RESPUESTA INMUNE INNATA FRENTE A INFECCIONES BACTERIANAS: SU FUNCIN EN LA DEFENSA Y EN LA PATOGNESIS DE LA SEPSIS

Jacquelin, Mara Josefina* y Basso, Beatrz **

RESUMEN El sndrome sptico es una causa importante de morbilidad y mortalidad, con una letalidad promedio de 40%, que se incrementa ms all del 60% en pacientes con shock sptico. El sistema inmune innato es la primera lnea de defensa contra microorganismos invasivos y es activado cuando un patgeno cruza las barreras de defensas naturales del husped. Instantneamente los componentes celulares (fagocitos) y solubles (va alterna del complemento) de este sistema inducen una respuesta defensiva. La unin de estructuras conservadas del patgeno a receptores de superficie celular, activa a los fagocitos a eliminar al microorganismo y a liberar mediadores inflamatorios como citoquinas. Si la bacteria resiste a este ataque inicial, pasa a sangre, donde induce una inflamacin sistmica caracterizada por una activacin masiva de macrfagos del sistema retculo-endotelial y leucocitos circulantes, liberacin de citoquinas, expresin de molculas de adhesin en clulas endoteliales y desarrollo de hipotensin. Si esto no es rpidamente controlado, la inflamacin sistmica puede progresar a sepsis, shock sptico y falla multiorgnica. Uno de los principales logros para entender la patognesis de la sepsis ha sido reconocer el rol principal del sistema inmune innato en la defensa contra microorganismos invasivos. El objetivo del presente trabajo es describir cmo las bacterias desencadenan las funciones del sistema inmune innato en la defensa del husped. Localizando la atencin en el rol que juegan los productos bacterianos (endotoxinas, pared celular de bacterias gram positivas), protenas de fase aguda, receptores y citoquinas en la patognesis de la sepsis. La terapia de la sepsis y shock sptico debera estar centrada en mantener la homeostasis, erradicar las bacterias y restaurar el balance entre la respuesta proinflamatoria y antiinflamatoria.

Palabras Clave: sepsis- inmunidad- bacterias

Laboratorio de Bacteriologa. Servicio de Neonatologa del Hospital Universitario de Maternidad y Neonatologa. Fac. Cs. Mdicas. UNC. Santa Rosa 1045. 5000 Crdoba

INTRODUCCIN

El sndrome sptico es una causa importante de morbilidad y mortalidad, con una letalidad promedio de 40%, que se incrementa ms all del 60% en pacientes con shock sptico. La piel, el tracto digestivo, el tracto respiratorio alto, rganos urogenitales externos y conjuntiva, estn conectados al ambiente externo y contienen bacterias comensales que no causan enfermedad. En particular, el tracto intestinal contiene billones de bacterias, que como Escherichia coli contribuyen a la funcin de los intestinos. De la misma manera, bacterias como Lactobacillus acidophilus son involucrados en el mantenimiento del ambiente cido de la vagina, mientras que el objetivo de bacterias como Staphylococcus epidermidis en la piel, es la defensa contra la invasin de microorganismos por la produccin de varias sustancias bactericidas. Los microorganismos patgenos as como los comensales inducen una respuesta inmune si ellos, o sus constituyentes, pasan la barrera entre el medio externo e interno normalmente estril. Despus del reconocimiento de la bacteria o de sus productos, el organismo lanza un ataque, mata a la bacteria y repara el dao producido. En este sndrome, la respuesta inflamatoria sistmica es iniciada por la liberacin de componentes microbianos, incluyendo endotoxinas, peptidoglicanos cido teicoico y varias exotoxinas. Esta secuencia de eventos es altamente regulada, permitiendo al organismo combatir la infeccin a travs de un ataque que es agresivo para erradicar la bacteria pero no tan violento como para causar un dao innecesario al husped. En sangre, las bacterias o productos bacterianos producen una inflamacin sistmica caracterizada por una activacin masiva de macrfagos en el sistema reticuloendotelial y de leucocitos en circulacin, liberacin de citoquinas, molculas de adhesin expresadas en clulas endoteliales y desarrollo de hipotensin. La consecuencia de esta inflamacin sistmica puede

progresar a sepsis, shock sptico y falla multiorgnica. (Fig.1) (1,2) La principal funcin del sistema inmune es proteger al husped contra microorganismos patgenos, tradicionalmente ha sido dividido en inmunidad innata e inmunidad adquirida. Las principales diferencias entre ambas respuestas son los mecanismos y los tipos de receptores usados para el reconocimiento antignico (3). Es importante mencionar que constantemente se describen nuevos factores, molculas y protenas con diversas propiedades inmunolgicas, las cuales son producidas por clulas consideradas como parte del sistema de defensa del husped. Asimismo, los mecanismos de regulacin de las citoquinas y su posible aplicacin en la medicina clnica permanecen an por esclarecer, por lo cual el estudio de las citoquinas y sus efectos se mantiene como un campo amplio de investigacin.

El objetivo de este trabajo es estudiar los diferentes componentes bacterianos, su interaccin con los componentes del sistema inmune innato a travs de receptores, activacin celular y produccin de citoquinas pro y anti- inflamatorias generadas a partir de esa interaccin, que contribuyen a la defensa del husped y a la patognesis de la sepsis. Adems conocer nuevas estrategias teraputicas para el manejo del paciente sptico.

MICROORGANISMOS

FIG.1. Representacin esquemtica de las defensas del husped contra las infecciones. Los microorganismos patgenos invasivos atraviesan la barrera epitelial y mucosa del husped e instantneamente el mismo prepara un a respuesta inmune innata defensiva formada por componentes solubles (va alterna del complemento, lectinas que fijan manosa) y componentes celulares (fagocitos). La unin de patrones moleculares asociados al patgeno (PAMPs) a los receptores de superficie celular activa a los fagocitos y eliminan al microorganismo. La liberacin de mediadores inicia la respuesta inflamatoria. La mayora de las veces el sistema inmune innato elimina al microorganismo. Pero si el patgeno resiste al ataque inicial, puede causar sepsis severa o shock sptico. La persistencia del patgeno gatilla la respuesta inmune adaptativa con activacin de linfocitos T y B.

INFECCIN POR BACTERIAS. INMUNIDAD INNATA Y ESPECFICA

Las principales clulas del sistema inmune innato (SII) son los macrfagos/monocitos, polimorfonucleares, neutrfilos, eosinfilos, mastocitos y clulas NK (natural killer). Las principales molculas secretadas o de membrana producidas por estas clulas e implicadas en la funcin del SII son: 1- molculas circulantes: protena C reactiva (PCR), protena amiloide srica (PAS), protena que fija manosa (PFM), protena que fija lipopolisacrido (PFL), CD14s (soluble), factor 3 del complemento (C3). 2- Molculas receptoras de membrana: receptores manosa del macrfago, DEC-205, receptores scavenger (tipo I y II, MARCO), CD14, receptores del complemento (CD35-CR1, CD21-CR2 y CD11b, CD18-CR3). Todas estas molculas tienen como funciones estimular la fagocitosis, fijar glcidos, glucolpidos, aumentar la depuracin de bacterias por los macrfagos (en sus diferentes variantes tisulares, como las clulas de Kupffer) y monocitos de la sangre. Algunas molculas, como DEC-205, fijan los componentes mencionados, ubicados principalmente en las cpsulas y membranas bacterianas, sobre las clulas dendrticas (4).

Las principales clulas del sistema inmune especfico (SIE) son los linfocitos B y T (Th y Tc) y las CPA. Las molculas solubles de este sistema son los anticuerpos especficos (Igs) y las citoquinas, las cuales son tambin muy importantes en el SII. Las principales molculas de membrana son los receptores del linfocito B (BCR), los del linfocito T (TCR) y los antgenos de histocompatibilidad (CMH). En todas las clulas se han reconocido casi 200 molculas solubles o de membrana diferentes (clasificadas

COMPLEMENTO FAGOCITOS MEDIADORES

SOLUBLES

SHOCK SPTICO PATGENOS

RESPUESTA INMUNE ADQUIRIDA

RESPUESTA INMUNE INNATA

en general como CD1,2.). Muchas de ellas participan directamente o indirectamente en el SI (4).

En la inmunidad especfica, los receptores reconocen a los microorganismos infecciosos e identifican antgenos propios y del medio. En cambio, en la inmunidad natural, los receptores reconocen estructuras altamente conservadas presentes en los microorganismos. Estas estructuras se conocen con el nombre de patrones moleculares asociados al patgeno, en ingls PAMPs. Los ejemplos ms conocidos de PAMPs son: LPS (lipopolisacridos) bacterianos, PGN (peptidoglicano), ALT (cidos lipoteicoicos), mananos, DNA bacteriano, RNA y glucanos. Aunque estas estructuras son qumicamente diferentes, todos los PAMPs tienen un punto en comn:

1. Los PAMPs son producidos solamente por microorganismos patgenos, y no por sus huspedes. Por ejemplo el LPS es sintetizado slo por bacterias; los receptores que reconocen a estos patrones, reconocen al LPS, por lo que alertan al husped de la presencia del microorganismo infeccioso.

2. Las estructuras reconocidas por el SII son esenciales para la sobreviva o patogenicidad del microorganismo.

3. Los PAMPs son estructuras usualmente invariables compartidas por diferentes clases de microorganismos, y por lo tanto, el receptor del husped que reconoce patrones de LPS, puede detectar la presencia de virtualmente todas la bacterias gram negativas infectantes (3).

Despus de la identificacin del microorganismo, los receptores activan una cascada de eventos intracelulares resultando en la produccin de molculas efectoras incluyendo mediadores proinflamatorios como las citoquinas. Las seales producidas por la inmunidad inespecfica, controlan aspectos de la inmunidad especfica.

