Rosa Pinto Labajo, Banco Nacional de ADN, Salamanca

Taller 5 Controles de calidad para muestras bioloacutegicas

Coordina Andreacutes C Garciacutea Montero Banco Nacional de ADN Salamanca

Ponentes Carmen Garciacutea MaciacuteasServicio de Patologiacutea Molecular CIC Salamanca Rosa Pinto Labajo Banco Nacional de ADN SalamancaAnna Bosch Comas Biobanco IDIBAPS BarcelonaAndreacutes C Garciacutea MonteroBanco Nacional de ADN Salamanca

Controles de calidad de aacutecidos nucleicos


Dra Rosa Mariacutea Pinto Labajo Aacuterea de Control de Calidad

Banco Nacional de ADN Carlos III- Universidad de Salamanca

CRITERIOS DE CALIDAD DE ADN Y ARN

Concentracioacuten

Pureza

Integridad

Funcionalidad

wwwbancoadnorg

Trazabilidad

- Espectrofotometriacutea

1 unidad de absorbancia en 1cm de trayectoria oacuteptica para ADN de doble cadena = 50 microg ml y para ARN = 40 microg ml

Cada moleacutecula absorbe la energiacutea radiante a una longitud de ondaespeciacutefica a partir de la cual es posible extrapolar la concentracioacuten de unsoluto en una solucioacuten

Ley de Lambert-Beer una relacioacuten lineal entre absorbancia A (DO) y concentracioacuten

A = DO = αlc (1)

α coeficiente de extincioacuten molar (probabilidad de que el fotoacuten sea absorbido por el material a esa λl distancia que recorre la luz para atravesar el materialc concentracioacuten

CONCENTRACIOacuteN

-basa la cuantificacioacuten en la medida de absorbancia 260 nmde todos los nucleoacutetidos

- concentracioacuten y pureza

- Espectrofotometriacutea Nanodrop ND1000

Ventajas

- sencillo raacutepido y econoacutemico

Incovenientes

La capacidad de absorcioacuten a una λ especiacutefca de lasposibles sustancias contaminantes

ADN degradadoADN monocatenariooligonucleoacutetidosARN

-No aporta informacioacuten sobre la integridad

CONCENTRACIOacuteN

-No discrimina entre ADN y ARN

Fundamento determinacioacuten de la concentracioacuten en funcioacuten de la fluorescenciaemitida por un fluoroacuteforo de unioacuten especiacutefica al ADN de doble cadena

Cuantificacioacuten relativa necesario realizar una recta patroacuten con un ADN estaacutendar (iacutentegro) de concentracioacuten conocida

PicoGreenreg SYBR Green reg QuantiFluortrade

Ventajas- concentracioacuten e integridad

Unioacuten exclusiva a ADN de doble cadena

- coste elevado metodologiacutea maacutes compleja (gran precisioacuten)

-No aporta informacioacuten sobre la pureza del ADN

RELACIOacuteN PicoGreenreg Nanodrop ND1000R lt 1

CONCENTRACIOacuteN DE ADN

- Fluorimetriacutea

Inconvenientes


muestra oacuteptima de ADN R 08gt

Picogreen PromediosPicogreen

MEDIDAS DE CONCENTRACION (ngul))MEDIDAS DE CONCENTRACION (ngul))

ltgt 1 2 3 ltgtA 9829 9678 9740 A 9749B 16827 17030 16198 B 16685C 40833 41898 41583 C 41438D 21674 21724 21649 D 21682E 9611 9224 9088 E 9308

Promedios NanodropMEDIDAS DE CONCENTRACIOacuteN (ngul))ltgtA 11800B 18730C 47950D 25650E 10480

Ratios piconano

A 083B 089C 086D 085E 089

Meacutetodo precipitacioacuten con salesldquosalting outrdquo

A4 B3 B6 B9 B10 C2 C3085 076 074 025 024 055 074

RELACIOacuteN PicoGreenreg Nanodrop

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

A4 B3 B6 B9 B10 C2 C3ng microl 588 658 68 50 455 455 42


concentracioacuten PicoGreenreg

concentracioacuten Nanodrop ND1000

Metodologiacutea RT-PCR a tiempo real


Ventajas- concentracioacuten e integridad mediante el caacutelculo de los valores de ciclo de umbral o Ct

- coste elevado metodologiacutea maacutes compleja interpretacioacuten de los resultados

