REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA

DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS

MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR DE PACIENTES CON SOSPECHA CLÍNICA DE BORRELIOSIS DE LYME

Trabajo presentado para optar al grado de Magister Scientiarum en Microbiología

Autor: Fabiola M. Espinoza L.

Tutor: Dr. Francisco Arocha

Cotutor: Dr. Manzur Hassanhi

MARACAIBO, Junio 2006

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“Diagnóstico serológico y molecular de pacientes con sospecha clínica de Borreliosis de Lyme”

________________________ MC. Fabiola M. Espinoza L. C.I. 12.591.464 Dirección: Av. 4A c/c 65. Residencias Jackie. Apart. 6B. Teléfonos: 0261-7929652; 0414-6142916 Correo electrónico: fabiolaespinoza@yahoo.com Autor _____________________ Dr. Francisco J. Arocha S. C.I. 7.709.263 Tutor ____________________ Dr. Manzur Hassanhi C.I. 7.610.407 Co-tutor

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VEREDICTO

Este jurado aprueba el trabajo de grado titulado “Diagnóstico serológico y molecular de pacientes con sospecha clínica de Borreliosis de Lyme”, presentado por la Médica Cirujana Fabiola Espinoza, C.I. 12.591.464, ante la División de Estudios para Graduados de la Facultad Experimental de Ciencias para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología Maracaibo, 29 de Junio de 2006 _____________________ Dr. Francisco J. Arocha S. C.I. 7.709.263 Tutor ___________________ Dr. Manzur Hassanhi C.I. 7.610.407 Co-tutor El Jurado ________________ _______________ Prof.: Prof.: C.I. C.I.: Miembro del Jurado Miembro del Jurado ________________

Prof.: C.I. Miembro del Jurado

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AGRADECIMIENTO

A los doctores Manzur Hassanhi, Francisco Arocha y Maricela Urbina por sus valiosos

aportes en el desarrollo de esta investigación.

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ÍNDICE DE CONTENIDO

Resumen

Abstract

Introducción 9

Objetivos 16

Objetivo General 16

Objetivos Específicos 16

Sistema de hipótesis y variables 17

Materiales y métodos 19

Tipo de investigación 19

Población de estudio y muestras 19

Técnicas y procedimientos 20

Entrevista personal 20

Obtención de las muestras 20

Pruebas diagnósticas 21

ELISA 21

Western Blot 23

Reacción en Cadena de la Polimerasa 26

Método de análisis estadístico 29

Resultados 30

Discusión 33

Conclusiones 38

Recomendaciones 39

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Lista de Tablas 40

Lista de Figuras 41

Índice de Referencias 42

Anexo 1

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Espinoza-León, Fabiola: “Diagnóstico serológico y molecular de pacientes con sospecha clínica de Borreliosis de Lyme”. Trabajo de grado presentado ante la División de Estudios para Graduados de la Facultad Experimental de Ciencias para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela. 2006. 46 p.

RESUMEN

La Borreliosis de Lyme es una enfermedad infecciosa causada por Borrelia burgdorferi y transmitida al humano por la picadura de garrapatas del género Ixodes. En 1994 se realizó en el Estado Zulia un estudio que detectó anticuerpos contra dicha bacteria en 29,7% de los pacientes analizados. Sin embargo, no hubo confirmación de los casos positivos mediante técnicas que proporcionan evidencia definitiva de la infección. El objetivo de esta investigación fue estudiar la presencia de infección por B. burgdorferi en suero de 30 sujetos con clínica sugestiva de la patología y 30 controles sanos, mediante las técnicas ELISA y Western Blot y en biopsias de piel de pacientes con morfea mediante el ensayo nested PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) usando primers específicos para el gen de la flagelina. Se encontraron cuatro muestras positivas (7%) de las 60 estudiadas; de éstas, tres (5%) correspondieron a pacientes sintomáticos y una (2%) a un sujeto sano. Todas las muestras ELISA positivas fueron negativas en la prueba IgG Western Blot. El ensayo nested PCR de las biopsias de piel no mostró amplificación de las secuencias seleccionadas del gen de la flagelina. Los datos obtenidos no soportan la evidencia de infección por B. burgdorferi en los pacientes estudiados, pero tampoco excluyen la posibilidad de la existencia de una genoespecie distinta de B. burgdorferi sensu stricto, de una especie de borrelia diferente del complejo B. burgdorferi sensu lato o de otro organismo espiroquetal, como el agente causal de Borreliosis de Lyme en la región. Palabras Clave: Borreliosis de Lyme, Borrelia burgdorferi, ELISA, Western Blot, PCR. Correo electrónico: fabiolaespinoza@yahoo.com

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Espinoza-León, Fabiola: “Serological and molecular diagnosis of patients with clinical manifestations associated with Lyme disease”. Trabajo de grado presentado ante la División de Estudios para Graduados de la Facultad Experimental de Ciencias para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela. 2006. 46 p.

ABSTRACT

Lyme disease is an infectious disease caused by the tick-borne spirochete Borrelia burgdorferi. In 1994 it was conducted a research in Zulia State that detected antibacterial antibodies in 29.7% of the studied population. However, none of the positive results were confirmed by other techniques. The aim of this research was to study Borrelia burgdorferi infection in sera of 30 patients with clinical manifestations associated with the disease and 30 healthy controls, using ELISA and Western Blot and in skin biopsies of morphea patients using nested PCR (Polymerase Chain Reaction), with a primer set specific for the bacterial flagellin gene. Four serum samples (7%) were ELISA positive: three (5%) from symptomatic patients and one (2%) from a healthy control. All ELISA positive samples were negative by IgG Western Blot. Nested PCR did not show amplification of bacterial DNA in the skin samples. Our data do not support evidence of infection by B. burgdorferi in the studied patients, but do not rule out the possibility of the existence of an unknown geno-specie of B. burgdorferi sensu lato complex, a different Borrelia specie or a different spirochetal organism, as the etiological agents of Lyme Borreliosis in the area. Key words: Lyme Borreliosis, Borrelia burgdorferi, ELISA, Western Blot, PCR. e-mail: fabiolaespinoza@yahoo.com

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INTRODUCCIÓN

La Borreliosis de Lyme es una enfermedad infecciosa multisistémica causada por

la bacteria Borrelia burgdorferi y transmitida al humano por la picadura de garrapatas

del género Ixodes. Los primeros reportes de la enfermedad fueron publicados en

Europa, a finales del siglo XIX, pero no es hasta 1975 cuando todas estas tempranas

descripciones cobran importancia, a partir de la epidemia de artritis ocurrida en Lyme,

Connecticut, USA, de donde toma el nombre de enfermedad de Lyme, el cual es luego

cambiado por Borreliosis de Lyme, a partir del aislamiento de la bacteria Borrelia

burgdorferi por William Burgdorfer, en 1982 (Nocton y Steere, 1995; Dickison y Battle,

2000).

A pesar de que ésta patología ocurre en todo el mundo, la incidencia real y la

distribución es todavía incierta, ya que la mayoría de los reportes provienen de países

desarrollados (Wang y col., 1999; Dickison y Battle, 2000). Sólo en ellos se ha aislado

el agente etiológico a partir de muestras humanas, de los reservorios y de las

garrapatas. En Estados Unidos y en Europa, representa la infección transmitida por la

picadura de artrópodos más frecuente. China, Japón, Australia, África y Sudamérica

también la reportan (Wang y col., 1999). La enfermedad es más frecuente en

poblaciones cercanas a áreas boscosas, en donde la transmisión a humanos sigue

un ciclo estacional que aumenta en primavera, verano e inicio de otoño (Nocton y

Steere, 1995).

