SANEAMIENTO DE POR HIDROCARBUROS DEL PETRÓLEO.

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA QUÍMICA

E INDUSTRIAS EXTRACTIVAS

SANEAMIENTO DE AGUAS SOMERAS Y SUBTERRÁNEAS CONTAMINADAS CON HIDROCARBUROS DEL PETRÓLEO

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

MAESTRO EN CIENCIAS EN INGENIERÍA QUÍMICA

P R E S E N T A

I.Q.I. YAIR CRUZ NARVÁEZ

DIRECTORES:

DR. JOSE JAVIER CASTRO ARELLANO

DR. ENRIQUE RICO ARZATE

1

MÉXICO D.F., JULIO 2013.

i

AGRADECIMIENTOS

A través de estas líneas quiero expresar mi más sincero agradecimiento a todas las

personas que con su soporte científico y humano han colaborado en la realización de

este trabajo de investigación.

Quiero agradecer en primer lugar a las instituciones que han hecho posible la

realización del trabajo por el apoyo económico y de recursos, al Consejo Nacional de

Ciencia y Tecnología (CONACYT, México), al Instituto Politécnico Nacional (IPN) y a

la Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas (ESIQIE).

Muy especialmente a mis directores de tesis, el Dr. José Javier Castro Arellano y al Dr.

Enrique Rico Arzate, por la acertada orientación, el soporte y discusión crítica que me

permitió un buen aprovechamiento del trabajo realizado, y que esta tesis llegara a buen

término.

Especial mención merecen las personas cuya colaboración han sido importantes en el

desarrollo de este trabajo, a la Dra. María Luis Roldán, por las facilidades prestadas

en su laboratorio y el uso de los equipos de microscopía óptica.

Agradezco a mi familia por su comprensión, comunicación constante y apoyo.

ii

DEDICATORIA

Dedico esta tesis a mi madre, por ser el pilar más importante y por demostrarme su

cariño y apoyo incondicional.

A mi padre, por sus consejos, su apoyo y su comprensión a lo largo de esta etapa.

A mi hermana Nallely por su disposición para escuchar y ayudarme en cualquier

momento.

A mi hermano Betuel por su cariño, sus ocurrencias, sus palabras y su paciencia.

iii

CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................... i

DEDICATORIA ............................................................................................................... ii

CONTENIDO .................................................................................................................. iii

ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................. vii

RESUMEN ................................................................................................................... xvi

SUMMARY ................................................................................................................. xvii

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1

CAPITULO I. ANTECEDENTES ................................................................................... 4

1.1. La contaminación por hidrocarburo ....................................................................... 4

1.2. Compuestos xenobióticos ...................................................................................... 6

1.3. Dispersión de contaminantes ................................................................................. 7

CAPITULO II. MÉTODOS DE TRATAMIENTO ....................................................... 11

2.1. Clasificación de tecnologías de remediación ....................................................... 11

2.1.1 Estrategia de remediación .................................................................................. 11

2.1.2 Lugar de realización del proceso de remediación .............................................. 12

2.1.3 Tipo de tratamiento ............................................................................................ 12

2.2. Métodos de separación ......................................................................................... 13

2.4. Tecnologías de transformación abióticos ............................................................ 14

iv

2.5. La biorremediación .............................................................................................. 15

CAPITULO III. BIORREMEDIACIÓN ........................................................................ 19

3.1. Prospectiva de microorganismos ......................................................................... 19

3.2. Microorganismos utilizados en la biorremediación ............................................. 27

3.2.1. Pseudomona aeruginosa. ................................................................................... 28

3.2.2. Pseudomona putida ........................................................................................... 29

3.2.3. Pseudomona fluorescens ................................................................................... 30

3.2.4. Acinetobacter calcoaceticus .............................................................................. 31

3.3. Crecimiento bacteriano ........................................................................................ 35

3.4. Factores que afectan el crecimiento microbiano .................................................. 36

3.4.1. Temperatura ...................................................................................................... 36

3.4.2. Influencia del pH .............................................................................................. 38

3.4.3. Oxígeno disuelto ............................................................................................... 38

3.4.4. Relación C:N:P ................................................................................................. 39

3.5. Adaptación de los microorganismos .................................................................... 40

3.6. Biodegradación de MTBE ................................................................................... 40

3.7. Degradación de BTEX ......................................................................................... 42

3.8. Cinética microbiana ............................................................................................. 44

3.8.1. Modelo matemático de Monod ......................................................................... 46

ESTADO DEL ARTE .................................................................................................... 47

v

CAPITULO IV. METODOLOGÍA ................................................................................ 51

4.1. Adaptación del consorcio ..................................................................................... 52

4.1.1. Preparación de soluciones modelo .................................................................... 53

4.2. Metodología de biodegradación. .......................................................................... 58

CAPITULO V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................... 60

5.1. Adaptación del consorcio. .................................................................................... 60

5.2. Caracterización de muestra real ........................................................................... 62

5.3. Biodegradación. ................................................................................................... 65

5.4. Cinética de biodegradación .................................................................................. 77

5.4.1. Estequiometria .................................................................................................. 77

5.4.2. Balance de masa ................................................................................................ 79

5.4.3. Operación intermitente ..................................................................................... 79

5.5. Tratamiento de datos ............................................................................................ 81

5.5.1. Cálculo de peso seco, masa de CO2 y de sustrato ............................................. 81

5.5.3. Cálculo de los balances de masa. ...................................................................... 84

CONCLUSIONES .......................................................................................................... 95

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 96

ANEXO A CURVA DE REFERENCIA ..................................................................... 115

ANEXO B LINEARIZACIÓN DE LAS ECUACIÓN DE MONOD ......................... 120

ANEXO C ADAPTACIÓN DEL CONSORCIO BACTERIANO .............................. 124

vi

ANEXO D TINCIÓN DE GRAM................................................................................ 128

ANEXO E CÓDIGOS DE POLYMATH .................................................................... 131

vii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1 Hidrocarburos que existen como una fase inmiscible y ................................. 5

Figura 3.1 Participación de biosurfactante (rhamnolípido) producido por bacterias del

genero Pseudomonas sp en el consumo de hidrocarburos. ............................................ 21

Figura 3.2 Esquematización de la degradación de alcanos por una bacteria gran-

negativa. .......................................................................................................................... 21

Figura 3.3 Esquema que muestra la principal ruta de degradación de .......................... 26

Figura 3.4 Micrografia de Pseudomona aeruginosa obtenida con microscopio de

barrido. ............................................................................................................................ 28

Figura 3.5 Micrografia de Pseudomona putida obtenida con microscopio de barrido. 30

Figura 3.6 Micrografia de Pseudomona fluorescens obtenida con microscopio de

barrido. ............................................................................................................................ 31

Figura 3.7 Micrografia de Acinetobacter calcoaceticus obtenida con microscopio de

barrido. ............................................................................................................................ 31

Figura 3.8 Micrografía de rotífero obtenida con microscopio óptico. .......................... 33

Figura 3.9 Curva típica de crecimiento para un sistema cerrado. ................................. 36

Figura 3.10 Relación entre la temperatura y las velocidades de crecimiento de

psicrófilos, mesófilos, termófilos y dos hipertermófilos diferentes. .............................. 38

Figura 3.11 Ruta metabólica propuesta para biodegradación aeróbica de MTBE ........ 41

Figura 3.12 Biodegradación microbiana del benceno hasta catecol.............................. 42

Figura 3.13 Biodegradación microbiana del tolueno. ................................................... 43

Figura 3.14 Biodegradación del xileno. ....................................................................... 43

viii

Figura 3.15 Etapas del crecimiento bacteriano como biomasa y de utilización de

sustrato, ........................................................................................................................... 44

Figura 4.1 Etapas consideradas durante el trabajo experimental. ................................. 52

Figura 4.2 Preparación del medio mínimo o solución de sales minerales..................... 52

Figura 4.3 Activación del consorcio microbiano. ......................................................... 53

Figura 4.4 Preparación de soluciones modelo para adaptación y biotratamiento de

sustrato. ........................................................................................................................... 54

Figura 4.5 Monitoreo de producción de CO2. ............................................................... 54

Figura 4.6 Esquema para el monitoreo del consumo de oxígeno utilizado. ................. 55

Figura 4.7 Emplazamiento del valle de México de donde fue recolectada la muestra de

agua real. ......................................................................................................................... 56

Figura 4.8 Esquematización de la toma de muestra real en un predio contaminado en el

valle de México. ............................................................................................................. 56

Figura 4.9 Método utilizado para caracterizar el tipo de contaminación por

hidrocarburos presente en la muestra de agua real. ........................................................ 58

Figura 4.10 Sistema empleado en la realización de la biodegradación. ........................ 58

Figura 4.11 Proceso de biotratamiento utilizado. .......................................................... 59

Figura 5.1 Volumen de oxígeno consumido por el consorcio bacteriano utilizado. ..... 60

Figura 5.2 Monitoreo de crecimiento bacteriano por absorción de CO2 en solución

alcalina. ........................................................................................................................... 61

Figura 5.3 Espectro UV-vis de la muestra de agua real. ............................................... 64

Figura 5.4 Disminución de la demanda química de oxígeno en el agua real, posterior a

la inoculación del consorcio bacteriano. ........................................................................ 65

ix

Figura 5.5 Porcentaje de remoción de materia organica susceptible de oxidación

química obtenido por el consorcio bacteriano. ............................................................... 65

Figura 5.6 Disminución del DQO en las muestras de agua sintéticas y en la muestra de

agua real. ......................................................................................................................... 66

Figura 5.7 Porcentaje de biodegradación de cada sustrato estudiado. .......................... 67

Figura 5.8 Decremento de la concentración de compuestos aromáticos de la muestra

contaminada con diésel (región de 250 a 300 nm). ........................................................ 70

Figura 5.9 Variación en la concentración de compuestos aromáticos en muestra

contaminada con petróleo, en la región entre 250 a 300 nm. ......................................... 70

Figura 5.10 Variación de IC, TOC, y TC en la muestra contaminada con diesel. ....... 71

Figura 5.11 Variación de IC, TOC, y TC en la muestra contaminada con petróleo. ... 71

Figura 5.12 Crecimiento microbiano en la muestra contaminada con diesel. El

desarrollo microbiano se incrementa con la temperatura. .............................................. 72

Figura 5.13 Crecimiento microbiano en la muestra contaminada con petróleo. El

desarrollo microbiano se incrementa con la temperatura. .............................................. 72

Figura 5.14 Cromatogramas obtenidos durante la biodegradación de las muestras

sintéticas de agua contaminadas con diesel. ................................................................... 73

Figura 5.15 Cromatogramas obtenidos durante la biodegradación de las muestras

sintéticas de agua contaminadas con petróleo. ............................................................... 73

Figura 5.16 Disminución de la concentración de hidrocarburos en las muestras

sintéticas de petróleo y diesel. ........................................................................................ 75

Figura 5.17 Porcentaje de biodegradación obtenido. La tasa de biodegradación fue

mayor en el caso del sustrato diesel que en el petróleo. ................................................. 75

x

Figura 5.18 Disminución de la concentración de cada fracción de diesel durante la

biodegradación................................................................................................................ 76

Figura 5.19 Disminución de la concentración de cada fracción de petróleo durante la

biodegradación................................................................................................................ 76

Figura 5.20 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de

biodegradación del diesel a 20ºC. ................................................................................... 85

Figura 5.21 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función

del tiempo del modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de diesel a

20ºC. ............................................................................................................................... 85





30ºC. ............................................................................................................................... 87





40ºC. ............................................................................................................................... 88


biodegradación del petróleo a 20ºC. ............................................................................... 89


del tiempo del modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de petróleo

a 20ºC. ............................................................................................................................ 90



xi



a 30ºC. ............................................................................................................................ 91





a 40ºC. ............................................................................................................................ 93

Figura 5.32 Tasa de mantenimiento microbiano en agua contaminada con diesel a 20,

30 y 40ºC. ....................................................................................................................... 94

Figura 5.33 Tasa de mantenimiento microbiano en agua contaminada con petróleo a 20,

30 y 40ºC. ....................................................................................................................... 94

xii

ÍNDICE DE ILUSTRACIONES

Ilustración 1 Cromatograma de referencia. Concentración de 5000 ppm de diesel en

CCl4. ............................................................................................................................. 115


CCl4. ............................................................................................................................. 115


CCl4. ............................................................................................................................. 116


CCl4. ............................................................................................................................. 116


CCl4. ............................................................................................................................. 116

Ilustración 6 Cromatograma de referencia. Concentración de 50 ppm de diesel en CCl4.

...................................................................................................................................... 117

Ilustración 7 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra de

agua contaminada con diesel a 20ºC. ........................................................................... 121





Ilustración 10 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra

de agua contaminada con petróleo a 20ºC. ................................................................... 122



xiii



xiv

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1.1 Ejemplos de contaminantes usuales de una refinería agrupados por familia

química. ............................................................................................................................ 5

Tabla 1.2 Compuestos Xenobióticos. .............................................................................. 6

Tabla 1.3 Solubilidad de Hidrocarburos y Derivados. .................................................. 10

Tabla 2.1 Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación in situ y ex situ. . 12

Tabla 2.2 Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación, ........................... 13

Tabla 3.1 Estado del nivel de depuración atendiendo a la observación microbiología. 34

Tabla 3.2 Composición de una célula bacteriana. ......................................................... 39

Tabla 4.1 Composición del medio mínimo o solución de sales minerales utilizada. .... 53

Tabla 4.2 Parámetros fisicoquímicos, normas mexicanas y técnicas analíticas ............ 57

Tabla 5.1 Enzimas involucradas en la biodegradación de hidrocarburos del petróleo. . 62

Tabla 5.2 Resultados de la caracterización de la muestra de agua real. ........................ 63

Tabla 5.3 Identificación del tipo de contaminación presente en la muestra de agua real.

........................................................................................................................................ 64

Tabla 5.4 Valores de referencia de R para tipos de hidrocarburos contaminantes. ....... 64

Tabla 5.5 Espectros de IR-ATR de las muestras al inicio y final del tratamiento. ........ 69

Tabla 5.6 Ecuaciones de referencia obtenidos a partir de cromatogramas de diesel (ver

anexo A). ........................................................................................................................ 74

Tabla 5.7 Variación de la concentración de biomasa para agua contaminada con diesel

y agua contaminada con petróleo, a tres temperaturas diferentes. ................................. 81

xv

Tabla 5.8 Variación de la concentración de DQO y de CO2 durante el tratamiento. .... 81

Tabla 5.9 Coeficientes de rendimiento entre la biomasa, el sustrato y el producto. ..... 82

Tabla 5.10 Ecuaciones de variación de los coeficientes de rendimiento durante el

tiempo de tratamiento para el diesel. .............................................................................. 82

Tabla 5.11 Ecuaciones de variación de los coeficientes de rendimiento durante el

tiempo de tratamiento para el diesel. .............................................................................. 82

Tabla 5.12 Constantes µmáx y Ks obtenidas aplicando una regresión lineal. ................ 83

Tabla 5.13 Balances de masa para agua contaminada con diesel durante el tratamiento a

20ºC. ............................................................................................................................... 84


30ºC. ............................................................................................................................... 86


40ºC. ............................................................................................................................... 87

Tabla 5.16 Balances de masa para agua contaminada con petróleo durante el

tratamiento a 20ºC. ......................................................................................................... 89


tratamiento a 30ºC. ......................................................................................................... 90


tratamiento a 40ºC. ......................................................................................................... 92

Tabla 0.1 Modelos de las curvas de referencia para la concentración de hidrocarburos

obtenidos por cromatografía de gases. ......................................................................... 117

xvi

RESUMEN

Entre los diferentes métodos existentes para la eliminación de hidrocarburos

contaminantes en agua, el biotratamiento es la mejor alternativa. Esta consiste en

utilizar microorganismos (hongos, bacterias, algas) para resolver o mitigar el problema,

y es especialmente efectiva en el tratamiento de contaminantes orgánicos, incluido el

petróleo. Para que las bacterias puedan eliminar las sustancias químicas dañinas, el agua

debe tener la temperatura, los nutrientes y la cantidad de oxígeno apropiados. Esas

condiciones permiten que los microorganismos desarrollen su ciclo de vida, propiciando

la fase de crecimiento exponencial, y de este modo asimilen una mayor cantidad de

sustancias químicas (Chaney, y otros, 1995).

En este trabajo se presenta una metodología para la biodegradación de las fracciones

del diesel y del petróleo que se solubilizan en agua. La cual consistió en obtener las

condiciones óptimas, de temperatura, período de adaptación, concentración de sales

necesarias para la homeostasis celular y el desarrollo de los microorganismos. Se

determinó la cinética de la biodegradación de los hidrocarburos presentes en el agua. Se

determinó la concentración inicial de los contaminantes a través de DQO, cromatografía

de gases, espectroscopía UV-vis, espectroscopia de IR-ATR. El desarrollo

microbiológico se efectuó a través de cuenta en placa y la actividad metabólica a través

de la producción de CO2 y consumo de O2.

La biodegradación se realizo en reactores de vidrio de 500 mL, con aireación continua

(flujo de 65 L/h), a temperatura constante de 20, 30 y 40 ºC. Se obtuvieron las cinéticas

de biodegradación correspondientes, así como las constantes de crecimiento

actualizando el modelo de Monod, que relaciona el desarrollo microbiano, el consumo

de sustrato y la generación de producto.

xvii

SUMMARY

Among the different methods available for removing hydrocarbon contaminants in

water, biotreatment is the best alternative. This is to use microorganisms (fungi,

bacteria, algae) to solve or mitigate the problem, and is especially effective in the

treatment of organic contaminants, including oil. For bacteria to remove harmful

chemicals, the water temperature should be, nutrients and oxygen appropriate. These

conditions allow microorganisms develop their life cycle, leading to the exponential

growth phase, and thus assimilate an increased amount of chemicals.

This research presents a methodology for the biodegradation of diesel and oil fractions

solubilized in water. Which consisted in obtaining the optimum conditions of

temperature adjustment period, salt concentration necessary for cell homeostasis and

development of microorganisms. Determined the kinetics of biodegradation of

hydrocarbons in water. Concentration determined initial COD contaminants through,

gas chromatography, UV-vis spectroscopy, IR-ATR spectroscopy. Microbiological

growth was effected by plate count and metabolic activity by CO2 production and O2

consumption.

Biodegradation reactors was performed in 500 ml glass with continuous aeration (flow

of 65 L / h) at a constant temperature of 20, 30 and 40 ° C. Were obtained

corresponding biodegradation kinetics and growth constants Monod updating the model

which relates microbial growth, substrate consumption and product generation.

1

INTRODUCCIÓN

El agua es un recurso primario, indispensable para el desarrollo y mantenimiento de la

vida. La contaminación de este recurso es un problema que afecta la salud de la

población, la integridad del medio ambiente y la calidad de vida. Cuando el

contaminante tiene significativos efectos adversos y es, además, de difícil eliminación,

sea porque se requieren tratamientos costosos, o porque la complejidad de este así lo

dicte, el problema se agrava considerablemente. Esto es particularmente cierto en el

caso de la contaminación del agua por hidrocarburos. El hecho anterior hace que los

hidrocarburos y el agua no se pueden considerar como fluidos inmiscibles ya que en los

primeros existen compuestos solubles.

En el presente trabajo se efectuó un estudio de la biodegradación de petróleo y diesel en

agua y el biotratamiento de una muestra de agua real extraída de un predio del valle de

México, que presenta esta problemática; utilizando un consorcio microbiano que

contiene microorganismos del género Pseudomona. Se llevo a cabo la caracterización

del agua real y la preparación de soluciones sintéticas con sales esenciales para el

desarrollo bacteriano. Se monitoreo la biodegradación de los sustratos hidrocarbonados

a través de DQO, respirometría, absorción de CO2, espectroscopía de UV-vis, infrarrojo

y cromatografía de gases-masas. Se obtienen los perfiles de biodegradación y las curvas

de crecimiento bacteriano.

En el capítulo 1 se presenta la problemática de la contaminación por hidrocarburos en el

medio ambiente, la clasificación general de estos, así como un panorama acerca de sus

efectos nocivos y de los principales componentes que se consideran xenobióticos. Se

hace un recuento de las diferentes industrias que generan contaminación por

hidrocarburos y que impactan de manera directa o indirecta el recurso del agua.

También se analiza en que puntos del proceso del petróleo hay riesgo de contaminar

este recurso. Se aborda una clasificación de los compuestos xenobióticos que se derivan

de las actividades petroleras o relacionadas con la industria de los hidrocarburos, así

como el daño que pueden causar en un ecosistema. Al final de este capítulo se hace un

2

análisis de las vías de dispersión de los compuestos hidrocarbonados, recurriendo a las

propiedades fisicoquímicas de estos. De esta manera, el lector tendrá un panorama

general de la problemática incipiente que representan estos contaminantes.