CONCENTRACIOacuteN DE ARN

- Fluorimetriacutea

Inconvenientes

Los fluoroacuteforos pueden ser de dos tipos a) fluoroacuteforos con afinidad por el ADN b) sondas especificas para fragmentos del ADN

Fundamento determinacioacuten de la concentracioacuten en funcioacuten de la fluorescencia emitida por un fluoroacuteforo de unioacuten al ADN sintetizado

Hay que tener en cuenta que el tamantildeo de los fragmentos amplificados es limitado

- deteccioacuten de contaminacioacuten por ADN- funcionalidad

- no aporta informacioacuten sobre presencia de contaminantes en la muestra

PUREZA

Capacidad de absorbancia a una λ determinada de las posibles sustancias contaminantes presentes en una solucioacuten de ADN

RELACIOacuteN DE ABSORBANCIAS

A280 proteiacutenas fenol (A270)A230 sales caotroacutepicas fenol hidratos de carbono

wwwbancoadnorg

A260A280Contaminacioacuten c aromaacuteticoslt 16

18 ndash 20 PUREZA OacutePTIMAgt 21 Contaminacioacuten ARN

A260A230 20-22 PUREZA OacutePTIMA

ADN

A260A280 20 - 21

A260A230 ~20

ge 18 Pureza aceptablePUREZA OacutePTIMA

PUREZA OacutePTIMAARN

A260280 187

A260230 246

A260280 204

A260230 168

ADN alta pureza

PUREZA

ARN alta pureza

Precipitacioacuten con etanol y sales

A260280 190

A260230 237

ngmicrol 1400

A260280 168

A260230 125

ngmicrol 2551

Contaminacioacuten con fenol

Relacioacuten A260230

A230sales caotroacutepicas fenolhidratos de carbono

Puede resultar muy variable dependiendo del tampoacuten que utilicemos como blanco en la medida del espectrofotoacutemetro

muestras concentracioacuten A260280 A26023010-3 5618 191 -6610-4 5736 197 -6810-5 577 191 -72510-6 567 187 -63910-8 548 188 -595

muestras concentracioacuten A260280 A26023010-3 5578 19 22510-4 5598 201 23910-5 5541 194 22610-6 5483 201 2310-8 532 203 235

Buffer TE

Buffer kit bolas magneacuteticas

A260280 189A260230 226

ngmicrol 1316

A260280 186A260230 172

ngmicrol 111

dilucioacuten 110

Si diluimos una muestra a la mitad de concentracioacuten en un tampoacuten salino larelacioacuten 260280 se mantiene constante (la muestra tiene la misma pureza) sinembargo el ratio 260230 disminuye por el efecto del incremento proporcional desales respecto al ADN

INTEGRIDAD

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

28 S18 S

gDNA

agarosa 07 agarosa 1

integridad bandas ribosomales 28S y 18S discretas en proporcioacuten 21 21

integridad una uacutenica banda definidaen la parte superior del gel

pureza deteccioacuten de presencia de ADN en la parte superior del gel

pureza deteccioacuten de presencia de ARN en la parte inferior del gel

ge 50 ng

CONCENTRACIOacuteN E INTEGRIDAD

Agilent 2200 TapeStation system

-Permite evaluar la concentracioacuten y la integridad de una muestra

-Requiere muy poca cantidad de muestra

-Uso de geles multi-liacutenea y microfluiacutedos que permiten un ensayo semiautomaacutetico

-Simplifica el manejo de muestras

Quantitative range25-500 pg microl10-100 ng microl

Integridad del ADN DINDIN DNA integrity number

Valor del 1 al 10 que define la integridad de una muestra de ADN

10 valor de una muestra iacutentegra

1 valor de una muestra con alto nivel de degradacioacuten

20445 DIN 8 9 amplifica todas las bandas por Long PCR muacuteltiple (1705 kb)

Amplif 5000 pb DIN 62 amplifica hasta 5 kb

13-21 FFPE DIN 15 amplifica deacutebilmente 600 y 300 pb Amplifica con intensidad 200 pb

4B-04 Qiagen DIN 15 amplifica deacutebilmente 300 pb Amplifica con intensidad 200 pb

5B-43 fC DIN 13 amplifica deacutebilmente 300 pb Amplifica con intensidad 200 pb

Integridad del ARN RINe

RINe RNA integrity number

10 valor de una muestra iacutentegra1 valor de una muestra con alto nivel de degradacioacuten

RINe= RIN 2100 Bioanlyzer (Agilent)