Los mecanismos de las respuestas inmune innata y adquirida forman un sistema integrado de defensa del husped, en el cual numerosas clulas y molculas funcionan colectivamente. La respuesta inespecfica temprana es un factor de suma importancia, influye en el tipo de respuesta especfica que se desarrollar subsecuentemente

(4). De igual manera, la inmunidad adquirida puede intervenir durante la inmunidad natural. Los fagocitos mononucleares son importantes participantes en ambas interacciones. Despus de haber ingerido al patgeno, los macrfagos respondedores durante una reaccin de inmunidad innata, actan como clulas presentadoras de antgenos (CPA), en este sentido los macrfagos tienen un importante papel en el secuestro y procesamiento antignico. La CPA expresa pptidos de ese microorganismo procesado a molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) clase II que se encuentra sobre su superficie y expresa adems molculas co-estimoladoras. Ambas seales son requeridas para la activacin de la clula T helper. De esta manera, los macrfagos y la clula T helper activada liberan ciertos tipos de citoquinas que controlan los componentes de la respuesta inmune adaptativa como la activacin de linfocitos T citotxicos, linfocitos B, etc. Mientras, las clulas T y B producen citoquinas tales como el IFN-, con la finalidad de incrementar las funciones microbicidas de los macrfagos. Por lo tanto, la interrelacin entre la inmunidad natural y la especfica es bidireccional y est mediada en gran parte por las citoquinas (5).

SEPSIS Y SHOCK SPTICO

Durante los aos 70 Lewis Thomas populariz la teora de que la sepsis es ms una incontrolada respuesta defensiva del husped que un efecto directo de los microorganismos. Tal afirmacin cobra fuerza hoy en da una vez que numerosas investigaciones ponen de manifiesto que un gran nmero de mediadores humorales y de productos celulares estn involucrados en esta exagerada respuesta sitmica (6).

La activacin de clulas en respuesta a la bacteria o sus componentes de pared resulta en la liberacin de mediadores inflamatorios, como citoquinas, prostaglandinas, mediadores lipdicos y especies oxidantes. Estos componentes inducen vasodilatacin y aumento de la expresin de las molculas de adhesin, resultando en la extravasacin de neutrfilos y monocitos; activacin de leucocitos, linfocitos y clulas endoteliales; y supresin miocrdica. Junto a la estimulacin de la coagulacin por citoquinas, los componentes bacterianos pueden interactuar directamente con el sistema de coagulacin. El resultado es la coagulacin intravascular

diseminada que causa hipoperfusin e hipoxia y junto al dao causado por clulas fagocticas intra y extravasculares, conducen a falla orgnica. Puede iniciarse as, el estado letal de sepsis, en el cual la falla multiorgnica, involucra principalmente pulmn (sndrome de diestrs respiratorio), hgado y rin (7). Adems la hipoperfusin causada por coagulacin intravascular diseminada puede daar la mucosa intestinal y como resultado de eso trasladar bacterias a los ndulos linfticos mesentricos y bajo condiciones de estrs, a varios rganos y a la circulacin. La liberacin de las bacterias alimentar an ms la falla multiorgnica y empeorar el pronstico. Si la sepsis persiste, hay un cambio hacia un estado antiinflamatorio inmunosupresor. Esta es una de las razones por lo cual la estrategia antiinflamatoria falla como terapia de sepsis (8). Los pacientes con sepsis se caracterizan por inmunosupresin, que incluye prdida de la hipersensibilidad tarda, incapacidad para actuar frente a la infeccin y predisposicin a las infecciones nosocomiales. Por lo tanto, el tipo de respuesta inmunolgica est determinado por muchos factores, incluyendo la virulencia del microorganismo, tamao del inculo y condiciones de base del paciente como estado nutricional, edad, y polimorfismo en los genes de citoquinas u otras molculas inmunoefectoras (6).

Hay marcada diferencia en la respuesta frente a bacterias gram positivas y gram negativas. Todas las bacterias gram negativas contienen lipopolisacridos (LPS) en su pared, como su mayor determinante patognico. Las bacterias gram positivas contienen un importante nmero de componentes de pared inmunognicos, adems de exotoxinas. La respuesta inmunolgica frente a bacterias gram negativas involucra principalmente a leucocitos y la produccin de citoquinas como factor de necrosis tumoral alfa (TNF-), interleuquina-1(IL-1), e IL-6. La liberacin de exotoxinas, muchas de las cuales son superantgeno, por bacterias gram positivas activan clulas T, resultando as en una respuesta celular diferente y diferencias en el perfil de citoquinas, con relativamente bajos niveles de TNF-, IL-1 e IL-6, pero incrementados niveles de IL-8. (9)

EPIDEMIOLOGA

Por sepsis, cada ao mueren ms de 135.000 pacientes en Europa y 215.000 pacientes en Estados Unidos. A pesar de contar con mejores

medios de soporte en las unidades de cuidados intensivos la mortalidad por shock sigue siendo muy alta y la incidencia de bacteriemias y sepsis hospitalarias en los ltimos aos se ha incrementado. La sepsis severa es una amenaza vital, que compromete ms de 18 millones de personas al ao a nivel mundial, lo que equivale aproximadamente a 1.400 personas fallecidas por da, cifra equivalente a la poblacin total de Dinamarca, Finlandia, Irlanda y Noruega juntas. En tres estudios distintos, la proporcin de infecciones debido a bacterias gram negativas vari entre un 30 y un 80 % y las infecciones por bacterias gram positivas entre 6 y 24 % del total de nmeros de casos de sepsis. (10). Sin embargo, la contribucin de bacterias gram positivas a la sepsis se ha incrementado, y al principio de la dcada del 90 fue superior al 50% de todos los casos de septicemia con Staphylococcus aureus y S. epidermidis como responsables de ms de la mitad de los casos de sepsis por bacterias gram positivas (2). El incremento en el grado de septicemia, probablemente se deba al incremento del uso de catteres y otros instrumentos invasivos, por quimioterapia, y por inmuno-supresin en pacientes transplantados. La mortalidad por sepsis y shock vara desde el 20 al 80% de los casos, y la misma est relacionada con la severidad de la sepsis as como tambin con la enfermedad de base del paciente que siempre est presente (9,11).

DEFINICIONES

El diagnstico de sepsis sigue siendo eminentemente clnico si bien se estn desarrollando diferentes marcadores que permitan un diagnstico precoz de estos pacientes y diferenciar los sntomas de otros procesos inflamatorios sistmicos no infecciosos. Ya en 1992 en un intento de identificar precozmente a los pacientes que presentaban un alto riesgo de desarrollar sepsis, el American College of Chest Physicians / Society of Critical Care Medicine llevaron a cabo un consenso para intentar definir los diferentes estadios de infeccin, bacteriemia, Sndrome de respuesta inflamatoria sistmica (SIRS), sepsis, sepsis severa, shock sptico, sndrome de disfuncin multiorgnica. A pesar de todo, en la prctica clnica, algunos de sus conceptos han sido cuestionados (12) (Tabla I).

Tabla I. Definicin de Sepsis. Critical Care Medicine Consensus Conference* Sndrome de respuesta inflamatoria sistmica (SRIS) Taquicardia > 90 latidos por min. Taquipnea > 20 respiraciones por minuto o PaCo2 < 32 mmHg Fiebre > 38C o hipotermia < 36C Leucocitos en sangre > 12.000 clulas/mm3 o < 4.000 clulas/mm3 o > 10% en bandas

Sepsis SRIS con infeccin documentada

Sepsis Severa Sepsis ms Disfuncin orgnica Acidosis metablica PaO2 < 75 mmHg o PaO2/FiO2 < 250 Oliguria: < 30 ml/h (3 h) o 700 ml/24 h Coagulopata: TP prolongado, descenso de un 50% de las plaquetas, plaquetas < 100.000 109 Encefalopata: GCS < 14 Hipotensin

Shock sptico Sepsis severa con hipotensin durante al menos una hora a pesar de la fluidoterapia.

Sndrome de disfuncin multiorgnica Incapacidad de un paciente en shock sptico de mantener su homeostasis sin ayuda.

(*)American College of Chest Physician/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Chest. 1992.101. 1644-1655

1.

Infeccin es un fenmeno microbiano que se debe a la invasin de los tejidos estriles por microorganismos y/o la respuesta inflamatoria consecuente con la presencia de microorganismos.

2. Bacteriemia-fungemia se entiende, como la existencia de hemocultivos positivo a una bacteria-hongo, y esta terminologa hace referencia estrictamente a un criterio microbiolgico. La bacteriemia polimicrobiana es tambin un criterio microbiolgico y se define por la existencia de hemocultivos positivo a dos o ms bacterias. Su frecuencia vara entre el 5 y el 22% del conjunto de bacteriemias.

3. Sndrome de respuesta inflamatoria sistmica (SIRS) representa la variante severa de

la inflamacin. No es un trmino que indique una etiologa en concreto y se puede deber tanto a la infeccin como a otras causas que puedan desencadenar una inflamacin generalizada por ejemplo: pancreatitis, isquemia, traumatismo, shock hemorrgico, autoinmunidad o la administracin de inmunomoduladores. Es una apreciacin eminentemente clnica y se caracteriza por la presencia de dos o ms de las siguientes manifestaciones clnicas detalladas en Tabla I. (12).

4. Sepsis es la activacin inflamatoria sistmica infecciosa aguda. Indica un sndrome de toxicidad sistmica grave. Se debe a la respuesta inflamatoria del sistema inmune del husped frente al estimulo antignico microbiano y no al

efecto directo del microorganismo invasor. Por tanto, no es preciso aislar al microorganismo para hablar de sepsis (45% al 50% de los pacientes presentan hemocultivos positivos), pero s es necesario tener evidencia de la infeccin (fiebre o hipotermia, hipotensin, taquicardia, fenmenos cutneos mucosos de CID (coagulacin intravascular diseminada), trombocitopenia, etc.) (12).

5. Sepsis severa es una sepsis asociada con disfuncin orgnica, anormalidades de la perfusin o hipotensin dependiente de la sepsis y que responde a la adecuada administracin de lquidos (12).

6. Shock sptico, se entiende, como la presencia de sepsis acompaada de una deficiente perfusin tisular, lo cual se traduce clnicamente por una presin arterial sistlica inferior a 90 mm de Hg o un descenso de 50 mm de Hg en un paciente con hipertensin establecida, por oliguria inferior a 20 ml hora 400 ml en 24 horas, por un pH inferior a 7,25 o por un descenso de nivel de conciencia a pesar de la adecuada reanimacin con fluidos (12).

7. Sndrome de disfuncin multiorgnica (MODS) se define como la presencia de alteraciones de diferentes rganos en un paciente enfermo en el cual la homeostasis no puede mantenerse sin medidas extraordinarias. En un primer lugar el MODS es el resultado directo de la agresin y la disfuncin orgnica ocurre de inmediato y es directamente atribuible a la misma. Posteriormente el MODS se desarrolla como consecuencia de la respuesta del husped y se identifica en el contexto del SIRS (12).

