Julián de la Mata

EMEAI Product Specialist

Mayo 2013

Analizar una muestra

compleja de la manera

más simple

Retos y tendencias en la

preparación de muestras

para análisis de fluidos

biológicos:

Agenda del seminario

• Retos y tendencias actuales en el análisis de fluidos

biológicos.

• Abordando las interferencias de la matriz

• Información general de las técnicas de preparación de

muestras disponibles

• Matrices más comunes

• Información sobre aplicaciones y productos

• Precipitación

• Precipitación avanzada

• SPE Polimérico

• Dried Blood Spotting (DBS)

1

Fundamentos

Tendencias

• Aumento en la utilización de MS

• Demanda de métodos Multi-analito

• Métodos genéricos

• Cada vez menores LODs & LOQs

• Regulaciones más estrictas

• Matrices complejas

• Más dependencia en la limpieza de

la muestra

• Número creciente de muestras

Retos

• Mantener la sensibilidad y

rendimiento de los instrumentos

• Los cientificos tienen cada vez

menos tiempo para el desarrollo de

métodos

• Más muestras en menos tiempo

• Supresión iónica en LC MS

• La preparación de muestra se

percibe como compleja y tediosa

¿Para qué hacer Preparación de Muestras?

Eliminar Interferencias, Concentrar, Cambiar Solvente

Dilución (Diluir y Disparar)

Dilución de la muestra (con Estandar interno añadido)

Ventajas

• Rápido y Fácil

• Alto rendimiento

Limitaciones

• No se eliminan las interferencias

• La Concentración se reduce

• Contaminación del Instrumento y la

columna

• Supresión Iónica

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Extracción Líquido-Líquido (LLE)

Uso de dos solventes inmiscibles para separar analitos

de diferentes polaridades

Ventajas

• Bajo costo

• Eficaz para la eliminación de sales inorgánicas

Limitaciones

• No hay concentración de analitos

• Uso de grandes volúmenes de solventes clorados

• No tiene selectividad

• Dificil de automatizar

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Precipitación de proteinas

• La Precipitación Protéica (PP) tiene como objetivo la eliminación de

proteinas (albuminas) de las muestras de plasma.

• Se logra por la adición de un solvente orgánico.

• El precipitado resultante se elimina por centrifugación o filtración.

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Ventajas

•Eliminación eficaz de proteinas

•Alto rendimiento y fácil automatización

•Métodos genéricos para todo tipo de plasma

Limitaciones

•Las sales y los lípidos no se eliminan.

•Contaminación de Columna e Instrumento

Extracción en fase sólida

Extracción selectiva de analitos usando sorbentes funcionalizados.

Ventajas

• La mejor eliminación de interferencias

• El mejor efecto de concentración

• Flexibilidad y automatización

• Extracción de grupos de fármacos

Limitaciones

• Requiere desarrollo de métodos

• Flujo de trabajo más complicado

Carga Lavado Elución

14

Dilute

&

Shoot

LLE Precipitación

Protéica

PPT

Precipitación

protéica

/filtración

CaptivaNDLipids

Silica

SPE

Polymer

SPE

Limpieza

Selectividad

Gasto

Desarrollo de

método

Alto

Rendimiento

Complejidad en

el flujo de

trabajo

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¿Cómo comparamos estas técnicas?

Matrices de muestra comunes: Biofluidos

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Plasma

Composición

• Agua (92%)

• Albúmina sérica (7%)

• Lípidos

• Otros péptidos

• Sales

Técnicas Disponibles

• Diluir y disparar

• Líquido-Líquido

• Precipitación protéica

• SPE Silica

• SPE Polimérica

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Orina

Composición

Agua (95% en volumen)

Urea & Ácido Úrico

Creatinina

Sales y pigmentos biliares

Enzima glucuronidasa

Técnicas Disponibles

• Diluir y disparar

• Líquido-Líquido

• SPE Silica

• SPE Polimérica

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Sangre total

Composición

• Agua (90% en volumen)

• Albúmina sérica

• Material celular

• Lípidos

• Sales

Técnicas Disponibles

• Diluir y disparar

• Líquido-Líquido

• Precipitación protéica

• SPE Silica

• SPE Polimérica

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Saliva

Composición

Agua

Mucus

Sales

Enzimas y Proteinas

Bacterias

Restos de alimentos

La saliva normalmente se muestrea en una solución conservante.

Esta puede contener tensioactivos oligoméricos (PEG, Tween) y

otras sales o tampones

Técnicas Disponibles

• Diluir y disparar

• Líquido-Líquido

• SPE Silica

• SPE Polimérica

20

Efectos de las interferencias endógenas

• Pobre cromatografía

• Problemas mecánicos (partículas, bloqueos)

• Problemas de tiempo de vida de la columna

• Inactividad del instrumento

• Contaminación cruzada

• Aumento de tiempo de análisis/costo por muestra

• Supresión iónica

• Pérdida general de sensibilidad

¿Cómo sé si tengo un problema de interferencia

endógena? = Efecto matriz

¿Qué es una Interferencia Endógena?