En el capítulo 2 se aborda el tema de los diferentes métodos de tratamiento existentes

por contaminación de aguas con hidrocarburos, dividiéndolos en tecnologías de

separación, de aislamiento, de transformaciones abióticas y la biorremediación. Se

presentan las ventajas y desventajas de cada uno de ellos, sus requerimientos mínimos

para poder ser aplicados y los riesgos implícitos. A través de este capítulo, se pretende

llevar al lector hasta la alternativa seleccionada en este trabajo, la biorremediación. Sin

embargo, también se mencionan los inconvenientes y limitaciones de esta tecnología, so

pesándolas con los beneficios que es capaz de reportar.

En el capítulo 3 se trata la tecnología de la biorremediación mas ampliamente, aplicado

a la contaminación de aguas con hidrocarburos, dando de este modo continuidad al

capítulo anterior. Se presenta un panorama de la utilización de microorganismos

capaces de utilizar hidrocarburos y sus derivados y se resaltan las características de los

que más utilizados. Se aborda el crecimiento bacteriano y los factores que afectan su

desarrollo. También se trata el tema de la degradación de los BTEX y del metil terbutil

éter haciendo énfasis en las rutas metabólicas principales. Se analiza el modelo de

crecimiento de microorganismos y se hace hincapié en el modelo de Monod, que

relaciona la biomasa y el consumo de sustrato.

Posteriormente se realiza una revisión sobre la literatura mas reciente que aborda esta

problemática, con lo cual se llega a la justificación de este trabajo y a los objetivos

buscados.

En el capítulo 4 el lector encontrará la metodología que se siguió para realizar las

experiencias, dividiéndolo en dos partes fundamentales, el acondicionamiento del

consorcio bacteriano y el seguimiento de la biodegradación del sustrato hidrocarbonado

por este. Se analiza las razones para el diseño y aplicación de la metodología seguida en

este trabajo. También se especifican los equipos y las técnicas utilizadas para cada

experiencia.

3

En el capítulo 5 se discuten los resultados obtenidos, su análisis e interpretación y se

proponen los modelos cinéticos. Se relaciona cada uno de los resultados obtenidos con

la literatura, mostrando la concordancia y aportando una interpretación sobria de dichos

resultados. En base a estos resultados, se calculan las constantes necesarias para

modelar el proceso de biorremediación de los sustratos utilizados a través de la cinética

de Monod.

Finalmente, a partir de los resultados y de sus análisis de llega a las conclusiones de este

trabajo y se presenta una perspectiva de los puntos que se pueden abordar en trabajos

futuros.

4

CAPITULO I. ANTECEDENTES

1.1. La contaminación por hidrocarburo

Del petróleo se obtienen determinados compuestos que son la base de diversas cadenas

productivas. El petróleo origina una amplia gama de productos: combustibles y

productos petroquímicos utilizados en las industrias de fertilizantes, plásticos,

alimenticia, farmacéutica, química y textil, entre otras. La desproporción entre el

volumen creciente de residuos peligrosos generados y las capacidades existentes de

manejo, vigilancia y control, dan lugar a un incompleto o en el peor de los casos nulo

tratamiento de contaminantes en tiraderos, drenajes municipales, barrancas, en

carreteras y cuerpos de agua. Esto origina contaminación crónica de los suelos y de los

cuerpos de agua superficial y subterránea que son fuente de abastecimiento de agua

potable.

Al transportar el crudo a los sistemas de almacenamiento para su debido tratamiento

existe la posibilidad de derrames del crudo debido a la fatiga y ruptura de tuberías,

bombas y tanques de almacenamiento. Los derrames generan situaciones de extrema

agresión al medio ambiente en sus distintas matrices, muy a pesar de la política de

prevención, contingencia y saneamiento puesta de manifiesto en la actualidad por las

empresas productoras. Una vez que el crudo llega a la refinería, se inicia una de las

fases más críticas para la generación de una matriz de contaminación. En esta actividad

se manejan volúmenes importantes de crudo, los cuales son sometidos al conjunto de

operaciones y procesos de refinación, donde se incluyen materiales auxiliares necesarios

para la obtención de las corrientes que conforman toda la gama de productos

comerciales, tales como, combustibles ligeros y medios (gasolina, kerosén, diesel),

combustibles residuales, aceites lubricantes, y otros productos (López, 1999).

Como consecuencia es posible la presencia en las aguas residuales de la refinería, de

compuestos orgánicos e inorgánicos. En la Tabla 0.1 se presentan algunos compuestos

típicos encontrados en las aguas residuales de una refinería y que provienen de la

actividad propia de los distintos tratamientos físicos y químicos efectuados sobre el

crudo (Office of Research and Standards, 2003).

5

Tabla 0.1 Ejemplos de contaminantes usuales de una refinería agrupados por familia química.

CONTAMINANTE COMPUESTOS REPRESENTATIVOS

Hidrocarburos alifáticos

y

aromáticos

n-hexano, ciclohexano, benceno, tolueno, xilenos,

etilbenceno, 1,2.4 trimetilbenceno, aromáticos

policíclicos, etc.

Olefinas Etileno, propileno, butadieno, estireno

Clorados Tetracloroetileno, tricloroetileno, tetracloruro de

carbono, diclorometano, 1,2 dicloroetano, etc.

Oxigenados Metanol, fenoles, formaldehido, MTBE, MEK

Metálicos Compuestos de níquel, de cobalto y de plomo

Otros Amoniaco, nitratos, ácido fosfórico, ácido fluorhídrico

Fuente: Elaboración propia.

El conjunto de actividades de la industria del petróleo finaliza con la etapa de

almacenamiento y distribución final de los productos comerciales. En esta fase, al igual

que en la de transporte, la matriz de contaminantes está presente con los frecuentes

derrames en tuberías, tanques y en el momento de la distribución de los distintos

productos.

Los hidrocarburos líquidos en fase no acuosa (NAPL, por sus siglas en ingles) presentan

una baja solubilidad en agua, se infiltran en el subsuelo y pueden alcanzar el agua

subterránea (Zhou, y otros, 1997). Los NAPL pueden clasificarse en aquellos cuya

densidad es mayor a la del agua (DNAPL, por sus siglas en inglés) y aquellos más

ligeros que el agua (LNAPL, por sus siglas en inglés). En la figura 1.1 se puede apreciar

como se ubican de acuerdo a su densidad.

Figura 0.1 Hidrocarburos que existen como una fase inmiscible y

separada cuando entran en contacto con el agua o el aire.

Fuente: (Celis Huaiquilaf, 2008)

6

Los LNAPL flotan sobre el nivel freático del acuífero formando capas de espesores que

van de los milímetros a los metros (a dicha fracción se le denomina fase libre). Las fases

volátiles ocupan parte de la zona vadosa y pueden incorporarse al flujo subterráneo. La

fase libre circula en la parte superior del acuífero a una velocidad por lo general menor a

la del flujo del agua subterránea. Las fases solubles de los LNAPL formarán una pluma

en la parte superior de la zona saturada, circulando a una velocidad mayor que la fase

libre. El problema se agrava debido a que las aguas subterráneas son una de las

principales fuentes de suministro para uso doméstico y para el riego en muchas partes

del mundo. De toda el agua dulce disponible, la proporción de agua subterránea alcanza

al 0.6% del total de agua del planeta (Bottura, 2003). En México representa

aproximadamente el 20% (Mazari, 2007).

1.2. Compuestos xenobióticos

Un compuesto xenobiótico es aquel que no se encuentra de forma natural en los

diferentes ecosistemas; se obtienen por síntesis química y llega a los ecosistemas por la

actividad antropogénica urbana o industrial. La contaminación con xenobióticos rompe

el equilibrio normal entre el medio físico, químico y biológico, compatible con la vida.

Su toxicidad radica en su persistencia en el medio donde impactan. Ejemplos de

xenobióticos son los plásticos (cloruro de polivinilo); explosivos (TNT); detergentes

(dodecilbencenosulfonato de sodio); plaguicidas (ácido 2,3,6 - triclorofenolacético;

hexaclorociclohexano; ciclodienos (aldrin); 2,1,1 – tricloro -2,2 – bis (p-clorofenil)

etano (DDT)); colorantes (azocompuestos) y pinturas (metilisobutilcetona). La literatura

especializada también recoge a los hidrocarburos poliaromáticos (naftaleno, fenantreno

y benzopirenos) bajo esta denominación. En la tabla 1.2 se señalan algunos compuestos

xenobióticos importantes. Entre los contaminantes orgánicos se encuentran

principalmente compuestos del grupo BTEX, fenoles, policlorobifenilos (PCB),

hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH) y plaguicidas.

Tabla 0.2 Compuestos Xenobióticos.

Etilen glicol Hidrocarburos aromáticos

Acrilamida Organoclorados

Metil-etil-cetona Nitroaromáticos

Fenoles Lignocelulósicos

Acrilonitrilo Surfactantes

Hidrocarburos Colorantes

Fuente: (Rodríguez, 1998)

7

Las aguas residuales industriales suelen contener compuestos químicos que eran ajenos

a la biosfera hasta el advenimiento de la química industrial (Temminik, 1993) . Estos

compuestos llamados xenobióticos, alteran las rutas metabólicas de los

microorganismos degradadores de las materias orgánicas transportadas por las aguas

residuales.

Las sustancias bíorresistentes (Williams, y otros, 1997) , o recalcitrantes se refieren a

compuestos orgánicos de origen sintético o natural que se resisten a la mineralización en

plantas depuradoras convencionales.

Un gran número de bacterias son capaces de metabolizar compuestos xenobióticos

como fuente de carbono en cultivos puros (Abalos, 2004), sin embargo no siempre una

simple bacteria posee toda la capacidad enzimática necesaria para degradar uno o varios

compuestos orgánicos contaminantes del ecosistema.

Las poblaciones mixtas o consorcios microbianos tienen mayor poder biodegradativo

porque la información genética que codifica al sistema enzimático del consorcio o la

población mixta es más completa y por tanto es más probable la degradación de las

mezclas complejas de xenobióticos presentes de un área dañada (Nápoles, 2005; Nuñez

Moreira, y otros, 2004).

Los géneros bacterianos degradadores de xenobióticos más comunes tanto en suelos

como en aguas son: Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Nocardia y Pseudomonas spp.

(Leahy, y otros, 1990).

1.3. Dispersión de contaminantes

Entre los combustibles destilados del petróleo más comunes se encuentran la gasolina,

kerosina o queroseno, turbosina, diesel, gasóleo y combustóleo. Y aunque han sido

investigados durante mucho tiempo y su química es bien conocida, el estudio como

contaminantes de suelo, e incluso de acuíferos y aire se ha desarrollado en las últimas

décadas.

Generalmente, la distribución de algunos de estos productos se realiza por una enorme

red de ductos (70 %) que recorre gran parte del territorio nacional, conectando las

8

diferentes estaciones y subestaciones de distribución y venta con las refinerías y plantas

petroquímicas del país, que son las encargadas del procesamiento de dichos productos.

Adicionalmente se utiliza la red de carreteras nacionales (30 %) para el transporte de

gasolina, diesel y algunos otros derivados del petróleo. Lo cual implica un riesgo latente

durante el traslado de estas sustancias. Es por eso que hoy en día los derrames de

hidrocarburos y demás sustancias químicas, se consideran como emergencias

ambientales debido a que pueden poner en peligro a la salud humana y recursos

naturales.

El transporte terrestre se realiza por medio de ductos, carreteras y ferrocarril. Los ductos

siempre están sujetos a riesgos de accidentes de diversa índole, que de producirse

significan derrames, explosiones, incendios, desprendimientos de gases de los tanques

de almacenamiento (evapotranspiración: vertimientos de residuos de hidrocarburos).

Por medio de las carreteras y el ferrocarril se transportan productos ligeros, gases

licuados, gasolinas, naftas, etc. En carretera el riesgo es mayor, aunque son menores los

volúmenes transportados. El transporte del petróleo y sus productos se realiza

principalmente por mar (transporte marítimo). Actualmente es del orden de 1,500

millones de toneladas anuales, lo que representa más del 60 % del tráfico marítimo

mundial.

Una vez que penetran los combustibles en el suelo, pueden amenazar la salud pública,

como una consecuencia de su migración y contacto con los mantos freáticos, que en su

gran mayoría son la fuente de abastecimiento de agua para las poblaciones aledañas.

Resultando indispensable tener en cuenta la dispersión de contaminantes en suelos y

acuíferos, ya que una vez que ha ocurrido un derrame en el primer caso se presentan

diversos fenómenos naturales que tienden a dirigirlo hacia las aguas subterráneas. La

combinación de las características del subsuelo, de los contaminantes, la profundidad

del manto freático y las condiciones climatológicas del sitio (temperatura y

precipitación pluvial) puede dar lugar a los diferentes procesos de transporte y

distribución de contaminantes.

Cuando ocurre un derrame en suelos o en cuerpos de agua, los contaminantes

inmediatamente tienden a dispersarse hacia donde el medio físico lo permite. Las

características fisicoquímicas del contaminante, como son la densidad, solubilidad y

9

viscosidad, así como las propias del sitio, como son la unidad del suelo, permeabilidad,

estructura, tamaño de las partículas, contenido de humedad y de materia orgánica,

determinan su permanencia o migración, como se muestra en la tabla 1.3. Esta es la

razón por la que derrames subterráneos que ocurrieron en el pasado, años después se

detectan fuera del predio donde acontecieron, y alejados varios metros e incluso

kilómetros en dirección de la corriente de agua subterránea. Ejemplos de lo anterior se

presentan comúnmente en zonas aledañas a poliductos, centros de almacenamiento y

distribución de combustibles, así como en estaciones de servicio.

Por otro lado, en el país en el área metropolitana de la ciudad de México, zona

metropolitana de la ciudad de Guadalajara, Jalisco; ciudad de Aguascalientes: ciudad de

Monterrey, Nuevo León; ciudad de Toluca, Estado de México por citar algunos

ejemplos, existen sedimentos arcillosos que en muchos casos se encuentran afectados

por fisuras y fracturas. En muchas situaciones la parte superficial de los estratos se

encuentran intemperizada/fracturada y afectada por diversos procesos tal como

extracción de agua, desecación-infiltración, tráfico vehicular y esfuerzos originados por

construcciones en zonas urbanas. Lo anterior implica que en muchas ciudades de la

república Mexicana, se tienen arcillas fracturadas e intemperizadas en donde a pesar de

que constituyen en muchos casos una unidad protectora de los acuíferos que sobre

yacen, la presencia de discontinuidades-heterogeneidades constituyen rutas de

migración preferencial por donde pueden migrar hacia los acuíferos subyacentes los

contaminantes que son derramados en la superficie del terreno (Aguilar, 2005).

Cuando los medios porosos de baja permeabilidad, como las arcillas, se encuentran

intemperizadas y/o fracturadas, las fisuras y fracturas constituyen rutas preferenciales

para la migración de contaminantes, presentándose advección-dispersión de los

contaminantes en las discontinuidades y difusión de las paredes de las fisuras hacia la

matriz porosa (Aguilar, 2005).

Además de las características hidrogeológicas de la cuenca de México, otros fenómenos

que pueden causar/extender la contaminación de sustancias químicas y en particular de

hidrocarburos derivados del petróleo al subsuelo, son la alta compresibilidad de los

sedimentos lacustres, la actividad sísmica y la extracción de agua subterránea

(Figueroa, 1989). Estos fenómenos pueden causar consolidaciones e inducción de

10

esfuerzos lo que eventualmente puede ocasionar la ruptura de tuberías y problemas de

hundimientos diferenciales en estructuras y cimentaciones. Todas las variables en su

conjunto definen el tamaño y la distribución tridimensional del frente de c

contaminación en una zona específica (Ortínez Brito, y otros, 2003).

Tabla 0.3 Solubilidad de Hidrocarburos y Derivados.

Grupo de Hidrocarburo Solubilidad en agua

(mg/L)

Valores numéricos de la solubilidad:

Solubilidad baja < de 10 mg/L

Solubilidad media entre 10 y 1000

mg/L

Solubilidad alta >1000 mg/L

Benceno 1,760

Tolueno 470

Xilenos 172

Etil benceno 140

Fenol 82,000

Fuente: (Fan, y otros, 1995)

De acuerdo con su densidad, los compuestos orgánicos se clasifican en dos grupos:

aquellos cuya densidad es menor a la del agua se denominan ligeros; mientras que los

que poseen una densidad mayor a la del agua se les conoce como densos. Esta

clasificación es importante, ya que es lo que determina el comportamiento de los

contaminantes en el acuífero.

Los ligeros tienden a formar una capa en forma de nata en el nivel freático, y se mueven

horizontalmente en dirección al flujo del agua subterránea, como las gasolinas, los

aceites y el petróleo crudo.

Los densos, por el contrario, migran hacia la base del acuífero creando una columna a

partir de la cual pueden ir en dirección al flujo del agua subterránea, contaminando así

el acuífero en toda su profundidad; ejemplo de estos, son los bifenilos policlorados.

11

CAPITULO II. MÉTODOS DE TRATAMIENTO

El término “tecnología de tratamiento” implica cualquier operación unitaria o serie de

operaciones unitarias que altera la composición de una sustancia peligrosa o

contaminante a través de acciones químicas, físicas o biológicas de manera que

reduzcan la toxicidad, movilidad o volumen del material contaminado (Environmental

Protection Agency (EPA), 2001). Las tecnologías de remediación representan una

alternativa a la disposición de desechos peligrosos que no han sido tratados, y sus

capacidades y posibilidades de éxito, bajo las condiciones específicas de un sitio,

pueden variar ampliamente.

El uso de una tecnología de remediación en particular depende, además de los factores

específicos del sitio y de las propiedades fisicoquímicas del contaminante, de su

disponibilidad, de la fiabilidad demostrada o proyectada, de su estado de desarrollo

(laboratorio, escala piloto o gran escala) y de su costo (Seller, 1999).

2.1. Clasificación de tecnologías de remediación

Las tecnologías de remediación pueden clasificarse de diferentes maneras, con base en

los siguientes principios:

Estrategia de remediación;

Lugar en que se realiza el proceso de remediación;

Tipo de tratamiento.

Es importante mencionar que cada una de estas clasificaciones proporciona diferente

información acerca de las tecnologías de remediación.

2.1.1 Estrategia de remediación

Son tres estrategias básicas que pueden usarse separadas o en conjunto, para remediar la

mayoría de los sitios contaminados:

Destrucción o modificación de los contaminantes. Este tipo de tecnologías busca

alterar la estructura química del contaminante.

12

Extracción o separación. Los contaminantes se extraen y/o separan del medio

contaminado, aprovechando sus propiedades físicas o químicas (volatilización,

solubilidad, carga eléctrica);

Aislamiento o inmovilización del contaminante. Los contaminantes son

estabilizados, solidificados o contenidos con el uso de métodos físicos o

químicos;

2.1.2 Lugar de realización del proceso de remediación

En general, se distinguen dos tipos de tecnología. En la tabla 2.1 se muestran ventajas y

desventajas de estas tecnologías.

In situ. Son las aplicaciones en las que el agua contaminada es tratada, o bien,

los contaminantes son removidos del agua, sin necesidad de extraerla. Es decir,

se realizan en el mismo sitio en donde se encuentra la contaminación;

Ex situ. La realización de este tipo de tecnologías, requiere la extracción,

bombeo o cualquier otro proceso para la movilización del agua contaminada

antes de su tratamiento que puede realizarse en el mismo sitio (on site) o fuera

de él (off site).

Tabla 0.4 Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación in situ y ex situ.

IN SITU EX SITU

Ventajas Permiten tratar el agua sin

necesidad de transportar.

Potencial disminución en

costos.

Menor tiempo de tratamiento.

Más seguros en cuanto a

uniformidad: es posible

homogeneizar y muestrear

periódicamente.

Desventajas Mayores tiempos de

tratamiento.

Pueden ser inseguros en cuanto

a uniformidad: heterogeneidad

en las características del suelo.

Dificultad para verificar la

eficacia del proceso.

Necesidad de transportar el agua.

Aumento en costos e ingeniería

para equipos.

Debe considerarse la manipulación

del material y la posible

exposición al contaminante.

Fuente: Elaboración propia.

2.1.3 Tipo de tratamiento

Esta clasificación se basa en el principio de la tecnología de remediación y se divide en

tres tipos de tratamiento. En la tabla 2.2 se muestran algunas ventajas y desventajas de

cada uno de ellos.

Tratamiento biológicos (biorremediación).Utilizan las actividades metabólicas

de ciertos organismos (plantas, hongos, bacterias) para degradar (destrucción),

transformar o remover los contaminantes a productos metabólicos inocuos.

13

Tratamientos fisicoquímicos. Este tipo de tratamientos, utiliza las propiedades

físicas y/o químicas de los contaminantes o del medio contaminado para

destruir, separar o contener la contaminación.

Tratamientos térmicos. Utilizan calor para incrementar la volatilización

(separación), quemar, descomponer o fundir (inmovilización) los contaminantes.

Tabla 0.5 Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación,

clasificadas de acuerdo con el tipo de tratamiento.

Ventajas Desventajas

Tratamientos

biológicos

Son efectivos en cuanto a

costos.

Son tecnologías más benéficas

para el ambiente.

Los contaminantes

generalmente son destruidos.

Se requiere un mínimo o

ningún tratamiento posterior

Requieren mayores tiempos de

tratamiento.

Es necesario verificar la

toxicidad de intermediarios y/o

productos.