El shock endotxico implica un criterio patognico, y hace referencia a los efectos de la endotoxina de las bacterias gram-negativas como mediadoras del desarrollo del shock.

COMPOSICIN DE LA ENVOLTURA CELULAR BACTERIANA

La mayor parte de las bacterias producen una envoltura celular que incluye la membrana plasmtica, la pared celular y las protenas y los polisacridos asociados. Algunas bacterias producen cpsulas o cubiertas mucosas. La pared celular es una estructura rgida que contiene y protege a la bacteria del dao fsico y de condiciones de baja presin osmtica externa. La

estructura y la naturaleza qumica de las envolturas se correlacionan con el hecho de que una bacteria se coloree como gram negativa, gram positiva o que sea cido-alcohol resistente. Los tres grupos de microorganismos presentan diferencias como la presencia de una membrana externa en las bacterias gram negativas, la que no aparece en las bacterias gram positivas o en las cido-alcohol resistente, y por la presencia en estos dos ltimos grupos de polisacridos ligados al peptidoglicano, que no se observa en las clulas gram negativas (13). (Fig. 2). El LPS de bacterias gram negativas y otros componentes de pared celular bacteriana como PGN, ALT, LAM (lipoarabinomananos) y DNA bacteriano son factores microbiolgicos implicados en el inicio de la respuesta inmune (14). Se describe a continuacin los distintos componentes de la pared celular bacteriana y luego la interaccin de los mismos con los componentes del SII. Esta interaccin puede ser significativamente diferente en lo que respecta a los factores involucrados, bacterianos y del husped

FIG.2. Estructura de la pared celular de las bacterias. Todas las bacterias contienen una membrana celular rodeada por una capa de Peptidoglicano (PGN). Los cidos lipoteicoicos (ALT) y Lipoarabinomananos (LAM) estn insertos en la membrana celular. El Lipopolisacrido (LPS) forma la parte externa de la membrana externa de las bacterias gram negativas. Las micobacterias tambin contiene una capa de PGN, pero no todas las bacterias presentan cpsula. Microbiologa y Parasitologa. USAL. Universidad del Salvador. Directora cientfica: Alicia Farinati.

LIPOPOLISACRIDO. (LPS)

Estructura. La pared celular de las bacterias gram negativas est compuesta por tres capas, las cuales incluyen: membrana interna y externa que envuelven a una delgada capa de peptidoglicano.

La membrana externa es una estructura trilaminar que se diferencia en su composicin qumica de la membrana citoplasmtica, ya que presenta en su capa externa lipopolisacridos. Estas molculas se encuentran cargadas negativamente y se unen de forma no covalente con cationes divalentes. Esto estabiliza a la membrana y provee una barrera para molculas hidrofbicas. El desplazamiento de los LPS por antibiticos policatinicos como polimixinas, aminoglucsidos o agentes quelantes, vuelven a la membrana externa ms permeable a grandes molculas hidrofbicas. El LPS se encuentra slo en bacterias gram negativas (1). E.coli contiene aproximadamente 3.5 X 10 6. Otros componentes de la membrana externa son glicerofosfolpidos y protenas (por ejemplo: protenas porinas como OmpA en E.coli) que se encuentran en la capa interna de la membrana externa, algunas de las cuales estn firmemente asociadas con las molculas del LPS. El LPS es un componente esencial de la pared celular, no es txico cuando est incorporado dentro de la membrana externa, pero liberado de la pared celular, su parte txica, el lpido A, es expuesto a las clulas inmunes y as evoca una respuesta inflamatoria. El LPS y otros constituyentes de pared son liberados desde las clulas bacterianas cuando estas se multiplican pero tambin cuando se mueren o se lisan (15).Varios factores endgenos como protenas bactericidas y el complemento, pueden causar desintegracin de la bacteria y as la liberacin del LPS. Adems, es conocido que algunos antibiticos liberan el LPS de la bacteria.

La molcula de LPS consiste en tres regiones diferentes: el lpido A, el ncleo polisacrido y el polisacrido O especfico. (Fig. 3) (16). La primera parte y esencial es el lpido A. Seis o ms residuos de cidos grasos estn unidos mediante uniones ster amina a un disacrido compuesto por N-acetilglucosaminafosfato. Cuatro de stos cidos grasos contienen un grupo hidroxilo en el carbn tres, mientras que los otros dos no estn hidroxilados. El disacrido est unido al ncleo polisacrido a travs de KDO (cetodesoxioctonato). Entre los cidos grasos que se hallan habitualmente en el lpido A estn el cido caproico, lurico, mirstico, palmtico y esterico. Distintas experiencias con lpido A sinttico han mostrado que esta porcin de la molcula del LPS es responsable de las actividades endotxicas.

El ncleo polisacrido es similar en todas las bacterias gram negativas y est compuesto

principalmente de N-acetilglucosamina, glucosa, galactosa, heptosa, fosfato y etanolamina. Las cuales estn unidas por medio del KDO al disacrido del lpido A.

El polisacrido O especfico est formado por una secuencia de azcares que es altamente variable. Est unido al ncleo y consta generalmente de galactosa, glucosa, ramnosa y manosa, todos ellos azcares de 6 tomos de carbono. Estos azcares estn unidos entre s formando secuencias de cuatro o cinco unidades que a menudo se hallan ramificados. La repeticin de estas secuencias de azcares da lugar a la formacin del polisacrido O.

La estructura exacta del lpido A y de los componentes del polisacrido vara segn la especie de bacterias gram negativas de que se trate. Si bien, la secuencia de los elementos principales (Lpido A-KDO-Ncleo polisacrido-Polisacrido O especfico) es por lo general uniforme. El Polisacrido O especfico cambia mucho segn la especie por lo que all reside la especificidad serolgica (17).

FIG.3. Estructura del Lipopolisacrido de bacterias gram negativas. KDO, cetodesoxioctonato; HEP, heptosa; GLU, glucosa; GAL, galactosa; GluNac, N-acetilglucosamina; GlcN, glucosamina. Brock Biologa de los microorganismos, 8 ed. Mitigan, Martinko, Parker. Ed. Printice Hall.

CIDOS LIPOTEICOICOS Y TEICOICOS.

Estructura. Muchas bacterias gram positivas contienen considerables cantidades de cidos teicoicos (AT) y cidos lipoteicoicos (ALT) en la pared celular. Las molculas son polmeros solubles en agua. Contienen residuos de ribitol o glicerol unidos a travs de enlaces fosfodister y transportan uno o ms aminocidos o azcares sustituyentes. La unidad repetida puede ser glicerol, unidos por enlaces 1,3 o 1,2, o por ribitol, unidos por enlaces 1,5. Pueden ocurrir uniones

ms complejas en las cuales glicerol o ribitol se une a residuos azcares como glucosa, galactosa, o N-acetilglucosamina. El nmero de unidades repetidas vara ampliamente, dependiendo de las especies, de la cepa, de las condiciones de crecimiento pero generalmente varan entre 4 y 30 para S.aureus (13). El aminocido sustituyente ms comn es D-Alanina, usualmente se une en la posicin 2 o 3 del glicerol o posicin 3 o 4 del ribitol o se une a uno de los residuos de la azcar. Diferentes especies pueden tener uno o ms tipos de azcares sustituyentes. El AT est covalentemente unido al peptidoglicano, participando en la adhesin bacteriana y el ALT est covalentemente unido a la membrana glicolpidica, anclando la pared celular a la membrana (1).

El ALT se asemeja al LPS de bacterias gram negativas, por lo tanto es considerado la contrapartida del LPS (2). (Fig 4) El ALT es esencial para el crecimiento bacteriano. Est involucrado en la regulacin de la concentracin de Ca 2+ y Mg 2+ en la pared celular y en la regulacin de la actividad de las enzimas autolticas. Varias condiciones pueden llevar a la liberacin de los ALT desde la pared celular, incluyendo la presencia de ciertos antibiticos (7).

Fig 4. Estructura del cido lipoteicoico de S.aureus. Ala: alanina. Clin.Microbiol.Rev. July 2003, p.379-414.

PEPTIDOGLICANO

Estructura. Debido a la estructura del peptidoglicano (PGN), la pared celular de las bacterias gram positivas y gram negativas es rgida, por lo que protege a las bacterias contra la ruptura osmtica. El PGN de las bacterias gram positivas est formado por 50 a 100 molculas de espesor representando el 90% de la pared, mientras que la pared celular de las bacterias gram negativas est formada por una o dos molculas de espesor, constituyendo slo el 10% de la pared

(13). El PGN es un heteropolmero de largas cadenas de polisacrido, en donde dos azcares N-acetilglucosamina y cido N-acetilmurmico estn alternados en forma lineal. La cadena pptidica que incluye a L-alanina, D-alanina, D-glutmico y lisina o en otros casos cido diaminopimlico (DAP), est unida a cada cido N-acetilmurmico. Estos componentes se unen entre s para formar una estructura que se repite a lo largo de la pared y que se llama tetrapptido del glicano. La estructura bsica del PGN est constituida por una fina lmina en la que las cadenas de azcares se conectan entre s por puentes, formados por aminocidos. Los enlaces glucosdicos que unen los azcares en las cadenas de glucano son muy fuertes, pero estas cadenas por si solas no son capaces de conferir rigidez. De ah que solo cuando se entrecruzan a travs de puentes peptdicos se logra la rigidez caracterstica de la pared. En las bacterias gram negativas los puentes se establecen por lo general mediante enlaces peptdicos directos del grupo amino del DAP y el grupo carboxilo de la D-alanina terminal. En bacterias gram positivas habitualmente se establece mediante el enlace de varios aminocidos cuyo nmero y tipo dependen de los diferentes organismos. En S. aureus, el puente est formado por cinco glicinas conectadas por enlaces peptdicos (17). (Fig. 5). La inhibicin de la sntesis del PGN es el objetivo principal de varias clases de antibiticos, incluyendo: Penicilinas, Cefalosporinas y Glicopptidos.

Fig. 5. Estructura de una de las unidades repetitivas integrantes del peptidoglicano de la pared celular: el glicano -tetrapptido. NAG: N-acetilglucosamina. NAM: N-acetilmurmico. Microbiologa y Parasitologa. USAL. Universidad del Salvador. Directora cientfica: Alicia Farinati.

