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BIOREACTORES Un biorreactor es un recipiente en el que se realizan reacciones de ndole biolgica, este les proporciona el medio de cultivo y el ambiente fisicoqumico ptimo para que se lleve a cabo el bioproceso. Son ampliamente usados en la industria de alimentos y de fermentacin como: Metabolitos: antibiticos, alcohol, cido ctrico Biomasa: levadura de panadera, protena unicelular Substratos transformados: esteroides Solventes purificados: en la regeneracin del agua Caracteristicas de las reacciones biolgicas Son procesos altamente dependientes de las condiciones ambientales, tienen carcter autocatalitico (las enzimas, clulas, etc actan como catalizadores), los biocatalizadores pueden modificarse a lo largo del proceso. Se debe tener un cuidadoso manejo de aporte de gas as como la eliminacin de gas producido.

agitacin, Sistema de aireacin, Deflectores, separadores de espuma, Sistemas de control

La mayora de las fermentaciones y reacciones enzimticas son homogneas. La mayora de las reacciones biolgicas continan hasta su trmino en un perodo finito de tiempo y con una velocidad finita. Las cinticas para muchas reacciones biolgicas son de orden cero, de primer orden y de tipo MichaelisMenten. Sistemas y restricciones de la operacin La mezcla de reactivos es relativamente compleja. Los metabolitos o sustratos polimricos y el crecimiento micelial de muchos microorganismos pueden producir mezclas muy viscosas. Operan en condiciones muy suaves respecto a los procesos qumicos, pero requieren un control crtico continuo de las concentraciones de solutos, pH, temperatura y presin. Debido a que las velocidades de crecimiento microbiano son bajas, se requieren volmenes grandes y tiempos de residencia largos. El requerimiento de que se produzca un microorganismo deseado en el reactor en tanto que se excluyen y/o eliminan los microorganismos no deseados, impone muchas limitaciones especiales al diseo. Esquema de un biorreactor El tamao de los fermentadores puede variar entre el de los pequeos de 5 a 10 litros, a escala de laboratorio y los enormes de 500.000 litros a escala industrial. Elementos: Sistemas de refrigeracin, Sistema de

Nota: no s si colocar lo de la diapositiva 13 y 14. Sistema de Agitacin Se utilizan agitadores rotativos, de columnas de burbujas y sistemas de elevacin de aire. El ms utilizado es el primero ya que es ms flexible en las condiciones de operacin, es ms fcil de conseguir comercialmente, provee una eficiente transferencia de gases a las clulas y es el tipo con el que se tiene ms experiencia. Sistemas de Aireacin Las ms utilizadas son difusores porosos, de orificios, de boquilla. Tipos de Biorreactores Biorreactor de tanque agitado Tiene un bajo costo de operacin y de capital, est provisto de deflectores y separadores de espuma, requiere de gran cantidad de energa por unidad de volumen, y es llenado solo hasta el 70-80% de liquido. Es ampliamente usado en la industria farmacutica y para reacciones con enzimas libres e inmovilizadas. Columna de Burbuja Posee inyeccin por aire, es una estructura sencilla por lo que su costo es bajo. Es utilizado en la produccin de levaduras de panificacin, cerveza, vinagre, tratamiento de aguas residuales. Biorreactores de elevacin con aire (airlift)

Agitacin por inyeccin de aire, existe separacin fsica de las corrientes ascendentes y descendentes. Es utilizado en cultivo de clulas animales, vegetales, procesos con catalizadores inmovilizados, produccin de protenas unicelulares a partir de metanol y tratamiento de aguas residuales. Es de construccin simple, bajo corte y de requerimientos de energa bajos. Su desventaja es q a gran escala se incrementan los costos de operacin y dificultan la esterilizacin Variables de Diseo

Reactores de enzimas o clulas inmovilizadas Consiste en pasar el medio fresco a travs de un biorreactor en el que por diversas tcnicas se han inmovilizado clulas (o enzimas). La transformacin del sustrato se lleva a cabo sin el soporte vital que proporcionan las clulas enteras. El producto resultante esta libre se clulas.