Desde su aislamiento inicial en 1982, se han identificado cientos de cepas de

Borrelia burgdorferi. Los análisis moleculares de dichas cepas indican la existencia de

diferencias genéticas y fenotípicas entre las mismas. Por esta razón se definió un grupo

o complejo que comprende las distintas especies o grupos genómicos de Borrelia

asociados con la Borreliosis de Lyme, el cual ha sido denominado complejo Borrelia

burgdorferi sensu lato. Dentro de ese complejo existen 10 especies, de las cuales hasta

la fecha, solo tres se consideran patógenas para los humanos: B. burgdorferi sensu

stricto, B. garinii, B. afzelii (Wang y col., 1999).

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Borrelia burgdorferi sensu lato, pertenece a la familia Spirochaetaceae, género

Borrelia. Es una bacteria gram negativa, microaerofílica, móvil, en forma de espiral, con

7 a 11 flagelos periplásmicos y un tamaño de 10 a 30 μm de longitud y 0.2 a 0.5 μm de

ancho. La cepa B. burgdorferi senso stricto B31, una de las más estudiadas, tiene un

cromosoma lineal de 910.725 pb y 21 plásmidos (nueve circulares superenrollados y 12

lineales). Uno de los plásmidos lineales, de 49 Kb, codifica dos de las principales

proteínas de superficie de la espiroqueta, Osp A y Osp B (Nocton y Steere, 1995; Wang

y col., 1999).

Las distintas especies de Borrelia están distribuidas en diferentes áreas

geográficas; B. sensu stricto se distribuye en Norteamérica y Europa Occidental,

B. afzelii se encuentra en Europa Occidental y Central y en Rusia y B. garinii se localiza

en Europa, Rusia y Norte de Asia (Reed, 2002).

Diversos estudios demuestran que las manifestaciones clínicas de la enfermedad

pueden variar de acuerdo a la genoespecie infectante de B. burgdorferi sensu lato: en

pacientes con artritis, las cepas más comúnmente aisladas pertenecen a B. burgdorferi

sensu stricto; mientras que B. garinii está más involucrada en casos donde predominan

las manifestaciones neurológicas y las cepas de B. afzelii son más prevalentes en las

formas cutáneas de la enfermedad, como son el eritema migrans (EM) y la

acrodermatitis crónica atrófica (ACA) (Balmetti y Pifferetti, 1995).

Por otra parte, las manifestaciones clínicas varían entre los pacientes de

Norteamérica y los de Europa y Asia. Por ejemplo, la encefalomielitis severa y la ACA

son más comunes en Europa, en contraste con la artritis que es más frecuente en

Norteamérica. Este hecho es explicado, en parte, por las diferentes genoespecies de

Borrelia responsables de la enfermedad en las distintas regiones geográficas que

pueden tener distintos tropismos tisulares y posiblemente por diferencias genéticas

entre las poblaciones afectadas (Wang y col., 1999; Reed, 2002).

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Las garrapatas del género Ixodes son los vectores o transmisores de la

enfermedad; se han descrito diferentes especies transmisoras: Ixodes ricinus en

Europa; Ixodes persulcatus en Asia y en el este de Europa; Ixodes pacificus e Ixodes

scapularis (antes llamado Ixodes dammini) en Norteamérica (Nocton y Steere, 1995).

Los vectores no son estrictamente especie-específicos. I. ricinus es vector de B.

burgdorferi sensu stricto, B. afzelli y B. garinii, mientras que I. scapularis e I. pacificus

son vectores de B. burgdorferi sensu stricto en Norteamérica (Wang y col., 1999). En

Venezuela se han encontrado garrapatas del género Ixodes: Ixodes iatrellei, Ixodes

ioricatus e Ixodes venezuelensis, que pudieran representar vectores potenciales de la

enfermedad (Arocha y col., 1994).

La Borreliosis de Lyme es una enfermedad infecciosa compleja, que

ataca piel, articulaciones, corazón y sistema nervioso. Las manifestaciones clínicas son

variadas y solapadas, debido a la múltiple afectación de órganos en las diferentes

etapas, simulando enfermedades infecciosas y no infecciosas (Dickison y Battle, 2000).

Siguiendo a la picadura de la garrapata y a un período de incubación de cinco a seis

días, se reconocen tres etapas clínicas: temprana localizada, temprana diseminada y

tardía. La etapa temprana localizada se extiende desde la picadura del vector hasta las

tres o cuatro semanas. En el 60 a 80% de los pacientes aparece la lesión cutánea

inicial denominada EM, en el sitio de la picadura. Comienza como una mácula o pápula

eritematosa que se expande gradualmente para formar una extensa lesión anular, con

un tamaño promedio de 5 cm, con el borde rojo brillante y el centro claro, y se

acompaña de síntomas parecidos a los de un síndrome viral autolimitado, como son

fiebre, malestar general, fatiga, cefalea y linfadenopatías (Nocton y Steere, 1995; CDC,

1997).

La segunda etapa, temprana diseminada, ocurre uno a tres meses después de la

picadura. En ella ocurre diseminación hematógena de las espiroquetas y se caracteriza

por: manifestaciones musculoesqueléticas en 50% de los pacientes (artralgias

migratorias recurrentes, mialgias, dolores óseos); manifestaciones neurológicas en

15 a 20% de los casos (meningitis linfocítica, neuritis craneal, particularmente parálisis

facial, que puede ser bilateral y radiculoneuropatías motoras, sensitivas o mixtas),

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manifestaciones cutáneas en la mitad de los pacientes (lesiones anulares

secundarias, urticaria, eritema difuso); manifestaciones cardíacas en 4 a 8 % de los

casos (bloqueos A-V de II o III grado que se resuelven en días o semanas y suelen ir

acompañados de miocarditis) y manifestaciones oculares (iritis, vasculitis retinal,

oclusión de las arterias de la retina, neuritis óptica) (Nocton y Steere, 1995; CDC, 1997).

La etapa tardía o crónica, aparece un año después de la picadura. Ocurren

manifestaciones neurológicas (encefalopatía multifocal, encefalomielitis,

poliradiculoneuropatías, psicosis); manifestaciones musculoesqueléticas (artritis

crónica en 60% de los pacientes que afecta sobre todo la rodilla) (Nocton y Steere,

1995; CDC, 1997); manifestaciones cutáneas (ACA, linfadenosis benigna cutis,

hemiatrofia facial progresiva, infiltración linfocítica benigna, fascitis eosinofílica, morfea,

liquen escleroso atrófico) (Nocton y Steere, 1995; Schempp y col., 1993);

manifestaciones oculares (queratitis, uveitis) (Nocton y Steere, 1995). Aunque se ha

descrito la transmisión transplacentaria el análisis de la evidencia actual indica que un

resultado adverso fetal debido a infección materna por B. burgdorferi en cualquier etapa

del embarazo es extremadamente raro (Elliott y col., 2001).

En vista de que el EM, está ausente en 20 a 40% de los casos y que las

manifestaciones musculoesqueléticas, neurológicas y cardiovasculares pueden

aparecer en gran variedad de combinaciones y generalmente lo hacen tardíamente en

el curso de la enfermedad, el diagnóstico clínico en etapas tempranas de la Borreliosis

de Lyme es complicado. Por esta razón se han utilizado diferentes métodos de

laboratorio en combinación con los antecedentes epidemiológicos y los hallazgos

clínicos para confirmar el diagnóstico de la infección por Borrelia burgdorferi (Steere,

2002; Dickison y Battle, 2000)

El cultivo de la bacteria, a partir de biopsias de piel o fluidos corporales (sangre,

plasma, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido sinovial) en el medio Barbour-Stoenner-

Kelly (BSK-H) (Sigma Chemical Co.), se considera la prueba estándar de oro, puesto

que proporciona evidencia definitiva de la enfermedad (Berger y col., 1992; Pollack y

col., 1993; Bunikis y Barbour, 2002). Sin embargo, es un método que permite el

13

aislamiento de la espiroqueta en un pequeño porcentaje (2–7%) de los casos (Berger y

col.,1992), ya que el número de microorganismos presentes en fluidos biológicos

accesibles y tejidos es generalmente bajo durante la infección aguda y disminuye aún

más en la fase tardía o crónica de la enfermedad (Bunikis y Barbour, 2002).