Un componente natural de la matriz

que causa un efecto negativo en el

análisis de las muestras

• Proteinas y péptidos

• Sales

• Lípidos y otras especies

hidrofóbicas

• Pigmentos

• Residuos/componentes

celulares N O

P

O

OHO

OR

OR

N OP

O

OHO

OH

OR

LYSOPHOSPHATIDYLCHOLINES

PHOSPHATIDYLCHOLINES

m/z 104 (M+H+)

m/z 184 (M+2H+)

m/z 184 (M+2H+)

Pérdida de sensibilidad/ Supresión Iónica

Causas

• Proteinas y Péptidos

• Lípidos (fosfo- y lisofosfolípidos)

• Sales

• Pigmentos

• Conservantes/tensioactivos(Tween, PEG)

Efectos en los Datos

• La pérdida de la señal iónica inhibirá la cuantificación del analito

• Pérdida de sensibilidad, precisión y exactitud.

La supresión iónica es un fenómeno nocivo que se experimenta durante el análisis LCMS

Dilute

&

Shoot

LLE Precipitación

proteica

Precipitación

protéica

/filtración

CaptivaNDLipids

Silica

SPE

Polymer

SPE

Dried

Blood

Partículas

Proteinas

Lípidos

Surfactantes

oligoméricos

Pigmentos

Sales

Eliminación de interferencias

Precipitación Protéica: Captiva

Precipitación Protéica con Centrifugación

4) Retirar

sobrenadante

5) Analizar

sobrenadante,

normalmente

después de

secar y

resuspender

Muestra

Añadir orgánico

y

Mezclar Centrifugar

Proteina en

solución

Analito

Otras

interferencias

Proteinas

precipitadas

Captiva Filtration Products

La Centrifugación no es necesaria

• Procesado por vacío o presión positiva

Facilidad de automatización

• Las placas de filtración Captiva son compatibles con la mayoría de las plataformas de automatización

• El método de centrifugación es muy dificil de automatizar

Menos pasos de transferencia

• Sin pellet , lo que significa secado y reconstitución en la misma placa de filtración

Más limpio, muestras libres de partículas

• Membranas de 0.2um o 0.45um

Beneficios de la Precipitación/Fitración con

Captiva

Precipitación Protéica: La familia Captiva

Captiva:

– Adecuado para la filtración de partículas en general

– Requiere alfombrillas selladoras para aplicaciones basadas en orgánico

Captiva ND:

– Placa filtrante sin goteo diseñada para la precipitación protéica de alto rendimiento basada en orgánico

Captiva NDLipids:

– Captiva ND con añadida capacidad de eliminación de lípidos hidrofóbicos causantes de la supresión iónica.

Precipitación Avanzada: Captiva ND Lipids

Tecnicas de Precipitación Avanzada

Combina la facilidad de uso de la

precipitación protéica y la limpieza de la

SPE

• Las sales no son una preocupación en

condiciones de cromatografia de fase

reversa.

• Los Fosfolípidos son los mayores

causantes de la supresión iónica

• Membrana de precipitación protéica +

eliminación de lípidos

Captiva ND Lipids

• Mecanismo hidrofóbico de deplección de lipidos

• No es un material de silice con metales

• Sin incompatibilidades de grupos funcionales

• No se necesita un pretratamiento con alta concentración

de ácido, ya que no hay grupos silanoles residuales

• Reducida gelificación de la muestra

• Flujo más reproducible

Mecanismo de eliminación de lípidos

N OP

O

OHO

OR

OR

N OP

O

OHO

OH

OR

LYSOPHOSPHATIDYLCHOLINES

PHOSPHATIDYLCHOLINES

m/z 104 (M+H+)

m/z 184 (M+2H+)

m/z 184 (M+2H+)

Universalidad del CaptivaNDLipids : Plasma

Analito LogP Respuesta relativa vs. solo

precipitación

Tranilcipromina 1.40 251.4%

Nomifensina 2.94 162.6%

Amoxapina 3.10 171.1%

Zolpidem 3.32 109.6%

Mianserin 3.52 167.4%

Sulindac 3.59 136.7%

Loratidina 3.65 103.4%

Nefazodona 4.70 144.9%

Maprolitina 5.10 159.0%

Vardenafil 6.01 106.5%

Loperamida 6.25 106.7%

Tiempo de vida de la columna UHPLC • 200 µL de plasma precipitado con 600 µL 0.1% acido fórmico en ACN

• ZORBAX Eclipse Plus RRHD C18, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm

• Presión medida después de 5000 inyecciones

• Captiva proporciona una filtración robusta para UHPLC

•Tecnología Innovadora , no-celulosa

•Proporciona un nuevo nivel de confianza en la recolección de muestras

•Mejora significativa en la sensibilidad analítica, reproducibilidad y fácil uso.

