos y no un

material único, estos compuestos son materiales resistentes, algo modificados a partir

del tejido originario, o compuestos sintetizados de tejido microbiano con restos de

organismos muertos. Actualmente se acepta la definición: “El humus es un complejo,

o mejor, una mezcla de sustancias oscuras o negruzcas, amorfas y coloidales que se


21

han modificado a partir de los tejidos originarios o han sido sintetizadas por los varios

organismos del suelo” (Mayea et al., 1982).

Sin embargo, el término humus es muchas veces sinónimo de materia orgánica del

suelo, aunque otros autores distinguen entre materia orgánica total en el suelo y el

humus. El humus es uno de los elementos que conforman el compost maduro, este

humus es la materia que queda de la descomposición de los restos vegetales como

hojas o flores, es la parte orgánica reestructurada, que además posee características

importantes en cuanto al mejoramiento de cultivos como son la elongación foliar,

aumento del tamaño radicular, mayor permeabilidad celular y por consiguiente,

mejora en la calidad del suelo.

2.2.3 Poblaciones desarrolladas durante el compostaje

El dominio Bacteria, es el grupo más importante de microorganismos durante el

primer paso del compostaje y la parte mas activa, tienden a dominar el proceso

gracias a su tiempo de duplicación tan corto, utilizando sustratos simples y

disponibles y muchas pueden vivir en altas temperaturas y bajas tensiones de oxígeno

(Palmisano y Barlaz, 1996).

Otros microorganismos presentes en este ciclo son los Actinomycetes termofílicos,

pueden tolerar una temperatura de 50ºC, además son aeróbicos y viven en un pH

neutro o ligeramente alcalino. Los actinomicetos representan un indicador de

madurez del compostaje (Palmisano y Barlaz, 1996).

Además de poseer poblaciones bacterianas, se encuentran diferentes géneros de

hongos, ya que tienen la capacidad de degradar muchos polímeros, incluyendo la

lignina, celulosa, hemicelulosa y diversas moléculas orgánicas (Palmisano y Barlaz,

1996) (Figura 3).


22

Figura 3. Cambios relativos observados en poblaciones microbianas características durante el

compostaje (Palmisano y Barlaz, 1996)

Autores como Galindo et al., (2005) realizaron un aislamiento de bacterias termófilas

y hongos mesófilos a partir de la fracción orgánica de residuos sólidos urbanos de la

ciudad de Villavicencio-Colombia, con el fin de evaluar la actividad proteolítica y de

producir un inoculante acelerante del proceso de degradación de materia orgánica en

compostaje, el inoculante producido consta de 14 cepas termofílicas, 3 Actinomycetes

y 11 bacterias, demostrando actividad enzimática de 140,18 Unidades Proteolíticas

(UP). Concluyeron que la actividad enzimática de proteasas depende del crecimiento

microbiano, siendo consideradas como metabolitos primarios. Estudios similares

realizados por Granados et al., (2003), obtuvieron actividades proteolíticas mayores,

del orden de 3200,92 UP/min/L de sustrato proveniente de residuos de la actividad

floricultora de especies de Pompon y Gypsophyla

Por otro lado, Cortés en 2005, estudió la degradación de residuos de caña de azúcar

por medio de microorganismos celulolíticos para así determinar su actividad

celulolítica mediante carboximetilcelulosa (CMC) al 1% m/v, efectuando

fermentaciones consecutivas de los microorganismos aislados de los residuos de caña,

que fueron Trichoderma con 95 Unidades Celulolíticas (UC)/min/L, Aspergillus 83

UC/min/L y Penicillium 100 UC/min/L.

ACTINOS TERMOFÍLICOS HONGOS MESOFÍLICOS ACTINOS MESOFÍLICOS BACTERIAS TERMOFÍLICAS HONGOS TERMOFÍLICOS BACTERIAS MESOFÍLICAS


23

2.2.4 Enzimas microbianas

Las enzimas son moléculas de proteínas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar

las reacciones químicas, disminuyendo el nivel de la energía de activación propia de

la reacción (Mallig, 1998), además determinan la pauta en las reacciones químicas y

transformación de diferentes tipos de energía. Estas enzimas son importantes en

muchos procesos biotecnológicos en este caso especial, en el proceso de compostaje,

ya que por medio de estas, se degradan los diferentes sustratos orgánicos generando

un producto de importancia comercial.

Por otra parte, en el suelo se expresan diferentes actividades enzimáticas gracias a las

transformaciones biológicas que tienen lugar, desarrollando un papel bastante

importante. Una parte de las enzimas del suelo son, extracelulares siendo liberadas

durante el metabolismo y muerte celular; otras son intracelulares, formando parte de

la biomasa microbiana. También existen enzimas inmovilizadas que son las que

pueden mantener un nivel constante y estable de la actividad enzimática en el suelo,

independiente de la proliferación microbiana y de las formas usuales de regulación de

la síntesis y secreción de enzimas. Este tipo de enzimas inmovilizadas pueden

permanecer unidas a coloides minerales (arcillas) u orgánicos (sustancias húmicas)

siendo muy resistentes a los procesos de desnaturalización (Paolini, 2002).

Dado que la mayor cantidad de materia orgánica presente en el suelo es polimérica, la

descomposición del carbono depende de la producción celular de enzimas

microbianas que convierten compuestos complejos en productos más pequeños

(Ratledge, 1994; Kogel – Knabner, 2002; Nannipieri et al., 2002).

2.2.4.1 Proteasas

Son enzimas del grupo de las hidrolasas, que catalizan la hidrólisis de enlaces

peptídicos de otras proteínas y péptidos. Cuando estas moléculas son atacadas por las

proteasas, no se descomponen directamente a aminoácidos sencillos; su degradación,

siempre sigue un patrón que se puede resumir así: >proteína >proteosas >peptonas


24

>péptidos >aminoácidos. Las proteasas se pueden clasificar de acuerdo a sus

propiedades catalíticas en exoproteasas (rompen hacia el extremo de la proteína

liberando los aminoácidos terminales) y endoproteasas (rompen hacia el interior de la

cadena peptídica liberando péptidos) (Granados et al., 2003). Una característica

importante que debe considerarse es el pH óptimo de la proteasa (Figura 4).

Figura 4. Mecanismos de acción de las proteasas (Rao y Col, 1998)

Las exoproteasas actúan solo al final de la cadena polipeptídica. Según el sitio de

acción del amino o carbono terminal se denominan en amino o carboxipeptidasas

respectivamente (Rao y Col, 1998).

La actividad de las aminopeptidasas se ve reflejada sobre el amino terminal libre de la

cadena polipeptídica, liberando un solo aminoácido residual, un dipéptido o un

tripéptido y las carboxipeptidasas, actúan sobre el carbono terminal de la cadena

polipeptídica, liberando un solo aminoácido o un dipéptido. Pueden dividirse dentro

de tres grupos mayores, según la naturaleza del aminoácido residual, del sitio de

acción de la enzima y son serina-carboxipeptidasas, metilo-carboxipeptidasas y

cisteína-carboxipeptidasas.

Según Rao & Col, (1998), las endopeptidasas se caracterizan por su acción

preferencial sobre los enlaces peptídicos de la región interna de la cadena, sin la

C O O

H2N +

+OH-

H2O + CN

OH

C

O

O H3N- +

+H+

C

O

OH H3N +

pH neutro

pH ácido

pH alcalino


25

presencia de nitrógeno o carbono terminal. Este grupo de enzimas, está dividida en

subgrupos basados en el mecanismo catalítico: serina proteasas, aspártico proteasas,

cisteína proteasas y metilo proteasas.

Las serina-proteasas, presentan el aminoácido serina en su sitio activo y generalmente

se mantienen activas a pH neutro o alcalino con un óptimo entre siete y once; las

aspártico-proteasas, son también conocidas como proteasas ácidas, que dependen de

los residuos de ácido aspártico generados por su actividad metabólica, además la

mayoría de estas enzimas demuestran actividad a bajo pH entre tres y cuatro; las

cisteína-proteasas depende de la presencia de cisteína (cis) o histidina (his), tienen un

pH óptimo neutro, aunque algunas trabajan a pH ácido y por último, las metilo-

proteasas que es un grupo de enzimas muy diverso, se caracterizan por poseer un ión

metálico divalente para su actividad (Rao & Col, 1998).

2.2.4.2 Celulasas

Las celulasas son enzimas que clivan diferentes uniones en la molécula de celulosa,

dicho compuesto es un polisacárido estructural de las plantas constituído por largas

cadenas no ramificadas de recursos lineales D-glucosa unidos por enlaces

glicosídicos β (1-4) (Figura 5), esta molécula está estabilizada mediante puentes de

hidrógeno externos y su clivaje genera residuos de celobiosa, cortando el disacárido a

monómeros de glucosa.

Figura 5. Estructura de química de la celulosa. Moléculas de glucosa unidas por enlaces β-1,4

glucosídicos (Ballesteros, 2001)


26

La degradación de la celulosa requiere un sistema enzimático complejo, ya que es

necesaria la utilización de varias enzimas que degraden este compuesto y producir

moléculas más simples para así, penetrar a la célula microbial. Las diferentes enzimas

que conforman este complejo, son listados en la Tabla 2.

Tabla 2. Características generales de las celulasas

Fuente: Uhlig, 1998

La presencia de complejos multienzimáticos aumenta significativamente la eficiencia

celular, la utilización de sustratos complejos con grandes diferencias, como son los

carbohidratos en las celulosas, hemicelulosas y pectinas, han desarrollado bacterias

de “hidrolasas multifuncionales” en la forma de complejos enzimáticos, los cuales

facilitan la utilización eficiente de estos sustratos (Guevara, 2003).

Las proteasas y las celulasas –entre otras enzimas- son las que permiten la adecuada

degradación de la materia orgánica y permiten producir un compuesto degradado y

bastante estable (Compost). Este tipo de microorganismos degradan eficientemente la

ENZIMA ACTIVIDAD PRODUCTO

EXOCELULASAS

Exo-biohidrolasa

1, 4 β-glucan celobiohidrolasa

Hidroliza los enlaces covalentes de los puentes glicosídicos, exponiendo a las exo y endoglucanasas del complejo Cx los grupos reductores y no reductores de las moléculas desacopladas de celulosa. Corta la celobiosa del extremo no reducido de la cadena glucano y de la celodextrina (fragmentos de celulosa con tres a seis residuos de glucosa).