Comparacion entre biorreactor de columna y de tanque agitado

Lecho Empacado Las partculas deben ser incompresibles y el medio recirculado debe ser limpio y no es apta para procesos en los que se produce gas. Es utilizado en biocatalizadores inmovilizado. Biorreactore Fluidificado Es utilizado para clulas inmovilizadas sobre un material partculas como en la produccin de etanol, vinagre, cerveza y tratamiento de aguas residuales. Este biorreactor posee caractersticas superiores de transferencia de masa y calor, bajas velocidades de corte y requerimientos bajos de energa. Biorreactor de Goteo (trickle bed) Es una variacin del lecho empacado y es usado en tratamiento aerobio de aguas residuales, oxidacin biolgica del etanol a acido actico. Biorreactores para fermentacin en estado solido Tipos de reactores y aplicaciones

Para aadir calor ara promover una reaccin deseada Para eliminar el exceso de calor generado Para concentrar los productos de la fermentacin por secado.

Etapas de la fermentacin

Aplicaciones de reactores con enzimas inmovilizadas

Preservacin del inculo. Consiste en mantener las cepas durante tanto tiempo como sea posible sin divisin celular. Las cepas maestras no deberan ser cultivadas ms que una vez cada dos aos controlando los niveles de actividad con cada uso. Multiplicacin del inculo: El cultivo preservado se reaviva inicialmente mediante crecimiento en un cultivo lquido en agitacin o en medio slido si se requiere la formacin de esporas. Cultivo de prefermentacin: A fin de obtener suficiente inculo para el fermentador de produccin, deben realizarse precultivos en fermentadores ms pequeos (La concentracin ptima del inculo determina el nmero de etapas del precultivo de fermentacin que son necesarias). En general se requieren las siguientes concentraciones de inculo: Actinomicetos...........5 - 10 % Hongos..................5 - 10 % Otras Bacterias..........0,1 - 3,0 %

Modo de operacin Clulas en suspensin vs. inmovilizadas Enzimas en solucin vs. disueltas Sustratos solubles vs. insolubles Sustratos monomrico vs. polimricos Operaciones continua vs. discontinuas Procesamiento agitado vs. tubular Sistemas en etapas mltiples vs. etapa nica Operaciones de paso nico vs. reciclo Fermentacin de produccin: Dependiendo de la fermentacin se utilizan biorreactores de distinto tamao y no puede darse un esquema general para la inoculacin de un fermentador de produccin. Criterios para el diseo de un fermentador 1.- El tanque debe disearse para que funcione aspticamente durante numerosos das, as como para las operaciones de ms larga duracin. 2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireacin y agitacin para cubrir las necesidades metablicas de los microorganismos. 3.- El consumo de energa debe ser tan bajo como sea posible. 4.- Debe tener un sistema para el control del pH. 5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras. 6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura. 7.- Las prdidas por evaporacin no deben ser excesivas. 8.- El diseo del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el funcionamiento, recoleccin, limpieza y mantenimiento sean mnimas.

Factores a controlar en un fermentador Transferencia de masa: en el abastecimiento de nutrientes y otros reactivos a las clulas o a las enzimas que predominan los procesos de difusin. Transferencia de Oxgeno: se requiere evaluar la solubilidad y los procesos de transferencia del oxgeno hacia los microorganismos. Transferencia de Calor: se requiere transferir calor para: Esterilizar el medio lquido del reactor

9.- El tanque debe ser verstil para la aplicacin de diversas modalidades de procesos. 10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea posible, soldaduras. 11.- La geometra del fermentador debe ser similar a otros tanques ms pequeos o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a diferentes escalas. 12.- Deben emplearse los materiales ms baratos que proporcionen resultados satisfactorios. 13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador. Es importante mantener la instrumentacin bajo ciertos parmetros los cuales son: Bajo mantenimiento. Esterilizables con vapor. Sencillez de manejo. Rpida calibracin. Objetivo del diseo de biorreactores Proporcionar la forma ms econmica para optimizar la productividad de los bioprocesos dentro del contexto de un proceso integrado. Especifcos biolgicos: (1) Disear o seleccionar los biocatalizadores ms apropiados para las reacciones. (2) Disear o modificar la composicin de los medios para (1) Especifcos de ingeniera bioqumica: (1) Disear los procesos de transporte que maximicen la cintica de las biorreacciones globales. (2) Disear la maquinaria a emplear. Estrategias de diseo de biorreactores en funcin de los factores determinantes de costos Investigacin y desarrollo: Maximizar la velocidad de cambio de escala, Maximizar la reproductibilidad de operacin. Minimizar riesgo de contaminacin. Materiales de partida: Maximizar la conversin del sustrato y el rendimiento del producto. Operacin del biorreactor: Maximizar la Productividad minimizando tamao del reactor. Optimizar condiciones del reactor y del medio de cultivo, mejorar de cepa. Recuperacin del producto: Maximizar la Concentracin de producto que abandona el reactor. Recuperacion del producto