No pueden emplearse si el tipo

de contaminante inhibe el

crecimiento microbiano.

Tratamientos

fisicoquímicos

Son efectivos en cuanto a

costos.

Pueden realizarse en períodos

cortos.

El equipo es accesible y no se

necesita de mucha energía ni

ingeniería.

Los residuos generados por

técnicas de separación, deben

tratarse o disponerse: aumento en

costos y necesidad de permisos.

Los fluidos de ectracción pueden

aumentar la movilidad de los

contaminantes: necesidad de

sistemas de recueración.

Tratamientos

térmicos

Destrucción completa de

contaminantes.

Es el grupo de tratamientos más

costoso.

Fuente: Elaboración propia

2.2. Métodos de separación

En estos métodos se encuentran:

Air sparging. En la aireación in situ, se inyecta aire en la zona saturada contaminada

volatilizando a los contaminantes en burbujas hasta la zona vadosa donde un sistema de

extracción de vapores captura la corriente de aire contaminada.

Movilización y solubilización mejorada. La baja solubilidad de los componentes de

los NAPL se puede mejorar, incrementando la masa de contaminante extraída, con el

lavado mediante surfactantes, con solventes, materia orgánica disuelta y ciclodextrinas

(McCray, y otros, 1998) .

Extracción de vapor. Esta tecnología implica la inyección de vapor para facilitar la

volatilización El proceso se facilita mediante mezcla mecánica del terreno hasta

profundidades de unos 7 metros con ayuda de barrenos.

14

Técnicas electrocinéticas. Necesitan por lo menos un par de electrodos alrededor del

área a tratar, y una corriente DC, de 50 a 150V. El tratamiento electrocinético consta de

varios procesos: electromigración, electroósmosis y electroforesis, que movilizan a los

contaminantes y electrolisis que los degrada (NRC, 1999). Un proceso llamado

LASAGNA combina el transporte electroosmótico con la captura de los contaminantes

por adsorbentes. Este proceso se aplicó en el campo en un sitio contaminado por TCE

(tricloroetileno) con una eficacia del 99 por ciento (NRC, 1999).

2.3. Tecnologías de aislamiento

En estas se engloban en:

Barreras Impermeables. Las barreras impermeables, para las zonas saturada y vadosa,

pueden impedir la migración de los NAPL. Son tecnologías probadas. Su misión es

confinar pequeñas bolsas de NAPL que pueden contaminar el agua subterránea. Hay

barreras verticales, coberteras superficiales, barreras horizontales, y combinaciones de

ellas.

Vitrificación/Encapsulación. Las técnicas de solidificación, estabilización,

vitrificación e inmovilización tienen el objeto de inmovilizar los contaminantes

subterráneos, fijándolos en una matriz sólida, e impermeable.

2.4. Tecnologías de transformación abióticos

Los métodos de transformación abiótica pueden ser in situ o ex situ. Los reactivos de

Fenton son aplicables de ambos modos. Las barreras permeables reactivas se aplican

sólo en el medio subterráneo, y el método UV/peróxido sobre el terreno después de la

extracción. La ventaja de los métodos in situ es que destruyen allí mismo al

contaminante. Los tratamientos ex situ evitan el problema de traslado de los reactivos y

posibilitan reacciones fotoquímicas sobre el terreno. Recientemente vienen recibiendo

atención las transformaciones químicas (redox) in situ: métodos pasivos como barreras

reactivas permeables con limaduras de hierro de valencia cero y, activos con inyección

de soluciones oxidantes (reactivo de Fenton, permanganato) en la zona contaminada.

15

Hidrodeshalogenación de los compuestos clorados. Se han realizado ensayos en lotes

con disolventes clorados con partículas de Pd como catalizador, obteniéndose etano y

ácido clorhídrico (Ordoñez Suárez, s/n). Los etilenos clorados con vidas medias de unos

4 minutos son los más reactivos. Los carbonatos desactivan gradualmente al catalizador.

La hidrodeshalogenación de contaminantes clorados en fase gas con catalizadores (Pd y

Pt) sería un método de destrucción antes de la adsorción con carbono activado u otros

sistemas.

Tecnologías bióticas. Se prefieren las técnicas de tratamiento in situ que son las que se

aplican sin necesidad de trasladar el agua subterránea afectada por el problema. Suelen

ser de utilidad cuando el problema afecta a un volumen muy importante del suelo, que

haga inviable su aislamiento y su tratamiento ex situ, o cuando éste supone un costo

económico que lo hace inviable, ya que el tratamiento in situ suele implicar un menor

costo económico. El tratamiento in situ puede ser de dos tipos: biológico o físico-

químico. La técnica de remediación in situ de carácter biológico es la biorremediación.

2.5. La biorremediación

Consiste en utilizar microorganismos (bacterias) para resolver o mitigar el problema, y

es especialmente efectiva en el tratamiento de contaminantes orgánicos, incluido el

petróleo. Para que las bacterias puedan eliminar las sustancias químicas dañinas, el

suelo y las aguas subterráneas deben tener la temperatura, los nutrientes y la cantidad de

oxígeno apropiados. Esas condiciones permiten que las bacterias crezcan y se

multipliquen, y asimilen más sustancias químicas (Chaney, y otros, 1995).

Los microorganismos pueden ayudar a eliminar la contaminación de las aguas

subterráneas, al igual que del suelo. En este caso, el agua se mezcla con nutrientes y aire

antes de que ser reinyectada al terreno. También pueden bombearse nutrientes y aire por

los pozos, de forma que la mezcla se produzca directamente en profundidad. Los

nutrientes y el aire añadidos ayudan a las bacterias a biorremediar las aguas

subterráneas. Una vez que se han eliminado las sustancias químicas dañinas, las

bacterias ya no tienen “alimento” disponible y mueren.

16

La biorremediación es muy segura, ya que depende de microbios que existen

normalmente en los suelos. Esos microbios son útiles y no representan un peligro para

las personas en el sitio o la comunidad. Además, no se emplean sustancias químicas

peligrosas. Los nutrientes que se añaden para que las bacterias crezcan son fertilizantes

de uso corriente en el césped o el jardín. La biorremediación transforma las sustancias

químicas dañinas en agua y gases inofensivos y, por lo tanto, las destruye totalmente.

Como principales ventajas de esta técnica se pueden indicar las siguientes

(EPA/625/R.94/005 USEPA, 1995):

Es una técnica in situ, lo que evita la necesidad de extraer el suelo, e

incluso el contacto de los trabajadores con el suelo o agua contaminados;

Evita la liberación de gases dañinos al aire y se generan muy pocos

residuos;

Generalmente esta técnica no requiere tanto equipamiento ni trabajo

como la mayoría de los métodos alternativos. Por lo tanto, suele resultar

más económica.

Como inconvenientes, se pueden citar los siguientes:

No es de aplicación más que para la descontaminación de hidrocarburos

biodegradables;

No suele ser efectiva más que en condiciones relativamente superficiales;

Presenta factores intrínsecos que la hacen completamente inviable en

determinados casos.

La biorremediación se considera actualmente como una alternativa tecnológica apta

para la limpieza de suelos y de acuíferos contaminados, donde se aprovecha el potencial

de los microorganismos para mineralizar o transformar residuos orgánicos en

compuestos químicamente más sencillos. El proceso obedece a la capacidad metabólica

de los microorganismos; y la actividad biodegradadora puede ser estimulada por la

adición de nutrientes básicos.

La característica más importante de la biorremediación es que los contaminantes no se

destruyen, sino que través de la actividad microbiana se transforman en compuestos

17

químicamente diferentes. Algunos pueden ser completamente degradados, en forma tal

que se cumple con la primera ley de la termodinámica. Cuando la transformación llega

hasta la generación de dióxido de carbono y agua, entonces se habla de una completa

mineralización.

Una ventaja importante de la biorremediación es su bajo costo en relación con otros

tratamientos. Es difícil hacer una comparación de costos, de ahí que conviene conocer

las características de cada sitio en particular; pero en términos generales, se puede decir

que es por lo menos diez veces más económica que la incineración y tres veces más

económica que algunas tecnologías fisicoquímicas de inmovilización. Este bajo costo se

debe a varios factores, como son un menor gasto de energía; bajo costo de los

nutrientes; y la operación en condiciones ambientales. Eso hace que su uso sea muy

atractivo para los países en vías de desarrollo, como México.

La versatilidad de esta alternativa tecnológica se basa en que puede adaptarse a las

necesidades de cada sitio. Así, puede aplicarse bioestimulación si únicamente se

requiere la adición de nutrientes para la actividad metabólica degradadora de la flora

bacteriana autóctona; bioincremento, cuando la proporción de la flora degradadora

autóctona es muy reducida y se hace necesario añadir microrganismos degradadores

exógenos; o bien bioventeo, cuando es imprescindible el suministro de oxígeno para

estimular la actividad microbiana degradadora presente en el lugar. En cualquiera de las

opciones anteriores puede realizarse fuera del sitio (ex situ) si la contaminación está en

el suelo superficial, pero necesariamente in situ cuando los contaminantes han

alcanzado grandes profundidades, e inclusive el manto freático.

En sitios donde ocurren derrames de hidrocarburos no atendidos inmediatamente, la

flora microbiana presente en el suelo se somete a un proceso de selección natural, en el

que los microorganismos sobrevivientes son aquellos que desarrollan capacidad

degradadora. En estos casos la mejor opción es utilizar la flora autóctona del sitio, en

lugar de agregar microorganismos exógenos. Para tratar derrames recientes,

probablemente será necesario recurrir a preparados microbianos frescos.

En el caso de aguas subterráneas, la biorremediación se aplica a través del bombeo-

tratamiento-recarga, que consiste en extraer el agua subterránea, promover la

18

biodegradación de los contaminantes en biorreactores instalados en la superficie y

posteriormente devolverla al acuífero, o bien inyectar nutrientes y bacterias, de tal

forma que se establezca una recirculación y el sitio mismo se convierta en un

biorreactor.

19

CAPITULO III. BIORREMEDIACIÓN

La contaminación de los recursos acuícolas en el mundo es un problema que ha ido en

aumento, de la mano del desarrollo que ha conseguido la sociedad. Cuando los

contaminantes son hidrocarburos, el problema se agrava, porque los métodos

convencionales para el tratamiento de aguas son insuficientes para conseguir hacerlos

inocuos.

3.1. Prospectiva de microorganismos

El desarrollo de nuevos procesos para este tipo de contaminantes ha ido en aumento en

las últimas décadas, donde los métodos químicos basados en oxidación son los más

destacados. Sin embargo, estos procedimientos en muchos casos resultan imprácticos,

costosos, de difícil adaptación y en muchos casos, generan subproductos que son más

peligrosos que los originalmente presentes (Kvenvolden, y otros, 2003; Holliger, y

otros, 1997; Alvarez, y otros, 1991).

Por lo anterior, la biodegradación es una alternativa viable. Consiste en el uso de la

capacidad degradativa de algunos microorganismos para utilizar los hidrocarburos como

fuente de carbono y convertir estos en sustancias inocuas para la biota. A partir de este

principio se desarrollan procesos de biorremediación. Múltiples microorganismos se

han estudiado, para evaluar tanto su capacidad como su eficiencia degradativa hacia los

hidrocarburos. Estos estudios se realizan utilizando microorganismos individuales o

consorcios microbianos. El tipo de microorganismos con capacidad de utilizar

hidrocarburos incluye hongos, bacterias y algas (Soo Cho, y otros, 1997).

Para que un microorganismo sea capaz de utilizar petróleo o alguna de sus fracciones

hidrocarbonadas como sustrato, es necesario que cuente con las enzimas adecuadas para

dicho sustrato. La variabilidad metabólica que presentan los microorganismos para usar

compuestos hidrocarbonados como fuente de carbono y de energía se debe a la

presencia de algún tipo o grupo de enzimas específicas. (Van Beilen, y otros, 2007) Los

microorganismos son capaces de desarrollar especificidad para metabolizar

contaminantes, llegando a ser selectivos para estos, cuando se encuentran sometidos

ambientalmente a condiciones en las cuales no existe otra fuente de carbono; tal es el

20

caso de la biodegradación de aromáticos policíclicos por microorganismos, la cual es

considerada una técnica altamente efectiva y ambientalmente benigna (Cerniglia, 1992;

Cerniglia, 1997).

En general, el tipo de bacterias que participan en procesos de biodegradación de

derivados hidrocarbonados son gramnegativas. El primer paso para que los

microorganismos metabolicen este tipo de contaminantes es la producción de

biosurfactantes, con el fin de incorporarlos en su metabolismo. Los biosurfactantes son

moléculas complejas que pueden incluir lipopéptidos, glicolipidos, polisacáridos

complejos, ácidos grasos y fosfolípidos (Fritsche, y otros, 2000).

Muchas especies de Bacillus sintetizan lipopéptidos, especies de Pseudomonas y

Candida sintetizan glicolipidos, mientras que algunas especies de Acinetobacter

sintetizan complejos poliliposacáridos. La importancia de dichos biosurfactantes es que

su presencia aumenta la biodisponibilidad de los contaminantes (Moussa, y otros,

2006). El condicionante para que los microorganismos sean capaces de sintetizar

biosurfactantes, es la presencia de carbono, nitrógeno y elementos traza, así como

condiciones apropiadas de temperatura y aireación (Yimin, y otros, 1995; Lin, 1996;

Wouter, y otros, 1998). Dentro de los compuestos que los microorganismos sintetizan

en la superficie celular, por sus efectos, se distinguen dos: aquellos que reducen la

tensión superficial en la interfase del agua y el aire (biosurfactantes) y aquellos que

reducen la tensión interfacial entre la interfase de líquidos inmiscibles o la interfase

liquido-sólido. Estas sustancias también facilitan la difusión de los compuestos

hidrocarbonados dentro de la célula microbiana. En la figura 3.1 se esquematiza este

proceso (Lin, 1996).

Otro mecanismo utilizado por los microorganismos para integrar estos compuestos es

modificar su pared celular, sintetizando lipopolisacáridos o surfactantes no iónicos.

Estos factores son importantes para implementar una estrategia exitosa de

biorremediación, ya que son los factores que influencian la biodegradación y la ecología

de las bacterias degradadoras de los contaminantes. Estos factores también dictan el

grado que se puede lograr de biodegradación del contaminante (Hofritcher, 2000

Germany).

21

Figura 0.2 Participación de biosurfactante (rhamnolípido) producido por bacterias del genero

Pseudomonas sp en el consumo de hidrocarburos.

Fuente: (Hofritcher, 2000 Germany)

En la figura 3.2 se muestra la localización y funciones de los productos del gen alk. Los

productos incluyen alcano hidroxilasa, rubredoxinas, aldehído deshidrogenasa, alcohol

deshidrogenasa, acetil-CoA sintasa, proteína de la membrana exterior que intervienen en

del consumo (AlkL), proteína metil-aceptora transductora que interviene en la

quimiotaxis (AlkN), rubredoxin reductasa (AlkT) y genes de regulación positiva (AlkS)

(van Beilen, y otros, 2001).

Figura 0.3 Esquematización de la degradación de alcanos por una bacteria gran-negativa.

Fuente: (van Beilen, y otros, 2001).

22

La recurrencia de algunas especies microbianas en sitios contaminados con derivados

hidrocarbonados específicos, tales como hidrocarburos poliaromáticos como parte de la

biota nativa, son el fundamento para la aplicación de la biorremediación. Entre dichos

microorganismos se encuentra Pseudomona, Cyclocasticus, Vibrio y Pseudalteromonas.

La participación de los microorganismos nativos en la biodegradación, cuando se

implementa un proceso de biorremediación, debe ser evaluado detalladamente, ya que

su presencia también condiciona la eficiencia de la biodegradación, llegando a

potenciarla en el mejor de los casos. Naturalmente, los microorganismos presentes en

un sitio contaminado (por hidrocarburos), desarrollaran la capacidad de utilizar como

sustrato el contaminante, en menor o mayor grado. Otro factor importante es la

composición del hidrocarburo contaminado, ya que el contenido de metales pesados

puede disminuir e incluso inhibir el desarrollo de parte o de la totalidad de la biota

microbiana existente en el medio, y por tanto afecta directamente el potencial

degradativo de estos organismos (Eckford, y otros, 2002; Eckford, y otros, 2002).

El petróleo, sin embargo, incluye una amplia variedad de compuestos hidrocarbonados,

con características químicas específicas y que por tanto interactúan de maneras muy

variadas en un medio contaminado. Muchos de los compuestos que conforman el

petróleo son considerados peligrosos para la salud tanto de humanos como de animales,

ya que está demostrado que tienen propiedades toxicas y carcinogénicas (Prabhu, y

otros, 2003).

La biorremediación es la alternativa cuyo mecanismo de remoción tiene mayor

participación en casos donde ha ocurrido contaminación de medios acuáticos por

hidrocarburos. Un hecho importante en los procesos de biorremediación del petróleo, es

que las bacterias adicionadas desaparecen con el tiempo, mientras que las bacterias

nativas son capaces de degradar el petróleo en algunos días. El uso de flora nativa ha

centrado el interés en estudiar la bioquímica y la genética involucrada en el proceso de

biodegradación de estos microorganismos (Bicca, y otros, 1999).

La especificidad de cada microorganismo sobre un componente del petróleo o un grupo

de componentes también puede ser estimulada por medio de su adaptación a dicho

sustrato. Para cada fracción del petróleo, se tiene un conjunto de microorganismos con

23

capacidad de metabolizar selectivamente dichas fracciones. Este hecho también permite

utilizar estos microorganismos como biosensores (Langworthy, y otros, 1998; Daunert,

y otros, 2000).

El metabolismo microbiano puede clasificarse de acuerdo a la vía por la cual el

contaminante se biotransforme. En metabolismo aerobio de los alcanos involucra la

acción de la enzima monooxigenasa sintetizada en la membrana celular, la cual

participa activamente en la β-oxidación del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. En el

caso de los poliaromáticos, la enzima polioxigenasa participa en la vía de salicilato o en

la vía a través de catecol hasta piruvato. La vía anaerobia involucra procesos tales como

la reducción de Fe(III), denitrificación, condiciones de sulfatoreducción; las cuales se

efectúan en bacterias anoxigénicas fotosintéticas, en consorcios sintrópicos y en

bacterias metanogénicas. Las proteobacterias de diferentes subclases son las

mayormente reportadas en la literatura para este tipo de condiciones, utilizando como

sustrato benceno, tolueno y xilenos (Cerniglia, 1997; Frazer, y otros, 1995).

Para el estudio de la biodegradación, el diesel representa un excelente sustrato, debido a

que su composición es representativa de la fracción soluble en agua del petróleo. Una

manera rápida de seleccionar a los microorganismos con capacidad degradadora es

caracterizando el biosurfactante que producen (Mukherjee, y otros, 2006).

Para estimular la producción de biosurfactantes y facilitar así dicha adaptación, se

adiciona una mezcla de sales minerales que contienen la relación de carbono, nitrógeno

y elementos traza necesaria para el desarrollo microbiano. Bajo este esquema de trabajo,

se espera obtener resultados que confirmen la capacidad degradadora del consorcio

utilizado sobre la mezcla de hidrocarburos contaminantes, y la estimulación de esta,

evaluando así los parámetros más importantes que afectan la eficiencia de la

biodegradación. Estos resultados permitirán desarrollar un sistema de tratamiento en

una escala mayor, fundamentando el proceso en la optimización de los parámetros

importantes que se detecten en el trabajo.

Algunas de las principales características que incorpora el consorcio bacteriano en uso

están bien descritas en la bibliografía especializada; sin embargo, esto no garantiza que

dicho consorcio pueda ser utilizado para cualquier tipo de contaminación por crudo. La

24

influencia de la flora nativa dependerá del sitio en el que ocurra la contaminación, ya

que esta varía de acuerdo al ambiente y a la región. Inclusive, la propia naturaleza del

crudo derramado, su contenido de metales pesados y su grado de dispersión en el medio

serán factores que permitan o inhiban el desarrollo de la biota indígena (Annweller, y

otros, 2000; Becker, 1997).

Esto obliga a concluir que antes de implementar cualquier metodología de

biorremediación, es indispensable contar con una caracterización tanto del lugar como

del tipo de hidrocarburo presente; así como las interacciones existentes en el medio

entre dicho contaminante y otras sustancias presentes naturalmente en el medio de

interés. Todo esto con el fin de obtener resultados óptimos del procedimiento por

aplicar (Suthan, y otros, 1999).

El territorio nacional, por poseer petróleo como un importante recurso natural, sufre la

problemática de los derrames y fugas de crudo, en ambientes especialmente sensibles

por su gran variedad de organismos y microorganismos presentes, tales como los

manglares y pantanos. Ello brinda la oportunidad de estudiar en detalle la flora nativa

que resiste, se adapta y degrada este tipo de contaminantes. Diversos casos se ubican en

regiones con esta problemática en el suroeste del país, las cuales sirven como fuentes de

obtención de microorganismos adaptados (Martínez de villa, y otros, 1995 Jun 5-9).