Celobiosa

ENDOCELULASAS

Endoglucanasa

1,4-β-D glucan-4-glucanohidrolasa

Corta el enlace glicosídico β-1,4 al azar en las regiones internas de la cadena de celulosa y derivados. Rompe los puentes de hidrogeno entre cadenas polisacáridas adyacentes, con el efecto subsecuente de la hidrólisis penetrante de los cristales de celulosa.

Celobiosa +

Glucosa

β GLUCOSIDASA

Celobiosa β-D-glucosido-glucohidrolasa

Hidrolizan los dímeros de celobiosa a monómeros de glucosa

Glucosa


27

celulosa en diferentes ambientes, pero los microorganismos aerobios se encargan del

reciclaje de material orgánico principalmente del suelo.

Criquet en 2002, cuantificó y caracterizó la actividad celulolítica en desechos

forestales, examinando factores como pH, temperatura, tipo de buffer y cantidad de

muestra, los cuales pueden afectar la cuantificación y actividad de esta enzima. Para

la extracción, utilizó el método propuesto por de Deng y Tabatabai (1994), midiendo

los azucares reductores mediante la técnica de Somogyi Nelson y en simultanea con

el método del ácido 3,5 dinitrosalisílico (DNS), comparando estas dos técnicas. De

esta manera, determinaron que la técnica de DNS no es una técnica sensible para la

cuantificación de azucares reductores en suelos. En cuanto al medio de extracción,

utilizó buffer acetato pues comprobó ser el ideal ya que presentó una mejor

recuperación de estas enzimas en el suelo a una temperatura de 50°C. Sin embargo,

ensayó con buffer citrato, considerado ser el mejor extractante de celulasas en suelos

aunque no presente la anterior característica.

Una herramienta adicional utilizada en esta investigación fueron los análisis

electroforéticos (PAGE), este modelo electroforético reveló que 2 isoenzimas pueden

estar relacionadas con 2 valores altos presentados por el buffer citrato utilizado para

la cuantificación de la actividad celulolítica

2.3 Métodos de determinación y seguimiento de humificación en suelos

Las sustancias húmicas que se encuentran en el medio natural son provenientes de

residuos de las plantas y animales en estado de descomposición, unidos a los

productos sintetizados por los microorganismos del suelo y ciertos intermedios de

dicha síntesis (Ayuso, 1995). Esta composición no es estable sino que representa un

gran dinamismo, por lo que más que un grupo de sustancias estamos ante un estado

de la materia orgánica, diferente según las condiciones de su formación.

Entre un 60% y un 90% de la materia orgánica del suelo está constituída por estos

materiales de naturaleza lignoproteíca (Gallardo, 1980).


28

De acuerdo al seguimiento del proceso de humificación, es necesario realizar como

primera medida la extracción de sustancias húmicas formadas ya sea en el suelo o en

compost, para este fin, se usan métodos químicos que permiten extraer una parte de

las sustancias húmicas mediante el empleo de reactivos alcalinos, utilizando

preferiblemente la extracción directa con NaOH 0,1M y posteriormente,

cromatografía fraccionada (Qualls et al., 2003).

Variadas y modernas técnicas analíticas son usadas para la determinación de ácidos

húmicos y fúlvicos, posterior a su extracción, que incluyen métodos complejos como

el usado por Sequi et al. (1986), que propuso un sistema de purificación dependiendo

de la capacidad de absorción de ácidos húmicos y ácidos fúlvicos por parte del

polivinilo (PVP).

De Nobili et al. (1989), planteó un “electro-focusing”, esta técnica permite el

seguimiento de la producción de sustancias húmicas durante el proceso de

humificación por medio de la observación de los cambios en el perfil obtenido a

través del densitómetro de bandas formado por el núcleo de las sustancias húmicas.

Sin embargo, existen métodos mas sencillos como el de espectrofotometría de

fluorescencia que permite la determinación de estas mismas sustancias en solución

acuosa (Olk et al., 2000) y por otro lado, se usan de la análisis colorimétricós

empleando diferentes reactivos, el cual es basado en la propiedad de las sustancias

húmicas de oscurecer los colores como proceso del compostaje.

Ya metodologías mas específicas son realizadas para poder comprobar de que están

compuestas estas sustancias húmicas como análisis cromatográficos, espectroscopía

infrarroja y densidad óptica, el RMN 13C, la resonancia del espín electrónico, la

pirólisis-espectrofotometría de masas y la extracción de gases super critica (Schnizer,

1990; Konova (1966).

Por otro lado, se establecen métodos de determinación de microorganismos en el

suelo, las técnicas tradicionales de detectar la presencia de microorganismos en el


29

suelo son los análisis de las muestras directamente en medios concretos. Las nuevas

técnicas incluyen el bioinformador inmunológico basada en la luz. La distribución

espacial de microorganismos específicos en una muestra puede determinarse por

medio del microscopio y de manera no invasiva empleando la hibridación

fluorescente insitu (HFIS -FISH) de microorganismos. La técnica más sensible,

específica y cada vez más utilizada, es el aislamiento directo y la amplificación del

ADN del suelo (efbpublic.org).

Si bien el suelo es el sistema biológicamente más diverso del planeta, no se cuenta

todavía con métodos satisfactorios para medir su biodiversidad. Se han sugerido

algunos índices basados en métodos moleculares estudiando grupos específicos de

microorganismos. Un enfoque práctico es el uso de características fenotípicas para

establecer un índice de biodiversidad. Basándose en los recuentos viables en caja se

puede determinar el número de morfotipos (colonias diferentes de bacterias) en las

muestras estudiadas y concluir cual de las muestras es más diversa que otra, lo que

permite comparar el impacto que diferentes manejos agrícolas que ejercen sobre la

diversidad microbiana. Utilizando la cinética de reasociación de moléculas de DNA,

se puede estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas. El DNA purificado

del suelo se desnaturaliza para formar bandas simples. La tasa de reasociación de

estas bandas depende del número de secuencias similares (Uribe, 1999). Así, en una

comunidad con muchas especies, entre mayor sea la complejidad, mas lenta será la

reasociación de secuencias de ADN similares. Debido a que el ADN de simple banda

absorbe más fuertemente a 260 nm que el de doble banda, el grado de reasociación

puede medirse utilizando un espectrofotómetro (Torsvick et al, (1994); Paul y Clark,

1996).

2.3.1 Determinación de materia orgánica total en el suelo

El método mas usado para esta determinación es el propuesto por Walkley y Black

(1934) que se basa en la oxidación de la materia orgánica mediante un oxidante fuerte

como es el dicromato (Cr2O7) en presencia de ácido sulfúrico (H2SO4) y esta materia


30

orgánica oxidada, se valora mediante una solución de sal de Mohr (Sal ferrosa FeSO4

7H2O). Este método usa 2 indicadores que son la difenilamina y el ácido fosfórico

(H3PO4) que permiten la unión del oxidante con la materia orgánica, mostrando de

esta manera el cálculo de la cantidad de materia orgánica presente en la muestra.

Walkley y Black determinaron que del contenido de materia orgánica total presente

en el suelo, solo el 58% pertenece al carbono oxidable, generando un cociente de 1,72

que permitirá realizar este cálculo más real.


31

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

• Realizar un seguimiento del proceso de humificación de compost inoculado

aplicado en suelo bajo condiciones de laboratorio determinando materia

orgánica por vía húmeda.

3.2 Objetivos específicos

• Evaluar el método de extracción enzimática propuesto por Lynch y Raphael

(1987) combinado con la técnica de DNS y TCA para la determinación de

actividades enzimáticas en el transcurso de 90 días en las matrices en estudio.

• Evaluar el método de determinación de materia orgánica por vía húmeda

propuesto por Walkley y Black (1934), en las matrices con diferente relación

compost:suelo, en el tiempo (0, 30, 60, 90 días).


32

4. MATERIALES Y MÉTODOS

Este proyecto fue realizado en los laboratorios de Microbiología Ambiental y Suelos

y de Química Analítica de la Pontificia Universidad Javeriana. Las muestras de

compost trabajadas fueron obtenidas a partir de un proceso de compostaje en el

Relleno Sanitario Don Juanito de la ciudad de Villavicencio, manejado por la

empresa Bioagrícola del Llano S.A. E.S.P. Por otro lado, el muestreo de suelo fue

obtenido a partir de un cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni situado en Puerto López-

Meta.

4.1 Recolección de muestras

4.1.1 Zonas de muestreo

La zona de muestreo del compost se encuentra situada en la ciudad de Villavicencio

departamento del Meta, ubicada en el piedemonte de la cordillera Oriental, en la

márgen derecha del río Guatiquía. Se localiza a una altura de 467 m.s.n y su

temperatura promedio es de 28°C; tiene una precipitación media anual de 3663 mm y

una humedad relativa del 77.8% (Manejo técnico del relleno sanitario Don Juanito

2004, citado por Galindo et al. (2005).

Por otra parte, se realizó el muestreo del suelo en el municipio de Puerto López

situado en el departamento del Meta. Su temperatura promedio anual es mayor a los

27°C, la precipitación promedio anual superior a los 2000 mm y la humedad relativa

superior al 75% (IDEAM, 1997).

4.1.2 Toma de muestras de compost

Las muestras fueron tomadas de una pila de compost que estaba compuesta de 60%

de residuos de plaza, 20% de contenido ruminal y 20% de poda, en tiempo de

maduración correspondiente a 75 días, con un tamaño aproximado de 2 m de largo

por 1.50 m de altura hasta completar 4 toneladas (Figura 6) y una temperatura

promedio de 32°C, ubicadas en el Relleno sanitario Don Juanito-Villavicencio


33

(Meta). A partir de este se tomaron diferentes muestras de manera aleatoria de

aproximadamente 700 g para un total de 10 muestras, con un guante protector,

tratando de tomar muestras en el interior de la pila, para ello se retiró el material

superficial de la pila posteriormente, se depositaron en cantidades adecuadas para

realizar la prueba en bandeja y así, efectuar los diferentes análisis enzimáticos

(proteasas y celulasas) y químicos (pH y materia orgánica total).

Para el transporte y conservación de las muestras, se depositaron las muestras en

bolsas de papel kraft a su vez, protegidas en bolsas de autosellado y dispuestas en

nevera a 4°C hasta el momento de su análisis, para luego llevarlas a los Laboratorios

de Microbiología Ambiental y de Suelos y de Química Analítica.