INTERACCIN ENTRE PRODUCTOS BACTERIANOS, PROTENAS

PLASMTICAS Y RECEPTORES DE CLULAS INMUNES

Tan pronto como la bacteria entra al cuerpo, esta confronta con dos lneas celulares de defensa: una lnea humoral y una lnea celular. Los factores humorales comprenden complemento, anticuerpos y protenas de fase aguda. En la lnea de defensa celular, las clulas mononucleares (monocitos y macrfagos) y los neutrfilos son de gran importancia ya que estas clulas pueden reconocer constituyentes de pared celular bacteriana directa o indirectamente despus de que anticuerpos o el complemento se unan a la bacteriana o a sus constituyentes (opsonizacin). Normalmente, las clulas inmunes estn expuestas continuamente a bajos niveles de LPS derivados de bacterias gastrointestinales que pasan a sangre a travs de la vena porta. Estos LPS son captados por los macrfagos y pueden ser esenciales para mantener al sistema inmune bajo un nivel basal de atencin (18).

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

El LPS y otros componentes bacterianos son reconocidos por anticuerpos, y el complemento, produciendo la opsonizacin y la lisis de la bacteria. Los fagocitos (monocitos, macrfagos y leucocitos polimorfonucleares (PMN)) son capaces de reconocer componentes bacterianos opsonizados a travs de receptores Fc de la Ig G (Inmunoglobulina G) y del complemento. Adems expresan receptores que reconocen componentes bacterianos. En la respuesta del husped a la bacteria los fagocitos mononucleares son de mayor importancia. El reconocimiento del LPS y de otros componentes bacterianos por estas clulas, inician una cascada de liberacin de mediadores inflamatorios, cambios vasculares y reclutamiento de clulas inmunes. Un macrfago activado por LPS, se vuelve activo metablicamente y produce depsitos intracelulares de radicales libres de oxgeno y otros agentes microbicidas (lisozima, protenas catinicas, hidrolasas cidas y lactoferrina) y secretan mediadores inflamatorios (19). Uno de los principales mediadores secretados es el Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-). Esta despus de la exposicin al LPS, es la primera citoquina liberada por los macrfagos. El RNAm de TNF- se transcribe constitutivamente en clulas de Kupffer, permitiendo una rpida liberacin despus del desafo inflamatorio.

La liberacin de TNF-, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, factor activador de plaquetas (PAF), eicosanoides, produce un profundo efecto sobre el tejido circundante (20). Las anafilotoxinas, C3a y C5a derivadas del complemento y varios de estos mediadores inflamatorios atraen PMN desde la circulacin y los activan. La extravasacin de PMN es posible por la vasodilatacin y el aumento de la expresin de molculas de adhesin en clulas endoteliales, PMN y macrfagos (21). Los PMN reaccionan a ste estmulo por agregacin intravascular, adherencia al endotelio, diapdesis y la produccin de mediadores inflamatorios como, leucotrienos B4, FAP (21). Los PMN activados expresan CD14, CD11/CD18, y varios receptores del complemento y receptores para la porcin Fc de la Ig G y por lo tanto estn capacitados para reconocer y fagocitar LPS, fragmentos bacterianos y bacterias completas.

Los PMN producen una serie de agentes microbicidas, como lisozima, protena inductora de permeabilidad/bactericida (PIP), enzimas y radicales libres de oxgeno. Estos agentes son usados para la muerte lisosomal de los microorganismos. No obstante, la adherencia de los PMN a las clulas endoteliales y la presencia de altas concentraciones de estmulo puede tambin resultar en la liberacin de agentes microbicidas; muchos de los daos endoteliales observados en la sepsis son causados por estos agentes (4).

Los mecanismos por el cual al LPS activa a las clulas e inicia la respuesta inflamatoria fueron explicados recientemente. El CD14 y la PFL son los principales mediadores de la activacin de las clulas inflamatorias (22, 23,24). CD14 no es una protena de transmembrana, por lo que una molcula de transmembrana era necesaria para explicar la estimulacin celular mediada por el complejo LPS-PFL y CD14 unido a membrana. Los receptores Toll (TLR4) funcionan como componentes de transmembrana y traducen las seales enviadas por el LPS. Despus de la activacin de la cascada de seales se transcriben las citoquinas codificadas en los genes (25,26). Las clulas endoteliales o epiteliales responden al LPS a travs del receptor CD14 soluble estimulndolas a liberar citoquinas a circulacin. Los mediadores inflamatorios secretados por poblaciones de clulas diferentes atraen y activan linfocitos T y B. Adems, la liberacin de mediadores como IL-2, Interferon gama (IFN- ), Factor estimulante de colonias granuloctica-macrfago (GM-CSF), estn involucrados en la

proliferacin y activacin de ms clulas mononucleares. La accin de las clulas inmunes activadas combinada con los efectos de los mediadores inflamatorios causan sntomas como fiebre, dao endotelial, derrame capilar, dilatacin vascular perifrica, desordenes en la coagulacin, microtrombos y depresin miocrdica. Este fenmeno puede resultar finalmente en fallo multiorgnico, shock y muerte (6).

BACTERIAS GRAM POSITIVAS

En comparacin con el LPS, se conoce relativamente poco acerca de la accin del ALT in vivo e in vitro. Contrario a las bacterias gram negativas, donde el LPS es la porcin biolgicamente activa, en bacterias gram positivas; los ALT, PGNs y exotoxinas son altamente relevantes con respecto a la respuesta inmunolgica (27). El ALT y el PGN son capaces de inducir la liberacin de xido ntrico (NO), IL-1, IL-6, y TNF- por monocitos y macrfagos y activar la muerte oxidativa (28). Las bacterias gram positivas pueden causar sepsis por dos mecanismos: el primero por produccin de endotoxinas y el segundo por estimulacin de la respuesta inmune a travs de mecanismos similares a los identificados en la sepsis por gram negativos. La sepsis por bacterias gram positivas difiere de la sepsis por bacterias gram negativas, en que las primeras, a menudo provienen de la piel, heridas, tejidos blandos y catteres ms que de fuentes genitourinaria o entrica. Adems, los microorganismos gram positivos, requieren de una respuesta inmune altamente orquestada, con muerte intracelular por neutrfilos y macrfagos (27). Esto no es el caso de los patgenos gram negativos, los cuales pueden ser eliminados rpidamente en el espacio extracelular por anticuerpos y el complemento (29).

Las exotoxinas pueden actuar como superantgenos, las cuales son potentes molculas proteicas que estimulan clulas T, producidas por S. aureus y S. pyogenes. Estos superantgenos son capaces de inducir sndrome de shock txico y pueden algunas veces causar falla multiorgnica (30). Los superantgenos son molculas bifuncionales que interactan con al menos dos receptores expresados en diferentes clulas, CMH clase II de la CPA (clula presentadora de antgeno) y cadenas V del receptor de las clulas T, y forman un complejo trimolecular (31,32). Esta interaccin trimolecular conduce a una liberacin descontrolada de numerosas citoquinas pro-inflamatorias, especialmente INF- y TNF-.,

las cuales son las causantes del sndrome de shock txico (33).

Las bacterias gram positivas presentan, adems otros componentes inmunognicos de pared celular, como PGN y ALT (11,27). Los ALT presentan actividad biolgica que median la induccin de citoquinas como IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 y otras molculas activadas en la inflamacin. En estudios experimentales en ratas, la administracin de ALT causa la liberacin de TNF-, produccin de xido ntrico sintetasa y falla circulatoria. La patognesis mediada por los ALT puede variar entre las especies bacterianas. El PG de S.aureus induce la transcripcin del RNAm de IL-6 e IL-10 en monocitos y clulas T. A diferencia de los ALT, el PG de S.aureus no induce la liberacin de xido ntrico. Pero la coadministracin de ALT y PG resulta en un incremento de cuatro veces en la produccin de xido ntrico que lo liberado por los ALT solos (1).

El CD14, el principal receptor del LPS, tambin reconoce componentes bacterianos como ALT. Los ALT pueden actuar sinrgicamente o como antagonista del LPS (34). El PG de bacterias gram positivas tambin se une al CD14, sugiriendo que este receptor est involucrado en la induccin de citoquinas en la infeccin por gram positivas (35,36). Estudios utilizando lneas celulares transfectadas con receptores Toll (TLR2) y factor nuclear de transcripcin NF-B luciferasa o macrfagos deficientes en el receptor TLR2, mostraron que el mismo est implicado en la respuesta a bacterias gram positivas (Staphylococos sp., Streptococos sp., Listeria monocytogenes) y a componentes de las mismas: PGNs, ALT. Se observ una interesante cooperacin entre los receptores TLRs, llamados TLR2 y TLR6 necesarios para el reconocimiento del PGN en los macrfagos murinos. Ambos receptores son requeridos para la induccin de NF-B luciferasa y producir TNF- en respuesta a bacterias gram positivas y PGNs. Los ratones con delecin en el gen TLR6 son resistentes a la estimulacin con PGN, indicando que dicho receptor es crtico para la respuesta frente al PGN. Por el contrario, el reconocimiento de lipopptidos bacterianos requiere slo de TLR2 o en combinacin con otro TLR distinto a TLR6 (37,38,39). Adems de estar involucrado en la respuesta celular a bacterias gram positivas, TLR2 media la respuesta del husped contra varios microorganismos incluyendo: micobacterias, micoplasmas, espiroquetas y levaduras. Tambin

TLR2 est implicado en la respuesta inmune innata hacia lipoprotenas y lipopptidos microbianos y componentes de pared celular de micobacterias como lipoarabinomananos (40,41).