La comercialización de dichos microorganismos se ha venido incrementando en los

últimos años. Es indispensable el estudio de las interacciones en el medio que provocan

los contaminantes y las existentes entre los microorganismos de estas zonas. Para esta

problemática, una alternativa es el acondicionamiento de los parámetros que favorezcan

el desarrollo de la microbiota capaz de degradar los hidrocarburos. Esto solo se puede

conseguir conociendo y estudiando estos parámetros (Atlas, y otros, 1992; Atlas, y

otros, 1992; Atlas, y otros, 1995).

La recurrencia del género Pseudomona en sitios que han sufrido esta problemática y la

capacidad de este microorganismo para adaptarse no solo al sustrato sino también a

condiciones aeróbicas o anaeróbicas lo hacen un buen representante de la acción

microbiana en medios con este tipo de presión. Otra razón importante para su estudio en

mayor profundidad, es su posible uso como biosensor, tomándolo como referencia para

25

sitios en los que a través de otras técnicas se ha abordados el problema (Rahman, y

otros, 2003; Cameotra, y otros, 2008; Beal, y otros, 2000; Pornsunthorntawee, y otros,

2008).

En este ámbito, la biodegradación de hidrocarburos del petróleo en ambientes acuáticos

es un tema en el cual falta por hacer y se debe prestar especial atención ya que nuestro

país presenta un problema serio que ha sido relegado, pero que afecta directamente a la

población y a la fauna y flora: el agua es un recurso primario, indispensable para la

conservación de la vida (Colwell, y otros, 1977). No hay vida sin agua.

Los procesos biológicos utilizan microorganismos, entre los que destacan las bacterias,

para llevar a cabo la eliminación de componentes indeseables del agua, aprovechando la

actividad metabólica de los mismos sobre esos componentes proteínicos denominados

enzimas. También se llevan a cabo una serie de reacciones bioquímicas mediante las

cuales los microorganismos utilizan la materia orgánica presente en el agua, la

sintetizan y la aprovechan para proveerse de energía mediante su síntesis (Rodríguez

Fernández Alba, y otros, 2006).

El tratamiento biológico resulta ser un proceso eficiente en la depuración de aguas

residuales que contienen compuestos orgánicos peligrosos (Brenner, y otros, 1992;

Yoong, y otros, 2001). Si bien los compuestos tóxicos como el fenol, hidrocarburos

aromáticos o determinados compuestos xenobióticos contribuyen con la inestabilidad de

los sistemas de tratamientos biológicos de aguas residuales, estos compuestos también

son usados como fuentes de carbono y energía por ciertos grupos de microorganismos

(Yoong, y otros, 2001; Rozich, 1983).

Los sistemas biológicos no sólo son capaces de destoxificar estos residuos, sino también

de completar la oxidación de la materia orgánica tóxica a productos finales simples

como CO2, H2O, NH3, CH4 y biomasa. En la figura 3.3 se esquematiza el proceso

dentro de una bacteria aerobia.

26

Figura 0.4 Esquema que muestra la principal ruta de degradación de

hidrocarburos en microorganismos aerobios.

Fuente: (Chandran, 2010)

Los microorganismos aerobios realizan la oxidación de los contaminantes, sin embargo,

para entender y aplicar eficientemente su función, es necesario considerar sus

limitaciones, algunas de ellas pueden ser la baja disponibilidad en nutrientes, en el

mismo contaminante, en el oxígeno disuelto (si los microorganismos son aerobios); se

requiere una adecuada relación carbono: nitrógeno: fósforo (C:N:P), y tomar en cuenta

el porcentaje de mortandad en relación a la concentración y grado de toxicidad de

ciertas sustancias; además de considerar ciertos parámetros de diseño del sistema de

tratamiento como por ejemplo el tiempo de retención hidráulico y el tiempo de

retención celular.

En México, el conocimiento de esta tecnología de tratamiento es escasa y se deben

establecer líneas de investigación con el propósito de estudiar procesos de vanguardia

en el área que ayuden a resolver los problemas que se producen en los efluentes

industriales debido a productos que no son fácilmente degradables, tales como los

compuestos característicos presentes en un agua residual de refinería que, requieren de

la manipulación de microorganismos especializados para su biodegradación.

27

3.2. Microorganismos utilizados en la biorremediación

La población microbiana es el factor determinante para que ocurra el proceso de

biodegradación. Se necesita una población microbiana adaptada, que posea las enzimas

necesarias que catalicen las reacciones de degradación. Los microorganismos pueden

degradar los contaminantes en forma de cultivos puros, mixtos o consorcios que

siempre es más eficiente que el cultivo puro. En los consorcios se establece una

completa interacción de las especies microbianas.

Los microorganismos se caracterizan por su increíble versatilidad metabólica y

fisiológica que les permite habitar en nichos ecológicos. Las especies como

Pseudomonas, Micrococos, Nocardia; Bacillus, Corynebacterium, Rhodococcus,

Arthrobacter, Corynebacterium, Flavobacterium Cladosporium, Fusarium y muchos

otros ampliamente distribuidos en suelos, lodos, alcantarillados y agua, han sido

reportados como degradadores de compuestos orgánicos por una serie de pasos

incluyendo transferencia de masas, adsorción y reacciones bioquímicas enzimáticas

permitiendo su crecimiento (Pandya, 2007).

Las bacterias son organismos procariotas unicelulares. Su modo habitual de

reproducción es por escisión binaria, aunque algunas especies se reproducen

sexualmente o por geminación. Si bien existen miles de especies diferentes de bacterias,

su forma general encaja dentro de alguna de las 3 siguientes categorías: esféricas,

cilíndricas y helicoidales. El tamaño de las bacterias es muy variable. Los tamaños

representativos son de 0.5 y 1 micra de anchura por 6 a 15 micras de longitud en el caso

de bacterias helicoidales (espirales).

Las bacterias del género Pseudomonas poseen la habilidad para utilizar diversos

substratos, incluyendo aquellos creados por el petróleo. Las Pseudomonas son bacterias

Gram negativas, que pertenecen a la subclase gamma de las Proteobacterias. Las

bacterias del género Pseudomonas poseen la habilidad de utilizar diversos substratos,

incluyendo aquellos creados por el petróleo.

Las Pseudomonas son ubicuas, de gran importancia ambiental, usando técnicas de

cultivo tradicionales se han realizado estudios sobre esta especie (Amann, y otros, 1995;

28

Moore, y otros, 2006). Otros estudios (Duineveld, y otros, 2001; Kaplan, y otros, 2004;

Gerdes, y otros; Popp, y otros, 2006; Ferguson, y otros, 2007), muestran que las

Pseudomomas pueden ser definidas como un miembro predominante en comunidades

de ecosistemas aeróbicos donde están presentes altas concentraciones de petróleo crudo

que actúa como un selector fuerte.

Las comunidades de bacterias predominantemente compuestas de Pseudomonas,

Sphingomonas, y Acidobacteria han sido reportadas por ejemplo en ecosistemas de

suelo-agua subterránea con contaminación de petróleo (Popp, y otros, 2006). La

predominancia de las bacterias Gram-negativas está en su capacidad de resistir a

concentraciones de solventes y en suelos contaminados y en una diversidad de muestras

donde el tratamiento es aplicado.

Algunas de las características de las bacterias del género Pseudomonas se mencionan a

continuación:

3.2.1. Pseudomona aeruginosa.

La Pseudomonas aeruginosa, es un microorganismo usado en biorremediación, presenta

una serie de actividades naturales sobre xenobióticos. Lamentablemente, también es

conocida por ser un patógeno oportunista en humanos y causante de complicaciones

graves en personas inmunosuprimidas, con quemaduras severas o con fibrosis quística.

En la figura 3.4 se muestra una micrografía de la bacteria.

Figura 0.5 Micrografia de Pseudomona aeruginosa obtenida con microscopio de barrido.

Fuente: (Improving Disease Treatment Through Genome Research, 2011)

29

Estudios con relación al desempeño metabólico de la Pseudomonas aeruginosa han

permitido identificarla como degradadora de gran cantidad de sustratos como el n-

hexadecano, mineralización de compuestos alifáticos en condiciones anaerobias, y

degradadora de hidrocarburos aromáticos y poli aromáticos, así como del pireno en

estudios in vitro.

La Pseudomona aeruginosa, es un microorganismo usado y estudiado en

biorremediación y presenta una serie de actividades naturales sobre xenobióticos. Tiene

la capacidad de sintetizar ramnolipidos cuando se encuentra en la fase estacionaria de su

crecimiento, por tal razón esto sólo se puede realizar en la primera fase del proceso de

biorremediación, contribuyendo así con la movilización y solubilización de los

contaminantes durante la fase siguiente de mineralización.

Estudios con relación al desempeño metabólico de la Pseudomonas aeruginosa ha

permitido identificarla como degradadora de gran cantidad de sustratos como el n

hexadecano, mineralización de compuestos alifáticos en condiciones anaerobias, y

degradadora de hidrocarburos aromáticos y poli aromáticos, así como del pireno en

estudios in vitro.

3.2.2. Pseudomona putida

La Pseudomona putida es un saprofito del suelo, oportunista, cosmopolita,

metabólicamente versátil, por poseer una dioxigenasa inicial, aunque no presenta la

dioxigenasa específica para los PAHs por lo cual es una buena candidata para las

aplicaciones biotecnológicas, tales como agricultura, biocatálisis, biorremediación,

biocontrol en protección de las plantas y producción de bioplásticos. En la figura 3.5 se

muestra una micrografía de esta especie.

La P. putida posee la capacidad de colonizar la rizosfera de plantas de cosecha y una

gran capacidad metabólica que facilita el desarrollo de biopesticidas y promotores de

crecimiento de la planta.

30

Figura 0.6 Micrografia de Pseudomona putida obtenida con microscopio de barrido.

Fuente: (Ceprio, 2011)

La degradación de los alcanos por Pseudomona putida se ha estudiado por

secuenciación en el plasmido OCT que codifica una enzima dioxigenasa que convierte

alcanos a aldehídos a través del hidroperoxidasa del n-alkyl sin un intermediario del

alcohol, conocido como la vía de Finnerty; un proceso similar lo presentan los géneros

Acinetobacter sp. y Nocardiodes sp. aunque ellos no poseen este plasmido.

3.2.3. Pseudomona fluorescens

Es un bacilo Gram-negativo, recto o ligeramente curvado pero no vibrioide, es saprófito

(todo lo que ingiere pasa a través de la pared de su citoplasma). Se puede encontrar en

suelo y agua. Es incapaz de formar esporas y crece aeróbicamente. La temperatura

óptima para su funcionamiento es de 25-30 ºC, aunque puede crecer desde los 5 hasta

los 42 ºC aproximadamente. No crece bajo condiciones ácidas (pH 4.5) y necesita

preferentemente pH neutro. Tiene movimiento activo en líquido por sus flagelos polares

(más de 1). Su pigmento fluorescente (fluoresceína) la hace reaccionar frente a la luz

ultravioleta, aunque recién cultivada o después de varios cultivos de laboratorio, puede

ser que no reaccione (Hermoso, 2008). En la figura 3.6 se muestra una micrografía de

este microorganismo.

31

Figura 0.7 Micrografia de Pseudomona fluorescens obtenida con microscopio de barrido.

Fuente: (Matt, 2009)

La Pseudomona fluorescens es degradadora de naftaleno y fenantreno, ventaja que tiene

frente a las otras Pseudomonas, que solo metabolizan naftaleno y asfaltenos.

3.2.4. Acinetobacter calcoaceticus

Acinetobacter calcoaceticus es un bacilo Gram negativo, es productor de ácido a partir

de la glucosa, se desarrolla a 41 y 44 ºC, produce a-xilosa y utiliza el malato. En la

figura 3.7 se muestra una micrografía de esta bacteria.

Figura 0.8 Micrografia de Acinetobacter calcoaceticus obtenida con microscopio de barrido.

Fuente: (Microbe Wiki, 2010)

32

En los lodos activos se encuentran diversos organismos vivos. Dentro de los géneros

bacterianos destacan: Spirillum (bacterias móviles helicoidales con forma de bacilos

largos y espiralados), Vitreoscilla (bacterias gram-negativas, aeróbicas o

microaerofilicas, que no tienen color y son filamentosas; producen hemoglobina

bacteriana homodimerica, especialmente bajo condiciones de crecimiento con

limitación de oxigeno), Sphaerotilus (bacteria filamentosa forrada que exhibe una

"falsa" ramificación), Beggiatoa (bacteria filamentosa del sulfuro constituida por

filamentos rectos).

Además de bacterias, existen en los lodos activos, un gran número de especies de

protozoos como flagelos, ciliados y amibas. Los protozoos son organismos de una

célula que puede nutrirse de materia orgánica y bacterias. Nematodos o rotíferos se

clasifican entre los organismos multicelulares.

Normalmente, un lodo activo en un sistema estable presenta estas 3 características:

La población de protozoos se presenta en una densidad superior a 106

individuos L-1

La microfauna se compone principalmente de ciliados reptantes y sésiles,

sin apenas presencia de flagelados;

Las especies y grupos de ciliados están muy diversificadas, de manera

que ningún grupo supera numéricamente a otro con un factor superior a

10.

En el caso de que estas premisas no se cumplan, la identificación del grupo dominante

permitirá obtener información sobre la situación particular del sistema, como se muestra

en la tabla 3.1. Así se puede determinar el estado del sistema con la simple observación

microscópica.

Los protozoos son protistas móviles microscópicos y, por lo general, unicelulares. La

mayoría de los protozoos son heterótrofos aerobios, aunque algunos son anaerobios. Los

protozoos sueles ser mayores que las bacterias, y se suelen alimentar de ellas para la

obtención de energía. De hecho, al consumir bacterias y materia orgánica, los protozoos

33

actúan como purificadores de los efluentes de procesos biológicos de tratamiento de

aguas residuales.

Los protozoos tienen importancia en las cadenas alimentarias como componentes del

plancton. Son considerados como bioindicadores en el proceso de tratamiento de aguas

residuales. Según la forma como se desplazan los protozoos se clasifican en: sacordinos,

ciliados, flagelados y esporozoos.

Los protozoos secretan una capa protectora gruesa que rodea su cuerpo y cesan toda

actividad. Es decir, quedan en estado latente a la espera de la llegada de condiciones

ambientales favorables que les permitan reanudar su actividad. Hay variabilidad

interespecífica (entre especies) en la resistencia de los quistes: resistencia a la

desecación y/o resistencia a las bajas temperaturas.

El rotífero es un animal aerobio, heterótrofo y multicelular. Su nombre procede del

hecho de que disponen de 2 juegos de pestañas giratorias sobre la cabeza, que emplean

para la captura de alimentos y para moverse. Los rotíferos son muy eficaces en la

eliminación de bacterias dispersas y floculadas, así como de pequeñas partículas de

materia orgánica. Su presencia en un efluente indica un proceso aerobio de purificación

biológica muy eficiente (Metcalf, 2004). En la figura 3.8 se muestra una figura de un

rotífero.

Figura 0.9 Micrografía de rotífero obtenida con microscopio óptico.

Fuente: (Wikipedia, 2009)

34

Los ciliados desplazan y capturan el alimento por medio de cilios, filamentos cortos,

vibrátiles y numerosos que rodean su cuerpo. Se caracterizan por ser los únicos

organismos con dos núcleos uno para la reproducción y otro relacionado con la

alimentación.

Cada organismo existente cumple una función fundamental, la de los organismos

ciliados (depredadores en su mayoría), es variada. Estos organismos favorecen la

depuración de efluentes, además, de la reducción de bacterias patógenas.

Tabla 0.6 Estado del nivel de depuración atendiendo a la observación microbiología.

GRUPO DOMINANTE NIVEL DE

DEPURACIÓN POSIBLES CAUSAS

Pequeños flagelados Bajo Oxigenación insuficiente, sobrecarga orgánica, sustancias en

fermentación

Pequeños nadadores (ciliados) Mediocre Lodo con aireación insuficiente

Grandes nadadores (ciliados) Mediocre Sobrecarga orgánica; lodo pobremente aireado

Ciliados reptantes Bueno -

Ciliados sésiles y reptantes Bueno -

Ciliados sésiles En descenso Transitoriedad en la carga orgánica, extracción de lodos reciente,

etc

Amebas desnudas y flagelados Pobre Carga orgánica muy alta poco degradable

Amebas testáceas Bueno -

Las principales interacciones que ocurren entre las diversas especies microbianas son:

1) Competición, que se refiere, como el nombre lo indica, a una competencia en el uso

de un determinado nutriente;

2) Predación, que ocurre cuando un organismo se alimenta de otro, cuando uno ingiere a

otro como sucede en el caso de una ameba o un protozoario que ingiere a células de

levaduras o de algas;

3) Parasitismo, cuando uno se aprovecha o vive a expensas de otro que generalmente

muere;

4) Comensalismo, cuando dos organismos viven simultáneamente sin beneficiarse ni

molestarse;

5) Mutualismo, cuando dos organismos se benefician mutuamente;

35

6) Amensalismo, que se refiere al caso de la excreción de un factor, por parte de un

organismo, que es dañino para el otro, como es el caso de la formación de un antibiótico

por un hongo que inhibe el desarrollo de una bacteria.

Métodos de cultivos básicos y métodos de cultivo independiente están siendo

desarrollados e implementados para mejorar el entendimiento acerca de estas

comunidades microbianas. La separación e identificación de microorganismos

responsables de las transformaciones de los hidrocarburos han sido ampliamente

reconocidas.

La lista de degradación de hidrocarburos por organismos (bacterias, levaduras, hongos y

algas) están disponibles bibliográficamente (Atlas, y otros, 1995; Atlas, y otros, 1981;

Leahy, y otros, 1990; Rosenberg, 2013; Magot, y otros, 2000), los cuales son

microorganismos de los depósitos de petróleo, incluyendo bacterias mesofílicas y

bacterias sulfatoreductoras, metanogénicas, bacterias termofílicas fermentativas, y

bacterias reductoras del hierro (Vieira, y otros, 2009).

3.3. Crecimiento bacteriano

En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro

fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano (Granados

Pérez, y otros, 1997), como se muestra en la figura 3.9:

Fase de latencia en la que no hay aumento de población;

Fase logarítmica o exponencial en la que las células se duplican al mismo ritmo;

Fase de crecimiento estacionaria en la que se van agotando los nutrientes y acumulando

productos tóxico;

Fase de muerte o lisis en la que mueren más células que las que se producen. La tasa de

muerte se acelera, haciéndose exponencial.

36

Figura 0.10 Curva típica de crecimiento para un sistema cerrado.

El crecimiento microbiano es el aumento del número de microorganismos a lo largo del

tiempo. Las poblaciones de bacterias crecen de forma exponencial acumulando grandes

números en un periodo de tiempo reducido.

Puesto que el efecto de los microorganismos en la mayoría de los casos depende de su

número, entender cómo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder

reducir sus efectos nocivos y en este caso potenciar los beneficios o aplicaciones. Se

requiere conocer el comportamiento en el crecimiento de bacterias incubadas en el

biorreactor.

3.4. Factores que afectan el crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano llevado a cabo tanto en un biorreactor como en un reactor

biológico (de lodos activados, de lecho fluidificado, por mencionar algunos) es

influenciado por una variedad de factores nutricionales y factores físicos. Los factores

físicos incluyen la temperatura, el pH y el oxígeno disuelto.

La importancia de establecer valores de cada uno de los factores físicos en un

biorreactor o bien en un reactor biológico se mencionan a continuación:

3.4.1. Temperatura

La temperatura a la que opera un reactor influye de manera importante en la actividad

de la biomasa, dado que las reacciones bioquímicas son directamente afectadas por este

37

parámetro. La temperatura no sólo influye en las actividades metabólicas de los

microorganismos, sino también tiene un efecto sobre la velocidad de transferencia de

gases y las características de sedimentación de los sólidos biológicos.

La temperatura ejerce dos efectos importantes sobre la población bacteriana: (1) afecta

en la velocidad de difusión del sustrato y nutrientes dentro de la célula bacteriana y (2)

afecta en la velocidad de la actividad enzimática. Con el incremento de la temperatura,

la velocidad de difusión del sustrato y de los nutrientes dentro de la célula bacteriana se

incrementa, y la velocidad de la actividad enzimática incrementa. La velocidad de

difusión y la actividad enzimática decrece cuando la temperatura disminuye.

Entonces el incremento de la actividad bacteriana se realiza manteniendo una

temperatura cálida, un operador en una planta de tratamiento de aguas residuales puede

reducir los sólidos (bacterias) y mantener aún un tratamiento aceptable en el agua

residual. Sin embargo, con la disminución de la actividad bacteriana mediante una

disminución de la temperatura en el agua residual, un operador en una planta de

tratamiento de aguas residuales puede necesitar incrementar la concentración de sólidos

con el fin de mantener aceptable el tratamiento del agua residual (Gerardi, 2006).