Figura 6. Disposición de pilas de compost. Tratamiento 5 con 60% de residuos de plaza, 20% de

contenido ruminal y 20% de poda. Fuente: Autor 2006.

4.1.2.1 Análisis fisicoquímicos de la muestra

De los aproximadamente 700 g muestreados de compost, 100 g fueron destinados

para el análisis de los parámetros fisicoquímicos realizados por AGRILAB,

laboratorio registrado ante el ICA, con el fin de establecer humedad, cenizas, pérdidas

por volatilización, carbono orgánico oxidable, pH, densidad, conductividad eléctrica,


34

retención de humedad, capacidad de intercambio catiónico, relación C/N, nitrógeno

total (NT), P2O5, -K2O, CaO, MgO, S, Fe, Mn, Cu, Zn, Bo, Na y residuos insolubles

en ácidos.

4.1.3 Toma de muestras de suelo

Las muestras de suelo fueron tomadas de un cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni

ubicado en Puerto López-Meta (Figura 7), cavando aproximadamente 20 cm de

profundidad y recolectando la muestra, descartando material grande, como piedras,

raíces, tallos, etc., depositándolos en bolsas de papel y luego en bolsas de autosellado,

para inmediatamente almacenarlos a 4°C (Mondini et al., 2005). Estas muestras se

recolectaron aleatoriamente aproximadamente de 700 g para un total de diez muestras

para posteriormente, mezclarlas con el compost anteriormente muestreado y realizar

la prueba en bandeja.

Figura 7. Cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni. Zona de muestreo ubicada en Puerto López-Meta.

Fuente: Autor 2006.


35

4.1.3.1 Análisis fisicoquímicos de la muestra

De los aproximadamente 700 g muestreados de suelo, 100 g fueron destinados para el

análisis de los parámetros fisicoquímicos realizados por AGRILAB, laboratorio

registrado ante el ICA, con el fin de establecer textura, pH, humedad, conductividad

eléctrica, capacidad de intercambio catiónico, carbono orgánico, iones K, Ca, Mg,

Na, Al, Fe, Mn, Cu, Zn, Bo, P, SO4, porcentaje de saturación de Mg, Na, Al, K y Ca,

además de los índices de Ca/Mg, Ca/K, Mg/K y (Ca + Mg)/K.

4.2 Ensayos invitro

4.2.1 Preparación de las muestras

Antes de realizar esta prueba, se sometieron, separadamente, las muestras de compost

y suelo a un tamizado (tamiz #12= 170 µm ó 0,0661 pulg.), para reducir el tamaño de

partícula y que quedara uniforme.

Se prepararon 11 diferentes tratamientos a partir de cantidades de compost:suelo con

un peso final de 100 g y se depositaron en pequeñas bandejas de aluminio con

dimensiones de 11.5 x 21 cm. y diez réplicas por cada tratamiento, estas mezclas se

obtuvieron de la siguiente manera: T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5

60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90 y T11 0:100. Se tomaron

diferentes tiempos del proceso (0, 30, 60, 90 días) para así, realizar la técnica de

extracción propuesta por Lynch y Raphael (1987) para luego, determinar la actividad

proteolítica y celulolítica en cada uno de los montajes. Estos tratamientos se

cubrieron con vinipel para evitar la deshidratación de la mezcla.

Todas las bandejas permanecieron a temperatura ambiente aproximadamente a 19°C

y expuestas a la luz.


36

4.2.2 Determinación de humedad de los tratamientos

Para esta determinación se pesaron 5 g de las diferentes muestras y se depositaron en

bolsas de papel kraft debidamente pesadas para luego colocar dichas bolsas en el

horno de secado a 80°C durante 24 horas, luego de las cuales se volvieron a pesar. El

porcentaje de humedad se determinó por medio de la ecuación (1) (Aguilera et al.,

2001):

100*sec

%frescoPeso

opesofrescoPesoHumedad

−= (1)

El mantenimiento de la humedad se hizo cada tres días y se llevó a capacidad de

campo (60%) que es la recomendada para sostener un cultivo y para conservar el

agua de la mezcla.

4.2.3 Determinación de pH en la mezcla compost:suelo

En la determinación de pH en la mezcla compost:suelo se utilizó la metodología

propuesta por Andrades (1996), reduciendo a la mitad el volumen de agua

desmineralizada y la cantidad de muestra a analizar, manejando una relación final de

1:24.

4.3 Determinación de materia orgánica en el suelo

4.3.1 Oxidación de materia orgánica total en el suelo por vía húmeda

Se determinó la materia orgánica total en el suelo por el método de Walkley y Black

(1934) que se basa en la oxidación con dicromato de potasio (K2Cr2O7) y ácido

sulfúrico (H2SO4).

Para esto, se secó aproximadamente 1 g de suelo en una bandeja de aluminio a una

temperatura de 105°C durante 2 horas, luego se pesaron tres réplicas idénticas de una

cantidad de aproximadamente 0.1 g, a continuación se añadió, con una pipeta aforada


37

5 mL de K2Cr2O7 1N y 10 mL de H2SO4 concentrado en todos los vasos con las

muestras pesadas anteriormente. Los vasos se llevaron a calentar en una estufa a una

temperatura de 150°C durante 15 minutos, transcurrido este tiempo, se dejaron enfriar

las soluciones y se transfirió el contenido de cada vaso a respectivos balones aforados

de 50 mL, se completaron con agua destilada y por último se agitaron (Swift, 1996).

De las mezclas anteriores, se tomaron alícuotas de 10 mL que se transfirieron a

erlenmeyers de 100 mL, añadiendo a cada erlenmeyer 4 gotas de indicador de

difenilamina y 2 gotas de H3PO4 concentrado. Hecho el anterior procedimiento, se

tituló con sal de Mohr (Anexo 1) a una concentración de 0,034N, se aconseja titular

las muestras con la sal ferrosa recién preparada, ya que las sales se precipitan y eso

altera la determinación. Finalmente, la titulación de la muestra produjo un viraje de

color azul-violeta a verde esmeralda (Swift, 1996).

Por otra parte, con el objeto de determinar la normalidad exacta de la sal ferrosa, se

efectúa un blanco paralelo, a un sistema que no posee muestra de suelo, y que se

titula siguiendo el mismo protocolo recién descrito

Para la determinación de la materia orgánica total, ella se expresa como % COT (2),

(3):

22*

50

5*1*10 ++

=

FeFe

NVNmL (2)

Para las muestras:

)(722)(722)(722 2 MOFeT OCrKgmeqdeNOCrKgmeqdeNOCrKgmeqdeN −°+−°=−° +

gmeq

g

W

g

mL

mLNVNCOT

muestraFeFe −

−

= ++

4000

12*

100*

10

50**

50

5*1*10% 22 (3)


38

Se supone que la materia orgánica del suelo contiene, por termino medio, un 58% de

carbono; así que la multiplicación del valor obtenido para el carbono por 1,77

(100/58) dará el % de materia orgánica (Faithfull, 2005).

4.4 Evaluación de la actividad enzimática cuantitativa

4.4.1 Extracción de proteasas

La extracción de proteasas se realizó según lo descrito por Lynch y Raphael (1987)

tomando submuestras de aproximadamente 15 g colectadas aleatoriamente de los

diferentes tratamientos y cada una de sus réplicas manejadas de las mezclas

compost:suelo, estas submuestras se llevaron a una congelación lenta (-55°C),

posteriormente se trituraron 5 g y se mezclaron con 50 mL de solución buffer fosfato

0.1 M (Anexo 2). Cada muestra se centrifugó a 16 000 g por 30 minutos en una

centrifuga refrigerada marca Biofuge-Sorvall.

El sobrenadante obtenido del anterior proceso, se transfirió a otro tubo de centrífuga

de 50 mL y se agregó a cada muestra 3 volúmenes de acetona a -15°C para precipitar

la proteína solubilizada, se repitió el proceso de centrifugación y el precipitado se

conservó ya que contenía las proteínas requeridas de las muestras analizadas. Este

último, se resuspendió en 30 mL de la solución buffer fosfato 0.1M (González et al.,

2004), seguido de la cuantificación de proteína utilizando el método del ácido

tricloroacético que más adelante será descrito.

4.4.1.1 Ensayo de la actividad proteolítica

A partir del extracto con enzimas obtenido, se tomó 1 mL y se diluyó en 9 ml de

buffer fosfato 0.1M (pH 7.2). Se tomó 1 mL de esta dilución y se adicionó a 1ml de

solución de caseína 1% m/v (Anexo 3) en buffer fosfato 0.1M pH 7,2 +/- 0,2. Cada

muestra se incubó durante 60 minutos a temperatura de 30°C en baño termostatado.

Terminado el periodo de incubación, se agregó 1 mL de ácido tricloroacético 15%

(TCA) m/v (Anexo 3) con el fin de precipitar la caseína no hidrolizada, además de

detener la reacción (Hubner, 1991), junto con el almacenamiento a 4° C durante 5


39

minutos. La mezcla se centrifugó a 5 000 rpm por 5 minutos y a los sobrenadantes se

les leyó la absorbancia posteriormente, a 280 nm en espectrofotómetro de luz U.V.,

utilizando como blanco una solución que contenía 1 mL de solución de caseína 1%

m/v, 1 mL de TCA y 1 mL de buffer fosfato 0.1M (Carrascal et al., 2006). Los

resultados de esta prueba fueron expresados en UP, referidos a la cantidad de enzima

capaz de liberar un µmol de tirosina/minuto/mL bajo las condiciones de la prueba

(Hubner, 1991).

4.4.1.2 Curva patrón para la técnica del ácido tricloroacético

Se prepararon diferentes soluciones de tirosina (10 µmol/mL -100 µmol/mL) (Anexo

4) disueltos en agua destilada, con un volumen final de 3 mL, luego se determinaron

espectrofotométricamente las absorbancias de las soluciones patrón a 280 nm, en el

fotómetro UV; como blanco de la prueba se utilizó una solución que contenía 1 mL

de solución de caseína 1% m/v, 1 mL de TCA (ácido tricloroacético) y 1 mL de

buffer fosfato 0.1 M. Posteriormente, la mezcla se centrifugó a 5 000 rpm por 5

minutos. Las absorbancias fueron leídas a 280 nm en espectrofotómetro de luz U.V

(Hubner, 1991) y finalmente estos valores (Anexo 5), se reemplazaron en la ecuación

de la curva patrón de tirosina.