EL SISTEMA COMPLEMENTO

Est constituido por una serie de enzimas proteolticas que interactan y funcionan como un efector inmunolgico de la respuesta inflamatoria aguda (13). Estas enzimas pueden ser activadas a travs de 3 vas distintas: clsica, alterna o properdina y MASP (ver receptores del SSI). Cada una de las cuales se activa en presencia de microorganismo o constituyentes de pared celular bacteriana como: antgeno O, cpsula, LPS, lpido A y ALT. La activacin del complemento sobre la superficie celular da como resultado alteraciones funcionales y estructurales de la membrana que conducen a la muerte de la clula. Durante la activacin secuencial del complemento se inician una serie de episodios biolgicos que facilitan la localizacin y destruccin del microorganismo por las clulas efectoras. La va clsica es activada por el complejo antgeno-anticuerpo generados por el husped ante una exposicin previa. La va alterna es dependiente de una glicoprotena plasmtica, properdina, la cual junto con receptores y un grupo de cofactores (factor B, D, H e I), reconocen directamente al microorganismo, guiados por la interaccin entre el factor B y la superficie del microorganismo. La va MASP es activada por el receptor lectina que une manosa de la superficie microbiana (42).

Los efectos de la activacin de la cascada del complemento por cualquiera de las tres vas son:

1. Activacin de C3b, el cual se une al microorganismo y lo opsoniza para su posterior fagocitosis por neutrfilos y macrfagos.

2. Generacin de C3a y C5a agentes vasoactivos y quimioatractivos. Ellos incrementan la permeabilidad vascular, aumentan la expresin de molculas de adhesin en clulas endoteliales y neutrfilos, y atraen y activan a estos fagocitos. Adems activan a granulocitos basfilos que liberan sustancias vasoactivas como histamina, facilitando la invasin de los fagocitos (21,43).

3. La insercin del complejo de ataque de membrana (CAM) C5-C9 dentro de la superficie celular, llevando a la lisis de la bacteria. El CAM tiene una superficie externa relacionada con los

lpidos, y un centro hidroflico a travs del cual pasan libremente los iones. De este modo, la insercin del CAM altera el equilibrio osmtico y qumico.

Durante la infeccin, las clulas hepticas (hepatocitos) son estimuladas por TNF-, IL-1 e IL-6 a producir protenas de fase aguda. Estas protenas son: protenas C reactiva, protena amiloide srica A y P , protena que fija LPS (PFL), hemopexina, haptoglobina, C3 y C9 del complemento, glicoprotena cida -1, 2-macroglobulina y algunas protenas inhibidoras de proteasas. Algunas de las protenas de fase aguda, como PFL, modulan la respuesta inmune por activacin de fagocitos y clulas presentadoras de antgeno, pero bsicamente la respuesta de fase aguda se produce para aliviar los daos causados durante la infeccin. La albmina es considerada una protena de fase aguda negativa, ya que su produccin es mnima durante la inflamacin (42).

Como se ha mencionado anteriormente, los macrfagos juegan un rol esencial en la respuesta celular al LPS. El sistema reticuloendotelial consta de macrfagos titulares especializados responsables de la respuesta primaria frente a microorganismos en la mayora de los tejidos. Ellos tienen por objetivo erradicar al microorganismo invasor (lisis, fagocitosis) y prevenir la diseminacin del microorganismo o sus componentes txicos al resto del organismo. Se ha demostrado tambin, que los macrfagos son capaces de remover endotoxinas y bacterias de la circulacin linftica y sangunea y responden a esa unin con produccin de mediadores inflamatorios. Las clulas del sistema reticuloendotelial adquirieron caracterstica especfica de tejido, por lo cual, hay diferencias de respuesta frente al LPS. Durante el desafo con LPS, ALT, u otros componentes bacterianos, los macrfagos liberan una serie de mediadores inflamatorios como; TNF-, IL-1, IL-6, eicosanoides, factor activador de plaquetas ( FAP), xido ntrico (NO) y reactivos del oxgeno. No solamente, el LPS, el ALT y el PG en sus formas libres, sino tambin bacterias vivas o muertas pueden inducir la liberacin de TNF- (44). Los mediadores lipdicos, eicosanoides y FAP, liberados por macrfagos y clulas hepticas tiene funciones importantes. Adems de sus funciones vasoactivas, las prostaglandinas PGE1-2, inhiben la transcripcin del RNAm del TNF- en macrfagos, resultando en un perodo largo de inhibicin de la liberacin del mismo. El ltimo

grupo de productos liberados en respuesta al LPS son las especies reactivas del oxgeno. La activacin de los macrfagos y PMN por componentes bacterianos y por TNF- y otros mediadores inflamatorios induce la produccin de O2-, H2O2 y otros productos microbicidas potentes. Si bien, estos componentes son responsables de la muerte de los microorganismos fagocitados, frente a altas concentraciones del activador se liberan a circulacin y causan dao tisular. El xido ntrico (NO) es un producto microbicida que es producido por macrfagos, clulas endoteliales y hepatocitos. Una vez secretado, este es rpidamente convertido a nitratos y nitritos. Adems de su efecto bactericida, el NO causa vasodilatacin, dao endotelial, dao heptico e inhibicin de la produccin de protenas de fase aguda (45).

Un estudio in vitro con macrfagos esplnicos y clulas de Kupffer, mostr que los macrfagos esplnicos producen ms significativamente TNF- va induccin por LPS, que las clulas de Kupffer. Adems, Lichtman y colaboradores, mostraron que hay grandes diferencias entre las vas de activacin de ambos tipos celulares. Mientras la respuesta de los macrfagos esplnicos es dependiente del CD14, las clulas de Kupffer lo hacen a travs de una va CD14 independiente. La va de ingreso del LPS al organismo tambin puede hacer variar la respuesta inmune. Asari y colaboradores demostraron que los niveles mximos y la cintica de liberacin del TNF- despus de la inyeccin va intraperitoneal (i.p.) versus intravenosa (i.v.) es diferente, confirmando que los macrfagos de rganos importantes responden distinto (7).

RECEPTORES DEL SISTEMA INMUNE INNATO.

Los receptores de reconocimiento de patrones que reconocen PAMPs, pertenecen a varias familias de protenas. Estructuralmente se dividen en: dominios ricos en leucina, dominios lectinas dependientes de calcio y receptor scavenger. Funcionalmente estos receptores pueden ser divididos en tres clases: los que son secretados que funcionan como opsonina unindose a la pared celular bacteriana y alertando a los fagocitos y al sistema de complemento para su reconocimiento. El receptor mejor caracterizado de esta clase es el receptor lectina que une manosa, miembro de la familia de lectinas dependientes de calcio. El receptor une los carbohidratos de la bacteria e inicia la activacin

del complemento. El receptor lectina que une manosa es sintetizado en el hgado y secretado al torrente circulatorio como un componente de la respuesta de fase aguda. Este receptor puede unir carbohidratos de bacterias gram negativas, gram positivas y levaduras, as como tambin de virus y parsitos. Las lectinas que unen manosa estn asociadas a dos Serin- proteasas 1 y 2. Estas serin protesasa estn relacionadas con las serin proteasas de la va clsica del complemento C1r y C1s. De la misma forma que C1r y C1s, las proteasas asociadas al receptor lectina, una vez activadas, clivan el tercer componente del complemento C3 y activan a C3 convertasa, lo cual resulta en la activacin de la cascada del complemento. Si bien, la proteasa C1 requiere la unin antgeno anticuerpo para su activacin, la proteasa asociada a el receptor lectina que une manosa para ser activada slo requiere la unin a su ligando microbiano (3, 42).

Los receptores con accin endoctica se encuentran en la superficie de la clula fagoctica, los mismos unen microorganismos a travs de sus PAMPs y conducen al patgeno a los lisosomas, donde el microorganismo es destrudo, las protenas derivadas del patgeno, pueden ser procesadas y el pptido resultante ser expresado en la superficie del macrfago a travs de las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad. Uno de los receptores con accin endoctica es el receptor manosa del macrfago, el cual tambin es un miembro de la familia lectina dependiente de calcio. Este receptor reconoce especficamente los carbohidratos con un gran nmero de manosas que es caracterstico de los microorganismos y media su fagocitosis por los macrfagos. Otro receptor con accin endoctica es el receptor scavenger del macrfago, el cual es esencial en la eliminacin de las bacterias de la circulacin (3).

Los receptores que traducen seales, como los de la Familia Toll, al unirse con los PAMPs activan varias vas de traduccin de seales intracelulares resultando en la activacin de factores de transcripcin como NF-B, AP-1, Fos y Jun. De ellos, tal vez el ms estudiado es el NF-B, el cual est compuesto de una familia de protenas que regula la transcripcin de una variedad de citoquinas, molculas de adhesin y genes productores de enzimas involucradas en el SIRS, las cuales, se encargan de orquestar la respuesta inmune innata o adquirida contra el patgeno invasor (20).

RECEPTORES QUE UNEN COMPONENTES DE PARED CELULAR BACTERIANA

Durante varios aos, el principal objetivo fue dilucidar la secuencia de eventos que se producen cuando se une el LPS a la clula y la respuesta de la clula. Uno de los primeros receptores en ser caracterizado fue el CD11b/CD18 o CR3, pero debido a que la clula no era suficientemente activada a travs del mismo, nuevos estudios fueron necesarios para identificar el receptor del LPS que active a la clula (46). En 1990, CD14 fue identificado como el receptor involucrado en la activacin celular. Sin embargo debido a que CD14 carece de dominios de seales de transmembrana, fue propuesto un receptor accesorio. Recientemente, los receptores tipo Toll (TLR) fueron identificados como receptores que traducen seales a travs de su dominio de transmembrana para el LPS, ALT y otros constituyentes microbianos. Las interacciones entre TLR- CD14 y entre la protena srica que fija LPS con el receptor soluble CD14, que funciona como receptor accesorio, se describir con ms detalles (47,48).

PROTENA QUE FIJA LIPOPOLISACRIDO (PFL)

El LPS liberado a la circulacin forma complejos con diferentes protenas y glicoprotenas circulantes que van a tener un importante papel en la activacin de la inflamacin o en el bloqueo y eliminacin del LPS. Aunque la endotoxina se puede unir a protenas transportadoras inespecficas como la transferrina, la albmina y los factores del complemento son sus uniones con protenas especficas como la protena fijadora de LPS (PFL), la protena inductora de permeabilidad (PIP), las lipoprotenas de alta densidad (HDL) implicadas en la activacin o neutralizacin fagocitaria.

PFL es una protena de fase aguda, y es inducida por IL-6 e IL-1 (49). Adems del hgado, los pulmones, los riones y el corazn tambin estn involucrados en la produccin de PFL. Los niveles sricos de PFL son bajos (1 a 15 ug/ml) pero su concentracin aumenta durante la infeccin. En los humanos durante la fase aguda de un trauma o sepsis, los niveles mximos de dicha protena se alcanzan a los dos o tres das.