RIN lt6 ARN degradado

RIN gt 7 ArraysRIN gt 4-7 qRT-PCR

RINe es una medida repetitiva pero puede diferir

del valor de RIN (en la misma muestra)

FUNCIONALIDAD DEL ADN

DIGESTIOacuteN del ADN con ENZIMAS DE RESTRICCIOacuteN

1

λ-HindIII

23 kb

2

FUNCIONALIDAD E INTEGRIDAD DEL ADN

kb

94

23

231

6543

20

λ-Hind III

1 2 3 4 5 6 7 H20

175

30

2024

kb

5070

PUNTUACIOacuteN

intensidadfuerte deacutebil

10 95

65745

253

5

8 75

1 2 3 4 5 6 7

LONG PCR MUacuteLTIPLE

Calidad del ADN

10-95 muestra oacutetpima

ge 65 muestra aceptable

lsaquo 45 rechazar muestra

45 muestra calidad comprometida


enviar al investigador informando de su calidad

5 parejas de oligonucleoacutetidos (primers) simultaacuteneamenteamplificacioacuten en 6 cromosomas diferentesamplicones entre 175 kb y 20 kb

Long PCR MuacuteltipleADN molde 10 ng microl

Funcionalidad del ADN

- PCR muacuteltiple (100 ng ADN molde) 4 amplicones de 100 200 300 400 pb

ADN

- ADN muy fragmentado

- modificaciones quiacutemicas del ADN por formalina

pb

11 6 22 2018 11 8 7 19 17 16

(van Beers et al 2006)

antildeos

7 muestras amplificaron fragmentos ge 200 pb

TEJIDOS FFPE

CGH array(comparative genomic hybridisation)

TEJIDOS FFPE6 muestras extraiacutedas de tejidos parafinados con el meacutetodo kit QiAampreg mini(Qiagen) diferentes edades de bloque

1000

300200100

500700900

pb

200 pb

M 11 10 7 6 2A 2B

Con este meacutetodo la capacidadde amplificacioacuten de 4 de las 6muestras estaacute limitada a 200pb

La edad del bloque no estariacutea relacionada con la capacidad de amplificacioacuten de la muestra

300200100

300 pb500700900

1000

pb M 11 10 7 6 2 A 2B

400600800

1000

pb11 10 7 6 2 A 2BM

600 pb

100 ng molde

FUNCIONALIDAD DE ARN

REACCIOacuteN DE RT-PCR

- funcionalidad siacutentesis de cDNA (ADN complementario) a partir de ARNmediante una retro-transcriptasa y amplificacioacuten de secuencias especiacuteficas deADN- pureza si hay ADN en la muestra la amplificacioacuten de una regioacuteninterexoacutenica daraacute lugar adicionalmente a un producto mayor del esperado

5rsquo 3rsquo gDNAintroacuten exoacuten

5rsquo 3rsquo RNA cDNAamplicoacuten

primer

M marcador tamantildeo molecular

Resultado PCR utilizando cDNA como molde

1 gDNA (control de la PCR)

2 cDNA

3 cDNA con contaminacioacuten deADN genoacutemico

1500 pb

400 pb

M 1 2 3

05

10

30

kb


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Laboratory Integrated Management System

- Etiquetas y lectores decoacutedigos de barras

- Microtubos 2D-coded

- Automatizacioacuten (Robots)

TRAZABILIDAD

IDENTIFICACIOacuteN DE SEXO PCR de Sexo

SEXO amplificacioacuten gen ZF (Fredsten y Villesten 2004)

B1

λ-Hind III 1 2 3 4 5

hombre mujer

1560 pb1137 pb

PCR sexo

cromosoma X insercioacuten de un elemento Alu de 423 pb

cromosoma Y no existe elemento Alu

TRAZABILIDAD

PERFIL GENEacuteTICO por MICROSATELITES o STRacutes

STRacutes ldquo Short Tandem Repeatsrdquo

-secuencias cortas de 2-7 pb que se repiten a lo largo de todo el genoma

-el nuacutemero de repeticiones es uacutenico en cada individuo

-la amplificacioacuten de estas regiones constituye el perfil o huella geneacutetica del individuo

TRAZABILIDAD

CHLC (Cooperative Human Linkage Center) markers

Sheffield JC et al (1995) Gastier JM et al (1995)

