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UNIVERSIDAD DE JAÉN

Facultad de Ciencias Experimentales

Trabajo Fin de Grado


María José Santolaya Hernández.

Septiembre, 2016

Análisis microbiológico de

diferentes encurtidos

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UNIVERSIDAD DE JAÉN

Facultad de Ciencias Experimentales



María José Santolaya Hernández

Septiembre, 2016

Análisis microbiológico de

diferentes encurtidos

3

ÍNDICE

RESUMEN…………………………………………………………………… 4

ABSTRACT…………………………………………………………………. 4

1) INTRODUCCIÓN…………………………………………………….. 5

1.1 Encurtidos……………………………………………………….. 5

1.2 Proceso de fabricación de los encurtidos…………………. 6

1.2.1 Cambios físicos………………………………………… 8

1.2.2 Cambios químicos……………………………………... 8

1.2.3 Cambios microbiológicos……………………………… 8

1.3 Control de la fermentación……………………………………. 9

1.4 Microbiota asociada a procesos de fermentación………… 10

1.4.1 Bacterias productoras de ácido láctico……………….. 10

1.4.2 Levaduras……………………………………………….. 13

1.4.3 Bacterias productoras de gases………………………. 14

1.5 Saprófitos y alteración………………………………………….. 14

1.6 Efectos de la conservación de los alimentos: encurtidos y

fermentación………………………………………………………….. 15

2) OBJETIVOS…………………………………………………………… 17

3) MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………… 18

3.1 Alimentos utilizados…………………………………………….. 18

3.2 Material de laboratorio………………………………………….. 18

3.3 Medios de cultivo empleados…………………………………. 19

3.4 Preparación de los medios de cultivo……………………….. 24

3.5 Procesado de los alimentos…………………………………… 25

3.6 Recuento e identificación preliminar………………………… 26

4) RESULTADOS ……………………………………………………….. 30

5) DISCUSIÓN……………………………………………………………. 41

6) CONCLUSIONES……………………………………………………… 43

7) BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………… 44

4

RESUMEN

El proceso de fabricación de encurtidos es un método de conservación muy antiguo,

originado por la necesidad de conservar las cosechas de temporada. Una parte

importante de los métodos utilizados para la conservación de alimentos es inhibir el

desarrollo de los microorganismos que pueden llevar a su deterioro, pero también

existe la posibilidad de utilizar algunos microorganismos para conseguir esa

conservación, generando condiciones desfavorables para el desarrollo de otros

microorganismos. En este trabajo se persiguió estimar la incidencia de

contaminación microbiana en los encurtidos vegetales empleados, analizar la

presencia de distintos grupos bacterianos en ellos y realizar un estudio de los

microorganismos presentes sobre estos alimentos. Para ello, se llevó a cabo la

estimación de la carga microbiana de los microorganismos crecidos a partir de las

muestras de encurtidos en los diferentes medios selectivos y no selectivos y se

realizó una identificación preliminar de los microorganismos aislados mediante

tinción de Gram y prueba de la catalasa. Los resultados obtenidos muestran que la

mayoría de los grupos bacterianos aislados son microorganismos asociados a los

procesos de fermentación de los encurtidos: bacterias ácido lácticas y levaduras.

ABSTRACT

The manufacturing process of pickles is a conservation method very old, arising from

the need to conserve the crops seasonal. An important part of the methods used for

food preservation is to inhibit the growth of microorganisms that can lead to their

deterioration, but there is also the possibility of using some microorganisms to get

that conservation, creating unfavorable for the development of other microorganisms

conditions. In this work the incidence of microbial pollution in vegetable pickles

employees was estimated as well as the presence of diverse bacterial groups on

them. To this, it was performed to estimate the microbial load of microorganisms

grown from samples pickled in different selective and nonselective mediums were

performed a preliminary identification of isolated microorganisms using Gram’s stain

and catalase test. The results showed that most groups are bacterial isolates

associated microorganisms fermentation of pickles: lactic acid bacteria and yeasts.

5

1) INTRODUCCIÓN.

1.1 Encurtidos:

Los encurtidos son los alimentos que han sido marinados en una solución de sal y

que fermentan por si solos o con la ayuda de un inoculo (microorganismo como

Lactobacillus plantarum), el cual baja el pH y aumenta la acidez del mismo con el

objetivo de poder extender su conservación. Son aquellos productos vegetales

hortícolas que, tras ser sometidos a diversas transformaciones, tienen en común su

aderezo con vinagre. Este proceso permite preservar por más tiempo los alimentos.

Las especies hortícolas más cultivadas para la realización de encurtidos son:

pepinillo, cebollita, guindilla, rabanitos, zanahoria, repollo, berenjenas, remolacha de

mesa, judía verde, pimiento, tomate verde, alcaparra, coliflor y apio.

La materia prima puede someterse a fermentación ácido-láctica o bien no

fermentarse. Los encurtidos totalmente curados, almacenados en sal, se pueden

convertir en una gran diversidad de productos eliminando la mayor parte de la sal.

La adicción de vinagre los convierte en encurtidos ácidos. También pueden

elaborarse numerosos tipos de encurtidos mediante adiciones de azúcares,

especias, esencias y aromas, pero siempre con presencia de vinagre, ya que es la

característica fundamental del encurtido. Independientemente de los encurtidos se

fermenten o no, pueden pasteurizarse para mejorar su conservación.

Todos los productos de esta naturaleza presentan una gran ventaja: que el riesgo de

intoxicación alimenticia es mínimo.

El encurtido permite conservar los productos vegetales durante mucho tiempo y

tiene la ventaja de que sus características nutritivas y organolépticas se mantienen.

En la elaboración de encurtidos dependen mucho los gustos, las costumbres y las

tradiciones, así como la preferencia por sabores dulces, ácidos, agridulces o

picantes.

6

1.2. Proceso de fabricación de los encurtidos.

El proceso de fabricación de encurtidos consta de las siguientes fases (Martínez,

1988):

- Materia prima: Constituida por los frutos inmaduros de las especies vegetales

utilizadas.

- Selección: Eliminación de las partes blandas de la planta, que normalmente

contienen poblaciones de hongos.

- Calibrado: Clasificación de los frutos según su tamaño.

- Lavado: se realiza un lavado para disminuir la suciedad y los restos de tierra

adherida que puedan llevar los frutos. La higiene en el manejo de la materia es

fundamental al ser la fermentación acido-láctica un proceso microbiológico.

- Fermentación: Es el apartado más importante de todo el proceso de fabricación.

El proceso de fermentación conlleva el uso de microorganismos para realizar

transformaciones de materia orgánica, catalizadas por enzimas. La fermentación ha

sido considerada durante muchos siglos como un arte, la elaboración de vino se

practica desde hace al menos 10.000 años, los historiadores indican que los

egipcios producían cerveza 5.000-6.000 años a.C. y también existen referencias de

elaboración de queso 5.000 años a.C. En resumen, la producción de alimentos y

bebidas fermentadas se viene realizando desde hace aproximadamente 10.000

años, antes de que se conociera la existencia de los microorganismos. (Casp y col.,

2003).

Una parte importante de los métodos utilizados para la conservación de alimentos es

inhibir el desarrollo de los microorganismos que pueden llevar a su deterioro, pero

también existe la posibilidad de utilizar algunos microorganismos para conseguir esa

conservación, generando condiciones desfavorables para el desarrollo de otros

microorganismos, como por ejemplo, la producción de grandes cantidades de

alcohol o de ácido por ciertos organismos crea unas condiciones desfavorables para

el desarrollo de otros. En este principio se basan los métodos de conservación de

alimentos por fermentación (Casp y col., 2003).

7

Un alimento se considera fermentado cuando sus componentes químicos

considerados útiles, son atacados por microorganismos, debido a ello, su

composición química se modifica. En estos procesos fermentativos, además de los

microorganismos, también pueden intervenir procesos proteolíticos debidos a la

acción de enzimas propias del producto alimentario de partida. En algunos casos,

además, el proceso fermentativo es realizado por microorganismos distintos, uno

actúa después de que el otro haya modificado la materia prima original, como por

ejemplo, el caso de los quesos azules, en los cuales después de que las bacterias

lácticas hayan realizado la fermentación de la lactosa, tiene lugar el desarrollo del

moho.

El proceso de fermentación consiste en poner las especies vegetales en solución

salina -salmuera y dejar que la flora microbiana que se encuentra asociada de

forma natural a la materia prima realice la fermentación natural. Los frutos se

reblandecerían durante las primeras horas y comenzarían a producirse

fermentaciones indeseadas que provocarían putrefacción si no utilizásemos un

medio adecuado, por lo tanto, debemos evitar fermentaciones anómalas y crear un

medio adecuado y favorable para la fermentación, como es el caso de la

fermentación acido-láctica.

La combinación de dos factores importantes da lugar a un medio favorable para la

fermentación. Estos factores son:

la concentración de sal

el descenso del pH de la salmuera debido a la producción de ácido láctico por

las bacterias fermentativas.

La fermentación se realiza en depósitos de diferentes tipos y capacidades. Este

proceso tiene lugar en condiciones de anaerobiosis. Durante la fermentación, se

producen cambios físicos, químicos y microbiológicos en los alimentos. (Martínez,

1988).