La amplificación de secuencias específicas del ADN de la espiroqueta

usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR), a partir de muestras de biopsias

de piel, sangre, orina, LCR y liquido sinovial, también proporciona evidencia definitiva

de la infección en fluidos corporales y es particularmente útil en individuos que se

encuentran en las etapas temprana diseminada y tardía (Liebling y col., 1995; von

Stedingk y col., 1995).

Las pruebas serológicas, representan el medio más práctico para confirmar la

enfermedad, debido a su menor costo, fácil y rápida realización y alta especificidad y

sensibilidad. La respuesta serológica en un paciente infectado está dirigida contra las

diferentes fracciones antigénicas de la bacteria, como el antígeno flagelar 41 Kd y los

antígenos de superficie celular. La respuesta inmune comienza con la aparición del

anticuerpo IgM en la primera semana, específicamente dirigido contra el antígeno

flagelar, el cual permanece detectable por cuatro a seis semanas. Para las cuatro a seis

semanas ya se han formado los anticuerpos IgG dirigidos especialmente contra la

fracción 34 Kd (Osp B) y 39 Kd, alcanzan su pico a las ocho semanas y pueden persistir

en el paciente indefinidamente (Reed, 2002).

Las pruebas serológicas más comúnmente empleadas son la

inmunofluorescencia indirecta (IFA) y el inmunoensayo enzimático (ELISA); estos

métodos utilizan el antígeno completo de la Borrelia o sus fracciones antigénicas y los

resultados cuantitativos se expresan en términos de la clase específica de

inmunoglobulinas IgM o IgG detectadas. La técnica ELISA es preferida por muchos

laboratorios, debido a su mayor sensibilidad, menor subjetividad y por ser más

apropiada para procesar gran número de muestras (Reed, 2002; Ledue y col., 1996).

14

A pesar de la alta sensibilidad (89-100%) de la técnica ELISA, debido a su falta

de estandarización responsable de variaciones interlaboratorios y a la existencia de

reacciones cruzadas con otros microorganismos (Treponema pallidum, Borrelia

recurrentis, Helicobacter pylori, Ehrlichia, Babesia), enfermedades autoinmunes (lupus

eritematoso sistémico) y síndromes virales (virus Epstein-Barr), la prueba presenta una

moderada especificidad (72-89%) (Fritz y Vugia, 2001).

En 1995, el Centers for Disease Control and Prevention (CDC) y la Association of

State and Territorial Public Health Laboratory Directors (ASTPHLD) de los Estados

Unidos, recomendaron un protocolo de dos pasos para la detección de anticuerpos, con

el objetivo de aumentar la especificidad de la técnica ELISA a un 99% o más. En este

protocolo a las muestras positivas o equívocas por ELISA o IFA (primer paso), se les

practica inmunoblot (prueba confirmatoria, segundo paso) el cual es interpretado según

los criterios estandarizados establecidos por estos organismos (Ledue y col., 1996; Fritz

y Vugia, 2001; Wormser y col., 2000; CDC, 1995).

Si el inmunoblot se utiliza en las primeras cuatro semanas, luego del inicio de la

enfermedad se deben realizar tanto IgM como IgG. Si se practica en pacientes con más

de cuatro semanas de evolución solo se lleva a cabo IgG. La mayoría de los pacientes

con Borreliosis de Lyme sufren seroconversión en este período de cuatro semanas. Si

un paciente con sospecha de enfermedad temprana tiene serología negativa, la

evidencia de infección se obtiene estudiando sueros pareados (fase aguda y de

convalescencia). Como la IgG específica debe estar presente en casi todos los

pacientes no tratados luego de un mes de infección, un resultado positivo de IgM solo

(sin IgG) en pacientes con más de un mes de evolución, no debe ser considerado

suficiente para diagnosticar infección activa, ya que es muy probable que sea un

resultado falso positivo (CDC, 1995; Reed, 2002).

En Sudamérica se han reportado pruebas serológicas positivas en Colombia,

México, Bolivia, Argentina, Brasil, Perú y Venezuela, sin embargo no se ha realizado

ningún estudio con procedimientos diagnósticos que proporcionen evidencia definitiva

de la enfermedad, como la reacción en cadena de la polimerasa o el cultivo in vitro

15

(Azulay y col., 1991; Need y Escamilla, 1991; Ciceroni y col., 1994; Wang y col., 1999;

Palacios y col., 1999, Gordillo y col., 1999).

En 1994 se realizó en el estado Zulia un estudio que detectó anticuerpos

específicos contra Borrelia burgdorderi en 29,7% de los pacientes estudiados, quienes

presentaban manifestaciones dermatológicas, neurológicas y reumatológicas asociadas

a la Borreliosis de Lyme, pero al igual que en otros trabajos sudamericanos, no hubo

confirmación de los casos positivos por otras técnicas (Arocha y col., 1994).

En vista de la localización en el estado Zulia de regiones rurales con

características ecológicas propias para el desarrollo de las garrapatas y de animales

que pueden ser reservorios potenciales; la evidencia previa de anticuerpos específicos

en la población regional y la existencia de pacientes con manifestaciones clínicas

compatibles con la enfermedad, quienes reciben tratamiento sin tener un diagnóstico

etiológico preciso, se hace necesario el diagnóstico de la infección por Borrelia

burgdorferi en dichos pacientes mediante la utilización de técnicas serológicas y de

biología molecular.

16

OBJETIVOS

Objetivo General

Diagnosticar la infección por Borrelia burgdorferi en pacientes con sospecha

clínica de Borreliosis de Lyme.

Objetivos Específicos

1. Detectar la presencia de anticuerpos contra Borrelia burgdorferi en suero de

pacientes con sospecha clínica de la enfermedad mediante las técnicas ELISA y

Western Blot.

2. Detectar el ADN bacteriano en muestras de piel (biopsias) de pacientes con

sospecha clínica de la enfermedad mediante el ensayo reacción en cadena de la

polimerasa (nested PCR).

3. Establecer las formas clínicas de la enfermedad más frecuentes en nuestro medio.

17

SISTEMA DE HIPÓTESIS Y VARIABLES

Hipótesis

Las manifestaciones clínicas dermatológicas, neurológicas y reumatológicas

sugestivas de Borreliosis de Lyme son ocasionadas por la infección de la bacteria

Borrelia burgdorferi.

Variables

Variable independiente: Infección por la bacteria Borrelia burgdorferi. Variable dependiente: Presencia de manifestaciones clínicas dermatológicas,

neurológicas y reumatológicas.

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Operacionalización de las Variables

Variable independiente: Infección por la bacteria Borrelia burgdorferi. DIMENSIONES INDICADORES INDICE

Negativa Indice Lyme (LI) menor o igual a 0.90.

Equívoca LI entre 0.91-1.09.

Detección de anticuerpos

específicos mediante ELISA

Positiva

LI mayor o igual a 1.10.

Positiva

Presencia de al menos 2 de las siguientes bandas: p41, p39, p23,

IgM Negativa Cualquier otro patrón de

bandas.