4.4.2 Extracción de celulasas

La extracción de celulasas se hizo de igual forma que la metodología para la

extracción de proteasas, en el numeral 4.4.1.

4.4.2.1 Ensayo de actividad celulolítica

A partir del extracto con enzimas obtenido, se tomó 1 mL y se adicionó 1 mL de

solución de carboximetilcelulosa (CMC) (Anexo 6) disuelta en buffer fosfato. La

mezcla final se incubó a temperatura de actividad en baño termostatado a 37ºC

durante 60 minutos (ó 6 horas a temperatura ambiente), según el caso, finalizando

este tiempo, se detuvo la reacción refrigerando a 4°C durante 5 minutos.

Posteriormente, se centrifugó la muestra por 10 minutos a 5 000 rpm, a partir del


40

sobrenadante se realizó la metodología descrita en la Tabla 3 (Miller 1959; Pedroza,

2000).

Tabla 3. Determinación de la actividad celulolítica cuantitativa por el método de DNS.

Reactivo Blanco (mL)

Para cada una de las muestras (mL)

Sobrenadante de la técnica enzimática

- 0.25

Agua 0.25

-

Reactivo DNS 0.25

0.25

Calentar con agua hasta punto de ebullición por 5 minutos y frenar reacción colocando los tubos en hielo

Agua

2.5 2.5

Proteger los tubos de luz y leer en espectrofotómetro a 540 nm. Ajustar el cero de absorbancia con el blanco de la prueba

Fuente: Miller, 1959

Los resultados de esta prueba fueron reportados en Unidades Celulolíticas (UC),

definida como la cantidad de enzima que libera un µmol de glucosa por minuto por

litro, bajo las condiciones de la prueba.

4.4.2.2 Curva patrón para la técnica del ácido 3-5 dinitrosalisílico (DNS)

Se prepararon diferentes soluciones de glucosa (Anexo 7) (0,5 g/L- 2 g/L) disueltos

en agua destilada, con un volumen final de 3 mL, luego se determinaron

espectofotométricamente las absorbancias de las soluciones patrón a 540 nm.

Como blanco de la prueba, se utilizó una solución que contenía 0,25 mL de agua

destilada, 0,25 mL de reactivo de DNS (Anexo 8) y por último, 2,5 mL de agua

destilada. Las absorbancias se reemplazan en la ecuación de la curva patrón de

glucosa (Anexo 9).


41

4.5 Análisis estadístico

Teniendo en cuenta los datos obtenidos a partir de los análisis enzimáticos y químicos

de los tratamientos hechos, se aplicó un análisis de varianza ANOVA, analizando

variables como pH, carbono orgánico oxidable, actividad proteolítica, celulolítica.

Por medio del valor F obtenido se indicó la probabilidad de aceptar o rechazar la

hipótesis nula, para ello se formularon las siguientes hipótesis

H0: Las medias de todos los tratamientos/tiempos son iguales.

Hi: Existe por lo menos una media de todos los tratamientos/tiempos diferente de las otras.


42

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1 Recolección de muestras

5.1.1 Toma de muestras

El muestreo efectuado para evaluar el seguimiento del proceso de humificación en

compost de residuos orgánicos domiciliarios, se realizó pasados 75 días del montaje

de la pila, reportando valores aproximados a los 32°C, según lo establecido por el

Relleno Sanitario Don Juanito.

Para realizar el muestreo del compost, se tomaron las muestras manualmente con un

guante protector cuando la temperatura se encontraba estable, corroborándose que el

proceso de compostaje realizado en Bioagrícola del Llano superaba las 9 semanas. El

origen del compost fue producto de la degradación de desechos del campo agrícolas,

rico en compuestos orgánicos (C y N) y presentó un estado físico sólido (Tabla 4).

La relación C/N proporciona una estimación directa de las fracciones biológicamente

degradables en el compost. Esta relación ha sido usada por distintos investigadores

como índice de estabilidad/madurez. En el proceso de compostaje, este índice

disminuyó a 11 al final del ensayo. Por lo general se considera maduro cuando la

relación C/N es menor de 25 o más cercano a 15 (Pascual et al., 1997), sin embargo

Sztern y Pravia (1999) aseguran que el coeficiente final de C/N para que un compost

se considere maduro y estable es del orden de 12 – 15. Bertoldi et al., 1996, sugieren

que este estado se presenta cuando la relación alcanza 10:1, es decir, no se presenta

alta actividad metabólica y la energía bioquímica disminuye como resultado de la

actividad enzimática de los microorganismos, índices un poco más bajos propone

Collis en 1971; y Palmisano y Barlaz (1996) que sugieren un índice de 10.

Por otra parte Muñoz (1994), asegura que una condición favorable del compost que

va ser incorporado al suelo es que presente una relación C/N de 10/12:1, por lo que

dicho producto sería apto para la aplicación en cultivos agrícolas y además, cumple


43

con los requerimientos estándares (<25:1) de Canadá, Chile, la Federal Compost

Quality assuranse Organization. Cabe aclarar que la NTCC-5167 no especifìca un

rango determinado para la relación C/N.

Tabla 4. Composición fisico-química del compost estable en base húmeda. Proveniente de un proceso de 75 días y con una composición de 60% de residuos de plaza, 20% residuos de poda y 20% de contenido ruminal. Comparación de resultados según la Norma Técnica Colombiana 5167, la Norma Chilena y la Norma Europea.

*BS: Base húmeda

Este valor tiene diversas desventajas como la variabilidad de los materiales que

inicialmente se usaron para el compostaje, además de su determinación analítica

debido a los procesos de secado y tamizado a los que son sometidas las muestras en el

laboratorio lo cual conlleva a pérdidas de N en forma amoniacal en los compost

inmaduros.

Parámetro Resultado NTC 5167 NCh 2880 Europea

Humedad 35% <35% ≥ 25 % MP y ≤ CMO

40%

Cenizas 13,6% - - - Pérdidas por volatilización

13,3% - - -

Carbono orgánico oxidable

8,16% 5 - 15% - -

pH 7,95 - - - Densidad (Base seca) 0,78 g/mL - - -

Conductividad eléctrica 15,6 dS/m - ≤ 5 mmho/cm - Retención de humedad 34,2% - - -

Capacidad de intercambio catiónico

14,2 me/100 g - - -

C/N 11 - - - Nitrógeno total (NT) 0,75% 10% mínimo ≥0,8% BS -

Fósforo total (P2O5) 0,55% 2% ≤ 0.1%

Sobre BS* -

Potasio total (K2O) 0,66% - - - Calcio total (CaO) 2,14% 10% mínimo - -

Magnesio total (MgO) 0,84% 10% mínimo - - Azufre total 902 p.p.m - - - Hierro total 2825 p.p.m - - -

Manganeso total 282 p.p.m - - - Cobre total 9,7 p.p.m - 50 p.p.m 100 p.p.m Zinc total 47 p.p.m - - - Boro total 7,8 p.p.m - - - Sodio total 1413 p.p.m - - -

Residuo insoluble en ácido

5,03% - - -


44

Restos de materia orgánica sin degradarse permanecieron en el compost y en el suelo,

desarrollándose baterías enzimáticas específicas para su degradación, es por esta

razón, que se midió el proceso de humificación por medio de la evaluación de la

actividad enzimática proteolítica y celulolítica que puede ser considerada como una

medida indirecta de este proceso y así, poderlo relacionar con el porcentaje de

carbono orgánico oxidable de cada uno de los tratamientos utilizados.

5.2 Procesamiento de muestras

5.2.1 Determinación de características fisicoquímicas

Las condiciones fisicoquímicas con las que cuenta el material inicial son

determinantes en el producto final. Por ello fueron tomadas muestras en el momento

inicial en el que se muestreó tanto el compost como el suelo. Los datos son mostrados

en la tabla 4 y 5, respectivamente.

Según la Norma Técnica Colombiana NTCC-5167, un abono orgánico debe tener un

contenido de humedad menor al 35%, según los datos dados por AGRILAB, el

contenido de humedad reportado para el compost final es el adecuado (Tabla 4). Por

otro lado, el análisis de carbono orgánico total al final del proceso fue bajo (8,16%)

debido a que el valor mínimo usado para abonos orgánicos según la NTCC-5167 es

de 15%. En cuanto al fósforo disponible (P2O5), se reportó un valor bastante bajo

(0,55%) con respecto al establecido por la norma NTCC-5167 de un mínimo de 2%

para ser considerado óptimo en un abono orgánico. El contenido de calcio (CaO) es

un factor favorable en la formación de agregados en el suelo, mejorando así la

estructura del mismo, por lo cual se considera que el dato reportado en la tabla 4 se

encuentra por debajo del valor óptimo respecto a la norma NTCC-5167.

De esta forma y según las características nutricionales del suelo y del compost, la

obtención de microorganismos productores de celulasas y proteasas se veía

favorecida por la composición inicial del montaje.


45

Tabla 5. Composición fisicoquímica del suelo. Proveniente de un cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni en Puerto López-Meta.

Parámetro Resultado Textura Franco arcilloso Arena 58 % Limo 16 %

Arcilla 26 % pH 6,23

Humedad Media Conductividad eléctrica 0,25 Ds/m

Capacidad de intercambio catiónico (C.I.C)

3,17 me/100 g

Carbono orgánico 1,03 K 0,16 me/100 g 64 p.p.m Ca 1,85 me/100 g 371 p.p.m Mg 0,46 me/100 g 56 p.p.m Na 0,52 me/100 g 120 p.p.m Al 0,17 me/100 g 15 p.p.m Fe 50 p.p.m Mn 4 p.p.m Cu 0,50 p.p.m Zn 1,30 p.p.m B 0,03 p.p.m

P Fosfatos 21 p.p.m S Sulfatos 22 p.p.m

Sat Mg 14,6 % Sat Na 16,5 % Sat Al 5,4 % Sat K 5,1 % Sat Ca 58,4 % Ca/Mg 4,00 Ca/K 11,38 Mg/K 2,84

(Ca + Mg)/K 14,23

Con relación al suelo, la estructura determina su porosidad e infiltración de agua, así

como la disponibilidad de esta para las plantas y susceptibilidad de erosión del suelo

(Six et al., 2000) con este antecedente se puede sugerir que el suelo manejado en esta

investigación es de alta porosidad, debido a la gran cantidad de arena que este posee.