Análisis Dried Blood Spotting (DBS)

Desarrollado en colaboración con Compañías farmacéuticas y CROs, este

dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que

hay en el mercado

•Muestreo de Sangre, plasma o suero (líquido sinovial,lágrimas, bilis, LCR) para

análisis bioanalíticos en pruebas farmacéuticas clínicas y preclínicas en

empresasa farmacéuticas de bioanálisis (DMPK, ADME and MetID) (no para

Diagnóstico clínico)

Precipitación Avanzada: Sangre

Muestras Dried Blood Spot (DBS):

• Añadir la mancha de sangre perforada directamene al

pocillo Captiva NDLipids y usar el método estándar de

desorpción/elución

Sangre total:

1. Diluir la muestra de sangre 1:1 con 0.1% fórmico en agua . Vortex

y dejar reposar por 1 hr.

2. Añadir MeOH con 0.1% ácido fórmico: muestra de sangre diluida a

la placa de Captiva NDL( 3:1)

3. Sellar la placa con la cubierta Duo-Seal y vortex por 1 minuto.

4. Dejar la cubierta puesta. Poner la placa en CaptiVac con la placa

recolectora. Aplicar un vacío suave.

5. El filtrado debe ser claro y puede requerir dilución antes del LC/MS

La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos

Farmacéuticos y Toxinas en Sangre Total

Análisis de Compuestos Farmacéuticos en Sangre Total con

la columna Poroshell 120, Usando el método Modificado

Mini-QuEChERS para la preparación de muestra.

Nota de Aplicación5990-8789EN

http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5990-8789EN.pdf

Descripción

Determinación de compuestos farmacéuticos en análisis clínicos y forénsicos ADME (DMPK).

Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con analisis LC–MS-MS para la determinación de fármacos en sangre total

Se analizan nueve diferentes fármacos (lidocaina, tramadol, amitriptilina, biperidina, oxazepam, lorazepam, clorpromazina, diltiazem, y naloxona).

El ACN con 4% de FA como solvente de extracción muestra una lisis más completa de la muestra frente a otros solventes de extracción que mostraron una masa sólida.

Las sales tamponadas AOAC de acetato Sódico generan el extracto más límpio y para la d-SPE se usaron 50mg de PSA y 150mg de MgSO4

Extracción en fase sólida: Bond Elut

Extracción en Fase Sólida (SPE)

SPE basado en sílica

• Selectividad obtenida por la química

de ligado específica

• >40 fases disponibles

• Fases para aplicaciones específicas

• A menudo se requiere desarrollo de

métodos

• Gran variedad de herramientas para

múltiples aplicaciones

SPE Polimérica

• Amplia selectividad de analitos

• Funcionalidad de modo mixto

• Métodos genéricos de fácil uso

• Mínima optimización

• Alta capacidad

• Versatilidad en todo el rango de pH

La familia Bond Elut Plexa

Bond Elut Plexa

Polimero no polar con superficie hidroxilada que es la mejor elección para un amplio rango de analitos ácidos, neutros y básicos.

Bond Elut Plexa PCX

basado en Plexa, con funcionalidad de intercambio catiónico fuerte, especialmente diseñado para resultados eficaces en compuestos básicos con un amplio rango de pka y logP.

Bond Elut Plexa PAX

basado en Plexa, con funcionalidad de intercambio aniónico fuerte, especialmente diseñado para resultados eficaces en compuestos ácidos con un amplio rango de pka y logP.

Características y beneficios

Polimero libre de grupos amida Minimiza la retención de matriz

La unión de proteinas y lípidos en la superficie del polímero se minimiza,

resultando en muestras más limpias y una reducida supresión iónica.