Positiva Presencia de al menos 5 de las siguientes bandas: p93, p66, p58, p45, p41, p39, p30, p28, p23, p18.

Detección de anticuerpos IgM/IgG mediante Western Blot

IgG

Negativa Cualquier otro patrón de bandas.

Presente

Amplificación de secuencias específicas de ADN bacteriano.

Presencia de ADN bacteriano

Ausente Ausencia de amplificación de secuencias específicas de ADN bacteriano.

Variable dependiente: Presencia de manifestaciones clínicas. DIMENSIÓN INDICADOR

MANIFESTACIONES DERMATOLÓGICAS Eritema migrans Presente

Ausente Lesiones localizadas tipo escleroderma (morfea) Presente

Ausente Liquen escleroso atrófico Presente

Ausente MANIFESTACIONES NEUROLÓGICAS

Parálisis Facial

Presente Ausente

MANIFESTACIONES REUMATOLÓGICAS Dolores migratorios articulares, musculares, óseos y en

tendones Presente Ausente

Artritis aguda y crónica (Factor reumatoide negativo) Presente Ausente

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MATERIALES Y MÉTODOS

Tipo de investigación

Se diseñó una investigación descriptiva, prospectiva, transversal que pretendió

establecer si las manifestaciones clínicas de los pacientes correspondían o no a la

infección por la bacteria, a través de la realización de pruebas serológicas y de biología

molecular en muestras biológicas que fueron recolectadas en un solo momento durante

la visita del paciente al laboratorio de investigación.

Población de estudio y muestra

La población de estudio estuvo constituida por todos aquellos individuos

habitantes o visitantes de cualquiera de las siguientes regiones del Estado Zulia: Perijá

desde el Km 18 en adelante, Santa Bárbara del Zulia, Catatumbo, Carrasquero, Cachirí,

Los Puertos de Altagracia, Palito Blanco, el Vigía e Isla de Toas, con antecedentes de

picadura de garrapatas.

La muestra estuvo compuesta por 60 sujetos de diferentes edades y sexo que

acudieron entre marzo del 2004 y agosto del 2005, al Laboratorio HLA y Biología

Molecular del Banco de Sangre de Maracaibo, quienes fueron seleccionados mediante

la técnica de muestreo intencionado y divididos de la siguiente forma:

• Grupo A (Control): Constituido por 30 personas sanas, voluntarios provenientes del

personal que labora en el Banco de Sangre de Maracaibo y estudiantes de la

escuela de Medicina, pertenecientes a diferentes grupos etarios y sexo, todos

habitantes de la ciudad de Maracaibo.

• Grupo B: Constituido por 30 pacientes de diferentes edades y sexo seleccionados

de las consultas de infectología, reumatología, dermatología y neurología de los

hospitales públicos y privados del Estado Zulia, que presentaban cualquiera de los

20

siguientes criterios de inclusión: eritema migrans, esclerodermia localizada (morfea),

liquen escleroso atrófico, artritis y parálisis facial, que hayan recibido o no

previamente antibioticoterapia. Se excluyeron a todas aquellas personas que

presentaban manifestaciones clínicas diferentes a las antes mencionadas.

Técnicas y Procedimientos

Entrevista personal

Se realizó una entrevista personal a todos los sujetos de la población de estudio

con la finalidad de llenar una historia clínica que se anexa al final, para investigar

antecedentes de picadura de garrapatas, visita a regiones rurales o boscosas, signos y

síntomas compatibles con la patología, tiempo de evolución y tratamiento médico

recibido (Anexo 1).

Obtención de las muestras

Muestra de sangre: A cada sujeto se le tomó una muestra de 5 cc de sangre

periférica, en la vena antecubital derecha, previa asepsia y antisepsia de la zona, la

cual fue transferida a un tubo de vidrio vacutainer, sin anticoagulante (EDTA). La

muestra se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos y el suero obtenido se dividió en

alícuotas en tubos Eppendorf de 1,5 ml y almacenó a -70 ºC hasta el momento de ser

procesado.

Muestra de piel (Biopsia): Previa asepsia y antisepsia del área donde se encontró

la lesión de morfea, se aplicó anestesia local subcutánea (cifarcaína al 1%) y se realizó

biopsia en saca bocados de 2 mm de diámetro, del borde de la lesión, posteriormente

se suturó el área y se cubrió con gasa estéril. La biopsia fue colocada en un tubo de

ensayo con 1 ml de buffer TE (0.5 ml M Tris-HCL, pH 9.0; 0.02 M EDTA; 0.01 M NaCl) y

llevada al laboratorio para proceder a la extracción del ADN.

21

Pruebas Diagnósticas

• ELISA

Se utilizó el kit comercial C6 B. burdogdorferi (Lyme) ELISA Kit (Inmunetics, Inc.

Cambridge, MA), que utiliza como antígeno un péptido sintético, el péptido C6, derivado

de la proteína VlsE de B. burgdorferi. La secuencia de este péptido está conservada y

es igualmente antigénica en humanos infectados con B. burgdorferi sensu stricto o con

genoespecies europeas, que incluyen B. afzelii y B. garinii (Inmunetics, 2001a).

Para la interpretación de los resultados se utilizó el índice Lyme (LI), que es

calculado al dividir la absorbancia a 450 nm de cada muestra por el valor mínimo (cut

off value) de la prueba (Inmunetics, 2001a).

Se consideraron como prueba negativa aquella cuyo LI fue menor o igual a 0,90,

como prueba dudosa o equívoca aquella cuyo LI estuvo entre 0,91-1,09 y como prueba

positiva aquella cuyo LI fue mayor o igual a 1,10. Las muestras positivas fueron

analizadas mediante la prueba confirmatoria específica Western Blot (Inmunetics,

2001a).

Preparación de los reactivos y procedimiento de la prueba ELISA

Preparación de los reactivos

Buffer de lavado: Se agregaron 60 ml del buffer de lavado concentrado 10x a 540

ml de agua desionizada/destilada en un frasco de 1 litro y se mezclaron.

Sueros control: Se centrifugaron los controles a 10.000 rpm por 10 segundos. Se

dispensaron 200 μl del diluyente de muestras en 6 pozos de una microplaca limpia. Se

agregaron 10 μl de suero control negativo en un pozo, 10 μl de suero control positivo en

22

otro pozo, 10 μl del calibrador en otros tres pozos y se mezcló. Un pozo sirvió como

blanco.

Muestras pacientes: Se centrifugaron por 1 minuto a 10.000 rpm en una

microcentrífuga para remover cualquier precipitado visible antes de la prueba. Se

dispensaron 200 μl del diluyente de muestras en cada uno de los pozos suficientes

para el número de muestras a analizar. Se agregaron 10 μl de cada muestra al pozo

correspondiente y se mezcló.

Procedimiento

Todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente (20-25 ºC) y se muestran

a continuación:

1. Identificar cada muestra en su respectivo pozo en la hoja proporcionada para tal fin.

Se utilizaron 6 pozos para: los controles (2), blanco (1) y los calibradores (3).

2. Remover las tiras de microplacas del estuche.

3. Agregar 100 μl del diluyente de muestras a un pozo (blanco).

4. Agregar 100 μl de suero control positivo diluido a un pozo y 100 μl de suero control

negativo diluido a otro pozo.

5. Agregar 100 μl de calibrador diluido a tres pozos.

6. Agregar 100 μl de cada una de las muestras diluidas de los pacientes en sus

respectivos pozos.

7. Incubar 30 minutos.

8. Aspirar los pozos. Lavar 4 veces en lavador automático, usar en cada lavado 300-

350 μl de buffer de lavado. Luego del lavado final, escurrir las placas en papel

absorbente para remover todo el líquido.