De esta manera, se concluye que este tipo de suelo es pobre en nutrientes orgánicos y

tiene una C.I.C y retención de agua muy bajo. En la tabla 5 se presentan los

respectivos análisis realizados. Este tipo de suelo se considera dentro de la

clasificación que realiza Oliver (1990) de los antrosoles, ya que los de esta clase han

soportado frecuentes y continuas influencias antrópicas, de esta manera se puede


46

clasificar el suelo de Puerto López, ya que es de un cultivo de Stevia rebaudiana

Bertoni.

Estos parámetros son importantes al momento de realizar el seguimiento del proceso

de humificación, sin embrago, existen diversos métodos que son utilizados para

analizarlo como actividad respiratoria, análisis de enzimas involucradas en el

proceso, pérdida de peso de los sustratos incorporados al suelo, aparición de

productos del metabolismo, recuentos de grupos fisiológicos, entre otros (Frioni,

1990).

De igual forma, la población microbiana del suelo y la desarrollada en el compost

participan en la formación de moléculas húmicas, catalizando distintas reacciones

bioquímicas, mediante baterías enzimáticas muy complejas que degradan la materia

orgánica presente. Estas enzimas son de carácter extracelular que pueden perdurar en

el suelo o en el compost adheridos a las partículas de arcilla, protegiéndose del ataque

microbiano Este fenómeno es altamente alterado por el microclima que existe en el

suelo, su estructura y atmósfera y la relación C/N. Por estos diversos factores, es

importante tenerlos en cuenta para obtener un buen desarrollo estas enzimas y de esta

manera, aportes significativos en esta investigación.

5.2.1.1 Determinación de pH

Se realizó la medición del pH al tiempo inicial, a los 30, 60 y 90 días, con el fin de

evaluar el grado de humificación del compost inoculado. Debido a que las enzimas

como las proteasas y las celulasas son mas activas a pH neutro, se favorece la

degradación de la materia orgánica del suelo y del compost. Se observó que la

fluctuación de los valores de pH es aproximadamente lineal y creciente con respecto

al contenido de materia orgánica (Figura 8).

Teniendo en cuenta que la materia orgánica se encontraba en alto grado de

descomposición en la pila, ya que tenia un proceso de 75 días de maduración, y


47

presentaba un pH estable de aproximadamente 8,25 (Tabla 6); se observa que a

medida que aumenta la cantidad de compost aumenta de igual forma el pH, esto es

probablemente debido a la formación de amoniaco por vía aerobia en un proceso

llamado amonificación o mineralización, en el cual ocurre una deaminación de las

proteínas y la descomposición de otros compuestos nitrogenados como la urea

(Richard, 1996).

0

2

4

6

8

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tratamientos

pH

Figura 8. Valores de pH de cada unos de los 11 tratamientos durante el primer muestreo.

De igual forma, esta característica es usada como indicador para determinar la

madurez del compost (Graves, 2000). A medida que va descendiendo la cantidad de

compost, es más bajo el nivel de pH, hasta llegar a un valor de pH de 6,46

correspondiente al tratamiento 10 (10 g de compost y 90 g de suelo). Los valores

bajos de pH en los tratamientos que están compuestos en su mayoría de suelo,

probablemente fueron producto de las altas concentraciones de aluminio presente, ya

que el aluminio en solución acuosa, produce una molécula que al oxidarse

nuevamente, libera altas concentraciones de iones hidronio (H+), generando de esta

manera, la disminución del pH.

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

10

8

6

4

2

0

pH

Tratamientos


48

Tabla 6. Medias de los valores de pH de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo. Tratamientos pH

Compost 8,25 2 8,02 3 8,12 4 7,84 5 7,76 6 7,73 7 7,66 8 7,32 9 6,83 10 6,46

Suelo 6,23

[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]

Por otra parte, analizando el seguimiento del pH durante los 90 días que duró el

proceso (Tabla 7 y Figura 9), se presentó una ligera tendencia de variación a los 30

días, en particular para los tratamientos 1, 9, 10 y 11, además de tendencia a

estabilizarse a los 60 y 90 días para todos los tratamientos.

Tabla 7. Medias de pH de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.

Tratamientos Tiempo 0 30 días 60 días 90 días Compost 8,32 7,87 8,14 8,18

2 8,11 8,06 7,92 7,91 3 8,18 8,03 8,00 7,85 4 7,75 7,78 7,75 7,79 5 7,68 7,74 7,87 7,87 6 7,70 7,71 7,70 7,64 7 7,74 7,59 7,67 7,62 8 7,15 7,36 7,45 7,59 9 7,09 6,67 6,99 7,20 10 6,63 6,36 6,69 6,86

Suelo 6,28 6,07 6,59 6,65

[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]


49

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

8,50

1 2 3 4

Tiempo (dias)

pH

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11

0 30 60 90

Figura 9.Seguimiento de los valores de pH durante los 90 días del proceso de humificación.

[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]

Estos valores graficados, demuestran que las desviaciones estándar son muy bajas

con respecto a la media del pH, lo cual se puede inferir que el método de

determinación de pH es preciso y confiable para este tipo de estudios (Anexo 9).

Para comprobar si existen diferencias altamente significativas entre tratamientos y a

lo largo de los tiempos de muestreo, se sugiere las siguientes hipótesis estadísticas:

H0: Las medias de todos los tratamientos son iguales.

Hi: Existe al menos una media significativamente diferente de las otras.

Según la tabla 8, se concluye que se rechaza la hipótesis nula que corresponde a que

durante todo el seguimiento del proceso de humificación se presentaron igualdades

significativas entre los tiempos y tiempos de muestreo, debido a que el estadístico de

prueba F es mayor al del valor crítico de F. En el caso de los tiempos de muestreo,

concluye que aunque no es alta la variación presentan disparidad. Por otro lado,

comparando estos dos valores en cuanto a los diferentes tratamientos, se presenta una

gran diferencia entre los valores de pH de cada tratamiento, por esta razón, se

produce una probabilidad muy baja, indicando que hay una altísima diferencia entre

8,5

8,0

7,5

7,0

6,5

6,0

C

0 30 60 90

pH

Tiempo (Días)

S


50

las dos de las medias de algún par de tratamientos por lo menos, debido posiblemente

a la diferencia en materia orgánica de cada tratamiento, a un nivel de confianza del

95%. Estas fluctuaciones pueden ser causadas por el metabolismo propio de los

microorganismos, debido a que en los primeros tratamientos presentados que

presentan una mayor cantidad de compost, es decir, de materia orgánica, son los que

le proveen las características nutricionales y de esta manera, aumentan su

metabolismo, generando un aumento en la temperatura, lo que puede explicar estas

variaciones.

Tabla 8 ANOVA. Seguimiento del pH durante todos los 90 de proceso

Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Promedio de cuadrados

F Prob Valor critico para F

Tiempos de muestreo

0,189 3 0,063 3,38 0,031 2,92

Tratamientos 13,958 10 1,396 74,7 2,11x10-18 2,16 Error 0,561 30 0,019 Total 14,708 43

Se rechaza la hipótesis nula , existen diferencias significativas entre las medias de los 11 tratamientos y entre los 4 tiempos de muestreo a lo largo de todo el proceso

El mantenimiento de la humedad de los diferentes tratamientos se realizó por medio

de un aspersor, liberando pequeñas gotas de agua en todas direcciones garantizando

así, una homogeneidad en la humedad a la que esta sometida la bandeja. Con los

datos arrojados de pH, se observa que hubo una buena distribución del agua en los

montajes, ya que los valores de pH de cada tratamiento fueron similares, pues de lo

contrario, es factible que se hubieran presentado cambios bruscos de pH. Se puede

argumentar que un exceso de agua generaría un ambiente de anaerobiosis y por ende,

mal olor y una ausencia de agua bajaría la actividad de los microorganismos

aeróbicos y el proceso se ralentiza.


51

5.2.1.2 Determinación de carbono orgánico oxidable

Es de anotar que es muy recomendable la determinación de carbono orgánico en

compost por vía húmeda, debido a que la descomposición de los carbonatos y la

pérdida de agua de las arcillas falsearían los resultados, es por esto que se recurre a su

determinación por vía húmeda. Otro método para la determinación de materia

orgánica es por medio de la vía seca (calcinación). Este es más efectivo que el de vía

húmeda, debido a que hay menos interferencias en este método, además del

tratamiento térmico por calcinación. En cuanto al suelo de Stevia rebaudiana Bertoni

se sabe que tiene carbonatos y por esto se recurre a la vía húmeda, que aunque es

menos efectiva en términos de oxidación de la materia orgánica es más fiable pues en

ella no ocurriría una reacción que fuera indeseable cuando se realice la

determinación. Esta determinación incluye o cuantifica sustrato presente y biomasa

presente en cada tratamiento.

Se puede observar que durante todo el proceso de humificación, el carbono orgánico

no disminuyó en gran medida (Figura 10), sin embargo, en la Figura 11 se muestran

los coeficientes de variación presentados con respecto a la materia orgánica del

primer muestreo, corroborándose de esta manera, que los tratamientos 9, 10 y 11

fueron los que presentaron cambio drásticos en cuanto a esta determinación. Se

observa que en el tratamiento 9, el coeficiente aumentó al día 30, esto demuestra

mayor desarrollo y crecimiento microbiano en este tratamiento, concluyendo, que el

consumo de materia orgánica se ve reemplazada por la producción de biomasa a

expensas de la biomasa muerta.

Por último, la disminución del porcentaje de materia orgánica en los 11 tratamientos

durante los 90 días del proceso llegó al 1% pero aun así, se mantuvo constante la

actividad proteolítica y lo contrario con la actividad celulolítica, que disminuyó

notablemente en todo el proceso, lo que quiere decir que el suelo mantiene su

fertilidad natural basado en su cubierta vegetal autóctona y en su reciclado de materia

orgánica.


52

024681012141618202224262830

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tratamientos

% MO

Tiempo cero 30 dias 60 dias 90 dias

Figura 10. Determinación de materia orgánica durante los 90 días del proceso. Determinación

mediante el método de Walkley & Black, 1934

0

0,20,4

0,60,8

11,2

1,4

0 30 60 90

Tiempo (dias)

Coeficiente de variación

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11

Figura 11. Coeficiente de variación Vs. Tiempo. Con la finalidad de observar los cambios que

existen a lo largo del proceso de humificación.