PFL une al LPS y al lpido A. La afinidad de la PFL por el lpido A es alta, con una Kd que vara desde 1 a 58 nM. El sitio de unin para el lpido A est situado en la porcin N-terminal entre los aminocidos 91 y 108. La porcin C-terminal de la molcula es la que media la transferencia del LPS al CD14. La PFL tiene mayor afinidad por bacterias muertas que por bacterias vivas (49).

Al igual que otros fosfolpidos de membrana, el LPS forma agregados en medios acuosos. Estos agregados impiden una difusin espontnea de los monmeros del LPS al CD14 sin la ayuda de lipoprotenas transportadoras (LTP). La PFL es un catalizador que permite transferir los monmeros de la LPS desde los agregados al receptor CD14 sensibilizando las clulas con el LPS. Esta transferencia del LPS al CD14, incrementa la activacin inducida por el LPS, de los monocitos, macrfagos y PMN de 100 a 1000 veces (50). La activacin mediada por el CD14 de macrfagos peritoneales por S. aureus inactivados por calor, ALT, PGN de pared celular o protenas micobacterianas no es incrementada por la PFL (2). En presencia de la PFL, el LPS induce un aumento de la muerte intracelular y secrecin de TNF- y NO por macrfagos e incrementa la adherencia de los PMN a las clulas endoteliales. Adems de su rol pro-inflamatorio, la PFL realiza acciones anti-inflamatorias, ya que media la transferencia de los LPS y los ALT a las HDL y a otras lipoprotenas (7). Como se mencion anteriormente, la PFL no es esencial para unir los componentes de pared celular de bacterias gram positivas al CD14, pero s promueve la neutralizacin de los ALT por lipoprotenas, sugiriendo que solo cumple un rol anti-inflamatorio frente a bacterias gram positivas.

CD14

El CD14 se puede unir al LPS, al PGN a otros constituyentes de la pared de bacteria gram positivas y al lipoarabinomano (LAM) de las micobacterias. Este hecho no quiere decir que estos diferentes productos bacterianos a travs del CD14 generen la misma seal intracelular. Aunque algunos grupos de investigadores suponen que el CD14 es un patrn de reconocimiento de protenas, la composicin estructural de los ligandos que interaccionan con el CD14 no se han determinado. Una hiptesis alternativa es que el CD14 podra unirse a una gran variedad de antgenos microbianos sin un reconocimiento especfico (51).

Estructuralmente el CD14 es una glicoprotena de membrana con una porcin glicosilfosfatidilinositol (GPI) que carece de dominios de transmembrana, por lo que necesita una molcula accesoria para la traduccin de seales. El receptor accesorio identificado, es un miembro de la familia de receptores Toll. La unin del LPS a la clula no resulta en una respuesta inmediata. Se observa un lapso de tiempo de 15 a 30 minutos entre la unin del LPS y la induccin de respuesta como la liberacin de citoquinas y molculas de adhesin, lo que sugiere que es un tiempo necesario para la internalizacin y para la traduccin de las seales (52).

El CD14 es expresado por clulas de linaje mieloide (monocitos, macrfagos y PMN), clulas B, clulas hepticas y fibroblastos gingivales (53). Se observ una expresin diferencial del CD14: los macrfagos pleurales y peritoneales tienen un alto nivel de expresin constitutivo, mientras que clulas de Kupffer (ratones), macrfagos alveolares, monocitos y PMN tienen bajo nivel de expresin de CD14 constitutivo. El CD14 est ausente en la clula mieloide progenitora pero su expresin se incrementa con la maduracin. El desafo de ratones con LPS result en un incremento de la expresin de CD14 en clulas de Kupffer pero tambin en clulas del corazn, pulmn, bazo y riones. La expresin del CD14 en PMN humanos es de bajo nivel, pero la misma puede ser inducida por TNF-, factor estimulante de colonias granuloctica y factor estimulante de colonias granulocticas monocticas, dentro de los 20 minutos, indicando que CD14 se encuentra almacenado a nivel intracelular.

CD14 SOLUBLE

La forma soluble de CD14 carece de la porcin glicosilfosfatidilinositol (GPI) y est presente en suero (54). Monocitos, macrfagos y clulas del parnquima heptico estn involucrados en su liberacin. La cual depende de la induccin del LPS y del TNF-, mientras que INF- e IL-4 la inhiben. En estado normal, la concentracin srica de CD14s es de 2 a 6 ug/ml. En pacientes en shock sptico, los niveles de CD14s se encuentran incrementados y se correlacionan con la muerte (55).

Las clulas endoteliales y epiteliales no expresan CD14 de membrana pero se hacen 10000 veces ms sensibles al LPS en presencia de

la protena en el suero. La sensibilidad al LPS puede ser bloqueada por anticuerpos anti-CD14 o por inmunodeplesin de CD14s desde el suero. La presentacin del CD14s-LPS a las clulas endoteliales o epiteliales resulta en la expresin de molculas de adhesin, excrecin de IL-6 e IL-8 y dao a nivel endotelial. El papel de PFL en transferir el LPS al CD14s todava no ha sido aclarado (54).

Adems de su accin pro-inflamatoria, el CD14s ejerce accin anti-inflamatoria. La inyeccin de CD14s a ratones inoculados con LPS, fue protectivo contra la muerte inducida por el LPS. A travs de otras experiencias se revel que concentraciones moderadas de CD14s aumentan la activacin de monocitos, macrfagos y PMN estimuladas por el LPS, mientras que la inhibicin de la activacin mediada por el LPS se observ cuando la relacin CD14s/PFL era muy alta (56).

FIG. 6. Unin de componentes bacterianos a CD14 y CD14s. PFL, CD14 y TLR2 o TLR4 en la activacin de clulas que expresan CD14 (macrfagos) y de clulas que no expresan CD14 (clulas endoteliales). LPS (izquierda) y PGN (derecha) representan ligandos especficos de TLR4 y TLR 2 respectivamente. Clin. Microbiol.Rev. July 2003, p379-414.

FAMILIA DE RECEPTORES TOLL.

Es una familia de protenas conservada a lo largo de la evolucin ya que se han descripto protenas homlogas no solamente en Drosophila sino tambin en una gran variedad de organismos incluyendo plantas, reptiles, pjaros y humanos. Presenta un papel central en la iniciacin de la respuesta inmune innata celular. Esta familia est provista de molculas de transmembrana que unen el espacio extracelular, donde ocurre el contacto y el reconocimiento de los patgenos microbianos, y el espacio intracelular, donde una cascada de seales lleva a iniciar una respuesta celular (57).

Toll y sus homlogos en humanos, son protenas de transmembrana tipo I, con un dominio rico en leucina y una o dos regiones ricas en cistena. El dominio intracelular de los receptores del tipo Toll contiene un dominio (TIR) Toll/IL-1 basado en la homologa de la regin con el dominio intracelular del receptor de la IL-1 (58).

El primer miembro de la familia Toll fue descubierto por mutaciones que establecan alteraciones en la polaridad dorso-ventral en embriones de Drosophila melanogaster. Luego se determin que Toll participaba de la respuesta inmune innata de moscas Drosophila adultas, debido a mutaciones en el gen Toll que reduca la habilidad de activar la expresin de pptidos antifngicos y la sobrevida a la infeccin fngica.

La va de seales activadas por el receptor Toll mostr una extensa analoga con una cascada de seales en humanos que activa al factor de transcripcin NF-B, conocido por su importante papel en la activacin de genes inmuno-reguladores y pro-inflamatorios. Un homlogo humano al Toll de Drosophila llamado receptor del tipo Toll 4 (TLR4) fue descripto por primera vez por Medzhitov y colaboradores en 1997. La expresin del RNAm de TLR fue detectada en muchos tejidos y lneas celulares humanas, e indujo la activacin del factor de transcripcin NF-B y los genes controlados por dicho factor, adems indujo la expresin de molculas co-estimulatorias como B7, requeridas para la activacin de clulas T nativas (57).

En el presente todos los esfuerzos estn enfocados a caracterizar la cascada de seales que es activada por los TLRs. La transcripcin del factor nuclear NF-B es esencial para regular la induccin de mediadores pro-inflamatorios que contribuyen a la respuesta inmune. La activacin de NF-B involucra la fosforilacin y degradacin de IB, un inhibidor de NF-B, lo que conduce a la translocacin del heterodmero NF-B al ncleo para ejercer su accin. El sistema NF-B/ IB puede ejercer regulacin transcripcional en los genes pro-inflamatorios. La mayora de los genes que codifican para molculas de adhesin y citoquinas tienen elementos de unin para NF-B en su regin promotor. Se conoce adems, que NF-B puede ser activado por varias citoquinas como IL-1, IL-6 y TNF-. Para la activacin de NF-B, TLR necesita de la activacin de molculas adaptativas intracelulares y de quinasas que traducen sus seales. Los componentes de la

va de seales en mamferos son los siguientes: CD14 TLR4 My88 IRAK TRAF6 IB NFB para mediadores inflamatorios. Donde IRAK es una quinasa asociada al receptor de IL-1 y TRAF6 es el receptor de TNF asociado al factor 6 (59).

Actualmente, han sido identificados 10 genes TLR en humanos que codifican para 10 protenas TLR: TLR1 al TLR10 y todos estn involucrados en la respuesta inmune. En el cromosoma 4 residen los genes TLRI, TLR2, TLR3, TLR6 y TLR10, en el cromosoma 9, TLR4, en el 1 TLR5, en el 10, TLR7 y TLR8 y en el cromosoma 3, TLR9 (60).

Los receptores TLR reconocen patrones microbianos especficos (PAMPs). Desde la dcada pasada se ha incrementado el nmero de ligandos. Diferentes TLRs tienen un papel importante en la activacin de la respuesta inmune frente a los PAMPs. A pesar de su especificidad ligando receptor, los estudios indican que la respuesta inmune innata es la suma de seales generadas por la interaccin de mltiples TLRs y otras molculas cooperadoras. Se discutir los diferentes receptores TLRs y la interaccin con sus ligandos.

TLR1: se expresa en clulas sanguneas y en bazo en altas concentraciones. No ha sido identificado un ligando directo. TLR1 actuara como co-receptor, ya que mostr estar asociado con TLR2 en respuesta a lipopptidos. Pero an resta aclarar su funcin.