9. Dispensar 100 μl de conjugado en cada pozo.

10. Incubar 20 minutos.

11. Aspirar los pozos. Realizar 4 lavados con buffer de lavado como se indicó en el

paso 8.

23

12. Luego de la aspiración final, invertir y sacudir las placas en papel absorbente para

eliminar todo el líquido residual.

13. Dispensar 100 μl de sustrato en cada pozo.

14. Incubar 4 minutos.

15. Dispensar 100 μl de solución de parada en cada pozo en el mismo orden en el que

se agregó el sustrato en el paso previo. Tapar la placa cuidadosamente para

mezclar el contenido de los pozos. Esperar 5 minutos antes de leer los valores de

absorbancia. Proteger la placa de la luz antes de la lectura.

16. Leer la absorbancia utilizando un lector de ELISA con un filtro de 450 nm,

blanqueado al aire.

• Western Blot

Se utilizó el kit QualiCode B. burgdorferi IgM/IgG Western Blot Kit (Inmunetics,

Inc. Cambridge, MA). Es un inmunoensayo de membrana cualitativo basado en el

método Western Blot, en el que las proteínas de la espiroqueta han sido separadas por

electroforesis y transferidas por electroblotting a una membrana de nitrocelulosa. Luego

ésta membrana que contiene los antígenos de B. burgdorferi es cortada en tiras para

estudiar muestras individuales. Durante el ensayo las tiras que contienen las proteínas

de la bacteria son incubadas con suero del paciente y luego lavadas para remover los

anticuerpos no unidos. La visualización de los anticuerpos IgM e IgG humanos unidos a

las proteínas de la espiroqueta se lleva a cabo con reacciones secuenciales con el

conjugado del anticuerpo IgM antihumano unido a fosfatasa alcalina y el sustrato de la

fosfatasa alcalina (Inmunetics, 2001b).

Las muestras ELISA positivas fueron analizadas mediante IgG Western Blot. No

se realizó IgM Western blot porque todos los pacientes tenían más de 4 semanas de

evolución.

24

La prueba IgG Western Blot era positiva si aparecían al menos 5 de las

siguientes bandas: p93, p66, p58, p45, p41 (Fla), p39 (BmpA), p30, p28, p23, p18. Si

aparecía cualquier otro patrón de bandas, la prueba era negativa (Inmunetics, 2001b).

Preparación de los reactivos y procedimiento de la prueba IgG/IgM Western blot

Preparación de los reactivos

Buffer de lavado: Se agregó la botella entera de buffer concentrado 10x en un

matraz y se diluyó hasta 250 ml con agua destilada y se mezcló completamente.

Buffer de dilución de las muestras: Se agregaron 0.05 g de leche en polvo a 1 ml

de buffer de lavado por cada tira usada. Se disolvió la leche en polvo en buffer de

lavado mediante agitación.

Controles: Se centrifugaron a 10.000 rpm por 10 segundos antes de usarse.

Muestras: Las muestras congeladas se llevaron a temperatura ambiente y

centrifugaron a 10.000 rpm por 10-30 segundos antes de la prueba.

Procedimiento

Todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente (20-25 ºC) y se muestran

a continuación:

Preparación de las tiras

1. Agregar 1 ml de buffer de lavado a cada canal de la bandeja de incubación.

25

2. Colocar las tiras individualmente en los pozos con los números de las tiras hacia

arriba.

3. Incubar por 1 minuto en la plataforma de agitación hasta que las tiras están

homogéneamente húmedas.

4. Aspirar.

5. Agregar 1 ml de buffer de dilución de muestras a cada canal.

Adición de las muestras

1. Inclinar la bandeja de incubación suavemente para que el buffer de dilución de

muestras forme una piscina en un extremo de los canales. Agregar 10 μl de las

muestras en estudio o controles a la piscina en los canales individuales apropiados y

pipetear hacia arriba y hacia abajo para facilitar el mezclado.

2. Incubar por 30 minutos en la plataforma de agitación.

3. Aspirar.

4. Enjuagar los canales con 1 ml de buffer de lavado, agitar por 3 minutos, luego

aspirar (Repetir este paso 2 veces más).

Adición del conjugado (IgG antihumana)

1. Agregar 1 ml de conjugado a cada canal.

2. Incubar por 15 minutos en la plataforma de agitación.

3. Aspirar.

4. Enjuagar los canales con 1 ml de buffer de lavado, agitar por 3 minutos, luego

aspirar (Repetir este paso 1 vez más).

5. Enjuagar los canales con 1 ml de agua destilada, agitar por 3 minutos, luego aspirar

(Repetir este paso 1 vez más).

26

Adición del sustrato (solución de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato tetrazolium)

1. Agregar 1 ml de solución sustrato a cada canal, con pipeta multicanal, para iniciar la

reacción al mismo tiempo en todos los canales.

2. Incubar por 6-8 minutos en la plataforma de agitación.

3. Aspirar los canales.

4. Enjuagar los canales con 2 breves cambios de agua destilada para detener el

desarrollo del color.

5. Transferir las tiras boca arriba a una toalla de papel y dejar secar al aire. No secar

las tiras entre toallas de papel. No interpretar los resultados hasta que el blot se

haya secado completamente.

• Reacción en Cadena de la Polimerasa

Se realizó una nested PCR a partir de biopsias de piel, con primers específicos

para el gen de la flagelina (Figura 1) de B. burgdorferi (Schempp y col., 1993). Las

secuencias de los primers utilizados y los subfragmentos amplificados se muestran a

continuación:

Gen blanco Primer Secuencia Subfragmento

amplificado Primer externo A1

Primer externo A2

5´-CTGCTGGCATGGGAGTTTCT-3´ 5´-TCAATTGCATACTCAGTACT-3´

730 bp

Flagelina

Primer interno B1

Primer interno B2

5´-AAGGAATTGGCAGTTCAATC-3´ 5´-ACAGCAATAGCTTCATCTTG-3´

290 pb

En estudios previos se demostró que los primers utilizados no hibrídan con el

gen de la flagelina de otras bacterias como Treponema pallidum, Treponema denticola,

Yersinia enterocolítica y Escherichia coli (Schempp y col., 1993). La especificidad de

las secuencias de estos primers fue comprobada mediante revisión en el programa

Blast (Basic Local Alignment Search Tool) del NCBI (National Center for Biotecnology

Information).

27

Los parámetros utilizados en el ensayo de PCR fueron: 40 ciclos en la PCR

externa y 30 ciclos en la PCR interna. Las temperaturas y tiempos que se utilizaron en

los ciclos fueron: Desnaturalización: 94 ºC por 30 segundos, hibridación: 48 ºC por 1

minuto y elongación: 72 ºC por 2 minutos (Schempp y col., 1993).