0 30 60 90 Tiempo (Días)

C

30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

Tratamientos

% CO

S

1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

Coeficien

te de variación


53

5.2.2 Cuantificación de la actividad proteolítica

Para llevar a cabo la cuantificación de la actividad proteolítica, se realizó la curva de

calibración de tirosina reportando un coeficiente de correlación de 0,9737, mostrando

una tendencia lineal de la curva y así mismo, el comportamiento colineal de los datos

(Figura 12).

y = 0,008x - 0,1845

R2 = 0,9737

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

30 40 50 60 70 80 90 100

Concentración de tirosina (µmol/mL)

Absorbancia 280 nm

Figura 12. Curva de calibración de tirosina. Para la cuantificación de proteínas.

Durante los 90 días de seguimiento, se tomaron en total 110 muestras por cada tiempo

de muestreo que fueron sujetas a extracción de proteasas y celulasas y posterior

evaluación de actividad enzimática proteolítica mediante la técnica del acido

tricloroacético y evaluación de actividad celulolítica mediante la técnica de

carboximetilcelulosa (CMC) 1% m/v.

La batería enzimática de las proteasas es muy importante, ya que es considerada

como el indicador del potencial proteolítico del suelo; además; revela su capacidad de

degradación de proteína, como se puede observar en los datos propuestos en la matriz

utilizada, ya sea en compost o en suelo, se presentan actividades enzimáticas bastante

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

30 40 50 60 70 80 90 100

Concentración de Tirosina (µmol/mL)

Absorb

ancia 280 nm

Y = 0,008x – 0,1845 R2 = 0,9737


54

altas debido a que el compost manejado es rico en materia orgánica, lo que no sucede

con el suelo.

El método de cuantificación de la actividad proteolítica empleado en esta

investigación presenta algunas objeciones en el sentido de considerar que como se

sabe, las proteasas que hidrolizan la caseína pueden estar generalmente asociadas con

la materia orgánica no humificada del suelo (Bonmati, 1998). Es por esto que las

proteasas unidas al humus por una parte, están protegidas contra la proteólisis, pero

por otra parte, son menos afines a los sustratos de gran peso molecular, como la

caseína. El aumento de la actividad proteolítica, al comienzo del proceso, es decir en

los primeros 30 días (Tabla 9 y 10) (Figura 13 y 14), es debido a que puede existir

gran cantidad de materia orgánica mineralizable que induce la proliferación

microbiana y la producción de mayor cantidad de enzima, que transforman esa

materia orgánica.

Tabla 9. Medias de los valores de UP/min/g de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo.

Tratamientos UP/min/g Compost 4133,00

2 4062,50 3 4796,00 4 4757,00 5 4750,50 6 4186,00 7 4287,00 8 4075,00 9 4100,50 10 4138,00

Suelo 4208,00 [T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10

10:90; T11 0:100]


55

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tratamiento

UP/min/g

Figura 13. Actividad proteolítica del primer muestreo (tiempo cero)

Aunque se mostró una gran actividad proteolítica, el valor máximo presentado fue al

termino de los 30 días (Figura 14), lo cual permite concluir que las enzimas se

mantienen con una viabilidad bastante notable aproximadamente a los 100 días de

proceso de compostaje (sumando los 75 días del proceso de compostaje), teniendo en

cuenta que los valores fueron muy cercanos entre si, con dos matrices completamente

diferentes como lo son el suelo y el compost. Además de poseer una elevada

actividad microbiana y consecuentemente a la gran concentración de proteínas y

péptidos liberados debido a la muerte de los microorganismos, por la disminución de

sustrato residual, lo que se observa en la oxidación de la materia orgánica (Figura 11).

Tabla 10. Medias de los valores de UP/min/g de cada uno de los 11 tratamientos del segundo muestreo (30 días).

Tratamientos UP/min/g Compost 4769,00

2 4750,00 3 4694,50 4 4704,00 5 4686,00 6 4806,00 7 4739,50 8 3943,83 9 4742,50 10 4734,50

Suelo 4481,50 [T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10

10:90; T11 0:100]

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

Tratamiento

6 000

5 000

4 000

3 000

2 000

1 000

0

UP/m

in/g


56

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tratamientos

µmol/mi

Figura 14. Actividad proteolítica del segundo muestreo (30 días)

De esta manera, se regulan los procesos de mineralización del nitrógeno catalizando

la hidrólisis de proteínas a polipéptidos y de oligopéptidos a aminoácidos,

manteniendo notablemente la actividad exhibiendo valores altos como 4806

UP/min/g. Posteriormente los valores disminuyeron los 90 días del proceso,

generando así, diferencias significativas durante todo el proceso (Tabla 11 y Figura

15).

Tabla 11. Medias de la actividad proteolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.

UP/min/g Tratamiento

Tiempo cero 30 días 60 días 90 días Compost 4133,00 4769,00 3839,50 4164,30

2 4062,50 4750,00 3847,00 4059,50 3 4796,00 4694,50 3885,00 4164,50 4 4757,00 4704,00 4013,50 4235,50 5 4750,50 4686,00 3743,00 4164,50 6 4186,00 4806,00 3870,50 4159,50 7 4287,00 4739,50 3834,00 4217,50 8 4075,00 3943,83 3838,50 4166,63 9 4100,50 4742,50 4231,00 4156,00 10 4138,00 4734,50 3859,50 4192,00

Suelo 4208,00 4481,50 3810,00 4164,60 [T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10

10:90; T11 0:100]

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

Tratamiento

UP/m

in/g

6 000

5 000

4 000

3 000

2 000

1 000

0


57

3000

3500

4000

4500

5000

0 30 60 90

Tiempo (dias)

UP/min/g

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11

Figura 15. Seguimiento de la actividad proteolítica durante los 90 días del proceso. [T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10

10:90; T11 0:100]

Para comprobar si existen diferencias altamente significativas entre tratamientos y a

lo largo de los tiempos de muestreo, se sugiere las siguientes hipótesis estadísticas:


Hi: Existe al menos una mediana significativamente diferente.

El análisis estadístico sugiere que entre los ensayos realizados en todos los tiempos de

muestreo, se observaron diferencias significativas en cuanto a la actividad proteolítica

de las matrices en estudio, sin embargo a lo largo de los 90 días del proceso de

humificación se mantuvo, la actividad proteolítica en forma constante (Figura 15).

Probablemente esto es debido a que las enzimas no se pudieron desnaturalizar, por la

unión a arcillas y a las sustancias húmicas, además de considerar los interferentes que

este método posee como los ya mencionados. Se recomienda realizar el proceso de

humificación durante un tiempo más prolongado, para poder observar en mejor forma

las diferencias en las actividades proteolíticas.

0 30 60 90

Tiempo (Días)

5 000

4 500

4 000

3 500

3 000

UP/m

in/g

C S


58

Se concluye esto, gracias al dato estadístico de prueba F ya que es mayor al del valor

crítico de F y de esta manera, se rechaza la hipótesis nula que corresponde a la

igualdad de las medias de todos los tratamientos (Tabla 12).

Tabla 12 ANOVA. Seguimiento de la actividad proteolítica durante todos los 90 de proceso


Suma de cuadrados

Grados de libertad



Tiempos de muestreo

3245103,5 3

1081701,18 28,47 6,505x10-09 2,92228

Tratamientos 532562,12 10 53256,2119 1,402 0,2269288 2,16458 Error 1139673,1 30 37989,1023 Total 4917338,7 43

Se rechaza la hipótesis nula , existen diferencias significativas entre las medias de los 11 tratamientos a lo largo de todo el proceso

Por otro lado, al adicionar materia orgánica fresca, que aunque ya sea un producto

generado por el compostaje, esta puede aun tener características ideales que le

proveen las suficientes fuentes de nutrición a los microorganismos, lo que genera

mayor biomasa y así, disminuye la materia orgánica disponible, es decir, la que es

determinada mediante el protocolo propuesto por Walkley y Black en 1934.

5.2.3 Cuantificación de la actividad celulolítica

La curva de calibración de glucosa (Anexo 10) (Figura 16) generó un factor de

correlación R2 0,9979 indicando la estrecha relación entre los valores entre el eje X

que corresponde a la concentración de glucosa en g/L y el eje Y que corresponde a las

absorbancias obtenidas a 540 nm, que finalmente se ve representada en la tendencia

lineal de los datos. Es bien sabido que el valor del R2, en los casos de las curvas de

calibración, debe estar muy cercano a 1 (Steel y Torrie, 1980).

Durante los 90 días de seguimiento, se tomaron en total 110 muestras por cada tiempo

de muestreo que fueron expuestas a la extracción y posterior evaluación enzimática

celulolítica mediante la técnica de DNS. Cabe anotar que los valores de absorbancias

resultantes, fueron promediados, puesto que se consideraron réplicas.


59

Figura 16. Curva de calibración de glucosa. Para la cuantificación de azucares reductores (glucosa).

Después de realizar la extracción de celulasas, se procedió a realizar la determinación

con estas dos técnicas (DNS y Somogyi Nelson), observándose que la concentración

de azúcar reductor presente en cada tiempo de muestreo aumentó en la lectura con

DNS. Este resultado no parece coincidir con el propuesto por Deng y Tabatabai

(1994) quienes propusieron que el método de DNS no es lo bastante específico como

lo es el método de Somogyi Nelson, ya que sugieren que es el ideal para cuantificar

actividad celulolítica en suelos.

Sin embargo, para corroborar o contrastar esta aseveración, se usó una matriz con un

alto contenido de materia orgánica para evidenciar reacciones enzimáticas altas, y se

aplicaron los dos protocolos propuestos y las respectivas técnicas de cuantificación.

Los protocolos estudiados fueron los propuestos por Deng y Tabatabai (1994) y

Lynch y Raphael (1987) y en cuanto a las técnicas de cuantificación, se estudiaron

DNS y Somogyi Nelson.

En el método de extracción empleado en la presente investigación (Lynch y Raphael,

1987), se observó notablemente que es más sensible para la técnica de DNS que para

la de Somogyi Nelson (Tabla 13).

