Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo

Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo

REPORTE DE PRCTICA #4Determinacin de hemaglutininas en leguminosasObjetivoDeterminar la presencia de hemaglutininas en leguminosas y su efecto en glbulos rojos humanos o en otras especies animales.IntroduccinLa hemaglutinina (HA) es una protena que se sita en la capa ms externa del virus, (la envoltura del virus). Ella reconoce un azcar de nuestra membrana celular, el cido silico, y es la responsable por el reconocimiento y unin del virus a nuestras clulas del sistema respiratorio (Iamarino, 2009).Su nombre viene de esta capacidad de reconocer y unirse a las clulas y aglutinar hemates (los glbulos rojos de la sangre), una de las primeras pruebas desarrolladas para diagnosticar el virus. Su numeracin es dada con base en la variacin de los aminocidos y son conocidos ms de 15 tipos de HA, siendo H1, H2 y H3 las ms comunes en virus que infectan a los humanos (Iamarino, 2009).

Marco terico

Las lectinas son protenas, las cuales han sido encontradas en una gran variedad de plantas, especficamente en leguminosas (frijol, etc). Una de las principales caractersticas de estos compuestos es su habilidad de aglutinar clulas rojas de diversos animales. A las lectinas, se les ha atribuido un efecto altamente toxicolgico, dependiendo de su origen, afectando principalmente al sistema gastrointestinal de humanos y de animales de laboratorio.Debido a su especificidad hacia ciertos azcares, se les ha dado cada vez mayor importancia en diversas reas de la ciencia. A estas protenas se les conoce como, hemaglutininas, fitohemaglutininas y como lectinas. Estas lectinas son protenas termolbiles, por lo cual, cuando son expuestas a determinadas condiciones de calor, la protena pierde su estructura cuaternaria y con ello su actividad biolgica.Desarrollo de la prcticaPreparacin de reactivos:Buffer de fosfatos-salino pH 7.4, 0.01M (PBS)

Para la preparacin de este buffer se requirieron los siguientes reactivos:

Fosfato monobsico de potasio 0.2 M (Sol. A)

Fosfato dibsico de Potasio 0.2 M ( Sol. B )

Cloruro de sodio 4 MSol. A: 27.22 g de fosfato monobsico en 1 L de agua

Sol. B: 34.84 g de fofato dibasico en 1 L de agua

NaCl: 116.88 g de NaCl en 500 mL de agua En un vaso se agreg 95 mL de sol. A, 405 mL de sol B, 75 mL de NaCl y 8 mL de azida, se aadi agua hasta casi un litro, se ajust el pH a 7.4 con HCl o KOH, posteriormente se ajust el volumen a 2 lt.Preparacin del extracto

La muestra fue perfectamente molida. Se pes 1 g de harina y se coloc en un vaso de pp. de 50 mL, se agregaron 10 mL de PBS y se dej en agitacin por 16 h a 4C. Al termino de este tiempo se pas la solucin a tubos de centrifuga. A continuacin, se centrifug por 20 min a la mayor velocidad posible. Preparacin de EDTASe prepar una solucin de EDTA al 2% en agua a un pH 7.0, empleando NaOH 1 M para ajustar el pH.Preparacin de eritrocitos Se tom una muestra de 5 mL de sangre de la vena perifrica y se agregaron inmediatamente 4 gotas de EDTA al 2%, se mezcl con mucho cuidado y posteriormente se centrifug a 2000 rpm por 10 min. Se separ el suero del paquete globular y posteriormente se procedi a lavar los eritrocitos con PBS 3 veces. Al final de las lavadas, se resuspendieron los eritrocitos con PBS para tener una solucin al 2% de eritrocitos en el PBS.

Soluciones para la tcnica de Lowry

A.Carbonato de sodio al 2% en agua destilada.B.Sulfato de cobre al 0.5 % en solucin de citrato de sodio 1%.C.50 partes de solucin A + 1 parte de solucin B (preparar inmediatamente antes de su uso).

D.Reactivo de Folin: Diluir en agua 1:3 inmediato a su uso.E.NaOH 0.1N en agua.F.Estndar de albmina bovina (400 g/mL) para la curva de calibracin.Procedimiento: DETERMINACIN DE PROTENA SOLUBLE EN LA MUESTRASe trabaj con semillas de frijol

0.5 g de la muestra + 0.5 mL de sol E, agitar y dejar reaccionar por 30 min.Agregar 5 mL de sol C, agitar y dejar reposar 10 min.Agregar 0.5 mL de sol D, agitar perfectamente y dejar reposar 45 min a temperatura ambiente.

Leer absorbancia a 750 nm.

Clculos:No. de TuboConcentracin (mg/mL)Absorbancia (750 nm)

10.0050.047

20.0110.112

30.0210.162

40.0320.248

50.0430.309

60.0530.352

Muestra 0.158

Regresin lineal

Concentracin de la muestra analizada

Procedimiento: ACTIVIDAD HEMAGLUTINANTE DE LECTINASSe colocaron 12 tubos de hemlisis en una gradilla. A cada tubo se agregaron 0.5 mL de PBS. Al tubo nmero 1 se agregaron 0.5 mL de extracto y se hicieron diluciones seriadas siguiendo la numeracin de los tubos, los ltimos 0.5 mL son desechados.

Posteriormente a cada tubo se le agregaron 0.5 mL de sol de eritrocitos y se agitaron suavemente. Se dejaron en incubacin por 1 h a temperatura ambiente, y al trmino de este tiempo, se observ la aglutinacin de cada tubo, anotndose la mayor dilucin que produce aglutinacin, la cual se conocer como valor n, y el ttulo de aglutinacin se reporta como 2n.

Clculos:Ejemplo: Calculo del ttulo de aglutinacin. Si el valor n = 8 se calcula 2 8.

Una vez que se tiene el ttulo de aglutinacin y el contenido de protena soluble (mg de/0.5 mL) se calcula la actividad especfica de las lectinas dividiendo el ttulo de aglutinacin entre el contenido de protena.

Los tubos que presentaron mayor aglutinacin fueron los que contenan las disoluciones 6 y 8 respectivamente.A) 26B) 28 Calculo de la actividad especfica de las lectinas

A) 26 / = 3200B) 28 / = 12800ConclusionesSe determin la presencia de hemaglutininas en leguminosas y su efecto en glbulos rojos humanos. La aglutinacin de eritrocitos humanos se identific en todos los tubos con las respectivas diluciones evaluadas. Se registr una discreta actividad hemaglutinante, la cual es afectada por factores como la concentracin del extracto, el tiempo y el tipo de eritrocitos utilizados.La actividad hemaglutinante detectada en el extracto indica la presencia de substancias que tienen esta propiedad y resalta la importancia que tiene el estudio de dichas sustancias en el rea de toxicologa alimentaria. Bibliografa

Iamarino, A. (12 de 09 de 2009). Biblioteca virtual en salud. Obtenido de Molcula del mes presenta: Hemaglutinina y Neuraminidasa: http://blog.h1n1.influenza.bvsalud.org/es/2009/09/12/molecula-del-mes-presenta-hemaglutinina-y-neuraminidasa/

Instituto de Ciencias Bsicas e Ingeniera

Licenciatura en Qumica en Alimentos

7 Semestre

Toxicologa de Alimentos

Reporte de prctica: Determinacin de hemaglutininas en leguminosas

Integrantes de Equipo:

Alba Iris Njera Garca

Sandibel Montao Franco

Itzamara Hernndez Hernndez