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Replicacin del ADN

Universidad de Morn Gentica Molecular - 2016

Replicacin del ADN

- Proceso esencial del cual dependen todas las formas de vida

- Es necesaria para la divisin celular -> generacin de nuevosorganismos (unicelulares) o de nuevas clulas en un tejido

(multicelulares)

- La secuencia de bases nucleotdicas existente en cada molcula

larga de la doble hlice de ADN debe duplicarse con precisin para

generar una copia de la molcula original

Watson y Crick: 1 ao despues de publicar el modelo de la doble hlice,

describieron un modelo para la replicacin del ADN

Hiptesis de replicacin de Watson y

Crick (1954)

- Se separan ambas hebras

- Se aparean nucletidos a cada hebra de

manera complementaria

- Los nucletidos se unen entre si por

accin de una o mas enzimas

- Resultante: 2 replicas, cada una con una

hebra parental y una hija -> proceso

semiconservativo

El experimento de Meselson-Stahl (1958) confirm la hiptesis de la replicacin

semiconservativa de Watson y Crick

E. coli cultivadas en un medio con un radioisotopo pesado (alta densidad

en gradientes de cloruro de cesio) -> se transfieren a medio liviano, sin

radioisotopo -> 1 : hibridos de densidad intermedia

Cada hebra hija enun hibrido es o

pesada o liviana

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Reaccin de sntesis de ADN

n(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) ADN + nPPiADN polimerasa

Templado de ADN

sustratos productos

Mecanismo de crecimiento de la cadena de ADN

El grupo OH- del nucletido en

el extremo 3reacciona con el

primer fosfato (fosfato a ) del

nucletido entrante.

Se libera pirofosfato

Los nucletidos se aaden en

el extremo 3de la cadena

Los nucletidos se aaden

segn la complementariedad

de bases:

A-T

C-G

Replicacin

Origen de replicacin: Regin generalmente rica en AT donde se inicia el

proceso de replicacin

Horquilla de replicacin: las dos cadenas de la doble hlice se separan y se

comienzan a copiar de manera independiente (cada una en direccin es 5 -> 3:

avanzan en direcciones opuestas: replicacin bidireccional)

Replicn: segmento de ADN que contiene un

origen de replicacin y que se copia como unaunidad

Procariotas:

- Origen de replicacin (Ori) nico

- Rep licn: cromosoma bacteriano

- Se forman dos horquillas de replicacin que avanzan

en ambas direcciones, formando estructuras en forma

de la letra griega tetha (q)

- Cuando se juntan las dos horquetas al finalizar el

crculo, se separan los dos cromosomas resultantes

Eucariotas:

- ADN mucho mas largo que procariotas: (ADN humano: 1,8 m; ADN E. coli:

1,3 mm)

- Mltiples replicones (cada 10 a 100 mm, 40 a 100 kb), cada uno con su

origen de replicacin -> la replicacin es mas rpida que con un origen nico

- Los fragmentos sintetizados por cada replicn se unen con los adyacentes al

encontrarse

Horquetas de replicacin

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Ambas cadenas se copian en direccin 5- 3 : para que la horquilla

de replicacin pueda avanzar: una de las cadenas se copia de

manera continua y la otra discontinua en cada horqueta

cadena lder: sntesis continua

direccin de avance

de la horqueta

cadena retardada: sntesis discontinua

EVENTOS de la REPLICACION

1. Inicio de la replicacin- El origen de replicacin es reconocido por protenas especificas:

- Proteinas especificas que controlan que la replicacin comience

- Helicasas desenrollan la doble hlice

- Topoisomerasas: alivian el superenrollamiento resultante en las

zonas que circundan a la horqueta de replicacion, mediantecortes de un nucleotido unico (nicks). Ej. girasa de ADN

- SSBs: single stranded DNA binding proteins (proteinas de unin a

ADN de cadena simple): mantienen ambas cadenas separadas

2. Primosoma

- La ADN polimerasa necesita de un primer para comenzar la sntesis de una

cadena de ADN (segmento corto de nucletidos complementarios a la

hebra templado)

- La Primasa (bacterias) o ADN polimerasa a(eucariotas) sintetiza primers de

ARN(10 nt aprox). Primasa forma un complejo con otras protenas =

Primosoma

- La ADN polimerasa III (bacterias) o d (eucariotas) agrega nt comenzando enel extremo 3 del primer:

Sntesis de ADN en bacterias

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Sntesis de ADN en eucariotas1) Replisoma: Complejo proteico, contiene ADN polimerasa con

dos sitios cataliticos (para cada una de las cadenas)

Enzima encargada de polimerizacion:

1) Bacterias: ADN polimerasa III

2) Eucariotas: ADN polimerasa

3. Accin del Replisoma

Replisoma : Fabrica de ADN que contiene mas de 30 protenas. El complejo puede estar

unido a la membrana plasmtica. El ADN entraen esta fabrica y es copiado. En

bacterias de crecimiento lento: 2 replisomas, uno en la membrana y otro en el centro de

la clula. En bacterias de crecimiento rpido: 4 o mas replisomas. En eucariotas: mltiples

- Cadena lider: se sintetiza en forma continua- Cadena retardada: fragmentos de Okazaki: 1000-2000 nt

en bacterias y 100 nt en eucariotas

4. Reemplazo de primers de ARN

RNASA H o ADN polimerasa I degrada los primers de ARN. ADN polimerasa I

o III agregan desoxiribonucletidos para llenar los huecos.