0 0,5 1 1,5 2 2,5 Concentración de glucosa (g/L)

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

y = 0,3713x + 0,1083

R2 = 0,911

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Concentración de glucosa (g/L)

Abs 540 nm

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Absorba

ncia 54

0 nm

0 0,5 1 1,5 2 2,5 Concentración de glucosa (g/L)

Y = 0,3713x + 0,1083 R2 = 0,911


60

Tabla 13. Comparación de 2 métodos de extracción y cuantificación de azucares reductores. Deng y Tabatabai Lynch y Raphael

DNS SN DNS SN

Media 0,03216667 0,3095 0,12966667 0,1725 DS 0,02550621 0,00288097 0,00287518 0,00350714 Varianza 0,00065057 8,3E-06 8,2667E-06 1,23E-05

Con lo anterior se puede concluir que en el protocolo usado en la presente

investigación se observan mejores resultados en cuanto a precisión y las diferencias

en exactitud, se pueden ajustar empleando un factor de corrección que considera las

diferencias en extracción, además de las diferencias en el desarrollo de la especie

absorbente y su naturaleza. Se observa que la cuantificación de azucares reductores

con la técnica de DNS presenta una menor desviación estándar que en la técnica de

Deng y Tabatabai, además hay menor dispersión de los datos con respecto a la media

obtenida de la técnica (Figura 17 y 18).

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

1 2 3 4 5 6

Réplicas

Abs 540 nm

DNS SN

Figura 17 .Valores obtenidos por la técnica de DNS y Somogyi Nelson. Desviación estándar de las 6 replicas realizadas por medio de la técnica de extracción de Deng y Tabatabai (1994).

1 2 3 4 5 6 Réplicas

0,4

0,3

0,2

0,1

0

-0,1

Absorb

ancia 540 nm


61

0

0,05

0,1

0,15

0,2

1 2 3 4 5 6

Réplicas

Abs 540 nm

DNS SN

Figura 18. Valores obtenidos por la técnica de DNS y Somogyi Nelson. Desviación estándar de las 6 replicas realizadas por medio de la técnica de extracción de Lynch y Raphael (1987)

Por otra parte, investigaciones realizadas por Kourtev et al (2002) mencionan que un

comportamiento normal de un proceso de degradación de materia orgánica, la

actividad celulolítica iniciaría con un aumento debido a la gran concentración de

sustrato presente, a medida del paso del tiempo, disminuiría con la reducción de

concentración de sustrato y los productos de la reacción van siendo tomados por los

microorganismos, con lo que la actividad enzimática tiende a disminuir. Sin embargo,

en un proceso de humificación ya de un material que está en un paso intermedio de

degradación (compost) y un suelo que tiene muy bajo porcentaje de materia orgánica

no sucede de esta manera, debido a que en el proceso de compostaje la totalidad o

gran parte de los sustratos son degradadas por las respectivas enzimas intra o

extracelulares hasta generar monómeros, posterior a esta degradación de materia

orgánica fresca ocurre la humificación, en donde se considera que el compost se

encuentra estable y de gran valor comercial, es por esto que la actividad celulolítica

es baja, ya que no hay casi sustrato que degradar. A este nivel, se encuentran las

sustancias húmicas y fúlvicas que pudieran ser cuantificadas para la medición directa

del grado de humificación en este tipo de materiales.

Partiendo de los resultados obtenidos en las pruebas de actividad enzimática

cuantitativa, se efectuaron análisis de ANOVA con el fin de estimar las diferentes

Absorb

ancia 540 nm

1 2 3 4 5 6 Réplicas

0,2

0,15

0,1

0,05

0

Absorb

ancia 540 nm


62

causas de variación entre tiempos y tratamientos. De esta manera, se definieron las

hipótesis estadísticas presentadas en este ítem.


Hi: Existe al menos una media significativamente diferente de las otras.

Este resultado esta condicionado por el valor calculado de F, si este es superior al

valor crítico de F se rechaza la hipótesis nula, con una confiabilidad del 95%.

Observando los datos graficados en el tiempo cero (Figura 19) se observa que hay

presencia de actividad celulolítica, debido a que en el compost utilizado aun

quedaban residuos de celulosa y hemicelulosa como sustrato capaz de proveer las

fuentes nutricionales a los microorganismos para que puedan liberar las enzimas

celulolíticas, además el suelo de Stevia rebaudiana Bertoni es un suelo que es rico en

microorganismos celulolíticos y porque es una matriz que posee materia orgánica por

el material vegetal en degradación caído provenientes de las cosechas.

0,0020,0040,0060,0080,00100,00120,00140,00160,00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tratamientos

UC/min/g

Figura 19. Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del primer

muestreo.

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S Tratamientos

160 140 120 100 80 60 40 20 0

UC/m

in/g


63

Este tiempo de muestreo produjo valores altos como 139,946 UC/min/g hasta el valor

mas bajo que fue de 106,878 UC/min/g (Tabla 14) presentando diferencias

apreciables durante todo el muestreo. La mayor producción de celulasas se observó

en el tratamiento dos que está compuesto de 90 g de compost y 10 g de suelo.

Tabla 14. Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento del tiempo cero

Tratamientos UC/min/g Compost 123,619

2 139,946 3 116,247 4 119,692 5 106,878 6 126,857 7 116,385 8 136,915 9 120,656 10 117,074

Suelo 119,210

[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]

En el segundo muestreo se presentaron cantidades mas altas de actividad celulolítica

(Tabla 15 y Figura 20), exhibiendo valores que van desde valores altos como 158,064

UC/min/g y valores mínimos de 126,512 UC/min/g.

Tabla 15. Medias de la actividad celulolítica de las 11 replicas de cada tratamiento del segundo muestreo (30 días).


2 133,815 3 143,184 4 158,064 5 140,290 6 137,121 7 149,797 8 142,495 9 144,630 10 143,046

Suelo 149,591

[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]


64

0,00

30,00

60,00

90,00

120,00

150,00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tratamientos

UC/min/g

Figura 20. Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del segundo

muestreo (30 dias)

En el tercer muestreo, es decir, cuando se cumplieron los 60 días, se evidenció

estabilidad en la actividad celulolítica (Tabla 16 y Figura 21) reportando valores

máximos de 139,119 UC/min/g y mínimos como 110,254 UC/min/g.

Tabla 16 Medias de la actividad celulolítica de las 11 replicas de cada tratamiento del tercer muestreo (60 días)


2 122,379 3 110,254 4 126,374 5 110,598 6 117,074 7 126,650 8 128,165 9 126,994 10 120,105

Suelo 139,119

[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]


UC/m

in/g

150

120

90

60

30

0


65

0,00020,00040,00060,00080,000100,000120,000140,000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tratamientos

UC/min/g


muestreo (60 días)

Aunque se presentó una disminución notable en la actividad celulolítica (Tabla 17),

presentó valores máximos de 105,569 UC/min/g y valores mínimos de 80,837

UC/min/g, durante el ultimo muestreo hecho (90 días) (Figura 22).

Tabla 17. Medias de la actividad celulolítica de las 11 replicas de cada tratamiento del cuarto muestreo (90 días)

Tratamientos UC/min/g Cosmpot 105,569

2 102,538 3 98,680 4 93,995 5 95,304 6 91,653 7 90,000 8 88,897 9 84,351 10 80,837

Suelo 80,837

[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]

UC/m

in/g


140 120 100 80 60 40 20 0


66

0,000

20,000

40,000

60,000

80,000

100,000

120,000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tratamientos

UC/min/g


muestreo (90 días)

Analizando los datos resultantes se puede inferir que en cada uno tiempos manejados,

tanto en el tiempo inicial como en el cuarto muestreo (Tabla 18) se observa que hay

una actividad celulolítica notable, mostrando mayor viabilidad durante los primeros

60 días (Figura 23). En este último muestreo disminuye la actividad celulolítica

debido probablemente a que este tipo de enzimas poseen efecto represor de los

productos de degradación de la celulosa, como celobiosa, ciclodextrinas y glucosa

(Warren, 1996), todas estas moléculas posiblemente fueron liberadas o producidas en

mayor cantidad que la glucosa. Un aspecto interesante es que la actividad proteolítica

del suelo pudo ser un efecto represor en la actividad de las celulasas (Criquet, 2002).

Tabla 18. Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.

UC/min/g Tratamiento

Tiempo 0 30 días 60 días 90 días Compost 123,619 126,512 128,028 105,569

2 139,946 133,814 122,379 102,538 3 116,247 143,188 110,254 98,68 4 119,692 158,064 126,374 93,995 5 106,878 140,29 110,598 95,304 6 126,857 137,121 117,074 91,653 7 116,385 149,797 126,65 89,999 8 136,915 142,495 128,165 88,897 9 120,656 144,63 126,994 84,35 10 117,0734 143,046 120,105 80,837

Suelo 119,21 149,59 139,119 80,837

UC/m

in/g


120

100

80

60

40

20

0


67

100

110120

130140

150

160

170

0 30 60 90

Tiempo (dias)

UC/min/g

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11

Figura 23. Seguimiento de la actividad celulolítica durante los 90 días del proceso. [T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11

0:100]

El análisis estadístico (Tabla 19) sugiere que entre los ensayos realizados en todos los

tiempos de muestreo, se observaron diferencias significativas en cuanto a la actividad

celulolítica de las matrices en estudio.

Tabla 19 ANOVA. Seguimiento de la actividad celulolítica durante todos los 90 de proceso


Suma de cuadrados

Grados de libertad



Tiempos de muestreo

14369,331 3 4789,77695 59,28 1,02x10-12 2,92228

Tratamientos 582,7465 10 58,27465 0,72 0,6984305 2,16458 Error 2424,1705 30 80,8056844 Total 43

Se rechaza la hipótesis nula , existen diferencias significativas entre las medias de los 11 tratamientos a lo largo de todo el proceso

Se concluye esto, gracias al dato estadístico de prueba F ya que es mayor al del valor

crítico de F (Tabla 19) y de esta manera, se rechaza la hipótesis nula que corresponde

a la igualdad de las medias de todos los tratamientos.

Esta técnica presenta grandes ventajas debido a que las actividades enzimáticas se

evidencian en mejor forma dado a que las enzimas extraídas fueron incubadas en un

0 30 60 90 Tiempo (Días)

UC/m

in/g

170 160 150 140 130 120 110 100 0

C S


68

sistema líquido-líquido el cual conduce al complejo enzima-sustrato y

consecuentemente a la medición de la actividad celulolítica, lo contrario pasa con el

ensayo hecho por Criquet (2002) que asegura una unión no muy estrecha debido al

sistema sólido-liquido.

Sin embargo se presentan muchas desventajas en este tipo de técnicas, una de ellas es

la cantidad de submuestra usada para la extracción, ya que esta no superó los 5 g

debido a las limitaciones de los materiales usados en cuanto a lavados y extracciones

con grandes volúmenes de acetona.