La recuperacin del producto conlleva la extraccin y purificacin de los productos biolgicos. La recuperacin en los procesos bioqumicos difiere de la recuperacin qumica, principalmente, en que los materiales biolgicos son frecuentemente mucho ms lbiles. Etapas de la recuperacin del producto 1-. Separacion de las partculas solidas del liquido o caldo de fermentacin (filtracin, centrifugacin, floculacin y flotacin). 2-. Aislamiento primario: en esta etapa se eliminan aquellos componentes cuyas propiedades difieren considerablemente de las del producto deseado (adsorcin, extraccin, precipitacin) 3-. Purificacion: es un proceso muy selectivo, ya que separan el producto de las impurezas que tiene caractersticas similares a las de este (cromatografa, ultrafiltracin, precipitacin fraccionada) 4-. Aislamiento final: esta etapa se encarga de lograr la pureza final del producto deseado (cristalizacin, centrifugacin y filtracin, secado)

Tipos de Biorreactores

Potencia de 10kW/m para recipientes pequeos 3 3 (0.1m ) hasta 1-2kW/m para recipientes grandes 3 (100m ). Fluidos Newtonianos sin aireacin: La potencia de la mezcla depende de la velocidad del agitador, del dimetro y geometra del impulsor y de las propiedades del fluido. Para seleccionar el agitador se debe calcular numero de Reynolds (La velocidad relativa entre la solucin nutritiva y las clulas individuales debera ser de 0,5 m/s. El flujo del sistema debe ser turbulento), de Froude, de Potencia. Relaciones geomtricas del tanque impulsor de turbina de disco de 6 palas planas

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AGITACIN.

La agitacin es la determinacin de la Potencia Absorbida por el sistema, que se relaciona a travs de correlaciones con parmetros operacionales y con la geometra del equipo, en funcin del tipo de impulsor utilizado. Los agitadores ms utilizados son las turbinas de Rushton (junto con la hlice marina son las q imparten ms potencia) la cual consta de varias paletas sujetas a un eje central. El dimetro de una turbina est normalmente entre 30 y 50% del dimetro de tanque y por lo general hay entre cuatro a seis paletas. Los patrones de flujo dependen del tipo de impulsor utilizado y el uso de deflectores para evitar el vrtice. Los impulsores de flujo axial generan corrientes de flujo paralelo al eje de la flecha que gira.

Otros tipos de impulsores. Flujo Axial

Flujo Radial Los impulsores de flujo radial aseguran un mejor mezclado y absorben ms energa, tienen una relacin potencia/volumen y un kLa mayor. Un mal mezclado produce perdidas de producto, desperdicio de espacio, energa y cambio de la cintica del fermentador.

Fluidos No Newtonianos. (Factores que afectan la viscosidad del caldo) Concentracin celular

Para suspensiones de levaduras y esporas de hasta un 14% de volumen de solidos se evala segn la ecuacin de Vand. Para concentraciones mayores al 14% afecta la viscosidad (duplicar la concentracin aumenta 90 veces la viscosidad aparente). El uso de cultivo fresco disminuye la viscosidad y mejora el flujo del fluido. Tamao, forma y masa de la clula. El crecimiento filamentoso produce un comportamiento pseudoplstico. La presencia de hifas afecta la reologa, ya q las clulas muy ramificadas tienen menos flexibilidad produciendo mayor viscosidad.

Corresponde al tiempo que le cuesta al fluido recorrer una vuelta al tanque.

Para lquidos en un tanque agitado con varios deflectores y un rodete pequeo, se establece: tm= 4tc Los tanques agitados con volmenes entre 1 y 100 m presentan tiempos de mezcla entre 30 y 120s, dependiendo de las condiciones. Ntm =f(Re) para Re < 5x103 Ntm= constante a partir de Re >5x1033

Presin osmtica del fluido de la suspensin.

En las turbinas Rushton para Re >5x103, el tiempo de mezcla puede calcularse:

Una mayor presin osmtica produce una menor rigidez y hace q las hifas sean ms flexibles.

Donde V es el volumen del lquido y D el dimetro del rodete.

Concentracin del sustrato y del producto polimrico.