TLR2: est involucrado en el reconocimiento de mltiples productos de bacterias gram positivas (PGN, lipoprotenas, ALT), micobacterias y levaduras. Los primeros estudios describan que TLR2 mediaba la respuesta al LPS, pero nuevos estudios indicaron que TLR4 es el principal receptor para el LPS. El anlisis de ratones deficientes en TLR2 demostr claramente que este receptor es esencial para la respuesta frente al PGN. TLR2 tambin interacta con lipoarabinomananos, constituyentes de la pared celular de Micobacterium tuberculosis. Adems TLR2 coopera con TLR6 o TLR1 para responder frente al factor soluble de estreptococos grupo B o lipopptidos y lipoprotenas de bacterias gram positivas (61).

TLR3 reconoce RNA viral de doble cadena, un patrn molecular asociado a infecciones virales.

TLR4 es el principal receptor de LPS, mayor constituyente de membrana externa de bacterias gram negativas. Como ya ha sido mencionado, adems de TLR4, el LPS necesita de una molcula CD14 que cataliza su traslado hacia el TLR4. Estudios realizados con ratones deficientes de TLR4 -, confirmaron que el mismo es crtico para la respuesta al LPS. Estudios realizados ms tarde en humanos sugirieron un rol similar; mutaciones en TLR4 se asocian con una falta de respuesta frente al LPS. No todos los LPS de bacterias gram negativas estimulan la respuesta inflamatoria a travs de TLR4, ya que, LPS derivados de bacterias como Leptospira sp. o Porphyromonas sp. lo hacen a travs de TLR2. Esto se debe a diferencias estructurales de LPS de bacterias como E.coli sp. o Salmonella sp (60,41).

TLR5 reconoce la protena flagelina de bacterias gram positivas y gram negativas. Flagelina es la subunidad monomrica del flagelo bacteriano. Esta protena presenta una potente actividad proinflamatoria induciendo la expresin de IL-8. TLR5 se expresa en bazo, leucocitos de sangre perifrica y clulas epiteliales. Se ha demostrado que las bacterias flageladas y no las no flageladas estimulan la respuesta a travs de TLR5, indicando que es flagelina el ligando especfico de TLR5 (38).

TLR6 es expresado en leucocitos de sangre perifrica y en bazo. Al igual que TLR1 acta como co-receptor.

TLR7 se expresa abundantemente en placenta, pulmn, bazo y leucocitos de sangre perifrica. Esta relacionado genticamente con TLR8 y TLR9. Su ligando natural todava no ha sido definido.

TLR8 fue identificado junto con TLR7 y TLR9, y se expresa en pulmn y leucocitos de sangre perifrica. Su ligando natural es desconocido.

TLR9 est localizado intracelularmente. Reconoce secuencias especficas DNA bacteriano no metiladas.

TLR10 es el ltimo miembro descubierto de la familia de TLRs humanos. Su funcin y su ligando natural todava no han sido caracterizados. Este receptor se expresa en clulas inmunes presentes en tejidos linfoides como ndulos linfticos, timo y bazo. Su anlisis gentico revela una extensa relacin con TLR1 y

TLR6, por lo que posiblemente acte como co-receptor (60).

FIG.7. Va de traduccin de seales TLR: a travs de la activacin de diferentes ligandos, TLRs inducen la atraccin de MyD88 va su dominio TIR, lo cual activa por fosforilacin a IRAK quinasa asociada al receptor IL-1. IRAK activada se combina con TRAF6 e induce seales que conducen a la activacin de NF-B, el cual a su vez induce la produccin de citoquinas pro-inflamatorias. Este es un simple esquema, ya que existen muchas otras molculas involucradas en esta va. Current Science. Vol.85.N.8.25 october 2003

Por lo anteriormente descripto, se concluye que, el papel principal de los TLR es alertar a sistema inmune de la presencia de microorganismos. La unin ligando TLR conduce a la produccin de citoquinas pro-inflamatoria y molculas efectoras dependiendo del tipo celular. Estudios en ratones TLR- han sugerido su importancia in vivo. Por ejemplo, ratones deficientes en TLR2 son altamente susceptibles al shock sptico causado por S.aureus. En otro estudio, ratones deficientes en TLR4 tuvieron infecciones persistentes con Haemophilus influenzae o virus sincitial respiratorio, lo que indica la importancia de este receptor en la defensa frente a infecciones (3, 4).

2 INTEGRINAS

Los antgenos CD18, o 2 integrinas comprenden una familia de tres glicoprotenas de membrana celular ntimamente relacionadas, cada una de las cuales poseen dos cadenas, una y otra . Las tres protenas comparten la misma cadena CD18 , pero tienen diferentes cadenas CD11 . La cadena confiere especificidad de sustrato y la cadena asegura la localizacin adecuada del receptor en la membrana celular. Las tres glicoprotenas son: I. 12 integrina o LFA-1 o CD11/CD18; II. 22 integrina o CR3 (receptor del complemento) o MAC-1, o

CD11/CD18; y III. 32 integrina o CR4 o p150,95, o CD11c/CD18. LFA-1 se expresa en todos los leucocitos, CR3 se expresa en monocitos, macrfagos, PMN y linfocitos, mientras que CR4 se expresa en monocitos y macrfagos. LFA-1 reconoce a las molculas de adhesin ICAM-1 e ICAM-2, CR3 reconoce a C3bi unido a la superficie celular y fibringeno, y CR4 tambin une fibringeno (13).

Muchas cepas de E.coli son reconocidas por los macrfagos sin la intervencin de anticuerpos ni del complemento. CD18 en la superficie celular puede ser responsable para el reconocimiento de la bacteria. En varios estudios se demostr que la activacin de monocitos por antgenos microbianos, incluyendo LPS, es parcialmente inhibida por anticuerpos contra CD18, CD11 o CD11c, lo que indica que las 2 integrinas estn involucradas en la activacin celular. CD11/CD18 y CD14 pueden tener vas de traduccin de seales en comn. Hay indicaciones que CD11/CD18 tambin utilizan la va TRL4 para la activacin va LPS, aunque con muy baja eficiencia, demostrado por las diferencias de cintica de activacin. Debido a la baja eficiencia de CD11/CD18 TLR4 con respecto a CD14-TLR4, la relevancia fisiolgica de este modelo es limitada. Mientras que la contribucin de CD11/CD18 a la activacin inducida por bacterias gram positivas a travs de TLR2 resta ser determinada (43).

RECEPTOR SCAVENGER (SR-A)

Los SR-A son glicoprotenas de transmembrana, expresadas por los macrfagos tisulares (Ej. clulas de Kupffer) y clulas endoteliales. Estructuralmente, estn formados por tres dominios extracelulares C-terminal ricos en cistenas, los que se conectan con un dominio de transmembrana a travs de una larga fibra de colgeno. Se han identificado tres SR-A, siendo SR-AI y SR-AII expresados en la membrana plasmtica. La regin C-terminal del dominio extracelular es el sitio de unin de ligandos polianinicos. Adems de unir bacterias y componentes bacterianos (Ej. LPS, ALT), los SR-A reconocen un amplio espectro de ligandos incluyendo: LDL acetilados, LDL oxidados. MARCO SR (receptor macrfago con estructura de colgeno), tambin pertenece a la clase de SR-A, y reconoce bacterias gram positivas y gram negativas (62).

La unin a los receptores scavenger puede formar un mecanismo protectivo, ya que remueve el exceso de microorganismos o sus componentes, por lo tanto previene la unin al receptor CD14 y el desarrollo de shock sptico. Aunque la incubacin de macrfagos con LPS no result en la activacin mediada por el SR-A, otros estudios revelaron que ligandos de SR como LDL modificado pueden inducir la liberacin de IL-1 y TNF-, aumentar la expresin del factor activador del plasmingeno en macrfagos, y las molculas de adhesin en clulas endoteliales (63).

PROTENAS QUE UNEN COMPONENTES DE PARED CELULAR BACTERIANA

PROTENA INDUCTORA DE PERMEABILIDAD/BACTERICIDA (PIP):

Esta protena catinica de 55KDa reside en los grnulos azurfilos de los PMN y en menor medida en monocitos y macrfagos. Se une con una elevada especificidad a bacterias gram negativas y mata a las mismas incrementando la permeabilidad de la membrana externa y por activacin de enzimas que degradan su pared celular. La actividad bactericida de PIP frente a bacterias gram positivas no fue observada. La unin de PIP a bacterias gram negativas es mediada por el LPS. Esta unin neutraliza la actividad biolgica del LPS, y por lo tanto, atena el dao endotelial, as como tambin la produccin por parte de los macrfagos de NO, TNF-, IL-1, IL-6, IL-8. Los PMN pueden secretar PIP, y la misma tiene idnticos efectos bactericidas que la PIP intracelular. Esta doble capacidad de la PIP (la neutralizacin de la LPS y su accin bactericida) le confieren capacidad para actuar clnicamente como anti-endotoxina (64,42). Debido a esto se ha desarrollado una PIP recombinante (rPIP, rPIP23, rPIP21) para la utilizacin en humanos. En estudios "in vitro" se ha visto que las PIPr inhiben la respuesta inflamatoria de los leucocitos. Tambin se han ensayado en modelos animales y se ha podido comprobar que previenen la mayora de los efectos hemodinmicos de la LPS y que su administracin incrementa la supervivencia. La corta vida media en el suero de la PIP es uno de los inconvenientes en su utilizacin en la clnica (65).

LACTOFERRINA.

Es una glicoprotena que est presente en los grnulos neutrfilos, en la leche, y en secreciones mucosas. Une al LPS y es bacteriosttica para la bacteria, indirectamente quela iones hierro y directamente desestabiliza las membranas celulares de las bacterias gram negativas (66,42). La lactoferrina es el principal componente producido y liberado por PMN activados, que neutraliza al LPS. Esta protena al unirse al LPS, previene la unin del mismo a la PFL y a su vez que el complejo LPS-PFL se una al CD14 y por lo tanto habr una reduccin en la liberacin de TNF- e IL-6. Baveye y col. demostraron que esta protena es capaz de unir CD14s o LPS-CD14s, e inhibe la activacin de las clulas endoteliales y por ende la expresin de molculas de adhesin (67).