8

1.2.1 Cambios físicos:

En las primeras 48-72 horas el agua, azúcares, proteínas, minerales y otras

sustancias contenidas en el vegetal se difunden por ósmosis en la salmuera. Estas

sustancias constituirán el alimento de las bacterias productoras de ácido láctico,

bacterias fermentativas y de otros microorganismos. A raíz de ello, los frutos se

arrugan y pierden peso. A continuación, la sal comienza a introducirse en los tejidos

y como consecuencia se produce una entrada de agua que hace que el vegetal

gane peso y vuelva a su situación original. El cambio de textura durante la

fermentación es de gran importancia ya que va a determinar las diferencias

cualitativas entre los encurtidos procedentes vegetales fermentados y de frescos. La

textura de los encurtidos preparados sin fermentación previa es dura, mejorándose

en gran medida con la fermentación.

1.2.2 Cambios químicos:

El principal cambio químico es debido a la transformación de los azúcares

contenidos en los frutos en ácido láctico como consecuencia de la acción

microbiana. El principal producto de la fermentación es el ácido láctico, pero también

se producen cantidades más pequeñas de ácido acético. También aparecen

alcoholes y ésteres en menores proporciones.

A medida que aumenta la producción de ácido láctico, desciende el pH inicial de la

salmuera 6,5- 7, pasando a valores entre 3,4 y 3,8, pero nunca superior a 4.

1.2.3 Cambios microbiológicos:

Durante la fermentación de las hortalizas, la flora implicada en el proceso procede

de las hortalizas crudas y del equipo de la planta de tratamiento utilizado para

prepararlas para el tanque de fermentación. Las hortalizas no se blanquean, gracias

a ello, retienen las bacterias acido-lácticas epifíticas que se encontraban asociadas

con ellas en el campo.

9

Primero se sala la hortaliza mediante una salmuera, éste salazón tiene un efecto

importante en la selección de la microflora predominante. Durante la fermentación, el

desarrollo de los microorganismos se lleva a cabo mediante una compleja

interacción de diversos factores: pH, sal, ácidos orgánicos, actividad del agua,

temperatura, potencial rédox, oxígeno y dióxido de carbono. Con algunas

variaciones, la fermentación de todos los alimentos vegetales sigue un patrón

parecido, que consta de un crecimiento secuencial de bacterias acido-lacticas que

incluyen Leuconostoc-mesenteroides, Lactobacillus brevis, Pediococcus acidilactici,

Pediococcus pentosaceus y Lactobacillus plantarum. Se han observado otras

lácticas, como Enterococcus faecalis, pero no son importantes en la fermentación.

1.2 Control de la fermentación.

El control de los microorganismos de la alteración depende del tipo de producto

encurtido, pero generalmente se consigue mediante:

Distribución adecuada de la sal o de la composición de salmuera: La

concentración de sal de las salmueras es otro de los parámetros más

importantes. No sólo se trata de favorecer una correcta fermentación desde el

inicio sino que debiera mantenerse una concentración constante y renovarla

si fuese preciso (Özay y Borcakli, 1995; Montaño y col., 1993; Bobillo y

Marshal, 1991). Tassou y col., (2002) demostraron que una concentración de

sal baja favorece el crecimiento de bacterias lácticas mientras que valores

elevados estimulan el crecimiento de levaduras.

Control del pH: Uno de los parámetros que se controlan de forma rutinaria

para evaluar el éxito de una fermentación es la acidez, tanto libre como total

(Panagou y Tassou, 2006).

Secuencia de fermentación adecuada (en los encurtido fermentados)

Mantenimiento de la temperatura apropiada durante la fermentación:

Tassou y col., (2002) también pusieron de manifiesto la importancia de la

temperatura en los procesos de fermentación. El uso de temperaturas

elevadas para la preservación del alimento está basado en su efecto

destructor en los microorganismos (Jay, 1992).

10

Destrucción o inhibición de la actividad de levaduras oxidativas: Se puede

conseguir cubriendo totalmente la superficie del tanque para excluir el

oxígeno.

Uso de cultivo indicadores.

1.3 Microbiota asociada a procesos de fermentación:

Existen numerosos tipos de microorganismos que intervienen en la fermentación, sin

embargo, los más importantes son:

Bacterias productoras de ácido láctico.

Bacterias productoras de gases.

Levaduras.

1.4.1 Bacterias productoras de ácido láctico

Una correcta fermentación se basa en la presencia y el rápido crecimiento de

bacterias lácticas (Garrido Fernández y col., 1997).

Las bacterias lácticas son un grupo de microorganismos representado por varios

géneros, con características morfológicas, fisiológicas y metabólicas en común.

Generalmente, las BAL son cocos o bacilos Gram positivos, no esporulados, no

móviles, anaeróbicos aunque generalmente toleran el oxígeno (aerotolerantes);

oxidasa, catalasa y bencidina negativas, carecen de citocromos, no reducen el

nitrato a nitrito y producen ácido láctico como el único o principal producto de la

fermentación de carbohidratos ( Carr y col., 2002; Vázquez y col., 2009). Además,

las BAL son acido tolerantes, pudiendo crecer algunas a valores de pH tan bajos

como 3.2, y valores tan altos como 9.6, y la mayoría crece en pH entre 4 y 4.5,

permitiéndoles sobrevivir en medios donde otras bacterias no aguantarían la

aumentada actividad producida por los ácidos orgánicos (Carr y col., 2009).

Las bacterias ácido lácticas comprenden un grupo muy heterogéneo de

microorganismos con fenotipos semejantes. Se clasifican en géneros en función de

sus diferentes características como morfología, modo de fermentación, crecimiento,

etc. Son los siguientes géneros: (Axelsson, 1998; Carr y col., 2002)

11

Aerococcus, Alloinococcus, Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus,

Globicatella, Lactobacillus, Lactococcus, Lactophaera, Leuconostoc, Oenococcus,

Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella.

Sin embargo, en el grupo de las bacterias lácticas caracterizadas por una gran

producción de ácido láctico y que presentan un interés particular en la fermentación

de alimentos se incluyen los géneros:

Lactobacillus: Los lactobacilos son bacilos que de manera habitual se

asocian en cadenas largas. Algunos lactobacilos alteran alimentos (por

ej.,Lb.plantarum), mientras que otros son valiosos cultivos indicadores para la

industria láctea.

Streptococcus: Presentan células similares a las del género Lactococcus La

mayoría de las especies crecen a 45ºC pero no a 10ºC. Streptococcus

thermophilus se utiliza como cultivo indicador en la elaboración de queso y

yogurt.

Leuconostoc: Son cocos que se agrupan en pares o en cadenas. Estas

bacterias son las encargadas de la fermentación de los carbohidratos

produciendo ácido y gas. Los leuconostoc son relativamente ácidorresistentes

y moderadamente tolerantes a la sal. Algunas de las especies de este género,

se utilizan en la fermentación de hortalizas (por ej., L. mesenteroides).

Pediococcus: Son cocos que se presentan individualmente, en pares o

tétradas. Juegan un papel importante en la fermentación de la carne. Las

especies de mayor interés son P.acidilactici y Pediococcus.cerevisiae.

Ya en 1920, Orla-Jensen clasificó las bacterias lácticas en dos grupos según sus

características bioquímicas, las homofermentativas y las heterofermentativas. La

diferencia entre estos dos grupos se detecta por la liberación de oxígeno. Las

bacterias homofermentativas se caracterizan por la capacidad de transformar la

glucosa y, en la mayor parte de los casos, también la fructosa en ácido láctico, con

producción nula o mínima de otros productos secundarios. Las bacterias

heterofermentativas no tienen fructosa-difosfato-aldolasa y por lo tanto degradan los

glúcidos por la vía llamada de las pentosas fosfatos o de las hexosas fosfatos.

12

Fermentación homoláctica (ruta de Embden –Meyerhof-Parnas):

C6H12O6 2 CH3-CH(OH)-COOH + 2ATP

La glucosa se convierte en ácido láctico casi cuantitativamente.

Fermentación heteroláctica (ruta de la fosfocetolasa):

C6H12O6 2 CH3-CH(OH)-COOH + CH3-CH2OH + CO2 + ATP

La glucosa se convierte en ácido láctico, etanol y gas dióxido de carbono.

Las homofermentadoras, como Lactococcus, Streptococcus, Pedicococcus,

Vagococccus y algunos Lactobacillus poseen la enzima aldolasa y producen ácido

láctico como el producto principal de la fermentación de la glucosa utilizando la via

de la glucólisis (Embden-Meyerhof)(Axelsson,1998). Por su parte las del género

Leuconostoc, Oenococcus, Weisella, Carnobacterium, Lactosphaera y algunos

Lactobacillus son heterofermentadoras y convierten hexosas a pentosas por la via 6-

fosfogluconato-fosfocetolasa, produciendo en el proceso cantidades significantes de

productos como acetato, etanol y CO2 además de ácido láctico. (Carr y col., 2002).

En la producción de moléculas no proteicas pequeñas y de bacteriocinas por las

bacterias lácticas, conviene resaltar que el desarrollo en aerobiosis de estas, lleva a

la formación de varios metabolitos del oxígeno, peróxido de hidrógeno, aniones

superóxido y radicales libres, que poseen un efecto bacteriostático y bactericida

frente a la flora láctica y no láctica. La actividad antimicrobiana de los ácidos

orgánicos (láctico, acético y fórmico) y del pH es complementaria, mientras que la

mayor actividad inhibidora la posee la fracción no disociada de los ácidos orgánicos.