Figura 1

Secuencia del gen de la flagelina de la cepa B31 de B. burgdorferi

1 ttatctaagc aatgacaaaa catattgggg aacttgatta gcctgcgcaa tcattgccat 61 tgcagattgt gttaaaatac tattagttgt tgctgctaca acctcatctg tcattgtag 121 atcttttatt tgagcataag atgcttttag attttcaatt gcatactcag tactattctt 181 tatagattca agtctatttt ggaaagcacc taaatttgcc ctttgatcac ttatcattct 241 aatagcattt tcaattttag caagtgatgt attagcatca actgtagttg taacattaac 301 aggagaatta actccgcctt gagaaggtgc tgtagcaggt gctggctgtt gagctccttc 361 ctgttgaaca ccctcttgaa ccggtgcagc ctgagcagtt tgagctccct caccagagaa 421 aagatttgca acattagctg cataaatatt tacagcaata gcttcatctt ggtttgctcc 481 aacatgaact cttaaagtcc aagacgcttg agaccctgaa agtgatgctg gtgtgttaat 541 ttttgcaggc tgcattccaa gctcttcagc tgttcttaca ttttgagaag cagatttgtt 601 tgataacatg tgcatttggt tatattgagc ttgatcagca attctattaa tttcgtctgt 661 aagttgctct atttcaattt gtatagaacc tctgtctgca tctgaatatg tgccgttacc 721 tgattgaact gccaattcct tcattcttac taagactttt tctacttcat ttaaattccc 781 ttctgttgtc tgaataaaat taatagcctt tgaagtattt ctagaagctt gtgacaaacc 841 tcttatttga gcattaatct taccagaaac tcccatgcca gcagcatcat cagaagctcg 901 attaattctg tacccactag aaagcttttc ttgagtttta ctaagattag cagcgttaat

961 gccattattt cttgaagcat taatagctga tgtattatga ttgataatca t Secuencia primers externos Secuencia primer internos

Fuente: NCBI-GenBank, 2005.

Lisis Celular y Extracción del ADN de piel

Las biopsias de piel fueron retiradas de los tubos de ensayo y luego cortadas con

tijeras quirúrgicas para dividirlas en pequeños fragmentos. Estos últimos se transfirieron

a un tubo cónico de 15 ml y se procedió a la extracción del ADN mediante el protocolo

de extracción con fenol-cloroformo recomendado por 12° Taller Internacional de

Histocompatibilidad (Charron y Fauchet, 1996).

1. Agregar 1 ml de proteinasa K (500 μg/ml). Incubar a 48 oC, en baño de María,

durante la noche.

2. Agregar 3 ml de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico.

3. Mezclar por 10 minutos por inversión.

4. Centrifugar por 5 minutos a 1500 rpm.

5. Transferir la fase superior acuosa a un tubo Falcon limpio de 15 ml.

28

6. Hacer una segunda extracción con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico

7. Extraer el cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y recuperar la fase acuosa.

8. Agregar 60 μl de NaCl 5M para obtener una concentración final de 0.1 M

9. Añadir 0.6 volumen de isopropanol 100%.

10. Mezclar gentilmente por inversión hasta que el precipitado se haya formado.

11. Recuperar el ADN precipitado en un tubo Falcon de 5ml.

12. Lavar 3 veces con 3 ml de etanol al 70%.

13. Descartar el etanol y dejar secar el ADN.

14. Resuspender el ADN en 1 ml de buffer TE (10mM Tris-HCL pH 7.5, 1mM EDTA pH

8.0).

15. Almacenar el ADN a – 20 oC hasta su utilización.

Procedimiento de la nested PCR

La mezcla de reacción de 25 μl usada en la PCR externa contiene:

1. PCR master mix (Promega®): 12.5 μl. Esta mezcla maestra contiene: Taq ADN

Polymerasa, dNTPs, MgCl2 y buffer de reacción (Promega®, 2004).

2. ADN extraído: 5 μl.

3. Set de primers externos (A1A2): 25 picomoles de cada uno.

La mezcla de reacción de 25 μl usada en la PCR interna contiene:

1. PCR master mix (Promega®): 12.5 μl.

2. Producto amplificado: 5 μl.

3. Set de primers internos (B1B2): 25 picomoles de cada uno.

Se procesaron además como control positivo, ADN genómico de la cepa B31 de

B. burgdorferi obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC 35210) y como

control interno, se realizó la amplificación del gen de la Beta-globina humana. Los

primers utilizados para la amplificación del gen de la Beta-globina humana son:

29

5´-CAACTTCATCCACGTTCACC-3´ y 5´-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3´. El

subfragmento amplificado del gen de la Beta-globina humana tiene un tamaño de 268

pb (Talmaci y col., 2004).

Electroforesis en gel

La verificación de los productos de amplificación se hizo mediante electroforesis

en gel de agarosa al 2% de la siguiente manera:

1. Mezclar 4,8 g de agarosa (Promega®) y 240 ml de TBE 1x.

2. Hervir la mezcla hasta que se disuelva en microondas.

3. Dejar enfriar hasta que pueda tocarse el recipiente con la mano.

4. Verter la mezcla en la cámara y dejar solidificar a temperatura ambiente.

5. Retirar los peines y colocar el gel en la cámara que contiene la solución

amortiguadora TBE 1x.

6. Cargar los pozos del gel de la siguiente manera: marcador de peso molecular pGEM

(Promega®) (5 μl), (1 pozo), ADN control (5 μl), (1 pozo), producto amplificado (4 μl)

(resto de los pozos). A cada pozo se añadió 1 μl de buffer de carga (loading dye

blue/orange 6x) (Promega®).

7. Correr a 100 mv y 60 miliamperios durante 1 hora y 30 minutos.

8. Retirar el gel de la cámara, colocarlo en bromuro de etidio (12 μl de solución de

bromuro de etidio a una concentración de 10 mg/ml) y luego en agua destilada.

9. Colocar el gel sobre el transiluminador para observar las bandas amplificadas.

10. Calcular el tamaño del producto amplificado con respecto al marcador de peso

molecular.

Método de Análisis Estadístico

Los resultados obtenidos se expresaron en valores absolutos y porcentajes. Para

hacer la comparación entre las medias de los grupos en estudio se utilizó el test no

paramétrico Chi-cuadrado. Se utilizó como nivel de significancia p < 0.01.

30

En el grupo de 30 pacientes con manifestaciones clínicas sugestivas de

Borreliosis de Lyme (Grupo B) resultaron tres muestras positivas (5%) en la prueba

ELISA, mientras que en el grupo de sujetos sanos (Grupo A) se obtuvo una muestra

positiva (2%) (p=0.61 (Tabla 1).

En relación a las entidades clínicas estudiadas, sugestivas de Borreliosis de

Lyme se obtuvo que el 70% (21) de los casos correspondió a sujetos con esclerodermia

localizada (morfea), seguido de un 20% (6) con parálisis facial periférica, un 6.7% (2)

con artritis crónica y un 3.3% (1) con liquen escleroatrófico. De las tres muestras que

resultaron positivas en el grupo sintomático, dos (6.7%) correspondieron a individuos

que presentaban morfea y una (3.3%) a un sujeto con parálisis facial periférica (Tabla

1).

Tabla 1

Relación entre la positividad de la prueba ELISA y las entidades clínicas sugestivas de Borreliosis de Lyme

Resultado ELISA Total

Positivo Negativo

Entidad Clínica No. casos % No. Casos %

No. casos

%

Morfea 2 6,7 19 63,3 21 70,0

Parálisis Facial Periférica 1 3,3 5 16,7 6 20,0

Liquen escleroatrófico 0 0 1 3,3 1 3,3

Artritis Crónica 0 0 2 6,7 2 6,7

Total 3 10,0 27 90,0 30 100,0

En relación al tiempo de evolución de las manifestaciones clínicas sugestivas de

Borreliosis de Lyme, se encontró que todos los pacientes en estudio estaban en la

etapa tardía o crónica de la enfermedad, es decir, presentaban más de un año de

evolución.

Todos los sujetos en el grupo sintomático negaron el antecedente de eritema

migrans, considerado la lesión patognomónica de la enfermedad y el antecedente de

31

picadura de garrapatas. Mientras que todos los sujetos en estudio (ambos grupos)

refirieron el antecedente de la visita o permanencia en áreas rurales.