5 pares de oligonucleoacutetidos PCR MUacuteLTIPLE

TRAZABILIDAD

50 Hi-Gel Matrix (Biotools) y 07 agarosa estaacutendar

310281 271

234

194

118

φx174 HaeIII1 2 3 4

VALIDACIOacuteN DEL PROTOCOLO

AND molde 100 ng

4 individuos en dos reacciones de PCR diferentes una con Tm a 55ordmC y otra con Tm a 58ordmC

ADN en solucioacuten

iquestqueacute muestraes A

Ceacutelulas en cultivo

A 1 2

1

2

A (11130)

A = 2

TRAZABILIDAD

MUCHAS GRACIAS

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EPICENTRE Forum 5 (3) |Multiplex PCR Amplification of STRs from DNA Isolated with the MasterAmptrade Buccal Swab DNA Extraction Kit| Haiying Grunenwald Epicentre Technologies Introduction Short Tandem Repeats (STRs) consist of short (3-7 bp) repetitive sequence elements that are distributed throughout the human genome The highly polymorphic nature of these markers makes them powerful tools for human identification STRs are often used by laboratories performing parentage determination forensic analysis genetic linkage map construction or any other application requiring genetic profiling1 Typically for genetic analysis at least two STRs are simultaneously amplified in a single-tube PCR reaction (multiplex PCR) Success in multiplex PCR depends on both the quality of the genomic DNA used in the analysis and the PCR amplification conditions Standard techniques used to obtain genomic DNA for STR analysis often involve blood draws and lengthy isolations We have shown that the MasterAmptrade Buccal Swab DNA Extraction Kit can be used to isolate human genomic DNA from buccal (cheek) cells in less than one hour without blood draws2 Here we demonstrate multiplex PCR amplification of five sets of STRs from four individuals using MasterAmp PCR reagents and human genomic DNA isolated with the MasterAmp Buccal Swab Kit Methods Isolation of human genomic DNA using the MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Kit Human genomic DNA was isolated from buccal cells of four different individuals using the MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Kit The procedure is outlined in Table 1 The extracted DNA was resolved on a 1 agarose gel and visualized by ethidium bromide staining Table 1 MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Protocol Outline

1 Thoroughly rinse subjects mouth twice with water 2 Press the brush firmly against the inside of the cheek and rotate the brush 20 times Move the brush to the

other cheek and repeat 3 Place the brush into the tube containing DNA Extraction Solution and rotate 4 Mix by vortexing and incubate the tube at 60degC for 30 minutes 5 Mix by vortexing and incubate the tube at 98degC for 10 minutes Repeat 6 Pellet debris by centrifugation at 4degC for 5 minutes 7 Carefully transfer the supernatant (containing the genomic DNA) to a new tube and store at -20degC

Multiplex PCR amplification of CHLC markers Cooperative Human Linkage Center (CHLC) markers are a group of STRs consisting of tri- and tetranucleotide repeats34 The CHLC marker loci are highly polymorphic Genomic DNA from different individuals are differentiated by the number of copies of these repeats contained within the amplified regions PCR products from CHLC loci range between 100-300 bp Since our study involved one female and three males we selected 5 sets of CHLC primers that amplify regions of both the X chromosome (four sets of primers) and the Y chromosome (one set of primers) These primers were also selected to minimize the possibility of generating PCR products of similar size The isolated human genomic DNA was PCR amplified using the following 5 sets of CHLC primers DXS7132 GATA31E08 DYS390 GATA175D03 and DXS6789 Primer sequences location and expected PCR product length for each primer set are listed in Table 2 To determine the optimal multiplex PCR conditions preliminary reactions were carried out with genomic DNA from one individual using the MasterAmp PCR Optimization Kit MasterAmp PCR PreMix A was the optimal PreMix for this multiplex PCR reaction (data not shown) Each 50 microl multiplex PCR reaction contained 25 pmoles of each primer 1X MasterAmp PCR PreMix A (50 mM Tris-HCl pH 83 50 mM KCl 15 mM MgCl2 200 microM each dNTP) 15 microl of buccal DNA (84-250 ng) and 125 units of MasterAmp Taq DNA Polymerase The samples were incubated at 94degC prior to the addition of MasterAmp Taq Polymerase Then the samples were incubated at 94degC for 2 minutes followed by 30 cycles of 1 minute at 94degC 1 minute at 55degC and 1 minute at 72degC followed by 4 minutes at 72degC Fifteen microliters of each reaction were resolved by electrophoresis on a 3 agarose gel and visualized by ethidium bromide staining

Results Figure 1 shows the human genomic DNA isolated using the MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Kit The extracted DNA has a high molecular weight