La actividad antimicrobiana del diacetilo, acetaldehido y de los isómeros D de los

aminoácidos es mucho menor y menos significativa. (Hernández y col., 1993).

La síntesis del ácido láctico y la tolerancia de las bacterias lácticas a este ácido

orgánico y a un pH inferior a 7, se utilizan en la conservación de alimentos, en

productos lácteos, productos cárnicos y vegetales fermentados. Estas condiciones

soportables para las bacterias lácticas, no lo son para otros muchos

microorganismos causantes de alteraciones como Pseudomonas, enterobacterias,

Alcaligenes, Acinetobacter, etc. Sin embargo, las bacterias lácticas pueden crear

13

problemas en algunas otras industrias, produciendo sabores y olores desagradables,

como: vino, cerveza, carne, zumos de frutas, etc. (Casp y col., 2003)

La fermentación acido-láctica es uno de los métodos más antiguos para preservar

los alimentos, además de mejorar sus propiedades sensoriales y nutricionales, es un

proceso microbiano muy complejo en el cual la población de bacterias lácticas llega

a ser la microflora predominante. (Shirai y col., 1996; García y col., 1998; Schneider

y col., 2006).

1.4.2 Levaduras

Las levaduras son organismos heterotróficos cuyos hábitats naturales son la

superficie de tejidos vegetales. La mayoría son aerobios obligados, aunque algunos

son anaerobios facultativos. Son organismos bastante sencillos en sus demandas

nutricionales, requiriendo una fuente de carbono reducido, varios minerales, una

fuente de nitrógeno y vitaminas.

Las levaduras pertenecen a tres clases de hongos: ascomicetos, basidiomicetos y

deuteromicetos, ésta última incluye las formas imperfectas de las levaduras. La

temperatura normal que permite el crecimiento de la mayor parte de las levaduras

oscila entre 25 y 30ºC, a pesar de que éstas no son las temperaturas óptimas de

crecimiento de las levaduras en sus hábitats naturales. Su velocidad de crecimiento

disminuye progresivamente para valores de aw inferiores a 0.99. Aunque el efecto de

la presión osmótica varía de una cepa a otra, la mayor parte de las cepas no pueden

desarrollarse para actividades de agua inferiores a 0.90, pero algunas toleran

presiones osmóticas mayores. Todas las levaduras son capaces de desarrollarse en

presencia de oxígeno: no hay levaduras anaerobias estrictas. (Casp y col., 2003)

Las levaduras van siempre asociadas a la fermentación especies hortícolas y

pueden dividirse dividirse en dos grupos:

Levaduras oxidativas o formadoras de película en la superficie de la

salmuera, que dan lugar a malos olores y a un producto de calidad inferior

debido a que consumen ácido láctico por oxidación .Dentro de este grupo

están los géneros Debaryomices, Endomycopsis y Candida. Este grupo de

levaduras puede ser controlado mediante la acción directa de la luz solar,

rayos ultravioleta, aceite mineral o cubiertas de plástico. El desarrollo

14

excesivo de estas levaduras traerá como consecuencia un peligroso ascenso

del pH de la salmuera al desaparecer el ácido láctico. Es por tanto

imprescindible la eliminación de estas levaduras.

Levaduras que desarrollan su actividad en la masa de salmuera y fermentan

restos de azúcares, produciendo una fermentación gaseosa (CO2) y alcohol.

Los géneros incluidos en este grupo son Torulopsis, Brettanomces,

Zvgosacharomices, Hajisenula y Kloeckera. La adición de ácido sórbico

inhibe la actividad de estas levaduras.

Durante la fermentación y el almacenamiento, las levaduras pueden producir

etanol, ácidos orgánicos, glicerol, alcoholes superiores, ésteres, y otros

compuestos volátiles que contribuirán significativamente a la textura y el aroma y,

a su vez, en la aceptación del producto por parte del consumidor (Garrido-

Fernández y col., 1997; Montaño y col., 2003; Sabatini y col., 2007).

1.4.3 Bacterias productoras de gases:

Dentro del grupo de bacterias productoras de gases tenemos las especies

coliformes del género Aerobacter. Estas bacterias se caracterizan por la producción

de anhídrido carbónico e hidrógeno. En una concentración de salmuera elevada

este género da lugar a una formación de gases muy vigorosa. A medida que

concentración de la salmuera desciende, la actividad se hace menor debido a que la

rápida formación de ácido láctico inhibe el desarrollo de estas bacterias productoras

de gases. Dentro de este grupo también se encuentra Lactobacillus brevis, que es

un bacilo productor de gas que en determinadas ocasiones puede ayudar a la

formación de ácido láctico.

1.5 Saprófitos y alteración:

La alteración de las hortalizas durante el proceso de fermentación se puede

producir de diversas maneras. Una de las principales causas es la distribución

irregular de sal. Si la concentración de sal es demasiado elevada en zonas

localizadas, pueden crecer algunas levaduras (Pederson y Kelly, 1938) o

lactobacilos (Stamer y col., 1973) y hacer que el producto adquiera color rosado; si

15

la concentración de sal es baja, es posible que la chucruta se ponga blanda debido a

las bacterias coliformes. Las hortalizas fermentadas se pueden convertir

microbiológicamente en estables con tal de que, todos los carbohidratos

fermentescibles sean eliminados durante la primera fermentación, exista ácido

suficiente para impedir el crecimiento de bacterias esporógenas de alteración, y el

oxígeno se elimine de los productos para impedir el crecimiento de superficie de

levaduras, de mohos y de bacterias esporógenas de la alteración (Fleming y col.,

1983). Si existe oxígeno, levaduras oxidativas pueden crecer rápidamente y utilizar

el ácido láctico que se forma. Debido a ello, aumentara el pH y permitirá el

crecimiento de las formas de alteración menos acidotolerantes.

Los encurtidos dulces y ácidos (no pasteurizados) preparados a partir de encurtidos

conservados en sal se conservan con vinagre y/o azúcar. En el caso de que el nivel

de ácido o de azúcar sea insuficiente, se desarrollará la alteración debida a bacterias

acidolácticas o a levaduras (Etchells y Bell, 1976).

Las levaduras y bacterias acidolácticas alteraran el producto si los encurtidos recién

envasados presentan una pasteurización insuficiente. Si la acidez es insuficiente en

la salmuera, las esporas de los anaerobios butíricos germinarán, crecerán y

alteraran el producto. Elevadas poblaciones de esporas en los productos de este

tipo indican el escaso e insuficiente lavado del fruto antes de ponerlo en la

salmuera.

1.6 Efectos de la conservación de los alimentos: Encurtidos y Fermentación.

La técnica de la fermentación se desarrolló como una forma de energía baja para

conservar los alimentos, junto con el secado y salado antes de la aparición de la

refrigeración, congelación y enlatado. Los ejemplos más divulgados han sido la

utilización de bacterias del ácido láctico para reducir el pH y el empleo de la levadura

para efectuar fermentaciones alcohólicas. El mecanismo de preservación se lleva a

cabo por la conversión de los hidratos de carbono y componentes relacionados con

productos finales, como ácidos, alcoholes y dióxido de carbono.

El alimento conserva un amplio valor nutricional, además, los cambios que se

producen durante los procesos de fermentación pueden aumentar el valor

16

nutricional de las materias primas, como por ejemplo, la acumulación de vitaminas

y antioxidantes o la conversión de polímeros relativamente indigeribles a productos

de degradación a más asimilable.(Bamforth, C. W . 2008).

Las técnicas de preparación y conservación de los alimentos son notorias en todas

las principales culturas, ya que no solo nos facilitan el vino, el pan, el queso, sino

también, miso, temphe, shoyu, idli y poi-poi, los encurtidos y el chucrut. Durante el

proceso de fermentación, se desarrollan microorganismos que alteran la

composición del alimento vegetal o animal aumentando la cantidad del ácido láctico

que contiene. Debido a esto, cambia el sabor y el aroma de los alimentos, se hacen

más fuertes y característicos, y algunas veces más amargos. Aunque puede haber

alguna pérdida de vitaminas y minerales solubles en el agua durante los procesos de

encurtido y fermentación, en conjunto, la influencia de los alimentos fermentados en

nuestra salud es bastante favorable. Son fáciles de digerir, e incluso, algunos se

usan para ayudar a la digestión. La investigación moderna ha demostrado que la

fermentación aumenta los valores nutritivos de los alimentos, sobre todo la vitamina

B. Se ha demostrado que el miso y el temphe (ambos productos de la fermentación

de la soja) tienen propiedades antibacterianas y pueden ser efectivos agentes en la

prevención de la enfermedad. Además tanto en el temphe como el natto (otro

producto fermentado de la soja) se aprecian múltiples aumentos de la vitamina B12.

Podemos suponer con seguridad que toda esa actividad microbiana en los alimentos

fermentados también aumenta su nivel de energía. (Colbin, 2004, el poder curativo

de los alimentos).

17

3) OBJETIVOS:

Los objetivos de nuestro estudio fueron los siguientes:

Cultivar y aislar los diferentes microorganismos presentes en encurtidos.