En lo referente a la administración de tratamiento antibiótico en los sujetos

sintomáticos, se encontró que de los 27 sujetos seronegativos, 9 (33.33%) recibieron

antibióticos antes de empezar el estudio y 18 (66.66%) no los recibieron. Mientras que

de los tres pacientes ELISA positivos, dos (66,7%) recibieron antibioticoterapia antes de

formar parte de esta investigación y uno (33,3%) no lo recibió.

Los sujetos cuyas muestras fueron positivas en la prueba ELISA se sometieron a

la prueba confirmatoria IgG Western Blot, en la cual resultaron negativos, como se

muestra en la Tabla 2. En el control sano no se detectó ninguna banda diagnóstica,

mientras que en los dos sujetos con esclerodermia localizada y parálisis facial se

encontró la banda diagnóstica p41 que corresponde a la proteína flagelina.

Tabla 2 IgG Western Blot de las muestras estudiadas

Bandas WB

Muestras 18 *

23*

28*

30*

31 34 39*

41*

45*

58 *

60 66*

93 *

Interpretación

CS Negativo EL + Negativo EL + Negativo PF + Negativo CN Negativo CP + + + + + + + + + + + Positivo

CS= Control Sano. EL= Escleroderma localizada. PF= Parálisis Facial, CN= Control Negativo. CP= Control Positivo. * Bandas Diagnósticas

El ensayo nested PCR de las biopsias de piel de pacientes con morfea no mostró

amplificación de las secuencias seleccionadas del gen de la flagelina: subfragmentos

de 730 bp (PCR Externa) y 290 bp (PCR interna); como se muestra en las Figuras 2 y

3, respectivamente. En los carriles correspondientes a las muestras de ADN de los

pacientes solo puede apreciarse la banda de 268 pb correspondiente al gen de la Beta-

globina humana, usada como control interno de amplificación.

32

Figura 2 Electroforesis en gel de agarosa de ADN de piel de pacientes con escleroderma

localizada (morfea)

17

12 13 11 2

1

M

3

4 5

6

7 8 10 9 14 15 16 18

1 9 20

21

PB PB

Figura 3

M: Marcador pGEM (Promega®) Carril 1: Control positivo ADN genómico B. Burgdorferi, cepa B31 (PCR Externa) Carril 2-21: Pacientes con morfea

730

268

676 460

2,645 1,605 1,198

517 396 350 222

Electroforesis en gel de agarosa de ADN de piel de pacientes con escleroderma localizada (morfea)

PB M 1 2 3 4 M

676

460

730

290 268

PB

222

517

396 350

2,645 1,605 1,198

M: Marcador pGEM (Promega®) Carril 1: Control positivo ADN genómico B. Burgdorferi, cepa B31 (PCR Externa) Carril 2: Control positivo ADN genómico B. Burgdorferi, cepa B31 (PCR Interna) Carril 3-4 Pacientes con morfea

33

DISCUSIÓN

La Borreliosis de Lyme es una enfermedad cuyo diagnóstico clínico se ve

complicado por las variadas manifestaciones y la gran cantidad de combinaciones en

las cuales pueden aparecer. Por esta razón existen diferentes métodos de laboratorio

para ayudar a sustentarlo, pero que en ningún caso representan el único criterio para

confirmar o descartar la infección, puesto que no están exentos de limitaciones.

Considerando que las pruebas serológicas representan actualmente el medio

más práctico para confirmar la enfermedad, en la presente investigación se utilizó la

prueba ELISA como método inicial para analizar muestras de suero de pacientes con

manifestaciones clínicas sugestivas de Borreliosis de Lyme, así como de sujetos

asintomáticos. Se encontraron cuatro muestras positivas (7%) de las 60 estudiadas; de

éstas, tres (5%) correspondieron a pacientes sintomáticos y una (2%) a un sujeto sano.

Siguiendo el protocolo de dos pasos recomendado por el CDC/ASTPHLD (CDC,

1995) las muestras positivas se sometieron a la prueba confirmatoria IgG Western blot

(por presentar más de un año de evolución), la cual fue interpretada de acuerdo a los

criterios del fabricante. Todas las muestras resultaron negativas, solo estuvo presente la

banda diagnóstica p41 en los sujetos sintomáticos y ninguna banda, en el individuo

sano.

Tomando en cuenta que el ensayo reacción en cadena de la polimerasa

proporciona evidencia definitiva de la infección y que la piel representa una muestra

biológica de alta sensibilidad para la detección de ADN bacteriano (von Stedingk y col.,

1995), se realizó el análisis de biopsias de piel de pacientes con escleroderma

localizada (morfea) mediante nested PCR, no encontrándose amplificación de la

secuencia blanco seleccionada (gen de la flagelina).

34

La obtención de resultados estadísticamente no significativos (p=0.61), al

comparar los grupos sometidos a pruebas serológicas, lleva a considerar varios

aspectos.

Los resultados de la prueba ELISA pueden ser falsos positivos. Son bien

conocidas las reacciones cruzadas de B. burgdorferi con otros microorganismos

(Treponema pallidum, Borrelia recurrentis, Helicobacter pylori, Ehrlichia, Babesia),

enfermedades autoinmunes (lupus eritematoso sistémico) y enfermedades virales (virus

Epstein-Barr) (Blaauw y col., 1999; Brown y col., 1999). En este sentido Rose y col.

estudiaron pacientes con resultados discordantes en las pruebas ELISA y Western Blot,

encontrando que el 91% de los individuos que presentaban ELISA positivo y Western

blot negativo tenían otra patología de tipo reumática o inflamatoria, diferente de

Borreliosis de Lyme.

La posibilidad antes mencionada fue descartada en esta investigación, puesto

que ninguno de los sujetos positivos presentó manifestaciones clínicas o hallazgos de

laboratorio sugerentes de cualquiera de las patologías ya nombradas y de otras que

frecuentemente necesitan ser diferenciadas de Borreliosis de Lyme, como esclerosis

múltiple y el síndrome de Guillain-Barré. Además, el inmunoensayo enzimático usado

en este estudio, elaborado con el péptido sintético C6, derivado de una región

inmunodominante conservada de la proteína bacteriana VlsE, se considera altamente

específico. Es capaz de discriminar entre Borreliosis de Lyme e infecciones por otras

espiroquetas (T. pallidum) u otras borrelias (B. hermsii, B. recurrentis), así como

enfermedades autoinmunes, infecciones por micobacterias, esclerosis múltiple y el

síndrome de Guillain-Barré (Ting y col., 1999).

A pesar de que según las recomendaciones del CDC/ASTPHLD, la obtención de

un resultado negativo en la prueba confirmatoria indica que no hay evidencia serológica

de infección por B. burgdorferi por el momento (CDC, 1995), existen estudios como el

realizado por Dattwyler y col., que demuestran la presencia de una respuesta

proliferativa vigorosa de células T frente a la bacteria en pacientes sin niveles

diagnósticos de anticuerpos en las pruebas ELISA, IFA o Western blot. Por esta razón

35

concluyen que no se puede descartar la Borreliosis de Lyme crónica por la sola

ausencia de anticuerpos contra la espiroqueta.

Una investigación similar conducida por Buechner y col., para estudiar la

respuesta linfoproliferativa frente a B. burgdorferi en pacientes con manifestaciones

cutáneas de la enfermedad, mostró una respuesta linfoproliferativa elevada en 45

pacientes con morfea, 32 de los cuales no tenían anticuerpos detectables mediante IFA,

por lo que concluyen que el ensayo de proliferación de linfocitos tiene valor diagnóstico

en pacientes con una fuerte sospecha clínica de Borreliosis de Lyme, pero sin niveles

diagnósticos de anticuerpos antibacterianos.