Métodos genéricos simples Mínimo desarrollo de métodos

Partículas monodispersas Flujo reproducible

Flujo rápido, sin particulas pequeñas, reproducible y fácil de usar

Precisión mejorada- Supresión iónica reducida

Amide Based Polymer

Plexa

Ion suppression zone

SPE Método Multi analito: Plasma

Fraccionamiento de Fármacos

ácidos, neutros y básicos

Bond Elut Plexa PCX 10 mg

Acidos:

Atorvastatina, Diclofenaco,

Furosemida, Pravastatina

Neutros:

Cortisona, Cortisol

Bases:

Procainamida, Metoprolol,

Paroxetina

Pretratamiento de muestra:

100 μL plasma humano

Diluir 1:3 con 2% H3PO4

Acondicionar 1. 500 μL CH3OH

2. 500 μL DI H2O

Carga Plasma 1:3 con 2% H3PO4

Lavado 1 500 μL 2% Formic acid

Elución 1 500 µL AcN:MeOH (1:1, v:v)

Acidos, Neutros

Elución 2 500 µL 5% NH3 in AcN;MeOH

Bases

•Este método genérico cubre un amplio

rango de fármacos básicos

•Amfetaminas

•Opiaceos

•Benzodiazepinas

•Ketamina/PCP

•Cocaina y metabolitos

•Antidepresivos

•Analgésicos sintéticos

Método Multi Analito en Orina con Plexa PCX: Bases

Plexa PCX 96 pocillos

(30 mg, 1mL)

Muestra 0.2 mL Orina

Pretratamiento Diluir 0.6 mL 100 mM

KH2PO4

Acondiciona-

miento

1. 0.5mL MeOH

2. 0.5 mL H2O

Lavado 1. 0.5mL 50% MeOH en

H2O

Secar 5 minutos

Elución 0.5 mL 50:50:5

EtAc:MeOH:NH3

Saliva (Oral Fluid)

Composición

Agua

Mucus

Sales

Enzimas y Proteinas

Bacterias

Restos de alimentos

La saliva normalmente se muestrea en una solución conservante. Esta puede

contener tensioactivos oligoméricos (PEG, Tween) y otras sales o tampones

Tendencias

•Matriz cada vez más común en los test de drogas de abuso

•Test no intrusivo, que puede realizarse en cualquier lugar

•Baja posibilidad de degradación/adulteración de la muestra

•Uso de surfactantes/conservantes en la toma de muestra

• Evita el ligado de los fármacos al plástico o recubrimientos de celulosa

• Reduce la degradación de la muestra

Retos

•Pequeño volumen de muestra

•Contiene surfactantes/oligómeros que causan supresión iónica en LCMS

Tendencias en el análisis de Fluidos Orales

Test Multi Analito Test Individual de Fármacos

Plexa PCX para el Análisis de Fluidos Orales

Plexa PCX (3mL30 mg)

Muestra 0.5 mL fluido oral

Pre-tratamiento Diluir 1:2 w/

100mM tampón fosfato

Acondiciona-

miento

1. 1 mL MeOH

2. 1 mL H2O

Lavados 1. 1 mL 100mM KH2PO4

2. 1mL 100% MeOH

Elución 1.0 mL 2% NH3 in EtAc

Plexa PCX (1mL 30mg)

Muestra 600µl de Saliva tamponada

Pre-tratamiento 500µl of 0.1M, pH6 tampón

fosfato.

Acondiciona-

miento

1. 1 mL MeOH

2. 1 mL H2O

Lavados

1. 1ml, 0.1M HCl

2. 1ml, 60:40

Metanol/0.1M HCl , luego

secado.

Elución 150µl, 50:50 (ACN:MeOH)

2x 150µl, 50:50:2

ACN/MeOH/ NH4OH

Descarge el Compendio de Aplicaciones “Drugs

and Metabolites in oral fluid”

Visite la página de Agilent

Forensics & Toxicology

• Menos partículas : reduce problemas de presión

• Menos acumulación de material endógeno

• Más bajos LODs & LOQs

• Alto rendimiento/Automatización

• Menos análisis fallidos/repetidos

• Menos inactividad/mantenimiento del instrumento

• Menores costos de solventes(incluyendo desechos!)

Mejora general en la calidad de los datos

Mejoras en la productividad

Soluciones totales desde la Extracción a la

señal MS

• Zorbax RRHD

• Zorbax RRHT

• Poroshell 120

• Bond Elut

• Captiva

• DMS

•QueChERS

• 1200 Infinity Series LC

• 6000 Series MS

Conclusiones de la Preparación de Muestra

• La preparación de muestra en el análisis de Fluidos Biológicos es un

componente esencial en el flujo de trabajo de LCMS

• Permite mantener el rendimiento del Instrumento, la sensibilidad y la

calidad de los datos.

•La eliminación de materiales endógenos y de la supresión iónica es

esencial para obtener el máximo de sus muestras.

• La retirada de una interferencia concreta con la técnica de preparación de

muestra “justa” traerá como ventajas la productividad y facilidad de uso.

• Las técnica genéricas simples, tales como la filtración/PP con Captiva y la

SPE polimérica están bien adaptadas a los entornos de alto rendimiento.

• Los complejos análisis multi-analito se abordan mejor con la SPE

polimérica.

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Technologies vaya a www.agilent.com o contacte con su

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