Evaluar la carga microbiana de los diferentes alimentos encurtidos.

Realizar un estudio de identificación macroscópico y microscópico de los

organismos aislados.

Evaluar la variabilidad de los resultados obtenidos en las diferentes sesiones.

18

3) MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Alimentos utilizados:

Para la realización de este proyecto se han analizado muestras de 12 tipos de

alimentos diferentes. El estudio se dividió en dos sesiones.

En la primera sesión se utilizaron 6 muestras de encurtidos (pepinillos, guindilla,

berenjena casera, aceitunas machacadas, surtido y aceituna manzanilla).En la

segunda sesión se utilizaron 6 muestras de encurtidos distintas (alcaparras,

aceitunas negras, maíz, altramuces, aceitunas aliñadas y berenjenas).

La mayoría de muestras son procedentes de alimentos cogidos a granel y otras

muestras son procedentes de encurtidos caseros (guindilla, berenjena, aceitunas

machacadas y aceitunas negras) ya que poseen menos cantidad de conservantes

que las conservas industriales. (Ver Fig. 1)

Fig.1 Muestras de alimentos.

3.2 Material de laboratorio:

1. Cloruro de sodio (NaCl).

2. Agua destilada.

3. Matraz Erlenmeyer de 500ml

4. Gradilla.

5. Probeta.

6. 25-30 tubos Eppendorff de 1,5ml

7. Algodón hidrófobo

8. Papel de aluminio

19

9. Báscula

10. Mechero Bunsen

11. Autoclave

12. Placas de Petri de 15ml

13. Asa de siembra triangular de Digralsky

14. Bolsas de plástico de cierre hermético.

15. Caja de puntas estériles para pipeta de 100µl.

16. Pipeta de 100µl

17. Triturador homogeneizador Stomacher 80 Biomaster, Seward Ltd..

18. Tubos Falcon de 50ml.

19. Estufas de cultivo reguladas a 37ºC y 30ºC

20. Agua oxigenada.

Material para tinción:

1. Agua destilada

2. Mechero bunsen

3. Asa de siembra

4. Portaobjetos

5. Cubeta

6. Pinzas

7. Alcohol 96º

8. Cristal violeta

9. Safranina

10. Lugol

11. Aceite de inmersión

12. Microscopio óptico, objetivo 100X

3.3 Medios de cultivo empleados:

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de

microorganismos. Existe una gran variedad de medios debido a que la diversidad

metabólica de los microorganismos es enorme.

20

Para el análisis microbiológico de los alimentos se han empleado 5 tipos de medios

de cultivo:

Un medio general: Son medios apropiados para el crecimiento de la mayoría

de microorganismos por la facilidad con la que se desarrollan en ellos.

a) Tríptona Soja Agar (TSA) (Panreac,Barcelona)

Se utiliza como medio de uso general para el cultivo de todo tipo de

microorganismos .Su aportación nutritiva permite el desarrollo óptimo de un gran

número de microorganismos, tanto exigentes como no exigentes. Se utilizan como

tales o como base para preparar medios especiales (Agar Sangre, Agar Proteus)

Composición (g/l):

Digerido Papaínico de Soja 5,0 g

Digerido Pancreático de Caseína 15,0 g

Sodio Cloruro 5,0 g

Agar 15,0 g

pH final: 7,3±0,2

(Panreac, Manual Básico de Microbiologia, 2003)

Cuatro medios selectivos: Estos medios presentan componentes

inhibidores del desarrollo de ciertos microorganismos, lo cual permite aislar

una determinada especie o evitar la presencia de agentes contaminantes.

b) Eosina Azul de Metileno (EMB), Agar. (Panreac, Barcelona)

Es un medio diferencial que se emplea para el aislamiento y diferenciación de

bacterias entéricas Gram-negativas.

Gracias a la combinación de estos dos colorantes y los dos hidratos de carbono se

pueden distinguir algunos géneros. Las bacterias lactosa-negativas y sacarosa

negativas (Salmonella y Shigella) dan colonias incoloras, mientras que las lactosa

21

y/o sacarosa-positivas dan colonias púrpura-violeta negruzco con/sin un centro

oscuro y quedan rodeadas de una zona incolora. Estos productos, además inhiben

el crecimiento de la microflora acompañante, sobre todo la Gram-positiva. También

es posible la identificación de Candida albicans.

Composición (g/l):

Eosina Amarillenta 0,4

Azul de Metileno 0,065

Lactosa 5,0

Peptona Bacteriológica 10,0

di-Potasio Hidrógeno Fosfato 2,0

Sacarosa 5,0

Agar 13,5

pH: 7,2±0,2


c) Vogel-Johnson, Agar (VJ) (Panreac, Barcelona)

Es un medio sólido con una fuerte acción selectiva para el aislamiento y la

identificación de Estafilococos donde la flora secundaria es inhibida casi por

completo. Los Estafilococos reducen el telurito a teluro metal lo que da colonias

negras sobre un fondo rojo si no son fermentadores del manitol y los fermentadores

del manitol dan colonias negras rodeadas de un halo amarillo. El cambio de color del

medio es debido al viraje del indicador de pH producido por la acumulación de

productos ácidos, obtenidos en la fermentación del manitol. La selectividad del

medio se mantiene durante las primeras 24 horas.

Composición (g/l):

Extracto de Levadura 5,0

Glicina 10,0

Litio Cloruro 5,0

D(-)-Manita 10,0

22


Rojo de Fenol 0,025

Triptona 10,0

Agar 15,0

pH: 7,2±0,2


d) MRS,Agar (Panreac, Barcelona)

Medio empleado para el cultivo y recuento de Lactobacilos. Es un medio ideal para

el crecimiento masivo de cepas de lactobacilos, tanto en productos lácteos como en

productos alimenticios en general.

La presencia de la peptona, glucosa, manganeso y magnesio aportan los

componentes nutritivos y energéticos para el crecimiento de los Lactobacilos. El di-

Amonio Hidrógeno Citrato es el inhibidor del crecimiento de la mayor parte de

gérmenes contaminantes. El di-Potasio Hidrógeno Fosfato estabiliza el pH del

medio, mientras que el Tween®constituye su fuente de ácidos grasos. Debido a ello,

este medio es ideal para el crecimiento masivo de todas las cepas de Lactobacilos,

incluso aquellas de crecimiento lento y difícil. El crecimiento también puede

mejorarse reduciendo el pH hasta 5,5 aproximadamente, sin embargo, se dificulta la

gelificación del medio. Si se acidifica a pH=5,5 ±0,1 permite el recuento de los

Lactobacilos propios del yogur.

Composición (g/l):

di-Amonio Hidrógeno Citrato 2,0

Extracto de Carne 8,0


D(+)-Glucosa 20,0

Magnesio Sulfato 0,2

Manganeso(II) Sulfato 0,05

Peptona Bacteriológica 10,0

23


Sodio Acetato 5,0

Tween 80 1,0

Agar 10,0

pH: 6,2±0,2


e) Agar Kanamacina Aesculina Azida (KAA- Agar) (Panreac, Barcelona)

Medio empleado para la detección, aislamiento y confirmación de enterococos en

alimentos, aguas y otras muestras biológicas. Este medio presenta una selectividad

muy elevada para enterococos, incluso superior a otros medios comparables.

Composición (g/l):

Sulfato de Kanamicina 0,02

Esculina 1,0

Azida Sódica 0,15

Citrato férrico 0,5


Cloruro de sodio 5,0

Citrato disódico 1,0

Triptona 20,0

Final pH 7,0 ± 0.2

(Panreac Manual básico de microbiología, 2003).

24

3.4 Preparación de los medios de cultivo:

Preparamos 5 medios de cultivo diferentes:

Un medio general (TSA) y 4 medios selectivos (EMB, MRSA, KAA y Vogel–

Johnson), todos ellos preparados según las indicaciones del fabricante.

Para el estudio fueron necesarias:

4 placas de TSA por muestra (6): 24 placas de TSA.

2 placas de MRS por muestra (6): 12 placas de MRS

2 placas de KAA por muestra (6): 12 placas de KAA

2 placas de Vogel-Johnson por muestra (6): 12 placas de Vogel-Johnson

2placas de EMB por muestra (6): 12 placas de EMB.

Con anterioridad, se prepararon dos matraces de solución salina esteril al 0,9%: 300

ml agua destilada + 2,7 gr ClNa para el procesado de los alimentos.

Solución salina estéril al 0,9%: 40 ml de agua destilada + 0,36 gr de ClNa para

diluciones.

Para la preparación de los medios de cultivo, se pesa la cantidad necesaria del

medio y su posterior disolución en agua destilada. Como las indicaciones del

fabricante están determinadas para la cantidad que hay que añadir para una

disolución en un litro de agua, se calcula la cantidad de medio necesario para diluirla

en 800ml de agua necesarios para el estudio. Así pues:

- TSA: 800 ml de agua + 32 g de TSA (Dilución original 40g/l)

- MRS: 800 ml de agua + 49.6 g de MRS (Dilución original 62g/l)

- KAA: 800 ml de agua + 34.4 g KAA (Dilución original 43 g/l)

- Vogel-Johnson: 800 ml de agua + 48 g Vogel-Johnson (Dilución original 60 g/l)

- EMB: 800 ml de agua + 28,8 g EMB (Dilución original 36g/l)

25

Una vez diluidos los medios en los matraces, estos se esterilizan mediante

autoclavado a 121ºC durante 20 minutos, a excepción del MRS que se autoclava a

115ºC durante 20minutos, ya que es un medio con gran cantidad de glucosa y a una

temperatura superior se carameliza. Una vez sacados del autoclave se pasan al

baño María donde se atemperan a unos 50ºC y se vierten en las placas Petri. Este

proceso se lleva a cabo siempre al lado del mechero para evitar contaminación

externa del medio. (Ver Fig.2 y Fig.3)

Fig.2. Preparación de los medios Fig.3. Preparación de los medios

A continuación las placas se dejan enfriar para que los medios solidifiquen y se

rotula en ellas el tipo de medio, el alimento sembrado y la dilución.

