CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS NO. 128

Práctica 2. Utilización de medios de cultivo y técnicas de tinción.

Sub módulo 3: Ejecuta técnicas de identificación de Microorganismos con base a las normas.

Integrantes: González Pizarro Lesly, Hernández Espinoza Nayelli, Hernández Holguín Alan, Herrera López

Hassel, Jiménez Cota Fabiola, Lagunas Jaime Itzel, Lira Torres Vanessa, Mata Toledo Lucero, Meléndez

Morales Araceli.

Facilitadora: Ing. Acosta Jessica.

Fecha: Inició el 28 de Septiembre de 2014; terminó el 8 de Octubre de 2014.

Introducción

Un medio de cultivo es una solución que contiene los

nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en

condiciones físicas óptimas, permite el crecimiento

de los microorganismos. Entre las condiciones

generales que se deben considerar para cultivar

microorganismos están: disponibilidad de nutrientes

adecuados, consistencia adecuada del medio,

presencia o ausencia de gases (como el oxígeno),

condiciones adecuadas de humedad, luz ambiental,

pH, temperatura y esterilidad del medio.

La tinción es una técnica en la que se utilizan

diferentes colorantes, que son captados por las

estructuras de los microorganismos que se observan

al microscopio, siendo cada estructura a fin a un tipo

determinado de colorante, por lo que se pigmentan

de diferente color y se pueden diferenciar e

identificar.

La tinción de Gram sirve para identificar las bacterias

Gram positivas o Gram negativas.

Los colorantes tiñen la pared de las bacterias de

color morado y, tras unos minutos, se realiza un

lavado del colorante. Después de eso puede que el

colorante permanezca en la pared bacteriana o que

se haya ido. En el primer caso se habla de Gram

positivas y, en el segundo, la pared tendría un color

rosado, y se habla de Gram negativas.

En esta ocasión se empleó el agar nutritivo y el EMB

para cultivar Escherichia coli. Tomando muestra y

observándola con ayuda de la tinción de Gram.

Resumen

En primer lugar, el material se esterilizó. Luego, se

preparó un medio nutritivo y un medio EMB en una

cantidad de 400 ml cada uno.

Estos fueron esterilizados junto con las placas de

Petri necesarias. En este caso, los microorganismos

se cultivaron a partir de heces. Una vez que se

obtuvo la muestra, se disolvió en agua y se sembró

sobre tres placas de Petri con medio EMB (eosina y

azul de metileno) y en otras cuatro placas de Petri

con medio nutritivo.

Los medios de cultivo se incubaron durante 3 días,

cuando se decidió trabajar con ellos, se colocaron

tres mecheros Bunsen en forma de triángulo y se

mantuvo el fuego regulada para evitar la entrada de

agentes contaminantes al medio de cultivo.

Se observó que crecieron diferentes tipos de

bacterias, incluyendo varios tipos de hongos (que

indican la contaminación del medio de cultivo), a

pesar de esto, era inició el análisis de la morfología

de la colonia. En los medios nutritivos crecieron un

promedio de 240-2232 colonias y en los medios de

EMB no era posible contar las colonias, porque éstas

no crecieron correctamente. En los medios de EMB,

crecieron algunos hongos de diferentes colores

(verde y naranja) y estos eran difíciles de contar.

Las colonias en los medios nutritivos tenían una

superficie convexa, era punteada e irregular, y su

borde era redondo.

Después de eso, se realizó la tinción de Gram. Para

ello, una pequeña muestra de cada cultivo fue

colocada sobre un portaobjetos con una gota de

agua. Luego, la muestra fue fijada mediante un

mechero Bunsen. La tinción se realizó con 1 gota de

diferentes sustancias: cristal violeta, yodo-lugol,

alcohol-cetona y safranina. Después, se colocó una

gota de aceite de inmersión y un cubreobjetos

rápidamente, para hacerla visible en el microscopio.

En la mayoría de las muestras, se observaron

bacterias Gram negativas.

Abstract

First, the material was sterilized. Then, a Nutritious

medium and a EMB medium was prepared in an

amount of 400ml each one.

Those were sterilized together with the necessary

Petri dishes. In this case the microorganisms were

cultured from feces. Once the sample was obtained,

this was dissolved in water and streaked on three

Petri dishes with medium EMB (Eosin and Methylene

Blue) a culture and in other 4 Petri dishes with

medium Nutritious.