Así que el impacto de la temperatura sobre la actividad bacteriana es importante. Por

cada 10 ºC de incremento en la temperatura, la actividad enzimática se duplica. Sin

embargo, por encima de una cierta temperatura algunas proteínas particulares pueden

sufrir daños irreversibles. En consecuencia, dentro de un cierto margen, un aumento de

temperatura supone un incremento en el crecimiento y en el metabolismo hasta un punto

en que tienen lugar las reacciones de inactivación. Por encima de tal punto, las

reacciones celulares caen rápidamente a cero. Así, para cada organismo existe una

temperatura mínima por debajo de la cual no es posible el crecimiento, una óptima a la

que se produce el crecimiento más rápido, y una temperatura máxima por encima de la

cual no es posible el crecimiento (Madigan, 2004).

Aunque existe todo un espectro continuo entre los microorganismos, desde los que

tienen su temperatura óptima a temperaturas muy bajas hasta los que la tienen muy alta,

se pueden distinguir cuatro grupos de microorganismos con relación a su temperatura

óptima: psicrófilos, con temperatura óptimas bajas; mesófilos, con temperaturas óptimas

38

moderadas; termófilos, con altas temperaturas óptimas; e hipertermófilos, con

temperaturas óptimas muy elevadas, como se muestra en la figura 3.10.

Figura 0.11 Relación entre la temperatura y las velocidades de crecimiento de psicrófilos, mesófilos,

termófilos y dos hipertermófilos diferentes.

Fuente: (Madigan, 2004)

3.4.2. Influencia del pH

Para la mayoría de las bacterias el pH óptimo de crecimiento usualmente está cercano al

neutro (entre 6.8 y 7.2), y no pueden tolerar niveles de pH por arriba de 9.5 o por debajo

de 4.0. El pH puede afectar en el grado de toxicidad del contaminante, pues a un pH

determinado las moléculas pueden estar ionizadas y ser menos tóxicas para el

microorganismo que la molécula sin ionizar.

3.4.3. Oxígeno disuelto

Las bacterias crecen en presencia o ausencia de oxígeno molecular y son clasificadas en

tres grandes grupos de acuerdo a sus necesidades del oxígeno molecular. Estos grupos

son las aerobias, las anaerobias y las anaerobias facultativas. Las primeras requieren

oxígeno para degradar el sustrato. Las bacterias anaerobias no usan el oxígeno

molecular para degradarlo.

Entre las bacterias aerobias y anaerobias están las bacterias anaerobias facultativas. El

término facultativo implica la habilidad de vivir bajo diferentes condiciones. Este tipo

de bacterias tiene la habilidad de usar el oxígeno molecular u otra molécula para

degradar el sustrato cuando el oxígeno no se encuentra disponible. Estas bacterias

39

prefieren el oxígeno a otro tipo de moléculas tales como NO3- para degradar el sustrato.

Las bacterias desnitrificantes, Bacillus, Escherichia, y Pseudomonas son ejemplo de

bacterias anaerobias facultativas (Gerardi, 2006). El factor nutricional microbiano se

refiere a la relación carbono: nitrógeno : fósforo (C:N:P).

3.4.4. Relación C:N:P

Las bacterias son tal vez los más diversos y versátiles organismos en cuanto a sus

requerimientos nutricionales. Existen considerables variaciones en sus requerimientos

específicos para su crecimiento. Las bacterias son aproximadamente el 80 % de agua y

el 20 % de material seco, de éste, aproximadamente el 90 % es orgánico y el 10 % es

inorgánico (tabla 3.2). Una fórmula orgánica simple que representa una célula

bacteriana es C5H7O2N . La mayoría de los elementos (macroelementos) en la

composición de la célula bacteriana incluyen C, H, N, O, P y S. Los elementos tales

como Ca, Fe, K, Mg y Na (microelementos) son requeridos en cantidades pequeñas para

las bacterias, y los elementos traza incluyen Co, Mn, Mo, Ni, y Zn son requeridos en

una cantidad relativamente pequeña. La adición de nutrientes a un tratamiento biológico

de aguas residuales industriales puede ser requerido para lograr la degradación de la

materia orgánica. En la tabla 3.2 se muestra la composición de una célula bacteriana.

Tabla 0.7 Composición de una célula bacteriana.

ELEMENTO COMPOSICIÓN

PROMEDIO

RANGO EN

COMPOSICIÓN

Carbón 50 45 – 55

Oxígeno 20 16 – 22

Nitrógeno 14 12 – 16

Hidrógeno 8 7 – 10

Fósforo 3 2 – 5

Azufre 1 0.8 – 1.5

Potasio 1

Sodio 1

Calcio 0.5

Cloro 0.5

Magnesio 0.5

Hierro 0.2

Elementos

traza

0.1

Donde ª Los rangos de los elementos son dados sólo para los macroelementos.

Fuente : (Gerardi, 2006)

40

La relación de C:N:P ha sido discutida en la literatura (Pinto Mariano, y otros, 2007;

Lee, y otros, 2007; Ferguson, y otros, 2003; Madigan, y otros, 2004; Strynar, y otros,

1999) asumiendo cada sistema con relaciones óptimas de C:N:P en función del tipo de

efluente que se trate, la concentración del carbón y de su disponibilidad y de la

habilidad de cada microorganismo para degradar los contaminantes.

3.5. Adaptación de los microorganismos

Cuando se trata de aguas residuales industriales, particularmente para la remoción de

compuestos orgánicos específicos, es necesario aclimatar la biomasa al agua residual.

La adaptación o aclimatación de una comunidad microbiana a un contaminante dado,

determina la rapidez con la que el compuesto puede ser transformado y/o mineralizado.

Esta adaptación puede ocurrir por 3 mecanismos: a) inducción o depresión de enzimas

específicas, b) cambios genéticos que deriven en nuevas capacidades metabólicas y c)

enriquecimiento selectivo de microorganismos capaces de transformar un compuesto de

interés.

El periodo de aclimatación se define como la duración de tiempo entre la adición de un

compuesto en un ambiente y una evidencia de su pérdida detectable. La aclimatación de

los microorganismos a los compuestos orgánicos es una fase importante en el proceso

de biodegradación, especialmente para los compuestos difíciles de biodegradar. Su

duración cuando los cultivos mixtos son expuestos a compuestos químicos nuevos e

inusuales, varía desde unas pocas horas hasta varias semanas o meses. La duración

depende del tipo de compuesto y un número de condiciones ambientales (Prieto Díaz, y

otros, 1999). La fase de aclimatación se considera que termina con el inicio del periodo

de la biodegradación. Muchos estudios realizados con compuestos tóxicos muestran que

incluso después de una extensa adaptación microbiana celular exhiben cinéticas de

crecimiento inhibitorias (Rozich, 1983; Rozich, y otros, 1986; D'Adamo, y otros, 1984).

3.6. Biodegradación de MTBE

Se ha reportado la biodegradación de MTBE por microorganismos de diferentes

orígenes (Bradley, y otros, 1999; Bradley, y otros, 2001; Fortin, y otros, 2001; Kane, y

otros, 2001; Landmeyer, y otros, 2001; Park, y otros, 1997; Salanitro, y otros, 1994). La

41

degradación aeróbica de MTBE ha sido observada en laboratorios con consorcios

microbianos (Fortin, y otros, 2001) y con cultivos puros (Hatzinger, y otros, 2001;

Francois, y otros, 2002). Durante el crecimiento con MTBE, algunos intermediarios de

la vía de degradación fueron detectados, ter-butil formiato (TBF), ter-butil alcohol

(TBA) 2-hidroxiácido butírico (HIBA) y acetona, como se muestra en la figura 3.11.

Varias actividades enzimáticas envuelven la vía de degradación del MTBE y fueron

estudiadas a nivel fisiológico: una MTBE/TBA monooxigenasa (Francois, y otros,

2002), una TBF esterasa y una acetona monooxigenasa (Francois, y otros, 2003).

Figura 0.12 Ruta metabólica propuesta para biodegradación aeróbica de MTBE

Fuente: (Francois, y otros, 2002).

42

La molécula de MTBE se caracteriza por la presencia de un enlace éter y un alto

impedimento estérico del carbono del grupo ter-butil enlazado al grupo metoxi. Los

éteres alquílicos son moléculas estables (ΔG0 de la formación del enlace éter = 360

kJ/mol) (White, y otros, 1996). La recalcitrancia del MTBE se atribuye a su estructura

química, específicamente al enlace éter y al átomo de carbono terciario son los

responsables de la dificultad en la biodegradación (Ostler, 1996). De lo anterior se

infiere que hay una alta demanda de energía para la degradación de MTBE que se

refleja por la baja eficiencia de producción de biomasa.

3.7. Degradación de BTEX

La degradación del benceno es similar a la de otros aromáticos. El benceno es digerido

por las dioxigenasa que provocan la ruptura del núcleo por hidroxilación de manera que

la molécula sea químicamente más accesible. Estas reacciones se presentan en las

figuras 3.12, 3.13 y 3.14.

Figura 0.13 Biodegradación microbiana del benceno hasta catecol.

Fuente: (Rittman, 1994).

La oxidación de los hidrocarburos produce ácidos grasos que son utilizados por las

bacterias o liberados al medio. Si este es el caso, el pH del medio disminuye, por lo que

puede utilizarse este parámetro para evaluar la degradación.

43

Figura 0.14 Biodegradación microbiana del tolueno.


Figura 0.15 Biodegradación del xileno.


44

La biodegradación de aromáticos disustituidos, produce ácido acético como producto

adicional, por lo que el medio donde se encuentre presente un contaminante de este tipo

presentará una disminución significativa del pH.

El ácido pirúvico, por su parte, entra como iniciador del ciclo de Krebs en las bacterias

degradadoras, con ayuda de la acetil coenzima A (Lehninger: Nelson, y otros, 2000).

3.8. Cinética microbiana

La relación entre el crecimiento celular y la utilización del sustrato puede ilustrarse con

un reactor batch. Si Cs representa la cantidad de sustrato soluble (en mg/L) y Cc

representa la cantidad de biomasa (en mg/L), la rapidez de consumo de sustrato es

dCs/dt, y la rapidez de crecimiento de biomasa es dCc/dt, ambos fenómenos pueden

representarse con las curvas que se muestran en la figura 3.15.

Figura 0.16 Etapas del crecimiento bacteriano como biomasa y de utilización de sustrato,

en función del tiempo.

La curva de biomasa está formada por varios segmentos que justifican un examen

minucioso. Los microorganismos tienen que aclimatarse primero a su ambiente y al

alimento disponible. Este periodo de aclimatación es llamado fase de retardo, y varía en

extensión dependiendo de la historia de los microorganismos sembrados. Si los

microorganismos están adaptados a un ambiente y sustrato similares, la fase de retardo

será muy breve. Una vez que se ha iniciado el crecimiento, continuará rápidamente. Las

células bacterianas se reproducen por fisión binaria, esto es, se dividen en segmentos

para formar dos nuevas células independientes entre sí. El tiempo de regeneración, o

45

tiempo requerido para que una célula madure y se separe, puede ser tan corto como 20

minutos, y depende también de factores ambientales y del suministro de sustrato.

Cuando está ocurriendo el máximo crecimiento, el comportamiento es de tipo

logarítmico, razón por la cual se denomina a este segmento de la curva fase logarítmica.

La rapidez de reproducción es exponencial, de acuerdo con la siguiente ecuación:

Ecuación 0.1

Donde N es el número de microorganismos producidos a partir de uno individual

después de n veces de regeneración.

El crecimiento máximo no puede continuar indefinidamente. El alimento disponible

puede agotarse, las condiciones ambientales pueden cambiar (por ejemplo,

sobrepoblación, acumulación de productos de desecho, etc.), y puede desarrollarse una

población de depredadores. Las células que son incapaces de obtener alimento de

fuentes externas inician el catabolismo endógeno, es decir, catabolizan el protoplasma

almacenado para mantener su energía. Otras células mueren, o se rompen liberando su

protoplasma, el cual se agrega al alimento disponible. Esta etapa se representa en la

figura 3.15 con el nombre de fase estacionaria y representa el tiempo durante el cual la

producción de nuevo material celular es aproximadamente igualado por muerte y

respiración endógena.

Mientras que en la fase estacionaria todavía existe algo de reproducción, la respiración

endógena y la muerte predominan en el cuarto segmento de la curva, denominado fase

endógena. En esta última fase, la biomasa decrece lentamente, acercándose

asintóticamente al eje de las abscisas.

El método más común para la cuantificación de biomasa es la prueba de sólidos

suspendidos. Cuando el agua residual contiene solamente material orgánico, esta prueba

debe ser bastante representativa, aunque no hay distinción entre células vivas y muertas.

La prueba de sólidos suspendidos volátiles es una prueba más adecuada cuando la

muestra de agua residual contiene una fracción medible de materiales inorgánicos

suspendidos. Ninguna de las dos pruebas exhibe la diferencia entre sólidos biológicos y

partículas orgánicas originalmente presentes en el agua residual.

46

Durante la fase de crecimiento logarítmico, la biomasa se incrementa de acuerdo con la

siguiente expresión:

Ecuación 0.2

Donde

dCc/dt = rapidez de crecimiento de la biomasa, en mg/Lt-1

.

Cc = concentración de biomasa en mg/L.

µ = constante de rápidez de crecimiento, en t-1

.

3.8.1. Modelo matemático de Monod

Si en un cultivo uno de los requerimientos esenciales para el crecimiento (sustrato y

nutrientes), estuviera presente sólo en cantidades limitadas, se agotaría primero y el

crecimiento cesaría. El modelo matemático de Monod (Monod, 1949) asume que la

rapidez de asimilación del sustrato, y en consecuencia la rapidez de producción de

biomasa, está limitada por la rapidez de reacción de las enzimas involucradas en el

compuesto alimenticio que está en menor cantidad con respecto a sus necesidades. La

ecuación de Monod es:

Ecuación 0.3

Donde:

µmáx = constante de rapidez máxima de crecimiento; t -1

Cs = concentración en la solución del sustrato limitante del crecimiento, mg/l de DBO,

DQO o COT

Ks = constante media de saturación, esto es, la concentración del sustrato limitante.

La rapidez de crecimiento de biomasa es una función hiperbólica de la concentración de

alimento.

47

ESTADO DEL ARTE

El petróleo es una mezcla compleja de hidrocarburos y otros compuestos orgánicos,

incluidos algunos constituyentes organometálicos, destacando complejos de vanadio y

niquel. El petróleo es recuperado de diferentes reservorios variando ampliamente en

composición y propiedades físicas. Sin embargo, es ampliamente reconocido que sirve

de sustrato para el crecimiento microbiano (Bushnell, y otros, 1941; Rhykerd, y otros,

1999), generándose productos del metabolismo microbiano (Ehrlich, 1995).

Se ha hecho una amplia variedad de estudios acerca de la biotransformación,

biodegradación y biorremediación de hidrocarburos del petróleo (Atlas, y otros, 1995;

Atlas, y otros, 1992; Becker, 1997; McClay, y otros, 2000; Prince, 1997; Rosenberg,

1993) y el interés en explorar organismos degradadores para aplicación en la limpieza

medioambiental se ha tornado en el centro de la microbiología del petróleo (Atlas, y

otros, 1981). Un tema común en la literatura reciente se enfoca en el análisis de los

factores, tales como nutrientes, estado físico del hidrocarburo, oxígeno, temperatura,

salinidad y presión, que influencian la velocidad de biodegradación de los

hidrocarburos, con un enfoque a la aplicación medioambiental (Atlas, y otros, 1981).

Los estudios metabólicos se han implementado en vías de biodegradación aerobias para

los alcanos, cicloalcanos e hidrocarburos aromáticos y policíclicos (Cerniglia, 1997;

Cerniglia, 1992; Juhasz, y otros, 2000; Kämpfer, y otros, 1993; Perry, 1984; Smith,

1990; Sutherland, 1992; Watkinson, y otros, 1990).

Los avances más significativos, a través del desarrollo y aplicación de técnicas

moleculares, son la comprensión del proceso de catabolismo de los hidrocarburos. Este

enfoque molecular ha contribuido a la caracterización en detalle de la estructura de la

membrana bacteriana (de Bont, 1998; Heipieper, y otros, 1994; Sikkema, y otros, 1995).

El aislamiento e identificación de microorganismos responsables de transformación de

hidrocarburos ha sido reconocido como un principio fundamental para su aplicación y

en la literatura están disponibles listas de organismos degradadores de hidrocarburos

(bacterias, levaduras, hongos y algas) (Atlas, y otros, 1981; Atlas, y otros, 1995; Leahy,

y otros, 1990; Rosenberg, 1992).

48

Una aplicación común de la microbiología del petróleo, abarca la remediación de

derrames de hidrocarburo (Prince, 1997; Prince, y otros, 1999; Swannell, y otros, 1999),

el tratamiento basado en humedales y fermentación (Geerdink, y otros, 1996; Jack, y

otros, 1994; Knight, y otros, 1999; Roy, y otros, 2000; Simon, y otros, 1999),

biofiltración de hidrocarburos volátiles (Ergas, y otros, 1999), recuperación mejorada de

petróleo con microorganismos (Banat, y otros, 2000; Donaldson, y otros, 1989) y

evaluación basada en comunidades microbianas (MacNaughton, y otros, 1999).

El tratamiento de derrames en costas y problemas asociados en remediación mar abierto

ha sido discutido en numerosos casos (Atlas, y otros, 1992; Atlas, y otros, 1995; Bartha,

1986; Prince, 1993; Swannell, y otros, 1996). Otra aplicación práctica incluye el

tratamiento de residuos de refinería (Atlas, y otros, 1992; Bartha, 1986).

La recuperación de hidrocarburos pesados, facilitada por microorganismos, fue sugerida

en la de cada de los 20’s y retomada en los 80’s (Donaldson, y otros, 1989).

Las bacterias con enzimas capaces de metabolizar petróleo se han utilizado para el

desarrollo de biosensores (Daunert, y otros, 2000). Estos sistemas se han aplicado en el

monitoreo ambiental de concentración y toxicidad de contaminantes durante la

implementación de procesos de remediación.

La caracterización del tipo de hidrocarburo presente en un recurso acuífero ha sido

abordado por diversos autores. Prieto Díaz y col. propusieron una metodología sencilla,

asequible y rápida para identificar el tipo de hidrocarburo presente en agua contaminada

realizando una extracción con CCl4, eliminando húmedad, rotoevaporando hasta

sequedad, para luego solubilizar en hexano el soluto obtenido, de esta forma a través de

espectroscopia de UV-vis se realiza la discriminación del tipo de contaminante (Prieto

Díaz, y otros, 1999).

Huang y col. realizaron un estudio sobre la degradación de ácidos nafténicos, en un

reactor batch y en un reactor continuo, utilizando un consorcio bacteriano desarrollado

en laboratorio, obteniendo una velocidad de degradación de 209 mg/Lh con un tiempo

de residencia de 0.15h (Huang, y otros, 2011).

49

Takahata y col. estudiaron la biodegradación por atenuación natural de agua subterránea

contaminada con benceno, tolueno y xilenos, tratado con bombeo y aireación, durante

un período de 73 semanas; obteniendo a través de reacción en cadena de la polimerasa

(PCR, por sus siglas en inglés) la identificación de los microorganismos nativos

(Takahata, y otros, 2006).

Luo y col. produjeron un consorcio microbiano a través del enriquecimiento de

muestras de agua de mar del puerto de Xiamen, China, contaminadas con una mezcla

de hidrocarburos policíclicos aromaticos. Lograron identificar y aislar 3 diferentes tipos

de bacterias pertencientes a los géneros Ochrobactrum, Stenotrophomona y

Pseudomona. Después probaron el consorcio utilizando como sustrato modelo

benzo(a)pireno, obteniendo una eficienca de degradación del 44.07% (Luo, y otros,

2009).

Auffret y col. evaluaron la capacidad degradadora de un consorcio bacteriano del

género Rhodococcus sobre una mezcla de hidrocarburos, gasolina y diesel, obteniendo

eficiencias de 43 y 73% (Auffret, y otros, 2009).

González y col. estudiaron el efecto de surfactantes sobre el crecimiento y la

velocidad de degradación microbiano sobre un hidrocarburo policíclico aromático, de

un consorcio obtenido de una muestra de suelo contaminado con petróleo. Obuvieron

eficiencias cercanas al 30% de disminución de la toxicidad (González, y otros, 2011).

Pactao y col. evaluaron dos consorcios microbianos para degradar una mezcla de

hidrocarbuos aromáticos y alifáticos. La evaluación fue realizada en condiciones

aerobias utilizando como sustratos modelo de alifáticos n-octano y n-decano y como

sustratos modelos de aromaticos tolueno, etilbenceno y p-xileno. Las eficiencias de

degradación para alifáticos fue de 17% y para arómaticos de 38% en un período de 72

horas de tratamiento (Pactao Bacosa, y otros, 2011).

Ma y col. analizaron la evolución de la calidad del agua contaminada por petróleo en el

río Malian, en China, durante 20 años (Ma, y otros, 2011).

Lizardi y col. evaluaron la velocidad de transferencia de hexadecano y de oxígeno

simultáneamente en un biorreactor utilizando un consorcio bacteriano con capacidad de

50

degradar hidrocarburos. Lograron una reducción del 33% en el consumo de energía

neta durante 7 días de tratamiento (Lizardi-Jiménez, y otros, 2012).