3.5 Procesado de los alimentos:

Para el procesado de alimentos se pesan 5gramos de muestra de cada tipo de

alimento y a continuación se introducen en bolsas herméticas donde se le añade

45ml de solución salina estéril al 0,9% a cada una de las muestras.

Posteriormente, la mezcla de alimento y solución salina son procesados por el

triturador- homogeneizador Stomacher 80 Biomaster, Seward Ltd.

Una vez homogeneizadas las muestras, se preparan tubos eppendorff en una

gradilla para realizar las diluciones decimales y cada tubo se rellena con 0,9ml de

solución salina estéril.

Para el medio general (TSA), se preparan diluciones seriadas a razón de -1,-2,-3 y la

solución madre que es considerada la dilución 0. Para los medios selectivos

(MRS,EMB, KAA ,VJ) se preparan diluciones a razón 0 (solución madre) y -1.

26

Las diluciones seriadas se preparan añadiendo 100µl de la solución madre sobre 0,9

ml de solución salina y así sucesivamente continuando de forma seriada. (Ver Fig.4)

Fig.4. Diluciones decimales.

Una vez realizadas las diluciones, se procede a la siembra de la muestra. Se

siembran 100µl de cada dilución, de la 0 hasta la -3 en el medio general TSA y 100µl

de las dos primeras diluciones (0 y -1) en las placas de los medios selectivos. Todo

el proceso se realiza siempre en condiciones estériles al lado del mechero Bunsen y

las muestras son distribuidas de forma homogénea sobre el medio con la ayuda de

la espátula de Drigalsky.

Los recuentos bacterianos de los medios se realizan tras 48horas, teniendo en

cuenta que a las 24horas ya no se aprecia el viraje de color en el medio selectivo

Voguel Jhonson y a una temperatura de 37ºC, con la excepción del medio selectivo

MRS que se incuba a 30ºC.

3.6 Recuento e Identificación preliminar:

Los recuentos e identificación bacteriana se llevaran a cabo tras 48horas de

incubación. Se observara el número y morfología de las colonias bacterianas

además de los cambios observados en los medios.

A continuación las colonias de diferentes morfologías obtenidas de cada medio de

cultivo serán seleccionadas para la identificación mediante la tinción de Gram y

prueba de la catalasa. (Ver Fig.5)

27

Fig.5. Identificación mediante Tinción de Gram

Tinción de Gram:

Tinción desarrollada por Christian Gram en 1884.Esta técnica es uno de los primeros

pasos a realizar para cualquier identificación bacteriana ya que es capaz de

diferenciar a 2 grandes grupos de eubacterias: Gram positivas y Gram negativas.

La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:

1. Primer colorante: Un colorante básico que al contacto con las células cargadas

negativamente produce una reacción con ellas coloreándolas. El más usado es

el Cristal de Violeta.

2. Solución mordiente: Cuya función es fijar las tinciones y aumentar la afinidad

entre el colorante y las células.

3. Agente decolorante: Un disolvente orgánico como alcohol.

4. Colorante de contraste: Un colorante de distinto color que el primero, como la

Safranina.

Las Bacterias Gram positivas se teñirán de azul debido al cristal violeta y no

perderán su coloración, sin embargo, las bacterias Gram negativas perderán la

coloración debida al cristal violeta en los sucesivos pasos y se teñirá de rosa debido

a la Safranina. Esta diferencia es debida a la composición de su envoltura celular.

Las bacterias Gram positivas poseen una malla de peptidoglicano en su parte

externa, sin embargo, las Gram negativas, recubriendo a una membrana de

peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la célula.

28

Realización:

- Añadir una gota de agua sobre un porta limpio

- Con el asa de siembra esterilizada se toma una muestra de la colonia

deseada y se extiende sobre la gota de agua.

- Secar y fijar la muestra con calor suave.

- Teñir con cristal de violeta y dejar actuar durante 2minutos.

- Escurrir el exceso de colorante y cubrir con Lugol durante 2minutos.

- Lavar con exceso de Lugol con agua.

- Decolorar con alcohol de 96º unos 30 segundos.

- Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

- Teñir con Safranina y dejar actuar durante 3 minutos.

- Lavar con agua para eliminar el colorante.

- Secar la preparación.

- Añadir una gota de aceite de inmersión y examinar al microscopio con el

objetivo 100X.

(Fig. 6.) Tintes para la tinción Gram

29

Prueba de la catalasa:

Realizamos la prueba de la catalasa a las colonias aisladas del medio selectivo

Voguel Jhonson.

La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Dicha

enzima es la encargada de la descomposición de hidrógeno en agua y oxígeno. El

desprendimiento de burbujas de oxigeno indica que la prueba es positiva.

Método:

Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos. A continuación, hacer

en ella una suspensión del microorganismo.

La presencia de catalasa se pondrá de manifiesto por un desprendimiento de

burbujas.

2 H2O22 H2O + O2.

30

4) RESULTADOS:

Recuento y carga microbiana.

Para el recuento se seleccionan las placas en las cuales en número de colonias se

encuentre entre 30-300 colonias. Seguidamente recuento de colonias es expresado

en Unidades Formadoras de Colonias por gramo de alimento (UFC/g) que sirve

para evaluar la carga microbiana de los alimentos empleados.

Sesión 1

UFC/g TSA MRS VJ KAA EMB

Pepinillos

2.102 3.10³ x x x

Guindilla(casera)

1,25.106 5.102 x x x

Berenjena(casera)

1,5.107 >3.105 x >3.105 x

Aceitunas de cornezuelo (caseras)

x 1,7.104 5.103 x x

Surtido

1,7.104 1,1.104 x x x

Aceituna manzanilla

5.104 >3.105 x x x

Tabla 1: Resultados de la carga microbiana (UFC/g) de los distintos alimentos del grupo 1

sembrados en los diferentes medios.

De acuerdo con los resultados de la sesión 1, en los que se hace referencia en la

Tabla 1, en su mayoría, solo se aislaron bacterias en los medios de cultivo TSA y

MRS, lo que pone de manifiesto que los organismos presentes en estos alimentos

eran bacterias lácticas. Podemos destacar mayor número de bacterias lácticas en

aceituna manzanilla y berenjena, con recuentos que superan las 5 unidades

logarítmicas. Además, en berenjena también se obtuvo presencia de enterococos en

una proporción elevada.

En el caso de aceitunas de cornezuelo, no hay crecimiento en el medio TSA, sin

embargo, si se obtuvo en los medios MRS y VJ, por lo que suponemos que ha

habido algún error en el caso del TSA. (Ver Graf.1)

31

Gráfica 1. Representa la carga microbiana de las muestras de encurtidos presentes en los

distintos medios de cultivo utilizados en la sesión 1.

En la Grafica 1, podemos observar claramente que la mayor carga microbiana se

encuentra en los medios TSA y EMB en todas las muestras de encurtidos a estudio.

Sesión 2

UFC/g TSA MRS VJ KAA EMB

Aceitunas negras(caseras)

9.106 >3.105 >3.105 3,8.104 >3.105

Alcaparras

5.102 1,01.105 3.102 6.102 4,5.104

Maíz

x x x x x

Altramuces

7,2.104 >3.105 7,9.103 3.104 3.104

Aceitunas aliñadas

1,18.104 1,2.105 x 3.104 2.104

Berenjenas aliñadas

1,4.103 3.104 8.102 1,5.103 1,1.103

Tabla 2: Resultados de la carga microbiana (UFC/g) de los distintos alimentos del grupo 2

sembrados en los diferentes medios.

En la Tabla 2, que hace referencia a los resultados obtenidos en la sesión 2,

observamos mayor carga microbiana en casi todos los medios, a excepción del maíz

que no presenta crecimiento en ninguno de los medios. Podemos destacar un mayor

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

EMB

KAA

VJ

MRS

TSA

32

crecimiento en las aceitunas negras caseras y los altramuces comparados con los

demás con cargas microbianas superiores a los 3x105. (Ver Graf.2)

Grafica 2. Representa la carga microbiana de las muestras de encurtidos presentes en los

distintos medios de cultivo utilizados en la sesión 2.

En la gráfica 2, observamos una mayor distribución de microorganismos en los

diferentes medios, a excepción del maíz que no presenta crecimiento alguno. Sin

embargo, sigue habiendo predominancia del crecimiento de microorganismos en los

medios TSA y EMB.

Identificación macroscópica y microscópica (tinción de Gram) de

las muestras.