The culture media were incubated for 3 days, when

it was decided work with them, were placed three

bunsen burners in form of triangle and was

maintained the fire regulated to prevent the entry of

contamination agents to the culture media.

It was noted that grew different types of bacteria

including several types of fungus (which indicated

contamination of the culture medium), despite this,

was began the colony morphology analysis. In the

Nutritious media grew an average of 240-2232

colonies and in the EMB media wasn't possibly count

the colonies, because these don't grew properly. In

the EMB media, grew some fungus of different colors

(green and orange) and these were difficult to count.

The colonies in the Nutritious media had a convex

surface, was punctate and irregular, and its edge was

round.

After that, was performed the staining Gram. To do

this, a small sample of each culture was placed on a

slide with a drop of water. Then, was set using a

bunsen burner. Then, the staining was performed

with 1 drop of different substances: crystal violet ,

iodine-Lugol, alcohol-ketone and safranin. After, was

placed a drop of immersion oil and a coversl ip

quickly, to make it visible in the microscope. In the

most samples, were observed Gram negative

bacteria.

Materiales y métodos

Materiales

Cajas Petri

Espátula

Balanza

Asas de platino

Mechero de Bunsen

Matraz Erlenmeyer

Heces fecales

Agar nutritivo

Agar EMB

Porta objetos

Cubre objetos

Microscopio

Mangueras de látex

Capsula de porcelana

H2O

Vidrio de reloj

Agitador

Cristal Violeta

Yodo-Lugol

Alcohol-Cetona

Aceite de inmersión

Safranina

Métodos

Técnicas de Vaciado

En este método se vierte en un matraz Erlenmeyer

un Agar nutritivo y en otro un agar EMB mezclándolo

con un poco de agua, luego se coloca al fuego del

mechero de Bunsen y se agita hasta conseguir una

tonalidad amarilla cristalina (en el caso del agar

nutritivo) y una morada (en el caso del agar EMB). Al

obtener este color, se cubren los matraces y se dejan

reposar. Luego, deben de ser colocados junto con

las placas Petri (previamente envueltas) en una olla

de presión para esterilizar el material. Una vez ya

esterilizados, los agares son vertidos sobre cada

placa Petri (40 ml por cada placa) con cuidado y

dentro de un triángulo de mecheros de Bunsen.

Métodos de estriado

Luego de vaciar los agares, es necesario dejar que

estos se cuajen en las placas. Cuando ya estén

solidificadas, en un vidrio de reloj se vierte una

muestra de heces fecales, mezclándolas con un

poco de agua. Luego se toma una gota de la muestra

de heces con las asas de platino y sobre el medio de

cultivo se comienza a estriar de manera continua

(primero se levanta un poco la tapa y se hace un

estriado, luego se gira 90° la placa y se realiza otro

estriado, y así sucesivamente). Después de estriar

todas las placas, están deben de ser colocadas en

las placas.

Morfología de colonias

Una vez que aparecen las colonias en los medios de

cultivos, es necesario hacer un análisis acerca de la

morfología de colonias, que consiste en contar las

colonias presentes e ir tomando en cuenta cada uno

de sus aspectos tales como la forma, borde,

superficie, color, numero de colonias etc.

Tinción Gram

En este método, se coloca en un portaobjetos una

gota de agua destilada, luego se toma una muestra

de cualquier colonia existente en el agar y se dejaba

secar por un tiempo. Una vez seca debe de ser fijada

pasado la muestra por encima del mechero de

bunsen. Después se le agrega 1 gota de cristal

violeta y se deja reposar por 1 min. Luego de esto se

enjuagaba muy bien para poder verter 1 gota de

Iodo-Lugol dejándolo reposar por 1 min. Se vuelve a

enjuagar y se vierte 1 gota de alcohol-cetona

dejando reposar por 30 segundos y se vuelve a

enjuagar, después se agrega 1 gota de safranina, se

espera 30 segundos y se enjuaga. Por último se le

agrega 1 gota de aceite de inmersión a la muestra y

se cubre con un cubreobjetos para poder verlo en un

microscopio a 100X y realizar el análisis de la

morfología de las bacterias presentes en los cultivos.