51

CAPITULO IV. METODOLOGÍA

La problemática actual en el país referente a la contaminación de aguas con

hidrocarburos a generado el desarrollo de tecnologías que eliminen efectivamente la

concentración de hidrocarburos en el agua subterránea. Este problema se agrava con el

paso de los años debido a la enorme cantidad de franquicias petroleras que instalan

gasolineras en suelos no aptos para estos propósitos, por un lado y a la falta de una

normatividad más severa para regular la forma en que se deben construir.

Además de los predios sobre los que se ubican refinerías las cuales a falta de

mantenimiento o a las condiciones del equipo generan contaminación sobre el suelo y el

agua debido a fugas y derrames. Sin embargo, es evidente por trabajos previos que

existe flora nativo en el subsuelo que es capaz de efectuar la degradación de estos

contaminantes; por tanto, tomando en cuenta estos hechos, se pretende desarrollar un

proceso en el cual, propiciando las condiciones de desarrollo óptimo de dicha flora

nativa, se puede conseguir una limpieza efectiva y al mismo tiempo degradar los

hidrocarburos presentes en estas aguas.

Desarrollar un proceso bioquímico que elimine y degrade hidrocarburos de fracción

media de aguas subterráneas contaminadas en un biorreactor que sea capaz de efectuar

la degradación de compuestos del petróleo.

Mediante un sistema de aireación, acoplado con un tratamiento biológico (biorreactor)

para lograr la eliminación y degradación de los componentes de diesel y del petróleo

que contamine aguas subterráneas.

Establecer una cinética de biodegradación de estos componentes durante el proceso.

El trabajo experimental se dividió en dos etapas, la primera fue la adaptación del

consorcio bacteriano y la segunda la biodegradación del sustrato en medio acuoso. En la

Figura 0.17 se muestran dichas etapas. Se utilizó una muestra de agua contaminada

obtenida de un predio contaminado (a la cual se le denomino muestra de agua real) y

dos muestras de agua que fueron contaminadas con diesel y petróleo (a las cuales se les

denomino sintéticas).

52

Figura 0.17 Etapas consideradas durante el trabajo experimental.

4.1. Adaptación del consorcio

Es indispensable, para el crecimiento de un microorganismo, que en el medio existan

los nutrientes necesarios para su desarrollo. Estos nutrientes no solo abarcan sustratos

orgánicos, sino también sales inorgánicas, así como condiciones adecuadas de

temperatura, pH y oxígeno. Considerando lo anterior, se preparó una solución de sales

minerales denominada medio mínimo. En la figura 4.2 se muestra el procedimiento para

la preparación de dicha solución.

Figura 0.18 Preparación del medio mínimo o solución de sales minerales.

ETAPAS DE EXPERIMENTACIÓN

ADAPTACIÓN DEL CONSORCIO

Conformación de consorcio

Selección de sustrato (muestras sintéticas)

Caracterización del agua

BIODEGRADACIÓN

Caracteristicas de l biorreactor

Condiciones de operación

Técnicas analiticas e intrumentales de

seguimeinto

Agua destilada

Sales minerales escenciales

Ajuste de pH a 7.2

Solución de sales minerales

NaCl

CaCl2

FeCl2

NH4Cl

MgCl

KH2PO4

Elementos traza

53

La formulación del medio mínimo se muestra en la tabla 4.1. Una vez preparado el

medio, se ajusta a pH de 7.2 mediante la adición de HCl 0.01N, dentro del rango óptimo

para el desarrollo del consorcio bacteriano, el cual va de 6.5 a 7.5 (Borkowski, y otros,

2009). Posteriormente se esterilizó en autoclave a 121º C, a una presión de 15 kg/cm2

por 15 minutos.

Tabla 0.8 Composición del medio mínimo o solución de sales minerales utilizada.

Medio mínimo Solución de elementos traza

FeCl2 0.1%...........................1.2 mL

KH2PO4 …………………0.5 g

MgCl …………………….0.4 g

NaCl ……………………..0.4 g

NH4Cl …………………....0.4 g

CaCl2 …………………….0.05 g

Solución elementos traza …1.0 mL

Agua destilada …………..1000 mL

ZnSO4………………... 10 mg

MnCl2 ………………… 3.0 mg

H3BO4………………… 30 mg

CoCl2 ............................. 20 mg

CuCl2 …………………. 1.0 mg

NiCl2 ………………….. 2.0 mg

Na2MoO4……………… 3.0 mg

El medio mínimo o solución de sales minerales esenciales fue contaminada en una proporción de 9:1 con

respecto al sustrato considerado (diesel o petróleo), manteniéndose en agitación a 20 rpm a 30ºC por un

periodo de 72 horas. Posteriormente se separó solo la fase acuosa. Esta fase se consideró el 100%,

haciendo diluciones con la solución de sales minerales a 70, 50, 30 y 10% respectivamente. En cada

dilución se agregó 1 g de soporte sólido con el consorcio, el cual se colocó en papel filtro, como se

muestra en la figura 4.3.

Figura 0.19 Activación del consorcio microbiano.

4.1.1. Preparación de soluciones modelo

En la figura 4.4 se esquematiza el procedimiento empleado para la preparación de las

soluciones modelo con petróleo y diesel mexicano. Estas soluciones se caracterizaron

para determinar la contaminación inicial a través de la medición de Demanda Química

de Oxígeno (DQO), Carbono Orgánico Total (COT), Carbono Inorgánico (CI) y

Carbono Total (CT).

54

El acondicionamiento del consorcio fue monitoreado por medio de la producción de

CO2 y el consumo de O2. El monitoreo de CO2 se realizó mediante la titulación de una

solución de NaOH 0.1N con HCl 0.1 N en presencia de fenolftaleína bajo el siguiente

principio:

SUSTRATO + BACTERIAS BIOMASA + CO2 + H2O

CO2 + NaOH NaHCO3

El CO2 producto de la mineralización del sustrato por el consorcio bacteriano es

adsorbido en la solución básica.

Figura 0.20 Preparación de soluciones modelo para adaptación y biotratamiento de sustrato.

En la figura 4.5 se presenta el método para realizar el monitoreo de la producción de

CO2.

Figura 0.21 Monitoreo de producción de CO2.

Frascos sellados hermeticamente se colocaron 15 mL de NaOH

En cada frasco se coloco un tubo de ensayo con 5 mL de agua contaminada.

Se titulo por triplicado alicuotas de 5 mL de NaOH por 5 días con

HCl 0.1 N

Solución de

sales minerales

Adición de dieselmexicano una parte

de diesel por nueve partes de

solución de sales

Agitación a 20 rpm

por 72 horas a 30ºc

Extracción de fase

acuosa

Medición DQO, COT, CI, CT

Adición de petroleo una parte de

petroleo por nueve partes de solución

de sales

55

El monitoreo del consumo de oxígeno se efectúo a través de respirometría. Se colocó

dentro de un frasco 10 mL de agua contaminada junto con un tubo de ensayo con

cristales de NaOH, el CO2 generado por la mineralización del sustrato se adsorbió

directamente por los cristales básicos, registrándose un desplazamiento en el nivel del

líquido manométrico como se aprecia en la figura 4.6; a) En un tubo de ensaye se

colocan cristales de NaOH; b) agua contaminada con hidrocarburos e inoculada con

consorcio bacteriano y c)fluido manómetrico, la diferencia en altura permite la

cuantificación de consumo de oxígeno.

Figura 0.22 Esquema para el monitoreo del consumo de oxígeno utilizado.

56

4.1.2 Recolección y caracterización de muestra real.

Dentro de las muestras consideradas para el biotratamiento, se utilizo una muestra de

agua real proveniente de un emplazamiento en el valle de México (figura 4.7), la cual se

obtuvo bajo el esquema mostrado en la figura 4.8, de acuerdo a la norma NMX-AA-

003-1980.

Figura 0.23 Emplazamiento del valle de México de donde fue recolectada la muestra de agua real.

Figura 0.24 Esquematización de la toma de muestra real en un predio contaminado en el valle de

México.

Toma de muestra

de predio

Conservación de muestra a

4ºc en frasco ambar para

transporte a laboratorio

Caracterización de agua:

Cloruros

Dureza de calcio

Dureza de magnesio

Dureza total

Conductividad

pH

Caracterización de tipo de

contaminación

57

Previo a realizar el tratamiento, esta muestra de agua fue caracterizada determinando los

parámetros mostrados en la figura 4.8. La caracterización fisicoquímica del agua se

realizo de acuerdo a la normatividad vigente, tal como se muestra en la tabla 4.2.

Tabla 0.9 Parámetros fisicoquímicos, normas mexicanas y técnicas analíticas

empleadas en la caracterización del agua contaminada.

PARÁMETRO NORMA MÉTODO EQUIPO

pH NMX-AA-008-SCFI-

2001

Potenciométrico Potenciómetro (marca:

Corning)

Cloruros NMX-AA-073-SCFI-

2001

Titrimétrico Balanza analítica (marca:

Sartorius,

modelo: TE1245)

Dureza de calcio --- Titrimétrico Balanza analítica (marca:

Sartorius,

modelo: TE1245)

Dureza de

magnesio

--- Titrimétrico Balanza analítica (marca:

Sartorius,

modelo: TE1245)

Dureza total NMX-AA-072-SCFI-

2001

Titrimétrico Balanza analítica (marca:

Sartorius,

modelo: TE1245)

Conductividad NMX-AA-093-SCFI-

2000

Conductimétrico Potenciómetro (marca:

Corning)

Demanda química

de oxígeno

NMX-AA-30-SCFI-2001 Espectrofotométri

co

Termo-reactor (marca:

Hach);

Espectrofotómetro

(marca: Hach,

modelo: DR 2700)

Nitrogeno total NMX-AA-026-SCFI-

2001

HACH Termo-reactor (marca:

Hach);

Espectrofotómetro

(marca: Hach,

modelo: DR 2700)

Fosforo total NMX-AA-029-SCFI-

2001

HACH Termo-reactor (marca:

Hach);

Espectrofotómetro

(marca: Hach,

modelo: DR 2700)

Sólidos

suspendidos

totales

NMX-AA-034-SCFI-

2001

Peso seco Balanza analítica (marca:

Sartorius,

modelo: TE1245); estufa

eléctrica (marca:

Termolyne, modelo:)

Sólidos

suspendidos

volátiles

NMX-AA-034-SCFI-

2001

Peso seco Balanza analítica (marca:

Sartorius,

modelo: TE1245); mufla

(marca:

Furnance, modelo:

48000)

Carbono orgánico

total

Oxidación térmica Analizador TOC

(marca:General Electric,

serie:)

58

La caracterización del tipo de contaminación presente en la muestra de agua real, se

realizo a través del método descrito en la figura 4.9 (Prieto Díaz, y otros, 1999).

Figura 0.25 Método utilizado para caracterizar el tipo de contaminación por hidrocarburos presente en la

muestra de agua real.

Fuente: (Prieto Díaz, y otros, 1999)

4.2. Metodología de biodegradación.

Después de la adaptación del consorcio microbiano, se procedió al biotratamiento.

Para llevar a cabo este proceso se construyó un sistema consistente de biorreactores de

vidrio de fase libre, con capacidad de 0.5 L, los cuales se airearon hasta saturación con

bombas de marca ELITE 800 con capacidad de 65 L/h, en un sistema isotérmico que

permitió mantener la temperatura fija en 20, 30 y 40 ºC, como se muestra en la figura

4.10.

Muestra de 250 mL de agua

En embudo separador agregar 5mL CCl4

Agitar vigorosamente 1 minuto

Repetir 3 veces la operacion , desechar

fase acuosa (remanente).

Hacer la operación hasta completar 1 L de

muestra.

Agregar 5 g sulfato de sodio anhidro, filtrar y

rotoevaporar a sequedad.

Disolver producto seco en hexano o heptano.

Espectro UV-vis.

59

Figura 0.26 Sistema empleado en la realización de la biodegradación.

El biorreactor operó de manera intermitente, con un suministro continuo de aire para

garantizar la saturación de oxigeno.

La operación se realizo de la siguiente manera:

1. Se cargó cada biorreactor con la muestra de agua real y con las soluciones

sintéticas de agua contaminada con diesel y con petróleo hasta un volumen de

495 mL;

2. Se estabilizó la temperatura del sistema con un baño ThermoScience;

3. Se inocularon 5 mL de consorcio adaptado, realizando la cuenta microbiana en

el momento de la inoculación (relación de inoculación 1:100);

4. Se mantuvieron las condiciones de temperatura y aireación por un período de 5

días, monitoreando los parámetros mostrados en la figura 4.11.

BIORREACTOR

HOMOGENEO

BATCH

V= 0.5 L

QAIRE=65 L/h

T= 20, 30 Y 40 ºC

495 mL FASE

ACUOSA

5 mL INÓCULO

DQO

COT

CI

CT

TPH

UV-VIS

IR-ATR

GC-MASS-FID

CONTEO EN

PLACA

TURBIDIMETRÍA

60

Figura 0.27 Proceso de biotratamiento utilizado.

61

CAPITULO V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. Adaptación del consorcio.

Durante la adaptación a un sustrato, el crecimiento bacteriano es sostenido, sin cambios

(Atlas, y otros, 2002). Esto se refleja en la actividad metabólica del consorcio, ya que ni

el consumo de oxígeno ni la generación de bióxido de carbono presenta un cambio

durante esta etapa. Las figuras 5.1 y 5.2 muestran el tiempo en el que el consorcio pasó

por esta etapa.

Figura 0.28 Volumen de oxígeno consumido por el consorcio bacteriano utilizado.

El primer paso para la adaptación de un microorganismo es la producción de

biosurfactantes por parte de la membrana celular, con esto aumenta la biodisponibilidad

del sustrato (Barkay, y otros, 1999). Durante esta etapa, la membrana celular genera

moléculas de biosurfactante que envuelven el sustrato, en este caso los hidrocarburos,

formando micelas, permitiendo el ingreso del sustrato al interior celular (Hofritcher,

2000 Germany).

0

50

100

150

200

250

300

350

0 1 2 3 4 5 6 7 8

V O

2(m

L)

Tiempo (dias)

Diesel Petróleo Real

Agua contaminada con:

62

Figura 0.29 Monitoreo de crecimiento bacteriano por absorción de CO2 en solución alcalina.

Cuando esta etapa ha sido superada, es decir, cuando el consorcio ha logrado sintetizar,

producir e introducir el sustrato, comienza la degradación enzimática. La capacidad

degradativa de un microorganismo hacia una familia de sustratos viene dado por la

presencia de un grupo de enzimas de la familia del citocromo p450 (Van Beilen, y otros,

2007).

Una vez, que el sustrato ingresó al interior del microorganismo, las enzimas

monooxigenasas comienzan a disminuir el tamaño de la molécula de sustrato para que

este a su vez, se integre al proceso respiratorio de la célula, es decir al ciclo de los

ácidos tricarboxílicos (Hofritcher, 2000 Germany).

Es necesario la integración de iones fosfato, sulfato, hierro y amonio, para que el

proceso de degradación y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos se efectué de manera

completa. Esta es la razón por la que se preparó una solución de sales minerales, ya que

estas son requeridas en cantidades mínimas. Dado que todas las reacciones del proceso

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 1 2 3 4 5 6

nC

O2(m

ol)

Tiempo (dias)

Diesel Petróleo Real

Agua contaminada con:

63

de biodegradación son enzimáticas, la participación de dichas sales es vital para el

aporte o trasporte de energía durante el proceso. En la tabla 5.1 se enlistan algunas

enzimas involucradas en la biodegradación de hidrocarburos del petróleo (Zimmer, y

otros, 1996).

Tabla 0.10 Enzimas involucradas en la biodegradación de hidrocarburos del petróleo.

ENZIMAS SUSTRATOS MICROORGANISMOS REFERENCIAS

Metano

monooxigenasas

solubles

C1-C8, alcanos,

alquenos y cicloalcanos.

Methylococcus

Methylosinus

Methylocystis

Methylomonas

Methylocella

(McDonald, y otros,

2006)

Metano

monooxigenasas

particuladas

C1-C5 (halogenados),

alcanos y cicloalcanos.

Methylobacter

Methylococcus

Methylocystis

(McDonald, y otros,

2006)

AlkB relacionados

Alcano hidroxilasas

C5-C16, alcanos, ácidos

grasos, alquil bencenos,

cicloalcanos y

homologos.

Pseudomonas

Burkholderia

Rhodococcus

Mycobacterium

(Jan, y otros, 2003)

P450 eucariontico C10-C16, alcanos y

ácidos grasos.

Candida maltosa

Candida tropicalis

Yarrowia lipolytica

(Iida, y otros, 2000)

Sistema bacterial de

oxigenasas p450

C5-C16, alcanos y

cicloalcanos.

Acinetobacter

Caulobacter

Mycobacterium

(Van Beilen, y otros,

2006)

Dioxigenasas C10-C30, alcanos. Acinetobacter sp. (Maeng, y otros, 1996)

Fuente: (Zimmer, y otros, 1996)

5.2. Caracterización de muestra real

Cuando se realizó la recolección del agua se pudo percibir que ésta tenía olor a

hidrocarburos, indicando la presencia de estos en fase acuosa. Además el agua era de

tonalidad verde, indicando con ello la presencia de organismos fotolitoautotrofos

(algas); por otro lado, se observó un burbujeo suave en el manto freático síntoma de la

realización de digestión anaerobia. Sin embargo no sólo los procesos de acidogénesis y

metanogénesis están involucrados, existen muchos procesos simultáneos en un sistema

en donde se tiene principalmente la presencia de sustrato, nutrientes, luz solar,

condiciones tanto aerobias, microaerobias, anóxicas y anaerobias. Por lo que en el

medio ambiente diferentes tipos de microorganismos se encuentran conviviendo, este

hecho determina el establecimiento de una serie de interacciones que posee diversos

grados de complejidad. Las relaciones entre poblaciones mixtas pueden ser

favorecedoras, perjudiciales o indiferentes (Pactao Bacosa, y otros, 2011).

64

Los resultados de la caracterización de la muestra de agua real se muestran en la tabla

5.2. Los valores más significativos son aquellos que indicaron si era necesario

acondicionar la muestra para permitir el desarrollo del consorcio bacteriano.

Tabla 0.11 Resultados de la caracterización de la muestra de agua real.

PARÁMETRO UNIDAD VALOR

pH Unidades de pH 6.93

Cloruros mg/L 378.13

Dureza de calcio mg/L 355

Dureza de magnesio mg/L 125

Dureza total mg/L 480

Conductividad µS 1051

Demanda química de oxígeno mg/L 1868

Nitrógeno total mg/L ND

Fosforo total mg/L 0.21

Sólidos suspendidos totales mg/L 34.6

Sólidos suspendidos volátiles mg/L 10.4

Carbono orgánico total mg/L 370

De acuerdo a los resultados obtenidos, se acondiciono la muestra de agua real

agregando únicamente sales de nitrato y fosfato. El pH se encontró en el rango de

desarrollo del consorcio bacteriano, entre 6.5 y 7.5 (Borkowski, y otros, 2009), por lo

que no fue necesario ajustarlo.

La caracterización del tipo de contaminación presente en la muestra de agua real

representó un reto. El método seguido para identificar el tipo de contaminación presente

es el señalado por Prieto Díaz y col. (Prieto Díaz, y otros, 1999), con la variación de que

no se roto evaporó hasta sequedad, sino que se optó por eliminar este paso y disolver en

hexano el extracto obtenido, para evitar pérdidas de hidrocarburos presentes por el

efecto del calor. El espectro UV-visible obtenido siguiendo dicha metodología se

muestra en la figura 5.3.

65

Figura 0.30 Espectro UV-vis de la muestra de agua real.

La relación de los valores de absorbancia en las longitudes de onda a 228 y 256 nm,

permite entrar en una tabla propuesta por Prieto Díaz, con el fin de identificar el tipo de

contaminación. En la tabla 5.3 se muestran los resultados obtenidos y en la tabla 5.4 se

muestra la selección del tipo de contaminación.

Tabla 0.12 Identificación del tipo de contaminación presente en la muestra de agua real.

LONGITUD DE ONDA (NM) ABSORBANCIA

228 0.871

256 0.580

R=Abs228/Abs254 1.5

Tabla 0.13 Valores de referencia de R para tipos de hidrocarburos contaminantes.

TIPO DE HIDROCARBURO RANGO DE R

FUEL OIL Y PETRÓLEOS COMBUSTIBLES

LIGEROS 1.5 – 1.7

Crudo 1.7 – 2.0

Aceites lubricantes 2.6 – 3.6

Diesel 4.9 – 7.7

Keroseno 11.3 – 12.3

Fuente: (Martínez de villa, y otros, 1995 Jun 5-9)

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 200 400 600 800 1000

Ab

sorb

anci

a

Longitud de onda (nm)

66

5.3. Biodegradación.

Los resultados de la degradación de muestra real se muestran en la figura 5.4 y 5.5. La

disminución de la demanda química de oxigeno (DQO) confirma la utilización de los

contaminantes.

Figura 0.31 Disminución de la demanda química de oxígeno en el agua real, posterior a la inoculación

del consorcio bacteriano.