Tanque con sistema de intercambio de calor

Si el producto de la fermentacin es un polmero, al ser excretado continuamente en el cultivo discontinuo aumenta la viscosidad del caldo (Se han observado los cambios de viscosidad de unos pocos cP hasta valores tan altos como 24000 cP por la produccin de un polmero). Si el medio de fermentacin contiene sustratos polimricos como almidn, la viscosidad aparente disminuir a medida que avanza la fermentacin y desaparece el polmero (cambio de fluido no newtoniano a newtoniano). Para fermentaciones de micelios, el caldo se torna pseudoplstico y viscoso. Las aplicaciones ms comunes son: Fluidos No Newtonianos sin aireacin Pseudoplsticos son soluciones de goma, de polmeros, fluidos biolgicos. Los dilatantes son algunas soluciones de harina de maz y azcar, almidn. En la industria la mayora de los fluidos no newtonianos son pseudoplsticos. Tiempo de mezclado (tm) Es el tiempo necesario para alcanzar un cierto grado de homogeneidad partiendo de un estado completamente segregado. Permite valorar la efectividad de la mezcla. Tiempo de circulacin (tc) ESTERILIZACIN. Flujo de calor hacia o desde los fluidos que circulan por el interior de tuberas, sin cambio de fase. Flujo de calor hacia o desde los fluidos que circulan por el exterior de tuberas, sin cambio de fase. Flujo de calor desde fluidos condensando Flujo de calor hacia lquidos en ebullicin

La esterilizacin significa la eliminacin de toda forma de vida de un medio o material, que se lleva a cabo generalmente por medios fsicos como filtracin o muerte de los organismos por calor, productos qumicos u otra va.

nmero inicial al exponerlas al calor. Se conoce como valor D.

Esterilizacin Batch.

Razn fundamental: En la microbiologa industrial se efecta para evitar la competicin por los nutrientes en medios de cultivo y permitir as que el cultivo de microorganismos especficos que se utilizan en un proceso de fermentacin d los rendimientos esperados en biomasa y/o metabolitos especficos.

Inactivacin: Es la eliminacin de microorganismos sin que exista necesariamente desintegracin de las clulas se hace a travs de: Calor hmedo y seco, radiacin electromagntica y snica, agentes qumicos.

Eliminacin fsica: Est restringida a la esterilizacin de gases lquidos, y es fundamentalmente llevada a cabo por: Filtracin Centrifugacin Flotacin Atraccin electrosttica Intercambio inico Adsorcin de virus por carbn.

Punto de Muerte trmica: Temperatura mnima para destruir todas las clulas en 10 min. Tiempo de muestre trmica: Tiempo requerido para destruir a todas las clulas a una temperatura dada, depende del microorganismo y de las condiciones. Mtodo del porcentaje: Expresa la destruccin por esterilizacin como el porcentaje de las clulas vivas sobrevivientes a la exposicin de calor por unidad de tiempo. Tiempo de reduccin al dcimo: Es el tiempo que tarda un nmero de clulas en reducirse al 10% de su

Limpieza y esterilizacin del aire. Requerimientos: 1. 2. 3. 4. El sistema debe ser de diseo sencillo. Su operacin debe ser barata. Debe ser estable y resistente a varias esterilizaciones con vapor. Debe acondicionar el aire, ajustando la temperatura y humedad.

Esterilizacin continua.

Los organismos pequeos son adsorbidos por el polvo del aire y pueden eliminarse junto con las partculas de polvo mayores. Se ha demostrado que el tamao medio de las partculas de polvo es de 0,6 . El nmero de organismos presentes en el aire es fundamental para poder disear un sistema de esterilizacin, los valores encontrados varan entre 103 y 104 partculas/m3.

Tipos de filtro. a. Escala pequea: Son filtros de tipo millipore de asbesto o porcelana. Escala mayor: Son filtros granulares con partculas de carbn (6-30 malla) poseen peligros de ignicin a temperaturas mayores de 50 C. Filtros fibrosos de lechos empacados de lana de vidrio o materiales similares: Poseen cadas de presin por encima de los lechos de carbn. El dimetro de la fibra vara entre 3 y 15 .

b.

c.

Mecanismos de retencin de partculas finas por filtros de aire: a) Impacto b) Intercepcin c) Difusin d) Sedimentacin, y e) Atraccin electromagntica. Casos: Caso 1: Partculas que chocan con las fibras (impacto inercial). Caso 2: Otras que aunque no choquen directamente, sern colectadas por el cilindro (intercepcin) Caso 3: Las partculas que sin chocar contra la fibra debido a su movimiento irregular lleguen a estar en contacto con ella y las retenga (difusin).

