Secuenciación de ARN. EST RNA-Seq Helicos Por métodos enzimáticos y químicos A partir del ADNc...
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Secuenciación de ARN
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Secuenciación de ARN
Secuenciación de ARN
EST
RNA-Seq
Helicos
Por métodos enzimáticos y
químicos
A partir del ADNc
Directamente a partir del ARN
Métodos para secuenciar el ARN
Transcripción conceptual
A partir del ADNg
Secuenciación del ARN
Secuenciación de ARN
Science, 147 (1965):1462-1465
Los primeros
n = 77
Secuenciación de ARN
Luego vino Fred Sanger
Ribonucleasa T1
n = 120
Secuenciación de ARN
Secuenciación de ARN
Síntesis del ARN por la ARN polimerasa
Secuenciación de ARN
1.- Se extrae el ARN de la célula
2.- La transcriptasa inversa genera el ADNc
3.- Se somete el cDNA a una electroforesis y se seleccionan los fragmentos que
tienen el tamaño adecuado para insertarlos en el vector de clonación.
5.- A partir de un clon se purifica el plásmido y se secuencia el inserto por ambos extremos
4.- Se transforman bacterias con los vectores recombinantes y se genera una genoteca de ADNc
Secuenciación del ARN a partir del ADNc
Secuenciación de ARN
Síntesis de ADNc a partir del ARNm
Los cDNA obtenidos a partir de RNAm, que
se caracterizan por tener la cola poli(A),
representan una instantánea de los genes que se están expresando en un
momento dado y en unas condiciones
determinadas, o sea, el transcriptoma.
Secuenciación de ARN
Purificación del ARNm y síntesis del ADNc
Secuenciación de ARN
Expressed sequence tags (EST)
Un EST es la secuencia parcial de un inserto clonado procedente de una genoteca de
cDNA obtenida a partir del RNAm.
Secuenciación de ARN
Expressed sequence tags (EST)
Secuenciación de ARN
3.- La mayoría son “nativas”, ya que la frecuencia de los clones refleja la abundancia de los distintos ARNm.
4.- Las genotecas “normalizadas” se han modificado para reducir la presencia de los mRNA más abundantes y aumentar
la probabilidad de detectar los mRNA menos frecuentes.
5.- La mayoría se han generado con un cebador poli(T), de modo que los extremos 3’ están sobrerrepresentados.
2.- La complejidad y la calidad de las genotecas varía mucho de una a otra.
1.- Se preparan a partir de varios organismos, tejidos, tipos
celulares, condiciones patológicas o condiciones experimentales.
Características de las genotecas de ADNc
Secuenciación de ARN
Características de los EST
Secuenciación de ARN
Limitaciones de los EST
Secuenciación de ARN
Secuenciación de ARN
RNA-Seq
Secuenciación de ARN
Esquema general de la RNA-Seq
Secuenciación de ARN
Generación de una biblioteca de ADNc
3.- Se añaden adaptadores a los extremos de los ADNc para
obtener una librería de fragmentos de ADNc. No es necesario clonarlos en un
vector y transformar bacterias.
4.- La amplificación de los fragmentos de ADNc se lleva a cabo mediante variantes de la PCR (en emulsión o puenteada).
1.- Se extrae el ARN de las células. Se puede eliminar
el ARNr y el ARNt o seleccionar únicamente el
ARN con cola de poliA.
2.- La transcriptasa inversa sintetiza los ADNc (de doble
hebra). Se fragmenta el ADNc y se seleccionan los fragmentos
del tamaño apropiado.
Secuenciación de ARN
Secuenciación masiva en paralelo (NGS)
5.- La secuenciación masiva en paralelo de los fragmentos de
ADNc mediante las técnicas de nueva generación (Roche 454, Illumina Solexa o ABI SOLID) .
6.- Las lecturas obtenidas en el apartado anterior se
ensamblan para generar el transcriptoma. Este proceso puede utilizar un genoma de
referencia o hacerse totalmente de novo.
Secuenciación de ARN
Single-Molecule Sequencing (Helicos)
Secuenciación de ARN
Evita los problemas asociados a la síntesis del ADNc
Secuenciación de ARN
El artículo que describe el método
Secuenciación de ARN
Terminador virtual
Secuenciación de ARN
El secuenciador HeliScope y la celda de flujo
108 moléculas por cm2
Secuenciación de ARN
El ARN poliadenilado (de forma natural o mediante
la enzima poli(A)-polimerasa) y bloqueado en el extremo 3’ con un residuo de dA se une a la superficie de la celda
de flujo, que está recubierta de poli(dT).
Unión del ARN a la celda de flujo
Secuenciación de ARN
Rellenado con T (fill) y adición de 3 TV (lock)
Fill: Se añade desoxitimidina natural y una ADN-polimerasa especial (con actividad transcriptasa inversa) para que todas las A de la cola de poliA estén emparejadas con una T. Así
nos aseguramos de que la secuenciación comienza
directamente en el ARN molde.
Lock: Se añade polimerasa y 3 terminadores virtuales (TV): A, C y
G. Los TV contienen un fluoróforo y están bloqueados en 3’ de forma
reversible. Cada molécula de ARN incorpora el TV correspondiente. El proceso se detiene porque los TV tienen el extremo 3’ bloqueado.
Secuenciación de ARN
Se toma una imagen y se elimina el fluoróforo
Se lavan los TV no unidos. Se excitan los fluoróforos y se toma una imagen. Cada señal
fluorescente corresponde a un ARN distinto y nos indica la posición que ocupa en la celda de flujo.
Se rompe el enlace que une el fluoróforo al TV y se desbloquea el extremo 3’ para un nuevo ciclo de incorporación de nucleótidos. Los fluoróforos
liberados se eliminan con un lavado.
Secuenciación de ARN
Síntesis
Lavado + imagen
Escisión del fluoróforo y
desbloqueo en 3’
En cada ciclo se añade un TV distinto, siempre en el mismo orden: C, T, A, G
Lavado y nuevo ciclo
En cada ciclo se añade un nucleótido distinto, siempre en el mismo orden
Secuenciación de ARN
120 ciclos de reacción y toma de imágenes
Secuenciación de ARN
La longitud media de las lecturas es de 33 nucleótidos
Secuenciación de ARN
La plataforma Helicos también puede secuenciar el ADN
Secuenciación de ARN
Helicos cierra por bancarrota
Secuenciación de ARN
SeqLL utiliza su tecnología