Figura 0.32 Porcentaje de remoción de materia organica susceptible de oxidación química obtenido por

el consorcio bacteriano.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

DQ

O (

mg/

L)

Tiempo (días)

MUESTRA REAL

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20

%R

EMO

CIÓ

N

Tiempo (días)

%REMOCIÓN

67

La tasa máxima de remoción se alcanza entre el quinto y el sexto día. Después de este

período de tiempo, el decrecimiento del sustrato disponible adopta un comportamiento

asintótico. En el sexto día se alcanzo un porcentaje de remoción del 80%.

En el agua real, además de los microorganismos inoculados, también se encuentran

presentes microorganismos autóctonos, los cuales pueden contribuir de manera positiva

o negativa con la velocidad y tasa de degradación (Reinhard, y otros, 1984; Barker J., y

otros, 1986; Major D. W., 1988; Grbic-Galic, y otros, 1987; Haag, y otros, 1991;

Kazumi, y otros, 1997). Algunas de las sustancias que secretan estos microorganismos

pueden facilitar el metabolismo de los contaminantes para otros organismos o inhibir su

actividad. Identificar la capacidad de biotrasformación de los microorganismos nativos,

es una clave fundamental en la formulación de las estrategias para la aplicación de un

bioproceso (Vroblesky, y otros, 1994; Borden, y otros, 1995).

En la figura 5.6 se señala la disminución del DQO en función del tiempo de tratamiento,

de cada una de las muestras empleadas. El porcentaje de biodegradación para cada

sustrato se muestra en la figura 5.7.

Figura 0.33 Disminución del DQO en las muestras de agua sintéticas y en la muestra de agua real.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 1 2 3 4 5 6

DQ

O (

mg/

L)

Tiempo (días).

Real

Diesel

Petroleo

Referencia

68

Figura 0.34 Porcentaje de biodegradación de cada sustrato estudiado.

La facilidad de biodegradación de cada uno de los sustratos depende de la estructura y

composición de cada uno de los contaminantes presentes.

De las distintas familias de hidrocarburos, los n-alcanos y los alcanos ramificados de

cadena intermedia (C10-C20) son los sustratos más fácilmente degradables por los

microorganismos, y que por lo tanto tienden a ser eficazmente biodegradados.

Sin embargo, los alcanos de cadena larga (>C20) son más difíciles de degradar debido a

su elevado peso molecular y su baja solubilidad en agua.

Los cicloalcanos, por norma general, se degradan más lentamente que los n-alcanos y

los alcanos ramificados.

Así mismo los hidrocarburos poliaromáticos que contienen de 2 a 3 anillos aromáticos

pueden ser biodegradados eficazmente en condiciones óptimas, mientras que los que

tienen 4 anillos, y especialmente, los de 5 o más anillos bencénicos presentan una

mayor recalcitrancia inherente y una baja solubilidad (Aycachi Inga, y otros, 2008;

Vignesh, y otros, 2011; Fortin, y otros, 1997; Langworthy, y otros, 1998).

0

50

100

0 1 2 3 4 5 6

%B

IOD

EGR

AD

AC

ION

Tiempo (días).

Real

Diesel

Petroleo

69

El diesel es el sustrato que se biodegrado mas fácilmente debido a las estructuras

presentes. En la tabla 5.5 se muestran los análisis de IR-ATR para cada uno de los

sustratos al inicio y al final del tratamiento.

En las muestras iniciales se encuentran presentes los picos característicos de los enlaces

CH, CH2 y CH3, entre las regiones de 2950 y 3000 cm-1

, propios de las vibraciones C-H

(Lafont J., y otros, 2011).

La ausencia de las bandas en esta región, permiten suponer una biodegradación de los

contaminantes mayor al 90%, lo cual es coincidente con los resultados obtenidos a

través del seguimiento por DQO.

En los espectros al final del tratamiento, se muestra también el de agua destilada. La

aplicación de IR permitió confirmar de manera cualitativa la capacidad biodegradativa

del consorcio utilizado.

70

Tabla 0.14 Espectros de IR-ATR de las muestras al inicio y final del tratamiento.

MUESTRA INICIAL (DÍA 0) MUESTRA FINAL (DÍA 3)

Muestra

Real

Muestra

sintética

con

diesel

Muestra

sintética

con

petróleo

La disminución de la concentración de aromáticos se monitoreo mediante

espectroscopia de UV-visible. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 5.8 y

5.9. La presencia de aromáticos se pone de manifiesto por el pico presente entre 250 –

300 nm.

01000 2000 3000 4000 5000

Wavelength(cm-1)

0 1000 2000 3000 4000 5000

Wavelength (cm-1)

Destilada

Aguafinal

01000 2000 3000 4000 5000

wavelength(cm-1) 0 1000 2000 3000 4000 5000

Wavelength(cm-1)

DESTILADA

Aguafinal

01000 2000 3000 4000 5000

wavelength (cm-1) 0 1000 2000 3000 4000 5000

Wavelength(cm-1)

Destilada

AGUAFINAL

71

Figura 0.35 Decremento de la concentración de compuestos aromáticos de la muestra contaminada con

diésel (región de 250 a 300 nm).

Figura 0.36 Variación en la concentración de compuestos aromáticos en muestra contaminada con

petróleo, en la región entre 250 a 300 nm.

La disminución de la cantidad de aromáticos en la muestra contaminada con diesel es

uniforme en el tiempo, mientras que en el caso de la muestra contaminada con petróleo

hay variaciones. Cuando se produce ruptura de algún compuesto con más de un núcleo

aromático por parte de los microorganismos, la concentración de dicho compuesto

aumenta, es decir, si previamente existía 1 mol de un compuesto poliaromático, ahora

existirán n moles de monoaromáticos (Janbandhu, y otros, 2011; González, y otros,

2011).

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 200 400 600 800 1000

Ab

sorb

anci

a


Diesel dia 0

Diesel dia 1

Diesel dia 2

Diesel dia 3

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 200 400 600 800 1000

Ab

sorb

anci

a


Petroleo dia 0

Petroleo dia 1

Petroleo dia 2

Petroleo dia 3

72

Los resultados obtenidos a través de carbono orgánico total, carbono inorgánico y

carbono total se muestran en las figuras 5.10 y 5.11. Este parámetro permite establecer

la cantidad de materia orgánica presente en el agua contaminada inicial.

Figura 0.37 Variación de IC, TOC, y TC en la muestra contaminada con diesel.

Figura 0.38 Variación de IC, TOC, y TC en la muestra contaminada con petróleo.

El incremento de la cantidad de carbono orgánico total se debe al crecimiento de los

microorganismos en la muestra. Esto sucede a expensas de la materia orgánica

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 1 2 3

mg/

L

Tiempo (días)

IC

TOC

TC

0

5

10

15

20

25

30

35

0 1 2 3

mg/

L

Tiempo (días)

IC

TOC

TC

73

disponible, es decir el hidrocarburo contaminante, por lo que hay una disminución en la

cantidad de carbono inorgánico a lo largo del tratamiento. El incremento de la materia

orgánica se corresponde con el crecimiento de la población microbiana (figura 5.12 y

5.13).

Figura 0.39 Crecimiento microbiano en la muestra contaminada con diesel. El desarrollo microbiano se

incrementa con la temperatura.

Figura 0.40 Crecimiento microbiano en la muestra contaminada con petróleo. El desarrollo microbiano

se incrementa con la temperatura.

0.00E+00

2.00E+08

4.00E+08

6.00E+08

8.00E+08

1.00E+09

1.20E+09

1.40E+09

1.60E+09

1.80E+09

2.00E+09

0 1 2 3

UFC

/mL

Tiempo (días)

Diesel 20ºC

Diesel 30ºC

0.00E+00

1.00E+08

2.00E+08

3.00E+08

4.00E+08

5.00E+08

6.00E+08

7.00E+08

8.00E+08

0 1 2 3

UFC

/mL

Tiempo (días)

Petroleo 20ºC

Petroleo 30ºC

74

El desarrollo microbiano mejora con el incremento de la temperatura de tratamiento,

siempre que se encuentre dentro del rango de desarrollo. Los cromatogramas de la

biodegradación de hidrocarburos se muestran en las figuras 5.14 y 5.15.

Figura 0.41 Cromatogramas obtenidos durante la biodegradación de las muestras sintéticas de

agua contaminadas con diesel.

Figura 0.42 Cromatogramas obtenidos durante la biodegradación de las muestras sintéticas de agua

contaminadas con petróleo.

Día 1 Día 0

Día 2 Día 3

Día 0 Día 1

Día 2 Día 3

75

En la tabla 5.6 se obtienen las ecuaciones de ajuste para determinar el contenido de

hidrocarburos totales a partir de la curva de referencia.

Tabla 0.15 Ecuaciones de referencia obtenidos a partir de cromatogramas de diesel (ver anexo A). NÚMERO DE

CARBONOS ECUACIÓN R2

HCtotal Y=337.12X-429.76 0.9954

C12 Y=371.32X-40.283 0.9879

C16 Y=351.96X-22.385 0.9761

C17 Y=358.25X-36.499 0.9750

C18 Y=382.88X-12.846 0.9433

C19 Y=367.93X-18.632 0.9620

C20 Y=394.3X-17.363 0.9377

C21 Y=360.24X-8.4409 0.9738

C22 Y=381.23X-10.447 0.9670

C23 Y=436.01X-10.82 0.9251

En la figura 5.16 se muestra la disminución en la concentración de hidrocarburos totales

durante la biodegradación, seguido a través de cromatografía de gases. La concentración

obtenida a través de este método directo y de la medición indirecta de DQO coincide,

señalando una tasa de biodegradación del 95.8% para el diesel y del 93.8% para el

petróleo (figura 5.17).

Las diferencias en las tasas de degradación obtenidas en cada uno de los sustratos,

obedecen a la naturaleza de cada uno de estos. Los resultados también coinciden con la

figura 5.6, donde la misma tendencia fue observada.

76

Figura 0.43 Disminución de la concentración de hidrocarburos en las muestras sintéticas de petróleo y

diesel.

Las fracciones que se degradaron (figura 5.18 y 5.19) en el caso del diesel, las

que representaron mayor dificulta fueron las correspondientes a C18, C21, C22 y C23 y

en el caso del petróleo al C22 y C23. Esto obedece a la estructura de las fracciones

presentes, lo que incrementó la dificultad para que los microorganismos los

degradadarán.

Figura 0.44 Porcentaje de biodegradación obtenido. La tasa de biodegradación fue mayor en el caso del

sustrato diesel que en el petróleo.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0 1 2 3

mg/

L H

idro

carb

uro

s to

tale

s

Tiempo (días)

Conc. diesel

Conc. petroleo

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3

%B

iod

egr

adac

ión

Tiempo (días)

%Biodegradacion diesel

%Biodegradación petroleo

77

Figura 0.45 Disminución de la concentración de cada fracción de diesel durante la biodegradación.

El proceso de biodegradación bacteriano se caracteriza por que los sustratos complejos

son fraccionados en cadenas simples y posteriormente metabolizados. En las figuras

5.18 y 5.19 se evidencia este paso.

Figura 0.46 Disminución de la concentración de cada fracción de petróleo durante la biodegradación.

En el caso del petróleo, la prevalencia de una pequeña cantidad de C23 probablemente

se deba al grado de complejidad de componentes hidrocarbonados de mayor peso

molecular, los cuales originan esta fracción.

0

100

200

300

400

500

600

0 1 2 3

mg/

L

Tiempo (días)

C12

C16

C17

C18

C19

C20

C21

C22

C23

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 1 2 3

mg/

L

Tiempo (días)

C12

C16

C17

C19

C20

C21

C22

C23

78

5.4. Cinética de biodegradación

El modelo utilizado para el crecimiento celular, es la ecuación de Monod (Fogler, 2008;

Monod, 1949) para crecimiento exponencial:

Ecuación 0.4

Donde:

rg=velocidad de crecimiento de la célula, mg/L dia;

CC=concentración de células, mg/L

µ=velocidad de crecimiento específico, dia-1

La velocidad de crecimiento específico de la célula se puede expresar como:

[dia

-1] Ecuación 0.5

Donde

µmáx=velocidad de reacción específica de crecimiento máximo, dia-1

KS=contante de Monod, mg/L

Cs=concentración de sustrato, mg/L

Los valores representativos de máx y Ks son 1.3 h-1

y 2.2x10-5

mol/dm3,

respectivamente, que son los valores de parámetros para crecimiento de E. coli sobre

glucosa (Fogler, 2008). Al combinar las dos ecuaciones anteriores se llega a la ecuación

de Monod para la velocidad de crecimiento de células bacterianas.

Ecuación 0.6

5.4.1. Estequiometria

La estequiometria del crecimiento celular es muy compleja y varía con el sistema de

microorganismos, los nutrimentos y las condiciones ambientales, como pH, temperatura

y potencial redox. Tal complejidad es particularmente cierta cuando más de un

nutrimento contribuye al crecimiento de células, como en este caso. Por lo anterior, para

efectuar los cálculos estequiométricos se requiere la siguiente simplificación:

79

Células + sustrato más células + producto

Con el propósito de relacionar el sustrato consumido, las nuevas células formadas y el

producto generado, se definen los coeficientes de rendimiento. El coeficiente de

rendimiento para células y sustrato es:

Ecuación 0.7

Ecuación 0.8

La formación de producto puede tener lugar durante diversas fases del ciclo del

crecimiento de la célula. Cuando la formación de producto sólo ocurre durante la fase

de crecimiento exponencial, la velocidad de formación de producto es:

Ecuación 0.9

Donde

Ecuación 0.10

El coeficiente de rendimiento estequiométrico que relaciona la cantidad de producto

formado por masa de sustrato consumido es:

Ecuación 0.11

Además del consumo de sustrato para producir nuevas células, parte del sustrato se

emplea simplemente para mantener las actividades cotidianas de las células. El término

correspondiente de utilización para mantenimiento es:

Ecuación 0.12

La ecuación para relacionar la tasa de consumo de nutrimentos, -rs, con las velocidades

de crecimiento celular, generación de producto y mantenimiento celular es:

80

Ecuación 0.13

Ecuación 0.14

Como el producto se sintetiza durante la fase de crecimiento, no es posible separar la

cantidad de sustrato consumido para crecimiento celular de la que se consume para

sintetizar producto (ya que el producto sintetizado es utilizado para el desarrollo

celular), todo el sustrato consumido se agrupa en el coeficiente estequiométrico YS/C.

5.4.2. Balance de masa

Hay dos formas en las que es posible explicar el crecimiento de los microorganismos.

Una es tomar en cuenta el número de células vivas y la otra la masa de las células vivas.

Para este caso se usara la segunda. Un balance de masa para el microorganismo en

reactor continuo de mezcla perfecta de volumen contante es:

Ecuación 0.15

Ecuación 0.16

El balance de sustrato correspondiente es:

Ecuación 0.17

Ecuación 0.18

5.4.3. Operación intermitente

El sistema de tratamiento empleado fue intermitente, donde υ = υ0 = 0 y los balances de

masa son los siguientes:

81

Células

Ecuación 0.19

Dividiendo entre el volumen del reactor V se tiene:

Ecuación 0.20

Sustrato

La velocidad de desaparición del sustrato, -rs, se deriva del sustrato empleado para

crecimiento celular y el sustrato empleado para mantenimiento celular:

Ecuación 0.21

Dividiendo entre V se obtiene el balance de sustrato para la fase de crecimiento:

Ecuación 0.22

Producto

La velocidad de formación de producto, rp, puede relacionarse con la velocidad de

consumo de sustrato a través del siguiente balance:

Ecuación 0.23

Estos tres balances generan un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias de primer

orden.

82

5.5. Tratamiento de datos

La obtención de las cinéticas de biodegradación de los sustratos hidrocarbonados fueron

obtuvieron bajo el siguiente procedimiento.

5.5.1. Cálculo de peso seco, masa de CO2 y de sustrato

La ecuación que relaciona el número de células microbianas con la masa de peso seco

es (Sánchez Gonzales, 2012):

Ecuación 0.24

Donde

Wseco[=] mg/L

UFC[=] número de microorganismos por mL

La concentración de biomasa para cada sustrato hidrocarbonado se muestra en la tabla

5.7.

Tabla 0.16 Variación de la concentración de biomasa para agua contaminada con diesel y agua

contaminada con petróleo, a tres temperaturas diferentes.

TIEMPO

(DÍAS)

WSECO (AGUA CONTAMINADA CON

DIESEL) [MG/L]

WSECO (AGUA CONTAMINADA CON

PETRÓLEO) [MG/L]

Temp. 20ºC 30ºC 40ºC 20ºC 30ºC 40ºC

0 3383.356 3383.286 3383.349 3383.356 3383.286 3383.349

1 4327.6 5517.6 6357.6 5272.6 5517.6 6077.6

2 5521.1 7232.6 10382.6 6357.6 6725.1 7652.6

3 6357.6 9682.6 15632.6 7197.6 7617.6 8632.6

La concentración del sustrato (medido como DQO) y de producto (como CO2)

muestran en la tabla 5.8.

Tabla 0.17 Variación de la concentración de DQO y de CO2 durante el tratamiento.

TIEMPO

(DÍAS)

AGUA CONTAMINADA CON DIESEL AGUA CONTAMINADA CON

PETRÓLEO

mCO2 [mg/L] mDQO [mg/L] mCO2 [mg/L] mDQO [mg/L]

0 0 2640 0 1200

1 528 630 352 210

2 1848 125 528 130

3 2200 108 968 107

83

5.5.2. Calculo de los coeficientes de rendimiento y de los parámetros µmáx

y Ks

Los coeficientes de rendimiento entre la biomasa, el sustrato y el producto durante el

tratamiento se muestra en la tabla 5.9. En la tabla 5.10 y 5.11 se muestran las ecuaciones

de variación en el tiempo de los coeficientes de variación para el diesel y el petróleo,

respectivamente.

Tabla 0.18 Coeficientes de rendimiento entre la biomasa, el sustrato y el producto.

Tabla 0.19 Ecuaciones de variación de los coeficientes de rendimiento durante el tiempo de tratamiento

para el diesel.

Tabla 0.20 Ecuaciones de variación de los coeficientes de rendimiento durante el tiempo de tratamiento

para el diesel.

AGUA CONTAMINADA CON DIESEL AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO

Temperatura 20ºC 30ºC 40ºC 20ºC 30ºC 40ºC

Yc/s [g/g] 0.469 1.061 1.479 1.908 2.155 2.721

Ys/c [g/g] 2.128 0.941 0.675 0.524 0.463 0.367

Yp/c [g/g] 0.559 0.247 0.177 0.186 0.164 0.130

Yp/s [g/g] 2.613 2.200

Ys/p [g/g] 0.000382 0.000454

AGUA CONTAMINADA CON DIESEL

Temperatura 20ºC 30ºC 40ºC

Ys/c [g/g] y = 0.6513x2 - 2.3568x + 2.1286 y = 0.1799x2 - 0.8272x + 0.9418 y = 0.214x2 - 0.7644x + 0.6758

Yp/c [g/g] y = -0.616x2 + 1.1629x + 0.5591 y = -0.5741x2 + 1.0964x + 0.2474 y = -0.2057x2 + 0.3561x + 0.1775

AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO

Temperatura 20ºC 30ºC 40ºC

Ys/c [g/g] y = 0.202x2 - 0.6522x + 0.524 y = 0.1785x2 - 0.5761x + 0.4639 y = 0.1447x2 - 0.4613x + 0.3674

Yp/c [g/g] y = 0.1928x2 - 0.2169x + 0.1863 y = 0.183x2 - 0.2021x + 0.1649 y = 0.1781x2 - 0.197x + 0.1306

84

Para encontrar los parámetros de la ley de velocidad µmáx y Ks se efectua una regresión

de los datos con la forma de Hanes-Woolf de la ecuación de Monod:

Ecuación 0.25

Al graficar los términos Cc/rg vs (1/Cs), la intersección con el eje de las abscisas es el

inverso de a constante µmáx y la pendiente es la relación entre Ks/µmáx. En la tabla 5.12

se muestran los valores obtenidos de las constantes así como el coeficiente de

correlación para el ajuste lineal aplicado.

Durante el tratamiento, al aumentar la temperatura en un mismo sustrato, la velocidad

de reacción especifica máxima (µmáx) se incrementa. Cuando el sustrato incrementa su

complejidad, como en el caso del petróleo en comparación con el diesel, su valor

también aumenta. Este resultado concuerda con el planteamiento de la cinética de

Monod, debido a que la velocidad de reacción de crecimiento depende de la estructura

y concentración del sustrato y de la temperatura de crecimiento del microorganismo

(Tabla 5.12).

Tabla 0.21 Constantes µmáx y Ks obtenidas aplicando una regresión lineal.

AGUA CONTAMINADA CON DIESEL AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO

20ºC 30ºC 40ºC 20ºC 30ºC 40ºC

µmáx

[dia-1

]

0.3098 0.4841 0.6748 1.1976 1.6085 3.7693

Ks

[mg/L]

109.468 99.951 78.946 815.904 1096.493 2555.107

R2

0.93 0.86 0.90 0.95 0.94 0.93

85

5.5.3. Cálculo de los balances de masa.

En las tabla 5.13, 5.14 y 5.15 se presentan los balances de masa para las muestras de

agua contaminadas con diesel, durante el tratamiento a 20ºC, 30ºC y 40ºC,

respectivamente.