Relativa

del agua o medio de crecimiento

Tcnicas de Acondicionamiento del caldo de cultivo.

Tcnica

Comentario 1. Reduce viscosidad la

2. Calentamiento

Lisis inducida por el calor promueve la agregacin final y reduce los volmenes de suspensin final.

Congelacin

Una congelacin y descongelacin posterior a la congelacin lenta, promueve lisis y agregacin. Adicin de iones metlicos multivalentes sobre sus productos de hidrlisis polimerizados. Adicin de polmeros orgnico naturales o sintticos. Valores extremos de pH causan lisis celular. Qumicos y surfactantes que pueden romper membranas y paredes celulares. El uso de proteasas, lipasas y amilasas cambian las caractersticas de las superficies y agregados celulares. Se han identificado genes responsables de la floculacin y se requiere la insercin de stos para obtenerla.

RECUPERACIN DEL PRODUCTO. Coagulacin Una etapa de recuperacin modifica la pureza y/o concentracin de un metabolito. Se emplean diversas tcnicas como: Extraccin, Cristalizacin, Destilacin, Dilisis, Precipitacin, Desecacin.

Floculacin

Acondicionamiento del caldo de cultivo.

pH

Propiedad Tamao Composicin qumica Formas

Caracterstica probable Puede pequeo Altamente compleja Esfera filamentos complejos Usualmente hidroflicas Bioespecfica Muy cargada negativamente Baja Similar a la a ser

Lisis Comentario 1-50 m Con enzimas biolgicas Usualmente mal definida Propiedades reolgicas del caldo Dificultan agregacin Clulas animales Son difciles de agregar la

Gentica

Hidroficidad Reactividad Superficie Densidad

Propiedades de la clula

Propiedades FORMA

Bacterias Bastones,

Levaduras Esferas,

Hongos Filamentos

cadenas de esferas

filamentos elipsoideos 5 15 m diam 1 50 m 50 500 m long. 10-11 g 1,05 1,1 1,05 1,1

Separacin de insolubles: Se hace a travs de la centrifugacin y filtracin

TAMAO

0,5 3 m

Se obtiene un producto intracelular

PESO DE LA CLULA PESO ESPECFICO

-12 10 g 1,05 1,1

Disrupcin Celular: Mcanica, Qumica, Enzimatica

Se obtiene un producto extracelularSustancias a recuperar: Metabolitos intracelulares cidos nucleicos Vitaminas Enzimas Algunos antibiticos: (sisomicina)

Separacin de restos celulares: Atravs de Centrifugacin, Filtracin o Extraccin Separacin o concentracin: Extraccin, Destilacin, Adsorcin y Ultrafiltracin

VITAMINA B12 Metabolitos extracelulares Aminocidos Alcoholes cidos orgnicos: ctrico Antibiticos Algunas enzimas (amilasa y proteasas)

Purificacin: Cromatografa, Precipitacin, Mtodos elctricos, Ultrafiltracin

Refinado: Cristalizacin, Secado

Grado de purificacin necesario: El nivel de pureza depende de: Dosis de consumo Frecuencia de uso Mtodo de aplicacin Naturaleza y toxicidad de los contaminantes asociados

Las etapas de recuperacin dependen de: La naturaleza del producto final. La concentracin del producto final. Los productos laterales presentes. La estabilidad del material biolgico. El grado de purificacin necesario.

Evolucin de la calidad del producto durante la recuperacin: Etapas del proceso de recuperacin. 1. 2. 3. 4. 5. Rompimiento Celular Separacin slido-lquido Concentracin Aislamiento/ Purificacin Desecacin Concentraci n del producto (g/L) 0.1 5 Calidad del product o (%) 0.1 1

Etapa

Operacin bsica

Caldo de partida Separaci n de clulas Aislamient Filtracin Extraccin

15 5 50

0.2 2 1 10

o primario Purificaci n Aislamient o final Cromatograf a Cristalizacin 50 200 50 200 50 80 D. 90 - 100

discos o de otro elemento agitador. Las bolas ocupan entre 80-95% del volumen vaco de la cmara Molino de discos: Se utiliza para hifas fngicas dbola>1mm, en tejidos animales y plantas, levaduras d200-10 20 0.5 2 0.005 0.008 0.00025 -

Tamao de la partcula

Filtracin a travs de fibra Microfiltracin Ultrafiltracin Hiperfiltracin

Tamao molecular

Cromatografa gel Diliss

en

2 0.0003 0.002 0.00025