Resultados

Al realizar toda la esterilización necesaria en los

instrumentos y siguiendo los requerimientos de la

práctica, los resultados se dieron conformé los días,

ya que el cultivar agares no quiere decir que estos

tendrán reacciones de una hora a otra, si no, estos

necesitan de al menos 2 días para lograr ver sus

resultados, los efectos y/o reacciones que tuvieron.

Por ejemplo, en los agares nutritivos se observó que

estos, junto con los desechos fecales, poseen cocos

y bacilos que solo son visibles con la ayuda de un

microscopio y de una tinción, en este caso la tinción

de Gram, entonces en ello se captó toda su

morfología como fue que uno llego a tomar una

superficie plana convexa, con una forma puntiform e

de color blanco-amarillento, con un borde redondo y

al menos 240 colonias en él. Como ya se había

mencionado a su vez este en este agar nutritivo

llegaron a crecer cocos y bacilos. Aunque en otros

agares no se logró captar nada ya que al no estriarse

bien crecen hongos de gran tamaño y esto llega a

afectar lo que se quiere determinar, que serían los

estreptococos.

Morfología de cultivos

Morfología de bacterias

Conclusiones

González Pizarro Lesly: Al momento de estar

desarrollando esta práctica, se obtuvieron diversos

conocimientos, desde la preparación de un agar,

como se debe vaciar correctamente el agar a la

placa, los métodos de estriados para poder obtener

un crecimiento de colonias esparcidas y que sean

posibles de contar a simple vista, obteniendo

diferentes resultados en cuanto a los números de

MEDIO FORMA COLOR SUPERFICIE

BORDE COLONIAS

Nutriti

vo 1

Puntif orme Blanco Plana Redondeado 240

Nutriti

vo 2

Puntif orme Blanco Conv exa Redondeado

120

Nutritivo 3

Puntif orme Blanco Conv exa Redondeado 114

Nutriti

vo 4

Puntif orme Blanco

amarillento

Plana Redondeado 2232

EMB 1 Irregular Morado Conv exa Redondeado (Grupos grandes de

colonias)

Irregular Verde

metálico

Plana Indef inido 1

EMB 2 Irregular Morado Conv exa Redondeado (Grupos grandes de

colonias)

Irregular

Verde

metálico

Plana Indef inido 1

EMB 3 Irregular Morado Conv exa Redondeado (Grandes grupos de

colonias)

Irregular

Verde

metálico

Plana Indef inido 2

Medio Color de

la colonia

Forma

de la bacteria

Tipo de

bacteria

Nutritivo 1

Blanco Bacilos Gram positiva

Nutritivo

2

Blanco Bacilos Gram positiva

Nutritivo 3

Blanco Bacilos Gram positiva

Nutritivo 4

Blanco amarillento

Cocos Gram positiva

colonias, y a el crecimiento de ellas, ya que en

diversas placas crecieron bacterias y hongos no

deseados esto por el mal desarrollo de la práctica.

Por mi parte el medio de cultivo con el que estuve

trabajando, el método de estriado fue bueno, sin

embargo falta más practica ya que debido a que el

estriado fue demasiado esparcido en las orillas de la

práctica, crecieron miles de colonias muy pequeñas,

dando como resultado 2232 colonias, después de

terminar el conteo, se prosiguió con la morfología de

las bacterias y por último se terminó de nuevo con la

esterilización de las placas para poder eliminar las

bacterias y retirar el agar.

Hernández Espinoza Nayelli: Se puede concluir

que ay que tener mucho cuidado con los cultivos

bacterianos , un medio de cultivo es un desarrollo

microbiano, dándonos cuenta que se pueden

desarrollar hongos, bacterias de todo tipo , forma,

tamaño etc..

Como ya hemos experimentado las bacterias se

encuentran en todos lados y no se ven a simple vista

ni fácilmente, y el crear nuevos hábitos de higiene.

La higiene es un factor muy importante tanto para el

que hace la práctica como para los materiales e

instrumentos que se vallan a utilizar ya que estos

deben estar muy bien esterilizados y el preparar los

agares con cuidado y precaución.