Una vez obtenido el recuento en los diferentes medios, elegimos algunas de las

colonias representativas de cada medio para, posteriormente, poder realizar un

estudio morfológico de ellas. En la identificación de los microorganismos se

observan las características macroscópicas (morfología, color, tamaño…) y las

características microscópicas en las que se puede observar las agrupaciones de los

microorganismos y el tipo de pared mediante la tinción de Gram.

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

EMB

KAA

VJ

MRS

TSA

33

Sesión1

TSA

Alimentos Identificación macroscópica

Identificación microscópica

Pepinillos Colonias blancas pequeñas Cocos Gram Positivos

Guindilla(casera) Colonias blancas pequeñas Gran cantidad de Cocos

Gram Positivos Berenjena (casera) Colonias blancas grandes

Colonias blancas pequeñas Bacilos Gram Positivos Cocos Gram Positivos

Aceitunas de cornezuelo(caseras)

Sin crecimiento x

Surtido Colonias blancas pequeñas Cocos Gram Positivos agrupados en racimos

Aceitunas manzanilla Colonias blancas pequeñas Bacilos dispersos Gram Positivos

Tabla 3: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en medio TSA.

En la tabla 3, se muestran las características macroscópicas y microscópicas de

colonias aisladas en el medio general TSA. Con respecto a las características

macroscópicas, la mayoría de las muestras presenta crecimiento de colonias

blancas de diferentes tamaños (en su mayoría tamaño pequeño) a excepción de la

muestra de aceitunas de cornezuelo que no presenta crecimiento alguno ( debido a

un error).En cuanto a la tinción de Gram, la mayor parte son cocos Gram positivos a

excepción de las muestras de berenjena que en su caso presenta dos tipos de

morfologías (colonias blancas grandes y pequeñas) siendo las colonias de mayor

tamaño bacilos Gram positivos y las de tamaño menor cocos Gram positivos y la

muestra de aceitunas manzanilla que solo muestra presencia de bacilos Gram

positivos.

MRS



Pepinillo

Colonias blancas Levaduras

Guindilla (casera) Colonias blancas pequeñas Levaduras

Berenjena (casera) Colonias blancas grandes Colonias blancas pequeñas

Bacilos Gram Positivos Gran cantidad de levaduras


Colonias blancas de diferentes tamaños

Levaduras

Surtido Colonias blancas grandes Levaduras

Aceitunas manzanilla Colonias blancas grandes Colonias blancas pequeñas

Gran cantidad de levaduras Bacilos alargados de gran tamaño Gram Positivos

Tabla 4: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio MRS.

34

En la Tabla 4, se muestra las características de las colonias crecidas en el medio

selectivo MRS. Hay similitud en cuanto a la identificación macroscópica de las

diferentes muestras, en las que se observan colonias blancas de diferentes

tamaños. En la identificación microscópica podemos apreciar que en todas ellas hay

crecimiento de levaduras. Sin embargo, en muestras de berenjena y aceitunas

manzanilla se aislaron además de levaduras, colonias de diferente morfología,

resultandos ser bacilos Gram positivos, lo que pone de manifiesto la presencia de

bacterias lácticas en dichos alimentos.

Vogel Jhonson (VJ)



Pepinillo Sin crecimiento x Guindilla (casera) Sin crecimiento x Berenjena(casera) Sin crecimiento x


Colonias blancas Levaduras

Surtido Sin crecimiento x Aceitunas manzanilla Sin crecimiento x

Tabla 5: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio VJ.

En la Tabla 5, no se observa crecimiento alguno en el medio VJ a excepción de

aceitunas de cornezuelo .A la hora de los recuentos, en el medio VJ se observó la

presencia de colonias blancas que no presentaban la morfología típica de una

colonia de estafilococos, por lo que se pudo concluir tras la tinción que se trataba de

levaduras como podemos apreciar en la Fig. 7.

Fig.7 Imagen microscópica de levaduras tras la tinción de Gram.

35

KAA



Pepinillos Sin crecimiento x

Guindilla (casera) Sin crecimiento x

Berenjena(casera) Colonias negras pequeñas Cocos Gram Positivos

Aceitunas de cornezuelo (caseras) Sin crecimiento x

Surtido Sin crecimiento x

Aceitunas manzanilla Sin crecimiento x

Tabla 6: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio KAA.

Con respecto a la Tabla 6, solo se observa crecimiento en el medio selectivo KAA

para muestra de berenjena (casera), en la que se puede observar

macroscópicamente una morfología típica de colonias de enterococos de pequeño

tamaño y de color negro que mediante la tinción de Gram se identificaron como

cocos Gram positivos.

EMB



Pepinillo Sin crecimiento x

Guindilla (casera) Sin crecimiento x

Berenjena (casera) Sin crecimiento x

Aceitunas de cornezuelo (caseras) Sin crecimiento

x

Surtido Sin crecimiento x

Aceitunas manzanilla Sin crecimiento x

Tabla 7: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio

EMB.

En la Tabla7, no se observa crecimiento de microorganismos en ninguna de las

muestras de alimentos sembradas en el medio selectivo EMB.

36

Sesión 2

TSA



Aceitunas negras (caseras) Colonias blancas pequeñas y medianas

Gran cantidad de Bacilos Gram Negativos agrupados muy juntos

Alcaparras Colonias pequeñas blancas Levaduras Maíz Sin crecimiento x

Altramuces Colonias blancas de diversos tamaños

Agrupaciones de Levaduras

Aceitunas aliñadas Colonias blancas de diferentes tamaños

Levaduras

Berenjenas aliñadas Colonias blancas pequeñas Gran cantidad de Cocos Gram Positivos

Tabla 8: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio TSA.

En relación a los resultados obtenidos en la sesión 2, a los que se hace referencia

en la Tabla 8, podemos observar diversas morfológicas de colonias en el medio

TSA, ya que es un medio general que permite el desarrollo óptimo de diversos

microorganismos. En las muestras de las alcaparras, altramuces y aceitunas

aliñadas se aislaron colonias de la misma morfología pero de diferentes tamaños,

concluyendo mediante la tinción de Gram la presencia de levaduras. Sin embargo,

en muestras de aceitunas caseras y berenjenas aliñadas se aislaron colonias

blancas de pequeño tamaño identificadas mediante la tinción como bacilos Gram

negativos (aceitunas negras) y gran cantidad de cocos Gram positivos en

berenjenas aliñadas.

MRS



Aceitunas negras(caseras) Colonias blancas pequeñas. Colonias blancas medianas. Colonias blancas grandes.

Cocos Gram positivos agrupados en racimos. Levaduras agrupadas en racimos. Hongos.

Alcaparras Colonias blancas medianas Levaduras Maíz Sin crecimiento x

Altramuces Colonias blancas pequeñas

Agrupaciones de Cocos Gram Positivos

Aceitunas aliñadas Colonias blancas

Bacilos Gram positivos de gran tamaño

Berenjenas aliñadas Colonias blancas de diversos tamaños

Levaduras


MRS.

37

En la tabla 9, se muestra las características de las colonias aisladas en medio

selectivo MRS, empleado para el cultivo de lactobacilos. Podemos observar en las

muestras de aceitunas negras, alcaparras y berenjenas aliñadas crecimiento de

colonias de diversas morfologías y tamaños que no eran típicas de la morfología

clásica de bacterias lácticas, concluyendo con la tinción de Gram la presencia de

levaduras. Sin embargo, en las muestras de altramuces y aceitunas negras se

observa agrupaciones de cocos Gram positivos y en la muestra de aceitunas

aliñadas bacilos Gram positivos de gran tamaño, lo que desvela la presencia de

bacterias lácticas dichos alimentos.

Vogel Jhonson (VJ)


Identificación macroscópica

Prueba de la catalasa

Aceitunas negras (caseras)

Pequeñas colonias blanquecinas

Cocos Gram Negativos

x

Alcaparras Colonias pequeñas blanquecinas

Bacilos alargados Gram Negativos de gran tamaño

x

Maíz Sin crecimiento x x

Altramuces

Colonias medianas amarillas. Colonias pequeñas rosas.

Cocos Gram Positivos Bacilos Gram Positivos grandes y alargados

Catalasa Negativa

Aceitunas aliñadas Sin crecimiento x x

Berenjenas aliñadas Colonias amarillas y rosas pequeño tamaño

Gran cantidad de Cocos Gram Positivos

Catalasa Negativa

Tabla 10: Características macro y microscópicas y prueba de la catalasa de los diferentes

alimentos en el medio VJ.

En los resultados recogidos en la Tabla 10, se muestran las características de los las

colonias aisladas del medio selectivo VJ para el aislamiento e identificación de

estafilococos.

En las muestras de aceitunas negras y alcaparras se observaron colonias blancas

de pequeño tamaño siendo cocos Gram negativos en el caso de aceitunas negras y

bacilos alargados de gran tamaño Gram negativos en el caso de alcaparras. Sin

embargo, aparecen colonias amarillas y rosas en las muestras de altramuces y

berenjenas aliñadas como podemos apreciar en la Fig. 8, en cuyo caso, se concluyó

que las colonias de color amarillo eran cocos Gram positivos y las colonias rosas

bacilos Gram positivos mediante la tinción de Gram.

38

Posteriormente a las colonias de cocos Gram positivos de dichas muestras se les

realizo la prueba de la catalasa, dando lugar en ambas un resultado negativo

(Catalasa Negativas).