Wang y Hilton en un intento por explicar la razón de la seronegatividad en

individuos con sospecha de la enfermedad, investigaron las diferencias entre los alelos

HLA (antígenos leucocitarios humanos) de clase II en pacientes seropositivos y

seronegativos para Borreliosis de Lyme, encontrando que HLA-DR7 estaba asociado a

la producción de anticuerpos contra la espiroqueta y presente en sujetos seropositivos,

mientras que HLA-DR1, presente en sujetos seronegativos, no se asociaba a la

producción de anticuerpos antibacterianos. Ellos concluyen que la presencia o ausencia

de anticuerpos frente a B. burgdorferi pueden estar asociada a tipos específicos de

antígenos HLA de clase II. Sería interesante realizar un estudio similar en los pacientes

seronegativos de la localidad que tienen manifestaciones asociadas a la enfermedad.

Otros estudios que intentan explicar la razón de la seronegatividad en individuos

con clínica de Borreliosis de Lyme, señalan que puede ser debida al secuestro de los

anticuerpos en complejos inmunes con los antígenos que inicialmente desencadenaron

su producción. La disociación de estos complejos libera principalmente anticuerpos

reactivos para el antígeno 41 kD y en ocasiones para un antígeno aproximado al 30 Kd

(Schutzer y col., 1990; Brunner, 2001)

Según un estudio llevado a cabo por Tugwell y col., antes de realizar pruebas de

detección de anticuerpos contra B. burgdorferi se debe valorar la probabilidad pretest

36

para la enfermedad. Si los síntomas y signos no son específicos de la patología y se

procede de un área de baja endemicidad, la probabilidad pretest es baja (<0.20). En

este caso, las pruebas serológicas arrojarán más resultados falsos positivos, que

verdaderos positivos (Tugwell y col., 1997; American Collegue of Physicians, 1997).

Hasta tanto no se lleven a cabo estudios de seroprevalencia en la región, con una

población representativa, no es posible considerar el planteamiento anterior.

Por otro lado, algunos autores expresan que en ausencia de síntomas y signos

clínicos típicos, las pruebas de detección de anticuerpos para B. burgdorferi tienen un

valor limitado (Blaauw y col., 1999). En los pacientes con clínica fuertemente sugestiva

de la enfermedad (EM, ACA, artritis crónica) es más probable que la serología sea

positiva, en particular si están en la etapa tardía, como los incluidos en este estudio. Por

el contrario en aquellos con manifestaciones que no están claramente asociadas a la

infección, la interpretación de los resultados debe ser cautelosa (Brown y col., 1999).

Este es el caso de la asociación entre morfea y Borreliosis de Lyme, la cual permanece

sin aclarar.

Desde que la relación entre B. burgdorferi y morfea fue sugerida por primera vez

en 1985 por Aberer y col., muchas investigaciones han sido conducidas para establecer

una posible asociación entre ambas patologías. Algunos estudios, la mayoría europeos,

usando diferentes técnicas como inmunohistoquímica (Aberer y Stanek, 1987), cultivo

(Aberer y col., 1987; Weber y col., 1988; Breier y col., 1999), serología (Aberer y col.,

1987; Aberer y col., 1991; Nakashima y col, 1999; Wojas-Pelc y col., 2002) y reacción

en cadena de la polimerasa (Schempp y col., 1993; Ozkan y col., 2000) han

demostrado dicha asociación. Por el contrario, los estudios realizados en Norteamérica

han fallado en ese propósito (Dillon y col., 1995; De Vito y col., 1996; Fujiwara y col.,

1997).

La asociación entre las diferentes manifestaciones clínicas de Borreliosis de

Lyme y las distintas genoespecies de B. burgdorferi puede parcialmente explicar estos

resultados controversiales. Balmetti y Pifferetti reportaron asociación entre síntomas

cutáneos (EM, ACA) y la genoespecie B. afzelii. Fujiwara y col., detectaron B. afzelii y

37

B. garinii (genoespecies Europeas), pero no B. burgdorferi sensu stricto, en biopsias de

pacientes de Alemania y Japón con morfea, usando reacción en cadena de la

polimerasa. Es importante señalar que la genoespecie predominante en Norteamérica,

B. burgdorferi sensu stricto, no ha sido relacionada hasta la fecha, con manifestaciones

cutáneas de la enfermedad (Schmidt, 1997).

En el estudio realizado previamente en la región por Arocha-Sandoval y col., el

54,5% de las muestras positivas mediante ELISA (elaborado con la cepa B31 de

B. burgdorferi), correspondió a individuos con morfea, mientras que en la presente

investigación, dos de las tres muestras ELISA positivas también correspondieron a

sujetos con morfea.

Los resultados negativos en el ensayo IgG WB de este estudio, la falta de

confirmación mediante inmunoblot de los resultados previamente detectados en el

Estado y la ausencia de amplificación del ADN bacteriano en las biopsias de piel de

pacientes con morfea, nos llevan a considerar la posibilidad de que los resultados

obtenidos por el grupo de Arocha-Sandoval sean falsos positivos, debidos a reactividad

cruzada.

Los datos obtenidos en este estudio no soportan la evidencia de infección por B.

burgdorferi en los pacientes estudiados, pero tampoco excluyen la posibilidad de la

existencia de una genoespecie distinta de B. burgdorferi sensu stricto, de una especie

de borrelia diferente del complejo B. burgdorferi sensu lato o de otro organismo

espiroquetal, como el agente causal de Borreliosis de Lyme en Sudamérica. Un estudio

realizado en Colombia reportó reactividad parcial en el suero de pacientes con sífilis y

escleroderma localizada, aportando evidencia de una posible asociación entre las

lesiones escleróticas y un organismo espiroquetal (Palacios y col., 2003).

También es importante señalar que la población de pacientes estudiada fue

pequeña, resultando pertinente llevar a cabo otro estudio con una mayor población,

para obtener conclusiones definitivas.

38

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en este estudio no soportan la evidencia de infección

por B. burgdorferi en los pacientes estudiados, pero tampoco excluyen la posibilidad de

la existencia de una genoespecie distinta de B. burgdorferi sensu stricto, de una

especie de borrelia diferente del complejo B. burgdorferi sensu lato o de otro organismo

espiroquetal, como el agente causal de Borreliosis de Lyme en la localidad.

39

RECOMENDACIONES

En vista de que los resultados obtenidos en la presente investigación no permiten

descartar definitivamente la presencia de la infección por B. burgdorferi, se recomienda

la realización de nuevos estudios dirigidos a la documentación de la infección en las

garrapatas consideradas vectores potenciales de la enfermedad en la región. Así

mismo, sería ideal llevar a cabo un estudio para intentar aislar la espiroqueta mediante

cultivo bacteriano de muestras humanas y si éste es positivo, realizar posteriormente la

extracción de un antígeno bacteriano que se utilizaría para la elaboración de un nuevo

ensayo ELISA. Finalmente se recomienda la realización de estudios para evaluar la

respuesta inmunitaria celular frente a la bacteria en pacientes con sospecha de la

enfermedad.

40

LISTA DE TABLAS

1 Relación entre la positividad de la prueba ELISA y las entidades clínicas sugestivas de Borreliosis de Lyme.

31

2 IgG Western Blot de las muestras estudiadas 32

41

42

LISTA DE FIGURAS

1 Secuencia del gen de la flagelina de la cepa B31 de B. burgdorferi.

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2 Electroforesis en gel de agarosa de ADN de piel de pacientes con escleroderma localizada (morfea)

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3 Electroforesis en gel de agarosa de ADN de piel de pacientes con escleroderma localizada (morfea)

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