Hernández Holguín Alan: La utilización de los

medios de cultivo es esencial en la microbiología, ya

que, por medio de estos es posible observar las

características de los cultivos y la morfología que

presentan diversos tipos de bacterias, así como

realizar análisis que permitan identificar diversos

tipos de microorganismos. También es importante

conocer las medidas de seguridad y los

procedimientos necesarios para preparar medios de

cultivo y utilizarlos para generar colonias de

bacterias, ya que si no se siguen las normas

apropiadas, no se llegaran a los resultados

deseados y pueden producirse problemas de salud

debido al mal manejo de los medios. En conclusión,

es necesario ser cuidadosos, conocer y seguir los

procedimientos adecuados, y tomar medidas de

seguridad al momento de emplear medios de cultivo

para evitar accidentes y evitar la propagación de

bacterias patógenas presentes en los cultivos.

Herrera López Hassel: Llego a la conclusión de que

el agar nutritivo fue un buen medio para cultivar

bacterias de estreptococos y que el método de

sembrado por estriado facilita el conteo de colonias

y que la técnica de tinción Gram auxiliar en la

identificación de bacterias.

Jiménez Cota Fabiola: Mi conclusión respecto a

esta práctica seria que al ver los métodos y

procedimientos que se realizan para hacer un agar o

medio de cultivo son cosas muy extraordinarias

porque el ver y saber cómo se prepara un agar no es

algo muy usual, ver qué tipo de consistencia toma y

la manera de estriar con heces fecales y observar lo

que sucede en ello, observar cuantas colonias

produce sus formas, colores que hasta en ellos

vimos que producían hongos, también el saber que

de tan poca muestra se pueden conseguir miles de

colonias que nunca imaginarias, ya por ultimo

observar las tinciones que se realizan para poder

observar que tipos de bacterias obtuviste en tu

muestra, e nuestro caso obtuvimos Gram positivas

ya que las diferenciábamos por su tonalidad que se

veía al observarlas en un microscopio a 100X.

Lagunas Jaime Itzel:

Lira Torres Vanessa: Un medio de cultivo es un

conjunto de nutrientes de crecimiento que propicia

un desarrollo microbiano. Claro está que existen

diversos tipos de medio de cultivo y en este caso el

utilizado fue solido ya que como cualquier otro tipo

de medio de cultivó es importante reconocer los

estreptococos que pueden crecer en ellos y así

poder determinar lo que son y por su puesto ver

cómo están conformados y así saber si son Gram

positivos o Gram negativos.

De igual manera la esterilización es uno de los

puntos más importantes que se debe resaltar ya que

si no se tiene un buen uso de ello, los medios de

cultivo no tendrían un desarrollo como el que se

desea obtener, debido a que los instrumentos y/o

materiales están contaminados y eso afectaría a la

práctica, también es uno de los principales pasos

para llegar realizar un buen agar aparte de saber

estriar de una manera adecuada.

Mata Toledo Lucero: Esta práctica nos ayudó a

preparar un medio de cultivo, identificar los

diferentes tipos de bacterias que pueden crecer en

cada medio de cultivo y a diferenciar entre las Gram

positivas y Gram negativas.

Esto es de gran importancia en nuestro aprendizaje

como Laboratoristas químicos, y tiene como finalidad

enseñarnos lo que debemos hacer al momento de

cultivar una bacteria de una manera segura y eficaz.

Debemos tomar en cuenta las medidas de seguridad

necesarias para evitar infecciones ya que las

bacterias que crezcan pueden ser muy dañinas para

nuestra salud. Al final obtuvimos buenos resultados,

no los esperados ya que crecieron algunas bacterias

no deseadas pero de igual forma esto nos dejó una

gran enseñanza de acuerdo a lo que hicimos durante

el tiempo estimado de la práctica.

Meléndez Morales Araceli: Durante la práctica

pudimos observar que en las en condiciones físicas

óptimas, permite el crecimiento de los

microorganismos los medios de cultivo, es un tema

muy interesante que nos permite observar la vida de

microorganismos que obviamente no podemos ver si

no es a través de un microscopio, además de

preparar el medio de cultivo, realizamos el estriado

en forma t para sembrar las bacterias de la E. coli de

la manera adecuada, después nuestros medios de

cultivo en las cajas Petri con nuestro estriado ya

realizado fueron guardadas en la incubadora

después de unos días pudimos observar nuestras

colonias de bacterias ya realizadas, después de

contar e identificar nuestras bacterias realizamos la

esterilización de nuestras cajas Petri y luego el

lavado para secar y luego secar y entregar, fue una

práctica que nos otorgó conocimientos nuevos.