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5. Ligacin de fragmentos

Los fragmentos de ADN de la cadena

retardada (o los de distintos replicones

son unidos por una ADN ligasa

Puente fosfodiester entre el OH- del

extremo 3 de la cadena creciente y

el fosfato en posicin 5del fragmento

de Okasaki (o entre el OH- del nt rio

arriba y el fosfato del nt rio arriba)

La ligacin tiene lugar con gasto de ATP

Terminacin de la replicacin

En procariotas

En E. coli: Cuando el complejo de polimerasa llega a un sitio determinacin en el ADN : sitio Ter. La proteina Tus se une a

estos sitios y la polimerasa no puede avanzar -> la replicacin se

detiene -> se separan los dos cromosomas

En muchos procariotas: la replicacin se detiene cuando se

encuentran ambas horquetas -> se separan los dos

cromosomas

Terminacin de la replicacin

En eucariotas

La evolucin resolvi este problema con los telomeros: secuencias

repetitivas (ricas en C + A) que son aadidas en los extremos por unaenzima (telomerasa o transferasa terminal de telomeros )

Al terminar la replicacin: la cadena retardada queda un poco mas corta

(cuando se agrega el ultimo primer de ARN, la polimerasa no puede unirse a

la cadena para reemplazar los ribonucleotidos por nucletidos.

Sin los telomeros, una de las cadenas quedara cada vez mas corta

Los telomeros estabilizan al cromosoma (lo sellan)

Telomerasa: es activa en clulas germinales pero no en clulas adultas. normales

En celulas cancerosas se activa -> se buscan drogas que inhiban a la telomerasa

para combatir el cncer

Sirven para que la celula distinga el fin del cromosoma de un extremo suelto

de ADN (por rotura). Este ultimo debe ser reparado, el telomero no

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Telomeros

Los telomeros siempre tienen la estructura

Cn(A/T)m donde n > 1 y m = 1 a 4

El nmero de repeticiones varia entre organismos, de 100 a 1000

Ej. de telomero

Telomero inicial

Degradacion parcial del

extremo rico en C+A

Los telomeros tienen un extremo de 14 a 16 nt como cadena simple en el extremo, por

degradacin parcial de la hebra rica en C+A

El extremo cadena simple forma un bucle

que estabiliza al cromosoma

Los telmeros son sintetizados por la telomerasa: una enzima compleja formada

por ARN y subunidades proteicas que agrega secuencias repetitivas en los

extremos de los cromosomas

1

2

3

4

5

6

Replicacin extra-cromosmica: crculo rodanteen bacterifagos, viroides y plsmidos

En fago l: varias vueltas de replicacin alrededor del

templado circular: se forma un concatamero, que

luego se cliva en unidades individuales y se

empaqueta

Replicacin de ADN de mitocondrias y cloroplastos

- La apertura de un dplex no conduce de forma necesaria al comienzo de

la replicacin en la otra cadena.

- La replicacin es unidireccional.

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Polimerasa No subunidades Funcion

Pol I 1 Remocion de primers de

ARN, reparacion

Pol II 1 Reparacion de ADN

Pol III (holoenzima) 9 Replicacion de ADN

Pol IV 1 Reparacion de ADN.

Sintesis trans-lesion (TLS)

Pol V 3 TLS

ADN polimerasas en procariotas: E. coli

ADN polimerasas deeucariotas

Procesividad de una ADN polimerasa: nmero de nucletidos que puede

incorporar a una cadena de ADN en formacin antes de disociarse del

templado. La eficiencia de sintesis de ADN es proporcional a la

procesividad de la polimerasa

Las ADN polimerasas aumentan su procesividad al asociarse a protenas

llamadas clamp = abrazaderas. Estas tienen una forma de anillo que rodea al

ADN. El hueco del anillo tiene cargas positivas. La abrazadera interactua con el

ADN pero no se une a el, permitiendo que la ADN polimerasa se desplace por lacadena sin desprenderse.

El ADN es cargado a la abrazadera por otra proteina: clamp loader (cargador

de abrazadera): abre la abrazadera, la carga al ADN (luego del agregado de un

primer de ARN) con gasto de ATP y luego la descarga en un momento apropiado

Es un mecanismo conservado en bacterias, arquibacterias y eucariotas y ocurre

en la cadena lider y la retardada.

Abrazadera, cargador de abrazadera y ADN polimerasa

cargador de laabrazadera

dos mitades dela abrazadera

deslizante

ADN polimerasa

ADN polimerasa unida al ADN