Tabla 0.22 Balances de masa para agua contaminada con diesel durante el tratamiento a 20ºC.


Temperatura 20ºC

Balance de

células (Wseco) Cc

Cs

CsCc

dt

dCc045.0

468.109

3098.0

Balance de

sustrato (DQO) Cc

Cs

CsCc

dt

dCs065.0)

468.109

3098.0)(2.1286 +2.3568t - 0.6513t( 2

Balance de

producto (CO2) Cs

CsCc

dt

dCp

468.109

3098.0)0.5591 +1.1629t + -0.616t( 2

El término de muerte celular, kd, limita el crecimiento celular, y su efecto es evidente

después de la etapa exponencial de crecimiento. La constante de mantenimiento celular,

m, es la cantidad de sustrato que se utiliza para el crecimiento y para los procesos

metabólicos dentro del microorganismo. En la figura 5.20, se observa que cuando la

tasa de crecimiento celular empieza a decrecer después de dos días y medio de

tratamiento. En este punto la tasa de muerte se incrementa drásticamente. La tasa de

mantenimiento celular permanece prácticamente constante a lo largo de los tres días de

tratamiento.

86

Figura 0.47 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de biodegradación del diesel a

20ºC.

En la figura 5.21, se muestran los datos experimentales y las predicciones del modelo de

Monod para el diesel a 20ºC.

Figura 0.48 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función del tiempo del

modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de diesel a 20ºC.

La misma tendencia se observa en los perfiles de velocidad mostrados en las figuras

5.22 y 5.24.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 1 2 3

Ve

loci

dad

mg/

Lh

Tiempo (días)

rg

rsm

rd

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 1 2 3

Co

nce

ntr

ació

n (

mg/

L)

Tiempo (días)

Cc Monod

Cs Monod

Cp Monod

Cc exp

Cs exp

Cp exp

87

Tabla 0.23 Balances de masa para agua contaminada con diesel durante el tratamiento a 30ºC. AGUA CONTAMINADA CON DIESEL

Temperatura 30ºC

Balance de

células (Wseco) Cc

Cs

CsCc

dt

dCc040.0

951.99

4841.0

Balance de

sustrato (DQO) Cc

Cs

CsCc

dt

dCs065.0)

951.99

4841.0)(0.9418 +0.8272t - 0.1799t( 2

Balance de

producto (CO2) Cs

CsCc

dt

dCp

951.99

4841.0)0.2474 +1.0964t + -0.5741t( 2


30ºC.

La concentración de biomasa predicha por el modelo de Monod, se desvía con el

aumento de la temperatura (ver figuras 5.23 y 5.25). El consumo de sustrato que el

modelo predice es menor al consumo obtenido. Esto puede deberse a que se tomo como

masa de sustrato a toda la materia presente susceptible de oxidación y no solo al sustrato

hidrocarbonado, de esta forma la biomasa que se genera en el tiempo contribuye a esta

medida. Sin embargo, la medida del sustrato directo medido por cromatografía de gases

indico que la degradación alcanza su pico mayor y se vuelve asintótico durante el

primer dia de tratamiento (ver figura 5.18).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 1 2 3

Ve

loci

dad

mg/

Lh

Tiempo (días)

rg

rd

rsm

88



El balance que se muestra en la tabla 5.15, a una temperatura de 40ºC para el diesel, se

observa que la tasa de muerte es mayor. Esto debido a que la tasa de crecimiento celular

también lo fue, por lo que el número de bacterias que murieron también se incrementó.

Tabla 0.24 Balances de masa para agua contaminada con diesel durante el tratamiento a 40ºC.


Temperatura 40ºC

Balance de

células (Wseco) Cc

Cs

CsCc

dt

dCc12.0)

946.78

6673.0

Balance de

sustrato (DQO) Cc

Cs

CsCc

dt

dCs018.0)

946.78

6673.0)(0.6758 +0.7644t - 0.214t( 2

Balance de

producto (CO2) Cs

CsCc

dt

dCp

0000746.0

6673.0)0.1775 +0.3561t + -0.2057t( 2

El perfil de velocidades a esta temperatura (figura 5.24), indica que la tasa de

crecimiento fue la mayor, pero también que la tasa de muerte se incremento.

Nuevamente, la tasa destinada al mantenimiento celular fue constante durante el periodo

de tratamiento.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 1 2 3

Co

nce

ntr

ació

n (

mg/

L)

Tiempo (días)

Cc Monod

Cs Monod

Cp Monod

Cc exp

Cs exp

Cp exp

89


40ºC.



En el tratamiento de la muestra de agua contaminada con petróleo, las velocidad de

crecimiento máximo fue 3 veces mayor a la presentada por el diesel a las

correspondientes temperaturas de tratamiento (tabla 5.16, 5.17 y 5.18). Así también el

valor debió a la muerte celular, lo cual limita el crecimiento celular.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0 1 2 3

Ve

loci

dad

(m

g/Lh

)

Tiempo (días)

rg

rsm

rd

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

0 1 2 3

Co

nce

ntr

ació

n (

mg/

L)

Tiempo (días)

Cc Monod

Cs Monod

Cp Monod

Cc exp

Cs exp

Cp exp

90

Tabla 0.25 Balances de masa para agua contaminada con petróleo durante el tratamiento a 20ºC.


Temperatura 20ºC

Balance de

células (Wseco) Cc

Cs

CsCc

dt

dCc15.0

904.815

1976.1

Balance de

sustrato (DQO) Cc

Cs

CsCc

dt

dCs01.0)

904.815

1976.1)(0.524 +0.6522t - 0.202t( 2

Balance de

producto (CO2) Cs

CsCc

dt

dCp

904.815

1976.1)0.1649 +0.2021t - 0.183t( 2

El perfil de velocidades que se muestra en las figuras 5.26, 5.28 y 5.30 indica que los

microorganismos pasaron por un proceso de readaptación al sustrato. Cuando se realizo

la adaptación del consorcio, este se adapto únicamente al diesel, por lo que al utilizar

como contaminante un sustrato de mayor complejidad represento un nuevo cambio en

las condiciones del medio.

Figura 0.53 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de biodegradación del petróleo

a 20ºC.

Esta adaptación es evidente en la concavidad positiva presente en el perfil de velocidad

de crecimiento de las tres figuras.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 1 2 3

Ve

loci

dad

(m

g/Lh

)

Tiempo (días)

rg

rsm

rd

91

Un efecto adicional de este proceso se observa en la muy elevada tasa de muerte, lo que

también es función de la toxicidad del petróleo para el consorcio microbiano.


modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de petróleo a 20ºC.

La predicción del modelo para este sustrato presento mayor desviación que en el caso

del diesel (figuras 5.27, 5.29 y 5.31).

Tabla 0.26 Balances de masa para agua contaminada con petróleo durante el tratamiento a 30ºC. AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO

Temperatura 30ºC

Balance de

células (Wseco) Cc

Cs

CsCc

dt

dCc12.0

493.1096

6085.1

Balance de

sustrato (DQO) Cc

Cs

CsCc

dt

dCs025.0)

493.1096

6085.1)(0.4639 +0.5761t - 0.1785t( 2

Balance de

producto (CO2) Cs

CsCc

dt

dCp

493.1096

6085.1)0.1649 +0.2021t - 0.183t( 2

Una tendencia en la tasa de muerte, que se obtuvo en el perfil de velocidades fue que al

final del periodo de readaptación al nuevo sustrato, la tasa de muerte comienza a caer,

esto se nota en el cambio en la concavidad de rd en las figuras 5.26, 5.28 y 5.30.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

0 1 2 3

Co

nce

ntr

ació

n (

mg/

L)

Tiempo (días)

Cc Monod

Cs Monod

Cp Monod

Cc exp

Cs exp

Cp exp

92

Figura 0.55 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de biodegradación del

petróleo a 30ºC.

Figura 0.56 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función del

tiempo del modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de petróleo a 30ºC.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 1 2 3

Ve

loci

dad

(m

g/Lh

)

Tiempo (días)

rg

rsm

rd

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 1 2 3

Co

nce

ntr

ació

n (

mg/

L)

Tiempo (días)

Cc Monod

Cs Monod

Cp Monod

Cc exp

Cs exp

Cp exp

93

Tabla 0.27 Balances de masa para agua contaminada con petróleo durante el tratamiento a 40ºC.


Temperatura 40ºC

Balance de

células (Wseco) Cc

Cs

CsCc

dt

dCc20.0

107.2555

7693.3

Balance de

sustrato (DQO) Cc

Cs

CsCc

dt

dCs012.0)

107.2555

7693.3)(0.3674 +0.4613t - 0.1447t( 2

Balance de

producto (CO2) Cs

CsCc

dt

dCp

107.2555

7693.3)0.1306 +0.197t - 0.1781t( 2

El análisis de la figura 5.30, indica que existe una concentración de sustrato en la cual

toda actividad metabólica debe cesar, y por lo tanto sobrevenir la muerte celular. Esto

también se nota en la tasa de mantenimiento celular, la cual es muy pequeña, lo que

indica una inversión significativa de energía y de recursos metabólicos en la actividad

celular para adaptarse al petróleo.

Figura 0.57 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de biodegradación del petróleo

a 40ºC.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 1 2 3

Ve

loci

dad

(m

g/Lh

)

Tiempo (días)

rg

rsm

rd

94


modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de petróleo a 40ºC.

El aporte de energía al consorcio como temperatura tuvo un efecto significativo sobre la

tasa de mantenimiento. A mayor temperatura, la tasa de mantenimiento fue menor, es

decir, la energía invertida por parte de la celula para sus actividades se reduce (Figura

5.32 y5.33). Esto permite concluir que es posible aportar energía al consorcio para

facilitar sus actividades metabolicas y aumentar su eficiencia sobre el sustrato. Este

comportamiento no se ha reportado en la literatura.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0 1 2 3

Co

nce

ntr

ació

n (

mg/

L)

Tiempo (días)

Cc Monod

Cs Monod

Cp Monod

Cc exp

Cs exp

Cp exp

95

Figura 0.59 Tasa de mantenimiento microbiano en agua contaminada con diesel a 20, 30 y 40ºC.

Figura 0.60 Tasa de mantenimiento microbiano en agua contaminada con petróleo a 20, 30 y 40ºC.

0

100

200

300

400

500

600

700

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

rsm

(m

g/Lh

)

Tiempo (días)

T=20ºC

T=30ºC

T=40ºC

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 1 2 3

rsm

(m

g/Lh

)

Tiempo (días)

T=20ºC

T=30ºC

T=40ºC

96

CONCLUSIONES

La cinética de Monod, para este consorcio, describe adecuadamente el

crecimiento bacteriano, no así, la utilización de sustrato ni la generación de

producto. Esto debido a que la medida del sustrato se realizo a través de DQO, el

cual es capaz de oxidar las células microbianas, lo cual puede incrementar el

valor del contaminante presente.

Estimular la producción de biosurfactantes y facilitar asi dicha adaptación, se

adiciona una mezcla de sales minerales que contienen la relación de carbono,

nitrógeno y elementos traza necesaria para el desarrollo microbiano.

El tiempo para alcanzar un grado de degradación de contaminantes fue de 3 días,

observando que existe un intervalo óptimo de temperatura de operación entre 30

y 40 ºC.

La tasa de mantenimiento se reduce, realizando el aporte de energía al sustrato,

por lo que las actividades metabólicas dentro de la célula microbiana se enfocan

en la degradación del sustrato. Esto mejora el rendimiento general del consorcio.

Se puede inferir, que la concentración de petróleo en la que todo metabolismo

microbiano cesa para el consorcio utilizado, es menor a la concentración de

diesel.

Es posible reducir la contaminación del agua por hidrocarburos a valores que ya

no representen toxicidad al medio ambiente cumpliando con la normatividad

ambiental vigente

El proceso es viable dese el punto de vista económico

El proceso es reproducible en otras latidudes y aplicable a otros contaminantes

derivados del petróleo semejantes.

La adaptación del consorcio al sustrato aumenta la eficiencia de la degradación.

Se obtuvieron eficiencias de biodegradación del 95 % para el diesel y del 90%

para el petróleo, con una adaptación previa del consorcio bacteriano.

97

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784-789.

116

ANEXO A CURVA DE REFERENCIA

La curva de referencia se realizo a través de cromatografía de gases con detector FID.

Se prepararon estándares de referencia a una concentración de 5000, 2500, 1000,500,

100 y 50 ppm de diesel en CCl4. Los cromatogramas se muestran en las ilustraciones 1

a 6. En la tabla 0-1 se muestra las curvas de referencia obtenidas de estos

cromatogramas.



117




118


Tabla 0.28 Modelos de las curvas de referencia para la concentración de hidrocarburos obtenidos

por cromatografía de gases.

Nº

Carbonos

Curvas de referencia Ecuación R

2

HCtotal

Y=337.12X-429.76 0.9954

C12

Y=371.32X-40.283 0.9879

C16

Y=351.96X-22.385 0.9761

y = 337.12x - 429.76 R² = 0.9954

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00

mg/

L

Área

y = 371.32x - 40.283 R² = 0.9879

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

mg/

L

Área

y = 351.96x - 22.385 R² = 0.9761

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 0.5 1 1.5 2 2.5

mg/

L

Área

119

C17

Y=358.25X-36.499 0.9750

C18

Y=382.88X-12.846 0.9433

C19

Y=367.93X-18.632 0.9620

C20

Y=394.3X-17.363 0.9377

y = 358.25x - 36.499 R² = 0.975

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 0.5 1 1.5 2 2.5

mg/

L

Área

y = 382.88x - 12.846 R² = 0.9433

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 0.5 1 1.5 2 2.5

mg/

L

Área

y = 367.93x - 18.632 R² = 0.962

0

100

200

300

400

500

600

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

mg/

L

Área

y = 394.3x - 17.363 R² = 0.9377

0

100

200

300

400

500

600

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

mg/

L

Área

120

C21

Y=360.24X-8.4409

0.9738

C22

Y=381.23X-10.447 0.9670

C23

Y=436.01X-10.82 0.9251

y = 360.24x - 8.4409 R² = 0.9738

0

50

100

150

200

250

300

350

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

mg/

L

Área

y = 381.23x - 10.447 R² = 0.967

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

mg/

L

Área

y = 436.01x - 10.82 R² = 0.9251

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

mg/

L

Área

121

ANEXO B LINEARIZACIÓN DE LAS ECUACIÓN DE MONOD

La linearización de la ecuación de Monod a través de Hanes-Wolf para el cálculo de las

constates µmáx y Ks se presenta a continuación.

A partir del modelo de Monod:

CcKs

Cs

Cc

rg

dt

dCc

Ccmáx

1

Obteniendo el recíproco:

máxmáx Cs

Ks

rg

Cc 11

Esta forma de la ecuación, adquiere la forma de la línea recta y = mx + b. Las graficas

de Cc/rg vs 1/Cs se presentan en las ilustraciones 7, 8, 9; para el diesel y 10, 11 y 12

para el petróleo. La velocidad se obtuvo ajustando la concentración de la biomasa y el

tiempo a un polinomio de orden 2, y derivando posteriormente en función del tiempo

como lo señala Ong (Ong, 1983).

122

Ilustración 7 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra de agua

contaminada con diesel a 20ºC.



y = 353.3x + 3.2274 R² = 0.9347

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01

Cc/

rg (

día

-1)

1/Cs (L/mg)

y = 206.44x + 2.0654 R² = 0.863

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01

Cc/

rg (

día

-1)

1/Cs (L/mg)

123




contaminada con petróleo a 20ºC.

y = 116.99x + 1.4819 R² = 0.908

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01

Cc/

rg (

día

-1)

1/Cs (L/mg)

y = 681.28x + 0.835 R² = 0.953

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009

Cc/

rg (

día

-1)

1/Cs (L/mg)

124





y = 681.69x + 0.6217 R² = 0.9491

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009

Cc/

rg (

día

-1)

1/Cc (L/mg)

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009

Cc/

rg (

día

-1)

1/Cc (L/mg)

125

ANEXO C ADAPTACIÓN DEL CONSORCIO BACTERIANO

Preparación del medio mínimo se muestra en las ilustraciones.

1.- Adición de sales minerales y ajuste de pH a 7.2.

2.- Esterilización del medio mínimo en autoclave a 121 ºC durante 20 minutos.

126

Contaminación con diesel y petróleo.

1.- Adición de una unidad de hidrocarburo por nueve unidades de solución de sales

minerales.

2.- Agitación por 72 horas, a 20 rpm, a una temperatura de 30ºC.

3.-Separación de la fase acuosa, la cual contiene la fracción del hidrocarburo capaz de

saturar la solución de sales minerales.

127

Adaptación del consorcio bacteriano.

1.- Presentación del consorcio bacteriano utilizado, soportado en cáscara de trigo.

2.-Pesar 1 g de consorcio por cada 100 mL de fase acuosa contaminada con

hidrocarburos.

3.- Adición en cartuchos de papel filtro del consorcio bacteriano. Se agrega cada

cartucho a 100 mL de fase acuosa contaminada.

128

4.- Agitación a 20 rpm, durante 72 horas, a temperatura constante de 30ºC. Al final de

este período, las soluciones se consideran inoculo adapatado.

Imágenes obtenidas con microscopia óptica en aumento de 60 y 100X.

60X 100X

129

ANEXO D TINCIÓN DE GRAM

El consorcio fue teñido mediante la técnica de Gram. La técnica se describe a

continuación:

Extensión:

En un porta bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca una gota de

agua destilada a la que. con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se

lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia.

Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la extensión por el

calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.

130

Coloración:

Un minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial) se lava con agua destilada.

Un minuto en lugol (mordiente), se decolora con alcohol de 95° (decolorante), se lava

con agua destilada.

Un minuto en fucsina básica (colorante de contraste) se lava con agua corriente se seca

suavemente y sin frotar con papel de filtro.

131

Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña de aceite

de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

En las ilustraciones se muestra fotografías del consorcio utilizado con tinción de gram.

Tinción de gram aplicada al consorcio bacteriano utilizado. Gram (-)

132

ANEXO E CÓDIGOS DE POLYMATH

TEMP. AGUA CONTAMINADA CON DIESEL AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO

20 ºC t(0) = 0

t(f) = 3

rg = (umax * Cs * Cc) / (Ks + Cs)

rsm = m * Cc

rd = kd * Cc

Ypc = -0.616 * t ^ 2 + 1.1629 * t + 0.5591

Ysc = 0.6513 * t ^ 2 - 2.3568 * t + 2.1286

Ks = 109.468

umax = 0.3098

m = 0.065

kd = 0.045

d(Cp)/d(t) = rg * Ypc

Cp(0) = 0.0

d(Cs)/d(t) = Ysc * (-rg) - rsm

Cs(0) = 2640

d(Cc)/d(t) = rg - rd

Cc(0) = 3383.356

t(0) = 0

t(f) = 3


rsm = m * Cc

rd = kd * Cc

Ypc = 0.1928 * t ^ 2 - 0.2169 * t + 0.1863

Ysc = 0.202 * t ^ 2 - 0.6522 * t + 0.524

Ks = 815.904

umax = 1.1976

m = 0.01

kd = 0.15


Cp(0) = 0.0


Cs(0) = 1200


Cc(0) = 3383.356

30 ºC t(0) = 0

t(f) = 3


rsm = m * Cc

rd = kd * Cc

Ypc = -0.5741 * t ^ 2 + 1.0964 * t +

0.2474

Ysc = 0.1799 * t ^ 2 - 0.8272 * t + 0.9418

Ks = 99.951

umax = 0.4841

m = 0.065

kd = 0.040


Cp(0) = 0.0


Cs(0) = 2640


Cc(0) = 3383.286

t(0) = 0

t(f) = 3


rsm = m * Cc

rd = kd * Cc

Ypc = 0.183 * t ^ 2 - 0.2021 * t + 0.1649

Ysc = 0.1785 * t ^ 2 - 0.5761 * t + 0.4639

Ks = 1096.493

umax = 1.6085

m = 0.025

kd = 0.12


Cp(0) = 0.0


Cs(0) = 1200


Cc(0) = 3383.286

40 ºC t(0) = 0

t(f) = 3


rsm = m * Cc

rd = kd * Cc

Ypc = -0.2057 * t ^ 2 + 0.3561 * t +

0.1775

Ysc = 0.214 * t ^ 2 - 0.7644 * t + 0.6758

Ks = 78.946

umax = 0.6748

m = 0.018

kd = 0.12


Cp(0) = 0.0


Cs(0) = 2640


Cc(0) = 3383.349

t(0) = 0

t(f) = 3


rsm = m * Cc

rd = kd * Cc

Ypc = 0.1781 * t ^ 2 - 0.197 * t + 0.1306

Ysc = 0.1447 * t ^ 2 - 0.4613 * t + 0.3674

Ks = 2555.107

umax = 3.7693

m = 0.012

kd = 0.20


Cp(0) = 0.0


Cs(0) = 1200


Cc(0) = 3383.349

SANEAMIENTO DE POR HIDROCARBUROS DEL PETRÓLEO.

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