Discusión

En esta práctica, se desarrollaron diversos

conocimientos, se aprendió a preparar los medios de

cultivo y a como esterilizarlos junto con los

instrumentos que se ocuparon en el proceso,

después de entender y poner en proceso la

esterilización se estuvo estudiando la morfología de

las colonias que crecieron a partir de la muestra de

excremento de un perro. Creciendo así diferentes

bacterias y hongos que se desarrollaron al momento

de introducir el medio de cultivo en la incubadora,

durante aproximadamente 72 horas. Se llevaron a

cabo la tinción de Gram a partir de una pequeña

muestra de cada uno de los medios de cultivo, para

poder llegar a la determinación exacta de la

morfología de bacterias determinando si eran Gram

positivas y Gram negativas. Al final se cumplió el

objetivo de la práctica, el cual era aprender a

emplear los medios de cultivo correctamente, los

métodos de vaciado, las técnicas de estriado y

determinar correctamente la morfología de colonias

y bacterias.

Bibliografía

FACULTAD DE AGROINDUSTRIAS. (2006).

Trabajo Práctico Nº 4 Medios de Cultivo.

12/10/2014, de Universidad Nacional del Nordeste.

Sitio web:

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf

Anexos

Cultivos

Un cultivo es un método para la multiplicación de

microorganismos, tales como bacterias, hongos y

parásitos, en el que se prepara un medio óptimo para

favorecer el proceso deseado. Un cultivo es

empleado como un método fundamental para el

estudio de las bacterias y otros microorganismos que

causan enfermedades en medicina humana y

veterinaria.

Un microorganismo se puede sembrar en un medio

líquido o en la superficie de un medio sólido de agar.

Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes

que van, desde azúcares simples hasta sustancias

complejas como la sangre o el extracto de caldo de

carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana

a partir de una muestra formada por muchos tipos de

bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido

donde las células que se multiplican no cambian de

localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada

bacteria individual genera por escisión binaria una

colonia macroscópica compuesta por decenas de

millones de células similares a la original. Si esta

colonia individual se siembra a su vez en un nuevo

medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de

bacteria.

La principal diferencia entre un medio de cultivo

sólido y uno líquido es que el medio de cultivo sólido

contiene un 1,5–2% de agar-agar, mientras que el

medio líquido no contiene agar-agar.

Los diferentes medios y técnicas de cultivo son

Esenciales en un laboratorio de microbiología de un

hospital, pues sirven para identificar las bacterias

causantes de las enfermedades infecciosas y los

antibióticos a los que son sensibles esas bacterias.

Los cultivos suelen usarse en medicina para

determinar la presencia de agentes patógenos en

fluidos corporales (como por ejemplo la sangre o la

orina).

Uno de los sistemas más importantes para la

identificación de microorganismos es observar su

crecimiento en sustancias alimenticias artificiales

preparadas en el laboratorio. El material alimenticio

en el que crecen los microorganismos es el Medio de

Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el

Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de

cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en

un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de

condiciones como son: temperatura, grado de

humedad y presión de oxígeno adecuado, así como

un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio

de cultivo debe contener los nutrientes y factores de

crecimiento necesarios y debe estar exento de todo

microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren

nutrientes complejos similares en composición a los

líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la

base de muchos medios de cultivo es una infusión

de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán

otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificarte muy empleado

para la preparación de medios de cultivo. Se licúa

completamente a la temperatura del agua hirviendo

y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas

excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de

las bacterias y no es atacado por aquellas que

crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificarte pero se

emplea mucho menos ya que bastantes bacterias

provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran

numerosos materiales de enriquecimiento como

hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis,

etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos

motivos fundamentales: para incrementar el valor

nutritivo del medio y para detectar reacciones de

fermentación de los microorganismos que ayuden a

identificarlos. El suero y la sangre completa se

añaden para promover el crecimiento de los

microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como

indicadores para detectar, por ejemplo, la formación

de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas

bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como

indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en

pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como

inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría

de las bacterias Gram-positivas).