LISOZIMA

Es una protena que destruye la pared celular de bacterias gram positivas y gram negativas, a travs de un mecanismo enzimtico (42). Se ha demostrado que la lisozima une al LPS y que esta unin inhibe la inmuno-estimulacin de las clulas B. Con respecto a la habilidad de la lisozima de afectar la liberacin de citoquinas, los datos son contradictorios (7).

PROTENAS DE FASE AGUDA

Las protenas surfactante A y D unen al LPS y a bacterias y por lo tanto previenen la unin del mismo a los macrfagos alveolares. La protena amiloide srica (PAS) une al LPS e inhibe la activacin de PMNs mediada por la induccin del LPS, pero contrario a la accin anti-inflamatoria, PAS inhibe la neutralizacin que ejerce la lipoprotena HDL al unirse al LPS, sugiriendo que bajo condiciones fisiolgica, PAS tiene principalmente un papel pro-inflamatorio (68).

LIPOPROTENAS

Aparte de las protenas neutralizantes producidas por los PMNs el organismo utiliza otras lipoprotenas para este fin. En estudios in vitro se ha detectado que las lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL), baja densidad (LDL), alta densidad (HDL) y la apolipoprotena neutralizan la actividad biolgica de la LPS al ser eliminadas a travs del metabolismo del colesterol (69). Los ensayos efectuados en animales indican que las

lipoprotenas podran ser importantes en la proteccin contra la endotoxemia. En humanos los estudios realizados hasta la fecha muestran resultados contradictorios.

CITOQUINAS

La unin de los componentes bacterianos a los receptores, como TLRs, inducen una va de seales intracelulares en las clulas del sistema inmune innato. Esta cascada de eventos intracelulares resulta en la activacin del factor de transcripcin nuclear NF-B implicado en la expresin de genes de respuesta inmune y la liberacin de molculas efectoras (3). Los mediadores pro-inflamatorios juegan un papel crtico en la erradicacin del microorganismo invasor. Ellos inician la respuesta inflamatoria y dirigen la respuesta humoral y celular. Las citoquinas son una importante clase de mediadores liberados por varios tipos celulares, incluyendo linfocitos, monocitos, macrfagos y clulas no inmunes. TNF-, interleuquinas, factores estimulantes de colonias, son miembros de esta familia de molculas mensajeras. Una estimulacin excesiva y no controlada de estos mediadores pueden ser responsables una vez que han alcanzado el torrente circulatorio de la mala perfusin tisular, del fracaso multiorgnico y en ltima instancia del shock (4).

Las citoquinas son pequeas protenas usualmente menor a 30 KDa, cuya expresin es mayormente inducida que constitutiva. Dos rasgos tpicos de las mismas es su pleiotrofismo (es la capacidad que tienen las citoquinas de estimular a varios tipos celulares) y su redundancia (es la habilidad de diferentes citoquinas para ejercer efectos similares). Adems tienen la capacidad de inducir la expresin de otras citoquinas y as ampliar la red de molculas que interacta. Su accin puede ser autcrina o parcrina mediada por la interaccin con receptores especficos expresados en las clulas diana. Las citoquinas ejercen efectos quimiotcticos para clulas inmunes, aumentan la expresin de las molculas del CMH clase I y II y participan en la activacin y proliferacin de linfocitos T y B (5).

Cuadro 1: Caractersticas de las principales citoquinas de la inmunidad innata.(5).

AVANCES CIENTFICOS: ESTRATEGIAS PARA PREVENCIN Y TRATAMIENTO DE SEPSIS Y SHOCK SPTICO

El tratamiento de la sepsis severa y el shock sptico involucra una gran variedad de aspectos a corregir que van desde los mecanismos moleculares de respuesta al patgeno invasor, pasando por la regulacin de la respuesta inflamatoria, el control de variables hemodinmicas y la ptima oxigenacin tisular.

Se han realizado numerosos estudios para crear una estructura que al unirse al LPS lo neutralice, y que pueda ser aplicable en la clnica para el tratamiento de pacientes spticos. Se han creado pptidos basados en PIP, PFL y Lactoferrina. A los que se les estudi su capacidad bactericida y su capacidad de neutralizacin. Los resultados son alentadores, pero se necesitan futuras investigaciones para determinar la estructura ptima del sitio de unin para que la neutralizacin del LPS y de los ALT sea altamente especfica (70).

Las nuevas estrategias apuntan a bloquear la interaccin ligando-receptor, actuando principalmente en la cascada de eventos inducida por los microoganismos. As, PFL, CD14 y TLR4 en bacterias gram negativas y CD14, TLR2 y TLR6 en bacterias gram positivas seran las estructuras diana de las nuevas drogas. Estn en marcha, estudios en fase I con anticuerpos monoclonales anti-CD14. Sin embargo, estas intervenciones con el objetivo de inhibir la respuesta inmune innata, acarrean un importante riesgo para el paciente. Como ya se observ, en ratones C3H/HeJ y C57BL/10ScCr con mutaciones o deleciones espontneas en los genes que codifica para el receptor TLR4, cuando son expuestos a dosis letales de LPS, ellos presentan una elevada sensibilidad a las infecciones bacteriana y mueren rpidamente cuando son expuestos a dosis no letales de bacterias (3).

La patognesis de la sepsis es muy compleja. Sin embargo, el trabajo en conjunto entre la ciencia y la investigacin clnica contina para proveer mayor informacin para la identificacin de un nuevo blanco teraputico. Se han obtenido, recientemente, resultados exitosos con una nueva estrategia teraputica, Protena C activada recombinante, diseada para corregir las alteraciones de la coagulacin inducidos por la sepsis. La Protena C activada recombinante inactiva los factores V y VIII previniendo la

generacin de trombina, mientras que promueve la fibrinlisis. Tambin inhibe la inflamacin ya que reduce los niveles de IL-6. Sin embargo, el uso de esta protena recombinante incrementa el riesgo de sangrado, por lo que debera ser administrada a pacientes con sepsis severa y con razonables expectativas de vida sin contraindicaciones absolutas relacionadas al sangrado (71).Por otra parte, la administracin intratraqueal de surfactante recombinante, puede prevenir el shock endotoxico en el recien nacido (72)

Numerosos estudios demostraron que altos niveles de mediadores pro-inflamatorios se asociaban con una menor sobreviva del paciente sptico, por lo que la inmunosupresin pareca ser la eleccin obvia en el tratamiento de la sepsis, pero se observ que esta incrementa la mortalidad. TNF- es el principal mediador en la patognesis de la sepsis, debido a esto, fueron probados en el tratamiento de la sepsis, preparaciones de anticuerpos anti-TNF- recombinante. Los ensayos clnicos de estas preparaciones fueron ineficientes. Otra importante citoquina en la inflamacin y sepsis es IL-1. Un receptor antagonista IL-1 recombinante fue probado en dos ensayos clnicos en fase III, pero tambin fue ineficiente (73).

El uso de corticoides ha sido un tema de debate durante muchos aos. Se conoce que los corticoides regulan la respuesta inmune. Ellos inhiben los procesos inflamatorios como la migracin de leucocitos, produccin de citoquinas y tienen un efecto positivo a nivel cardaco ya que bloquean la sntesis de NO. Basados en estos efectos los pacientes han sido tratados en dos ensayos clnicos usando corticoides en la fase temprana de la sepsis. Los resultados de estos ensayos indicaron que no hay efecto benfico en el tratamiento de la sepsis temprana.

Si bien el bloqueo o la modulacin de los distintos componentes de la respuesta inmune como factores del complemento, de la coagulacin, adherencia de neutrfilos y liberacin de NO son exitosos en animales, falta determinar si esta teraputica pueda ser efectiva en humanos (73).

CONCLUSIONES

El Sistema Inmune presenta una gran variedad de receptores para reconocer microorganismos

invasores y as producir la expresin de genes asociados con el desarrollo y mantenimiento de la respuesta inmune. Las bacterias han desarrollado diversos mecanismos o estrategias para evadir o manipular esa respuesta inmune.

La sepsis no debe ser atribuida solamente a un Sistema Inmune descontrolado, ya que puede indicar un sistema inmune daado o comprometido incapaz de erradicar al microorganismo invasor. Se observ en ratones deficientes en TNF- y deficientes en su receptor, una disminucin de la sensibilidad al LPS pero se vieron afectados por pequeas concentraciones de bacterias vivas (6).

Los pacientes con sepsis se caracterizan por ser inmunosuprimidos, incapaces de controlar una infeccin e incluso con alta predisposicin a las infecciones nosocomiales. Como se expuso anteriormente, las terapias anti-inflamatorias en pacientes con sepsis fueron ineficientes. Por qu ocurre esto? Inicialmente la sepsis se debe a un incremento en los mediadores inflamatorios, pero si la sepsis persiste, las clulas inmunocompetentes son capaces de inducir una respuesta antiinflamatoria, con produccin de mediadores que inhiben a las citoquinas proinflamatorias, intentando establecer un balance entre ambos tipos de mediadores. Hay evidencia de inmunosupresin en sepsis, en estudios que muestran una liberacin marcadamente menor de TNF- e IL- 1 de clulas de pacientes con sepsis estimuladas con LPS con respecto a los pacientes controles.

La respuesta inmune durante la sepsis est determinada por varios factores, la virulencia del microorganismo invasor, el tamao del inculo y las condiciones coexistentes del husped como edad, estado nutricional, enfermedad de base, y el polimorfismo de genes que codifican para citoquinas, receptores y otras molculas efectoras.

La evaluacin del bazo post-mortem de pacientes con sepsis demostr que en estado de sepsis prolongado con persistencia de infeccin, desarrollaron una respuesta hipo-inmune prolongada con prdida de clulas T y B. Ocurren muchas muertes durante el estado hipo- inmune y revertir o prevenir la deficiencia inmune debera ser el objetivo de la terapia. Mientras que la terapia antiinflamatoria aplicada tempranamente en pacientes con respuesta hiperinmune podra salvar la vida (73).

Por lo tanto medir la concentracin de los mediadores inflamatorios circulantes puede proveer informacin valiosa para evaluar el estado de sepsis y aplicar la terapia correspondiente. El objetivo principal del la terapia de la sepsis y shock sptico debera estar apuntado a mantener la homeostasis, erradicar las bacterias y restaurar el balance entre la respuesta proinflamatoria y antiinflamatoria.

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