Además, en la muestra de altramuces observamos que el medio cambia de color del

medio debido al viraje del indicador de pH producido por la acumulación de

productos ácidos, obtenidos en la fermentación del manitol. (Ver Fig.8)

KAA



Aceitunas negras (caseras) Colonias pequeñas negras Cocos Gram Positivos en parejas

Alcaparras Colonias pequeñas negras Cocos Gram Positivos Maíz Sin crecimiento x

Altramuces Colonias pequeñas negras Cocos Gram Positivos agrupados en parejas.

Aceitunas aliñadas Colonias pequeñas negras Cocos Gram Positivos Bacilos Gram Positivos

Berenjenas aliñadas Colonias pequeñas negras Cocos Gram Positivos en parejas o pequeños grupos


KAA.

La tabla 11, muestra las características macroscópicas y microscópicas de las cepas

aisladas en el medio selectivo KAA empleado para la detección, aislamiento y

confirmación de enterococos. Con respecto a la identificación macroscópica

observamos una morfología, tamaño y color común en todas las muestras, colonias

pequeñas de color negro. En cuanto a la identificación microscópica, en su mayoría

presenta cocos Gram positivos agrupados en parejas o pequeños grupos (ver Fig.9)

con excepción de aceitunas aliñadas que además presentan bacilos Gram positivos.

Fig.8 Identificación

macroscópica en medio VJ

39

Fig. 9 Imagen microscópica de cocos Gram positivos agrupados en parejas o pequeños

grupos ramificados.

Además, en el caso de las muestras de aceitunas negras, alcaparras y altramuces el

medio solido KAA cambia a color oscuro casi negro, esto es debido a que los

microorganismos hidrolizan la esculina presente en el medio con la producción de

glucosa y esculetina la cual reacciona con el citrato férrico para dar un complejo de

color variable entre el verde y el negro como podemos observar en la Fig. 10.

Fig.10 Cambio de viraje del medio KAA.

Todo ello pone de manifiesto que los organismos presentes en estos alimentos eran

enterococos.

40

EMB



Aceitunas negras (caseras) Colonias pequeñas verde brillante metalizado

Bacilos Gram Negativos agrupados en racimos

Alcaparras Colonias pequeñas blancas Levaduras Maíz Sin crecimiento x

Altramuces Colonias pequeñas verde brillante metalizado Colonias pequeñas blancas

Cocobacilos Gram Negativos Bacilos Gram Negativos

Aceitunas aliñadas Colonias pequeñas blancas

Bacilos Gram Negativos

Berenjenas aliñadas. Colonias blanquecinas Bacilos Gram Negativos


EMB.

La tabla 12 hace referencia a los resultados obtenidos en el medio EMB que es

utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido

desarrollo. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia

Enterobacteriaceae.

En las muestras de aceitunas negras y altramuces observamos crecimiento de

colonias de pequeño tamaño con un característico brillo verde metálico (ver Fig. 11)

identificadas mediante la tinción como bacilos Gram negativos, que presentan una

morfología clásica y un brillo clásico de muchas cepas de E. coli. Sin embargo, en

las muestras de altramuces, aceitunas y berenjenas aliñadas se identificaron

colonias blancas de pequeño tamaño siendo reconocidas como bacilos Gram

negativos. En alcaparras, hubo crecimiento de colonias blancas que no

correspondían con la morfología típica de enterobacterias y coliformes, dando lugar

como resultado a levaduras.

Fig11. Identificación macroscópica en medio EMB.

41

5) DISCUSIÓN

La presencia de microorganismos en los alimentos no significa necesariamente un

peligro para el consumidor o una calidad inferior de estos productos.

Como se observa en los resultados, en la mayoría de las diferentes muestras de

encurtidos se puede apreciar una microbióta típica asociada a procesos de

fermentación de los como son la presencia de bacterias acido lácticas y levaduras.

En determinados tipos de alimentos (por ejemplo, embutidos fermentados, col ácida,

queso y otros derivados lácteos) es natural y deseable una gran multiplicación

bacteriana, con una «fermentación» o «maduración» paralela del alimento. En estos

productos, un recuento elevado, como tal, carece prácticamente de significado, ya

que los microorganismos impropios no pueden diferenciarse generalmente de la

microflora propia o normal.

Sin embargo, si el proceso no se desarrolla adecuadamente, pueden aparecer otras

bacterias que alteran aún más el producto e incluso ser patógenas, como nuestro

caso en la muestra de aceitunas negras caseras en las que podemos destacar el

crecimiento de E.coli. Es un germen cuyo hábitat natural es el tracto entérico del

hombre y de los animales. Su presencia en alimentos representa mala calidad

higiénica en el proceso, falta de higiene de los manipuladores o recontaminación

después del proceso. Estas si bien no son generalmente patógenas de por sí, son

indicadores de presencia de microorganismos potencialmente patógenos y por lo

tanto son un índice de deficiencias sanitarias. (Perdomo y col., 2001) .E. coli es el

indicador clásico de la posible presencia de patógenos entéricos en el agua, en los

moluscos, en los productos lácteos y en otros alimentos. Según estudios científicos

E. coli O157:H7 es un miembro del grupo enterohemorrágico del patógeno E. coli

O157:H7 es altamente tolerante a pH ácidos, y los brotes atribuidos a esta bacteria

se han encontrado en muchos alimentos ácidos que tienen un nivel de pH similar a

los de los productos encurtidos (Sun Young Lee, 2005). E. coli O157: H7 y

Salmonella sp., especialmente, han sido implicados en la participación de varios

brotes de las frutas ácidas o jugos de fruta (Beuchat, 1996; Burnetty Beuchat, 2001;

Han y Linton, 2004). A diferencia de la mayoría de los patógenos transmitidos por

los alimentos, E. coli O157: H7 es tolerante con los ambientes ácidos (Lee y Kang,

2009).

42

Haciendo referencia a los resultados obtenidos en las muestras de aceitunas en

general, podemos decir que, aunque hay que tener en cuenta las condiciones

iniciales, se establece que las bacterias lácticas aparecen espontáneamente en

aceitunas aderezadas mientras que en aceitunas al natural pueden verse

desplazadas por las levaduras (Garrido Fernández y col., 1997; Balatsouras, 1995).

Las bacterias lácticas tienen un metabolismo complejo y diverso lo que les permite

adaptarse a situaciones cambiantes, aunque las condiciones de cultivo impuestas

cuando se trabaja con ellas en el laboratorio limitan sin duda sus posibilidades

(Axelsson, 1998).

En relación a presencia de enterococos en el caso de las muestras de aceitunas

negras, alcaparras y altramuces, Enterococcus se encuentran dentro del grupo de

microorganismos indicadores de la inocuidad de los alimentos, pues por su amplia

distribución pueden encontrarse en estos productos, especialmente en los de origen

animal. Suelen considerarse buenos indicadores porque mueren más lentamente

que los coliformes, debido a que son muy resistentes a condiciones adversas como

congelación, desecación y como resultado sobreviven más que éstos. Pequeñas

números de estreptococos fecales en los alimentos carecen de significado, excepto

cuando se trata de productos industrializados que han sido sometidos a un riguroso

tratamiento bactericida (por ejemplo, alimentos precocinados congelados). Carecen

igualmente de significado cifras elevadas en productos en cuya fermentación

intervienen normalmente estos microorganismos.

43

6) CONCLUSIONES:

1) Se ha comprobado la presencia de distintos grupos bacterianos, bacterias

Gram positivas, Gram negativas, hongos y levaduras en los distintos tipos de

encurtidos.

2) En general, la identificación preliminar de los microorganismos aislados

coincide con las características esperadas de acuerdo con los medios

selectivos empleados (enterobacterias en medio EMB, bacterias lácticas en

medio MRS y estafilococos en medio VJ).

3) En el medio selectivo EMB se observó una carga microbiana significativa en

la muestra de aceitunas negras caseras, concluyendo la presencia de E.coli,

que indica generalmente una contaminación directa o indirecta de origen

fecal.

4) No se encuentran diferencias significativas en cuanto a la diversidad de

microorganismos aislados en las diferentes muestras de encurtidos

envasados.

5) En general, podemos concluir que de los grupos bacterianos aislados, en

su mayoría son microorganismos asociados a los procesos de fermentación

de los encurtidos.

44

7) BIBLIOGRAFíA :

Axelsson, L. (1998). Lactic acid bacteria: Classification and Physiology. Lactic acid

bacteria, Microbiology and functional aspects. Marcel Dekker Inc. 2, 1-72. New York ,

USA.

Bae, Y.M., Lee, S.Y. (2015). Combined effects of organic acids and salt depending

on type of acids and pathogens in laboratory media and acidified pickle.

Baird-Parker, A.C, Buchanan ,R.L, Busta, F.F, Cole, M.B., Doyle, M.P., Eyles, M.,

Farkas, J., Flowers, R.S, Mendoza,S., Merican,Z., Quevedo,F., Sharpe, A.N., Teufel,

P., Tompkin, R.B., Van Schothorst, M. (2001). Microorganismos de los alimentos:

Ecología microbiana de los productos alimentarios. Ed. ACRIBIA S.A. Zaragoza

(España).

