ARN POLIMERASA Y TRANSCRIPCION:

La principal enzima responsable de la síntesis del ARN es el ARN POLIMERASA, que cataliza la polimerización de los ribonucleosidos1 5’Trifosfatos (NTP) dirigida por un molde de ADN.

La ARN Polimerasa cataliza el crecimiento de la cadena de ARN en dirección 5’3’ a diferencia del ADN Polimerasa esta no requiere de un cebador preformado para iniciar la síntesis del ARN. En lugar de ello, la transcripcion empieza de novo en secuencias especificas al principio de los genes.

La ARN Polimerasa es una enzima compleja compuesta de multiples cadenas polipeptidicas

Esta se compone de 4 tipos de subunidades:

Alfa,beta,beta’,gamma,sigma

Sigma: Ya que el nucleo de la polimerasa es totalmente capaz de catalizar la incorporación de NTP al ARN, la subunidad sigma no es necesaria para la actividad catalitica básica de la enzima, sin embargo el nucleo de la polimerasa no se une específicamente a las secuencias que señalizan la iniciación normal de la transcripción por tanto, subunidad sigma es necesaria para identificar los lugares adecuados para iniciar la transcripción.

Promotor: Es la secuencia de ADN a la que se le une la ARN Polimerasa para iniciar la transcripción de un Gen.

Sitio de inicio de la transcripción: +1

Region corriente arriba 5’ del sitio de iniciación de la transcripción

Region corriente abajo 3’ del sitio de iniciación de la transcripción

Estas regiones comúnmente abarcan 6 nucleotidos cada una y aprox a 10 y 35 bases corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción .

Secuencias promotoras -10 y -35 indican su posición relativa respecto al sitio de inicio de transcripción. Su importancia funcional :

1° lugar los genes con promotores que difieren en las secuencias consenso son transcritos de una forma menos eficiente que aquellos genes cuyos promotores se asemejas mas a las secuencias consenso .

2° Las mutaciones introducidas en cualquiera de las 2 secuencias consenso tienen un gran efecto en la función motora.

3° Lugar los sitios de unión de la ARN polimerasa a los promotores han sido identificados mediante la técnica footspringting de ADN, utilizada de forma habitual para determinar los sitios en los que se unen las proteínas al ADN.

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Trancripcion mediante la ARN Polimerasa de E.Coli:

Transcripcion mediante la ARN polimerasa en la E.Coli:

La polimerasa se une inicialmente al ADN de forma no especifica y recorre la molecula hasta que la subunidad sigma se une a los promotores 35- y 10-, dando lugar a un complejo cerrado.Entonces la polimerasa va separando las 2 cadenas de ADN alrededor del sitio de iniciación, y comienza la transcripción mediante la polimerisacion de los NTPs libres . la subunidad sigma se separa del nucleo de la polimerasa y se desplaza a lo largo del ADN y va alargando la cadena de ARN en crecimiento.

La polimerasa se une inicialmente al ADN de forma no especifica y recorre la molecula hasta que la unidad sigma se une a los promotores -35 y -10, dando lugar a un complejo promotor cerrado.Entonces la polimerasa va separando las 2 cadenas de ADN alrededor del sitio de iniciación, y comienza la transcripción mediante la polimerización de los NTP libres. La subunidad sigma se separa del nucleo de la polimerasa, que se desplaza a lo largo del ADN y va alargando la cadena de ARN en crecimiento.La síntesis del ARN continua hasta que la polimerasa encuentra una señal de terminación, tras la cual se detiene la transcripción, se separan el ARN y la polimerasa y la enzima se disocia del molde de ADN. Exiten 2 mecanismos activos para la terminación de la transcripcion de la E.Coli:

la terminación mas simple y común es una secuencia palindromica rica en GC seguida de 4 o mas residuos de A. La transcripción de la region rica en GC da lugar a un segmento del ARN que forma una horquilla estable por apareamiento complementario de bases. La formación de una estructura autocoplementaria en el ARN altera su unión al molde de ADN y finaliza la transcripcion.

La transcripción de algunos genes se termina mediante una proteína especifica de terminación (Denominada Rho) que se une a los segmentos extendidos (Mayores de 60 nucleotidos) de ARN de hebra sencilla. Puesto que los ARNm de bacterias se asocian con ribosomas y son traducidos mientras son transcritos , dichas regiones extendidas de ARN de hebra sencilla están expuestas solo en el extremo de un ARNm.

Las subunidades B y B’ forman una estructura de forma de pínza de cangrejo que sujeta el molde de ADN. Un canal interno entre las subunidades B y B’ acomoda aprox 20 pares de bases de ADN y contiene el centro activo de la polimerasa.

ARNm : sirve de molde para la síntesis de protinas

ARNr y ARNt: participan en la traducción del ARNm

Tecnica del footprinting del ADN:

Se divide en 2 una muestra que contiene fragmentos de ADN marcados radiactivamente en un extremo, y una mitad de la muestra se incuba con una proteína que se une a una secuencia

especifica de ADN dentro del fragmento . Ambas muestras son dirigidas con una ADNasa , de tal forma que la ADNasa introduzca una media de un corte por molécula. La región de ADN unida a la proteína esta protegida de la digestión por la ADNasa. Los complejos ADN-Proteina son desnaturalizados, y se analiza mediante electroforesis el tamaño de los fragmentos de ADN obtenidos por la ADNasa y marcados radiactivamente (igual para la secuenciacion de ADN). En la muestra de ADN que fue incubada con la proteína están ausentes los fragmentos de ADN resultantes de la digestión por la ADNasa de la región protegida por la unión de dicha proteína.

Control Negativo de la transcripción y represores:

La expresión de las enzimas implicadas en el metabolismo de la lactosa, que es una fuente de carbonos y energía tras ser hidrolizada a glucosa y galactosa. La B-galactosidasa enzima que cataliza esta reaccion y otras enzimas implicadas en el metabolismo de la lactosa están presenten únicamente cuando existe lactosa en el medio.En caso contrario la bacteria es capaz de economizar no invirtiendo energía en la síntesis innecesaria de ARN y proteínas. Por lo tanto, la lactosa induce la síntesis de la enzimas implicadas en su metabolismo. En el metabolismo de la lactosa intervienen otras 2 enzimas cuyos genes se encuentran muy ligados al de la B-galactosidasa: son la galactosido permeasa, que transporta lactosa al interior de la celula y una transacetilasa cuya función en esta via se desconoce. Los genes que codifican la B-galactosidasa, permeasa y la transacetilasa, se expresan en una unidad única, denominada ‘operon’ .

En el estudio de mutaciones se identificaron 2 loci distintos, denominados ‘o’ e ‘i’ que controlaban la expresión del operon . El locus ‘o’ (el operador) situado junto al inicio de la transcripción, controla la transcripción del operon .El gen ‘i’que no se encuentra dentro del operon codifica una proteína que regula la transcripción al unirse al ADN del operador. Los mutantes no sintetizan un producto funcional del gen ‘i’ se caracteriza por la expresión constitutiva del operon incluso en la ausencia de galactosa. Este daño señala que el producto normal del gen ‘i’ actuaria como un represor que inhibiría la transcripción al unirse a ‘o’ . La adicion de lactosa supone la inducción del operon como consecuencia de la unión de este nutriente al represor, lo que impediría su asociación con el ADN del operador.

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