Aunque muchos autores, entre ellos el del actual protocolo, González et al., (2004),

Deng y Tabatabai (1994) y Mondini y Cayuela (2005) usaron 5 g de suelo para

realizar las extracciones de diferentes enzimas encontradas en este, obteniendo muy

buenos resultados, otros autores como Criquet (2002) usaron 1 g y Kandeler et al

(1999) solo usa 300 mg debido a que adicionan diferentes tipos de sustrato a un

extracto de compost con el fin de analizar el desarrollo de las enzimas sobre estas

substancias.

Por otra parte, como el suelo usado es de naturaleza arcillosa, puede ocurrir que las

partículas minerales que lo componen, interactúen con estas enzimas modificando sus

propiedades catalíticas o inhibiendo su actividad (Quiquampoix et al., 1993).


69

6. CONCLUSIONES

- El seguimiento del proceso de humificación mediante la determinación de

carbono orgánico, actividad proteolítica y celulolítica fue exitoso.

- La técnica de extracción de Lynch y Raphael (1987) permitió una buena

recuperación enzimática a partir de matriz suelo o mezclas con compost.

- El método propuesto de Walkley & Black (1934) de determinación de

carbono orgánico por vía húmeda en matriz de suelo y compost analizado,

permitió obtener resultados altamente satisfactorios, a pesar de que porcentaje

de carbono orgánico en las muestras de compost y suelo fue bajo.

- No hay diferencias entre los tratamientos manejados de manera que si se

aplica cualquiera de estos, se mostrará actividades enzimáticas altas.


70

7. PERSPECTIVAS

- Es recomendable usar otro tipo de sustrato proteíco diferente a la caseína 1%

m/v para determinar la actividad proteolítica, debido a las numerosas

interferencias que este aporta.

- Para complementar la presente investigación, sería conveniente realizar una

extracción de sustancias húmicas para poder evaluar con detalle el proceso de

humificación de compost inoculado y poderlo relacionar con la producción de

proteasas y celulasas.

- Es recomendable realizar el seguimiento por mucho más tiempo y en

intervalos más cortos para poder ver en forma más amplia las diferencias entre

actividades enzimáticas.

- Para corroborar los resultados referentes a la actividad enzimática sería

aconsejable comprobar la correspondencia contra una metodología que utilice

sustratos fluorogénicos, que aunque sea mucho más costosa, es más confiable.

- Estudiar con mayor profundidad la relación que existe entre contenido de

materia orgánica o naturaleza de la matriz y actividad enzimática de cada

matriz en el tiempo.


71

8. REFERENCIAS

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80

ANEXO 1 ● Sal ferrosa (Mohr)

- Pesar 12,0432 g de FeSO4 7H2O y disolver en 4 L de agua destilada fría.

- Almacenar en un frasco ámbar.

Observaciones

- Preparar el reactivo el mismo día de uso, de lo contrario las sales que lo componen

se precipitarán y el resultado no seria significativo.

- Adicionar el agua destilada fría, de lo contrario el hierro se oxidará.


81

ANEXO 2 ● Preparación de buffer fosfato 0,1M (Galindo et al., 2005).

- Pesar 14,2 g de Na2HPO4 en un vaso de precipitado de 250 mL y disolver en 200

mL con agua destilada.

- Por otro lado, pesar 12 g de NaHPO4 en un vaso de precipitado de 250 mL y

disolver en 200 mL con agua destilada.

- Posteriormente, se mezcla las anteriores soluciones y se ajusta el pH a 7,0 ± 2,0,

transvasar a un balón aforado de 1000 mL y enrasar con agua destilada.

Observaciones

- Homogenizar muy bien cada una de las soluciones fosforadas, si es necesario

calentar en horno microondas.

- Dejar enfriar las soluciones para poder enrasar a 1000 mL con agua destilada, de lo

contrario el volumen variará.


82

ANEXO 3

● Preparación de la solución de caseína hidrolizada

- Pesar 10 g de caseína en un vaso de precipitado de 250 mL y disolverlo en 200 mL

de buffer fosfato 0,1M.

- Verter la anterior mezcla en un balón volumétrico de 1000 mL y enrasar.

- Disolver en baño termostatado a 37ºC durante 1 hora.

Observaciones

- Guardar a 4°C la solución de caseína hidrolizada para evitar contaminación y así,

interfiera en la cuantificación de actividad proteolítica.

� Preparación del ácido tricloroacético (TCA) al 15% m/v

- Pesar 15 g de ácido tricloroacético en un vaso de precipitado de 50 mL.

- Disolver en 30 mL de agua destilada.

- Enrasar hasta 100 mL en un balón volumétrico con agua destilada.

Observaciones

- Manejar este reactivo con las medidas de seguridad necesarias, ya que es altamente

tóxico e irritante.


83

ANEXO 4

● Preparación de la solución stock de tirosina 100 µmol/mL

- Pesar 0,01g de tirosina en balanza analítica; 0,0052 g de NaH2PO4 y 0,0022 g de

Na2HPO4.

- Disolver en agua destilada los anteriores compuestos hasta obtener 50 mL y

verterlos en un balón volumétrico de 100 mL y enrasar con agua destilada.

Las soluciones de concentración mas baja (de 10 en 10 hasta 100) se preparan de

acuerdo a la aplicación de la formula V1C1 = V2C2, teniendo en cuenta que el

volumen final de cada una es de 3 mL.

Concentración Tirosina (µmol/mL)

Solución stock Tirosina (mL)

Agua destilada (mL)

10 0,3 2,7 20 0,6 2,4 30 0,9 2,1 40 1,2 1,8 50 1,5 1,5 60 1,8 1,2 70 2,1 0,9 80 2,4 0,6 90 2,7 0,3 100 3,0 0

(Galindo et al., 2005).

Como blanco de la prueba se utiliza una solución que contiene 1 mL de solución de

caseína 1% m/v (ó 2 mL de solución de caseína en buffer fosfato 0,1M sin adición de

1 mL de buffer fosfato 0,1M), 1 mL de TCA y 1 mL de Buffer fosfato 0.1M;

posteriormente la mezcla se centrifuga a 5000 rpm por 5 minutos. La prueba se lee a

280nm en espectrofotómetro de luz U.V.


84

ANEXO 5

● Promedio de absorbancias para la determinación de la curva patrón de tirosina

Réplicas Concentración

Tirosina (µmol/mL) 1 2 3 Promedio

10 0 0 0 0 20 0 0 0 0 30 0,025 0,026 0,027 0,0260 40 0,173 0,175 0,175 0,1743 50 0,213 0,213 0,212 0,2127 60 0,277 0,276 0,276 0,2763 70 0,416 0,416 0,414 0,4153 80 0,42 0,419 0,419 0,4193 90 0,504 0,503 0,502 0,5030 100 0,64 0,637 0,639 0,6387


85

ANEXO 6

● Preparación de carboximetilcelulosa (CMC) al 1% m/v en buffer fosfato 0,1M

- Pesar 1,0 g de carboximetilcelulosa (CMC) en un vaso de precipitado de 250 mL y

disolverlo lentamente en 50 mL de buffer fosfato 0,1M (solución tampón).

- Calentar esta solución en horno microondas durante 1 minuto, o hasta que se

disuelva bien el sustrato, ajustar el pH a 7,0 ± 2,0.

- Enrasar a 100 mL con buffer fosfato 0,1M en un balón volumétrico.

Observaciones

- Procurar que la CMC quede totalmente disuelta antes de trasvasar al balón

volumétrico, de lo contrario todo el sustrato quedará sólido en el vaso de precipitado

y así, cambiará la concentración de la CMC.


86

ANEXO 7

● Preparación de la solución stock de glucosa 2 g/L

- Pesar 2 g de glucosa anhidra en balanza analítica y disolver en 500 mL de agua

destilada utilizando un balón volumétrico de 1000 mL, homogenizar y completar

hasta 1000 mL con agua destilada.

● Preparación de la solución stock de glucosa (0,5 – 2 g/L)

- Empleando la fórmula de V1.C1 = V2.C2, se preparan 6 soluciones que tengan un

volumen final de 2 mL.

Concentración glucosa (g/L)

Solución concentrada Glucosa (mL)

Agua destilada (mL)

0,5 0,5 1,5 0,7 0,7 1,3 1 1,0 1,0

1,5 1,5 0,5 1,7 1,7 0,3 2 2 -


87

ANEXO 8

● Preparación del reactivo de DNS

Esta técnica se fundamenta en la oxidación de la glucosa. Esta molécula en solución

permanece en forma estable, es decir, cíclica, para que ocurra una oxidación se

requiere un calentamiento y que la molécula de glucosa esté en forma lineal y quede

el grupo aldehído expuesto para su posterior oxidación.

Características como la alcalinidad del medio se requiere para que se oxide, para ello

se adiciona NaOH. Este NaOH en solución acuosa se ioniza liberando Na+ y OH- y

así, forma ácido glucónico. Con ayuda del Tartrato de Na y K se reemplaza el - NO2

del carbono 3 del ácido 3-5 dinitrosalicílico por un grupo - NH2 y forma 3 amino – 5

nitrosalicílico que aumenta su color de acuerdo a la cantidad de glucosa oxidada.

Procedimiento

- Depositar 50 mL de agua destilada en un vaso de precipitado de 250 mL.

- Adicionar 1,6 g de NaOH y disolver mediante agitación magnética a temperatura

ambiente.

- Posteriormente adicionar lentamente 43,8 g de Tartrato de sodio y potasio hasta

disolverse por completo.

- Adicionar 1 g de ácido dinitrosalicílico y completar con agua destilada hasta 100

mL en un balón aforado.

- Dejar en agitación toda la noche en un frasco oscuro.

Observaciones

- La técnica se lee a una absorbancia de 540 nm.


88

ANEXO 9 ● Medias y desviación estándar de los valores de pH obtenidos de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo

0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11

Tratamientos

pH


89

ANEXO 10

● Promedio de absorbancias a 540 nm para la determinación de azucares reductores por el método de DNS

Concentración glucosa g/L

Abs 540 nm

0,5 0,195 0,7 0,434 1 0,567

1,5 0,625 1,7 0,724 2,0 0,852

SEGUIMIENTO DEL PROCESO DE HUMIFICACIÓN EN COMPOST … · 17 Valores obtenidos por la técnica de...

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