Figure 1 Human genomic DNA extracted from buccal cells Approximately 5 (85 microl) of the extracted human genomic DNA was separated on a 1 agarose gel DNA was visualized by ethidium bromide staining Lane M DNA ladder Lanes 1-4 human genomic DNA from 4 different individuals

Four of the five sets of CHLC primers DXS7132 GATA31E08 GATA175D03 and DXS6789 amplify regions of the X chromosome whereas DYS390 amplifies a region of the Y chromosome For the female sample we expected to see no amplification from primer set DYS390 (Y chromosome) and therefore no PCR product in the 205-221 bp range The other four primer sets were expected to result in either one or two PCR products depending on heterozygosity For the male samples a single PCR product from each of the five primer sets was expected Figure 2 shows the multiplex PCR results The amplification products from the female sample are shown in Lane 2 and amplification results from the three male samples are shown in Lanes 4 6 and 8 As expected for the female sample (Lane 2) there is no amplification product between 205-221 bp from DYS390 There is one PCR product in the 118-150 bp size range from DXS6789 two PCR products from GATA175D03 due to heterozygosity (in the size range 170-186 bp) one product at approximately 250 bp from GATA31E08 (226-254 bp) and two PCR products in the size range 283-299 bp from DXS7132 again due to heterozygosity For the male samples in Lanes 6 and 8 there is clearly a single PCR product from each of the five primer sets Lane 4 shows the appearance of a doublet at ~230 bp from DYS390 and GATA31E08 (DYS390 produces products between 205-221 bp and GATA31E08 produces products between 226-254 bp) and therefore this sample also shows amplification from each primer set Multiplex PCR analysis of these CHLC markers resulted in four distinct patterns for these four individuals (Figure 2) Further statistical analysis would be needed to determine the significance of these comparisons

Figure 2 Multiplex PCR amplification of CHLC markers from buccal DNA Multiplex PCR of five sets of CHLC markers was carried out using human genomic DNA extracted from buccal cells as described in the text Fifteen microliters of each reaction were resolved on a 3 agarose gel and visualized by ethidium bromide staining Lanes 1 3 5 7 100 bp DNA ladder Lane 2 multiplex PCR from a female sample Lanes 4 6 and 8 multiplex PCR from the three males samples Multiplex PCR products in Lanes 2 4 6 and 8 correspond to the human genomic DNA samples shown in Figure 1 in Lanes 1 2 3 and 4 respectively

Summary Human genomic DNA isolated from buccal cells using the MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Kit was an excellent template for the multiplex PCR amplification of STRs This DNA extraction system is both fast and non-invasive In addition use of the MasterAmp PCR Optimization Kit made it easy to determine the optimal conditions for the multiplex PCR analysis References

1 Edwards A et al (1991) Am J Hum Genet 49 746 2 Watson J (1997) Epicentre Forum 4 (1) 6 3 Sheffield JC et al (1995) Hum Mol Genet 4 1837 4 Gastier JM et al (1995) Hum Mol Genet 4 1829


Nuacutemero de diapositiva 1






























EPICENTRE STR MULTIPLEX



Dra Rosa Mariacutea Pinto Labajo Aacuterea de Control de Calidad

Banco Nacional de ADN Carlos III- Universidad de Salamanca


Concentracioacuten

Pureza

Integridad

Funcionalidad

wwwbancoadnorg

Trazabilidad





A = DO = αlc (1)