Balatsouras, G. (1995). Table olives: Cultivars, Chemical Composition, Commercial

Preparations, Quality Characteristics, Packaging, Marketing (2nd ed. ed.),

Agricultural University, Athens.

Bamforth, C.W. (2008).Food, Fermentation and microorganism. Chichester, GB:

Wiley-Blackwell.

Beuchat, L.R. (1996). Pathogenic microorganisms associated with fresh produce. J

Food Prot 59, 204–216.

Bobillo, M., Marshall, V.M. (1991). Effect of salt and culture aeration on lactate and

acetate production by Lactobacillus plantarum. Food Microbiology, 8, 153-160.

Burnett, S.L. and Beuchat, L.R. (2001). Human pathogens associated with raw

produce and unpasteurized juices, and difficulties in decontamination. J Ind Microbiol

Biotechnol 27, 104–110.

Carr, F., Chill, D., Maida, N. (2002). The lactic acid bacteria: A literature survey.

Critical Reviews in Microbiology. 28, 281- 370.

45

Casp, V.A., Abril ,R.J. (2003). Procesos de conservación de alimentos (2a. ed.).

Madrid, ES: Mundi-Prensa.

Colbin, A. (2004). El poder curativo de los alimentos, Ediciones Robinbook .s. l.,

Barcelona.

Díaz, P.M., Rodriguez, M.C., Zhurbenko, R. (2010). Aspectos fundamentales sobre

el género Enterococcus como patógeno de elevada importancia en la actualidad.

Rev Cubana Hig Epidemiol v.48 n.2 Ciudad de la Habana.

Doyle, M.P. (1991). Escherichia coli O157:H7 and its significance in

foods.International Journal of Food Microbiology, 12, pp. 289-302.

Etchells, J.L., Bell, T.A. (1976). Pickle Products, in Compendium of Methods for the

Microbiological Examination Foods (ed. M.Speck), Amer. Public Health Assoc.,

Washington DC, pp. 574-93.

Fleming, H.P., McFeeters, R.F., Thompson, R.L., Sanders, D.C. (1983). Storage

stability of vegetables fermented whit pH control. J. Food Sci., 48, 975-81.

Franco, W., Pérez-Díaz I.M. (2012). Microbial interactions associated with

secondary cucumber fermentation. Journal of Applied Microbiology 114, 161-172.

García, M.,Revah, S., Gómez, L. (1988). Productos lácteos. En Biotecnología

Alimentaria, Limusa Noriega Editores.Pp. 163-178. Mexico.

García, M.P., Fernández del Barrio, M., Paredes, S.F. (1997). Microbiología Clínica

Aplicada, 3º Edición, Permalink.

Garrido-Fernández, A., Fernández Díez, M.J., Adams, M.R. (1997).Table olives,

production and processing. Champman and Hall, London.

Giraffa, G. (2003). Studiying the dinamycs of microbial population during food

fermentation. FEMS Microbiology Reviews .

46

Gomez-Sanchez, A.I. (2007). Microorganismos de importancia en el tratamiento

térmico de alimentos ácidos y de alta acidez. Universidad de las Americas. Temas

selectos de Ingenieria de los Alimentos I .24-32.

Han, Y., Linton, R.H. (2004). Fate of Escherichia coli O157: H7 and Listeria

monocytogenes in strawberry juice and acidified media at different pH values and

temperatures. J Food Prot 67, 2443–2449.

Harris, L.J. (1998). The microbiology of vegetable fermentations. In: Wood, B.J.B.

(ed.). Microbiology of Fermented foods.

Hernández, P., Rodriguez, J., Cintas, L., Moreira, W., Sobrino, O., Fernández, M.,

Sanz, B. (1993). Utilización de bacterias lácticas en el control de microorganismos

patógenos de los alimentos. Microbiología. 9, 37-48

Hurtado, A., Reguant, C., Esteve-Zarzoso, B., Bordons, A., Rozés, N. (2008).

Microbial population dynamics during the processing of Arbequina table olives. Food

Research International 41, 738-744.

Hurtado, A., Reguant, C., Bordons, A., Rozés, N. (2009). Influence of fruits ripeness

and salt concentration on the microbial processing of Arbequina table olives. Food

Microbiology 26,827-833.

Hurtado, A. (2001). Tesis doctoral: Estudio de la microbiota asociada al proceso de

fermentación de las aceitunas Arbequinas de mesa.

Jay, J.M. (1992). Modern Food Microbiology. 4ª Edicion. Chapman y Hall. Nueva

York.

Keith, H.S. (1997). Classifaction of fermented foods: wordwide review of household

fermentation techniques. Food control.Vol.8.No.5/6.pp.311-317.1997

Lee, S.Y. (2005). Microbial Safety of Pickled Fruits and Vegetables and Hurdle

Technology.

Lee, S.Y., Kang, D.H. (2009). Combined effects of heat, acetic acid, and salt for

inactivating Escherichia coli O157: H7 in laboratory media. Food Control 20, 1006–

1012.

mailto:

47

Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H., Sthal, D.A. (2015).

Brock: Biología de los Microorganismos. 14ºEdición, (Madrid).

Martínez, J. (1988). Fabricación de encurtidos de pepinillo. Ministerio de Agricultura,

Pesca y Alimentación, 7. Madrid.

Montaño, A., Sánchez, A.H., De Castro, A. (2000). Changes in the amino acid

composition of green olive brine due to fermentation by pure culture of bacteria. Food

Microbiology and Safety, 65, 1022-1027.

Montaño, A., Sánchez, A.H., Casado, F.J., de Castro, A., Rejano, L. (2003).

Chemical profile of industrially fermented green olives of different varieties. Food

Chemistry, 82, 297-302.

Mozzi, R.R., Graciela, .M V. (2010). Biotechnology of Lactic Acid Bacteria: novel

applications. Ed. Wiley-Blackwell.

Özay, G., Borcakli, M. (1995). Effect of brine replacement and salt concentration on

the fermentation of naturally black olives. Food Research International, 28, 553-559.

Perdomo, H., Casanova, O.N., Ciganda V.S. (2001). Contaminación de aguas

subterránea con nitrato y coliformes en el litoral sudeste de Uruguay. Agrociencia.

Vol 5. Nº1. Pg:10-22.

Panagou, E.Z. ,Tassou C.C., 2006. Changes in volatile compounds and related

biochemical profile during controlled fermentation of cv. Conservolea green olives.

Food Microbiology, 23, 738-746.

Panreac, Manual básico de microbiología Cultimed (2003).

Pascual, Mª R., Calderón, V. (2000). Microbiología alimentaria, metodología analítica

para alimentos y bebidas.

Pederson, C.S., Kelly, C.D. (1938). Development of pink colour in sauerkraut. Food

Res, 3, 583-8.

48

Pérez,D. (2007). Lactobacilli and Tartrazine as Causative Agents of Red-Color

Spoilage in Cucumber Pickle Products. Journal of Food Science.

Ramírez, J., Rosas, P., Velázquez, M., Ulloa, J., Romero, F. (2011). Bacterias

lácticas: Importancia en alimentos y sus efectos en la salud. Revista Fuente, 7.

Ruiz, P.P. (2010).Tesis doctoral: Biodiversidad de la microbiota láctica presente en la

fermentación maloláctica de vinos tintos de la variedad cencibel: caracterización

molecular y tecnológica para la selección de cepas. Toledo, España. Universidad de

Castilla la Mancha.

Sabatini, N., Mucciarella, M.R., Marsilio, V. (2008). Volatile compounds in inoculated

and inoculated table olives with Lactobacillus plantarum. (Olea europaea L.,cv.

Moresca and Kalamata). Food Science and Technology, 41, 2017-2022.

Schneider, R., Fernández, F.J., Aguilar, M.B., Guerrero-Legarreta, I., Alpuche-Solís,

A., Ponce-Alquicira, E. (2006). Partial characterization of a class IIa pediocin

produced by Pediococcus parvulus 133 strain isolated from meat (Mexican

“chorizo”). Food Control. 17:909-915.

Shirai, K., Guerrero, I., Lara, P. (1996). Bacterias lácticas en alimentos fermentados.

Ciencia. 47, 125- 137.

Stamer, J.R., Hrazdina, G., Stoyla, B.O. (1973). Introduction of red colour formation

in cabbage juice by Lactobaillus brevis and its relationship to pink sauerkraut. Appl.

Microbiol., 26, 161-6.

Tassou,C.C., Panagou, E. Z., Katsaboxakis, K. Z. (2002). Microbiological and

physicochemical changes of naturally black olives fermented at different

temperatures and NaCl levels in the brines.

Vázquez, S.M., Suárez, H., Zapata, S. (2009). Utilización de sustancias

antimicrobianas producidas por bacterias ácido lácticas en la conservación de la

carne. Revista Chilena de Nutrición. 36(1):64-71.

49

Yousef, A.E., Carlstrom, C. (2006). Microbiología de los alimentos: Manual de

Laboratorio. Ed. Acribia ,S.A. (España).

Páginas web consultadas:

Ministerio de agricultura, alimentación y medio ambiente:

http://www.magrama.gob.es/es/

www.scharlab.com

http://www.infoagro.com/conservas/fabricacion_encurtidos.htm

http://www.magrama.gob.es/es/

http://www.scharlab.com/

http://www.infoagro.com/conservas/fabricacion_encurtidos.htm

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