CONCENTRACIOacuteN




Ventajas


Incovenientes




CONCENTRACIOacuteN











- Fluorimetriacutea

Inconvenientes







Ratios piconano

A 083B 089C 086D 085E 089


A4 B3 B6 B9 B10 C2 C3085 076 074 025 024 055 074


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C










- Fluorimetriacutea

Inconvenientes






PUREZA




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ADN

A260A280 20 - 21

A260A230 ~20



A260280 187

A260230 246

A260280 204

A260230 168

ADN alta pureza

PUREZA

ARN alta pureza


A260280 190

A260230 237

ngmicrol 1400

A260280 168

A260230 125

ngmicrol 2551







Buffer TE


A260280 189A260230 226

ngmicrol 1316

A260280 186A260230 172

ngmicrol 111

dilucioacuten 110


INTEGRIDAD


28 S18 S

gDNA






ge 50 ng



























1

λ-HindIII

23 kb

2


kb

94

23

231

6543

20

λ-Hind III

1 2 3 4 5 6 7 H20

175

30

2024

kb

5070

PUNTUACIOacuteN


10 95

65745

253

5

8 75

1 2 3 4 5 6 7


Calidad del ADN











ADN



pb

11 6 22 2018 11 8 7 19 17 16


antildeos


TEJIDOS FFPE



1000

300200100

500700900

pb

200 pb

M 11 10 7 6 2A 2B



300200100

300 pb500700900

1000

pb M 11 10 7 6 2 A 2B

400600800

1000

pb11 10 7 6 2 A 2BM

600 pb

100 ng molde






primer




2 cDNA


1500 pb

400 pb

M 1 2 3

05

10

30

kb


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TRAZABILIDAD



B1


hombre mujer

1560 pb1137 pb

PCR sexo



TRAZABILIDAD






TRAZABILIDAD




TRAZABILIDAD


310281 271

234

194

118



AND molde 100 ng





A 1 2

1

2

A (11130)

A = 2

TRAZABILIDAD

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Concentracioacuten

Pureza

Integridad

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A = DO = αlc (1)


CONCENTRACIOacuteN




Ventajas


Incovenientes




CONCENTRACIOacuteN











- Fluorimetriacutea

Inconvenientes







Ratios piconano

A 083B 089C 086D 085E 089


A4 B3 B6 B9 B10 C2 C3085 076 074 025 024 055 074


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C










- Fluorimetriacutea

Inconvenientes






PUREZA




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ADN

A260A280 20 - 21

A260A230 ~20



A260280 187

A260230 246

A260280 204

A260230 168

ADN alta pureza

PUREZA

ARN alta pureza


A260280 190

A260230 237

ngmicrol 1400

A260280 168

A260230 125

ngmicrol 2551







Buffer TE


A260280 189A260230 226

ngmicrol 1316

A260280 186A260230 172

ngmicrol 111

dilucioacuten 110


INTEGRIDAD


28 S18 S

gDNA






ge 50 ng



























1

λ-HindIII

23 kb

2


kb

94

23

231

6543

20

λ-Hind III

1 2 3 4 5 6 7 H20

175

30

2024

kb

5070

PUNTUACIOacuteN


10 95

65745

253

5

8 75

1 2 3 4 5 6 7


Calidad del ADN











ADN



pb

11 6 22 2018 11 8 7 19 17 16


antildeos


TEJIDOS FFPE



1000

300200100

500700900

pb

200 pb

M 11 10 7 6 2A 2B



300200100

300 pb500700900

1000

pb M 11 10 7 6 2 A 2B

400600800

1000

pb11 10 7 6 2 A 2BM

600 pb

100 ng molde






primer




2 cDNA


1500 pb

400 pb

M 1 2 3

05

10

30

kb


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TRAZABILIDAD



B1


hombre mujer

1560 pb1137 pb

PCR sexo



TRAZABILIDAD






TRAZABILIDAD




TRAZABILIDAD


310281 271

234

194

118



AND molde 100 ng





A 1 2

1

2

A (11130)

A = 2

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A = DO = αlc (1)


CONCENTRACIOacuteN




Ventajas


Incovenientes




CONCENTRACIOacuteN











- Fluorimetriacutea

Inconvenientes







Ratios piconano

A 083B 089C 086D 085E 089


A4 B3 B6 B9 B10 C2 C3085 076 074 025 024 055 074


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C










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Inconvenientes






PUREZA




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ADN

A260A280 20 - 21

A260A230 ~20



A260280 187

A260230 246

A260280 204

A260230 168

ADN alta pureza

PUREZA

ARN alta pureza


A260280 190

A260230 237

ngmicrol 1400

A260280 168

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Buffer TE


A260280 189A260230 226

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INTEGRIDAD


28 S18 S

gDNA






ge 50 ng



























1

λ-HindIII

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2


kb

94

23

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6543

20

λ-Hind III

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175

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2024

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5070

PUNTUACIOacuteN


10 95

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Calidad del ADN











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antildeos


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2 cDNA


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10

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TRAZABILIDAD



B1


hombre mujer

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TRAZABILIDAD






TRAZABILIDAD




TRAZABILIDAD


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234

194

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1

2

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A4 B3 B6 B9 B10 C2 C3085 076 074 025 024 055 074


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A

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PUREZA

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PUNTUACIOacuteN


10 95

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PUREZA

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PUREZA

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A260280 168

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PUREZA

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10

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B1


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1

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Rosa Pinto Labajo, Banco Nacional de ADN, Salamanca

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