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23/08/2009
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Relación Dosis/Respuesta y Ensayos de Toxicidad en
Animales
Liz María Vega VillalobosII Semestre 2009
Toxicología
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Relación Dosis/Respuesta:Individual o Graduada
Es el espectro de los efectos tóxicos y las características de la exposición unidas en una relación correlativa.
Existen 2 tipos de relaciones:
• Individual (r/ de un organismo individual a ≠ D del químico)
• Cuantal (distribución de r/ individuales a ≠ D en una población)
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Relación Dosis/Respuesta:Individual o Graduada
• Pero para la mayoría de agentes químicos másde un efecto resulta trasla administración
• ¿Por qué?
• ¡existen múltiplesdianas en diferentes tejidos !
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Relación Dosis/Respuesta Cuantal
• Cuantal: es la respuesta del “Todo o Nada”
• En una población, un individuo “responde o no responde”
• En el eje Y está la fracción de población que responde y en el eje X el rango de dosis administradas
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Relación Dosis/Respuesta Cuantal
Estimados estadísticos de la exposición al tóxico:
• ED50 “Effective Dose” o Dosis Efectiva al 50%
• Si muerte es el punto final de medida a la ED50
se le llama LD50 de “Lethal Dose”
• Es un valor marginal de peligro ya que por ejemplo no refleja el riesgo al medio ambiente
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Relación Dosis/Respuesta Cuantal
• Curva con forma de campana de Gauss conocida como distribución de frecuencias normales
• La razón de esto son las diferencias individuales en r/ hacia los químicos (idiosincrasia)
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Individuos Hipersusceptibles Resistentes
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Relación Dosis/Respuesta Cuantal
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Risk Analysis, Vol. 18, No. 6, 1998
“critical effect size”(CES)
Relación Dosis/Respuesta Cuantal
La dosis efectiva mínima a un químico que evoca r/ de “todo o nada” es llamada Dosis Umbral
(no es experimental → extrapolada)
• Si el # de individuos respondedores a cada dosis consecutiva se suman juntos, se obtiene la relación D/R acumulativa
• Cuando se han usado un buen # animales por dosis se obtiene una curva D/R sigmoidea
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Relación Dosis/Respuesta Cuantal
• Se puede convertir el % de r/ a unidades de desviación de la media (normal equivalent deviations NEDs)
• La NED de 50% es 0 + 5 (p/ evitar -); la NED +1 se equipara con 84.1% de r/.
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Esta conversión de unidades es llamada probit units de la contracción probability unit
Relación Dosis/Respuesta Cuantal• La Pendiente de las
curvas puede ser obtenida
• A con pendiente más plana requiere cambios mayores en la dosis para observar cambios en la r/
• Mientras B con pendiente más empinada requiere pequeños cambios
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Relación Dosis/Respuesta: Alometría
• Alometría: campo de estudio que examina las relaciones entre el peso corporal y otros parámetros físicos y biológicos como la tasa de metabolismo basal, frecuencia cardiaca, flujo de sangre, etc
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La relación entre área superficial y el peso corporal entre las especies de mamíferos es: AS = 10.5*(peso en g)0.67
(0.030)
Cálculo de Probit Manual y en SPSS
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Forma de la curva Dosis/Respuesta
• Nutrientes esenciales en forma de U (vit y minerales)
• Deficiencia - Homeostasis -Toxicidad
• Ej: Vit A (tox. hepática y def. fetales) y Vit C
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Hormesis:sustancias no
nutricionales
pueden dar
efectos
estimulatorios
benéficos a D
bajas, pero a D
altas producen
efectos
adversos
Ej: la radiación y
el alcohol
Forma de la curva Dosis/Respuesta
• Umbral: D bajo la cual la probabilidad de una r/ individual es cero (depende del #)
• Es muy difícil establecer un Umbral de “no efectos”
• Para carcinogénesis se habla de un Umbral Aparente llamado NOAEL del Ingles “no observable adverse effect level”
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Forma de la curva Dosis/Respuesta• Varia con el tiempo de exposición
al tóxico
• Las pendientes a D bajas y a D altas son muy ≠ por la disposición del químico
• Razones de las inflexiones agudas en la Curvas D/R:
Saturación de las vías de biotransformación, de los sitios de unión a proteínas o receptores y supresión de cofactores intracelulares
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Forma de la curva Dosis/Respuesta• NAPQI = N-acetil-p-
benzoquinoneimina (metabolito hepatotóxico)
• Destoxificado por conjugación intracelular con glutatión
• A D altas se consume el glutatión hepático y se acumula NAPQI que causa toxicidad hepática fatal
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N Engl J Med 359;3 july 17, 2008
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Supuestos de la relación D/R
1. La respuesta es debida al químico administrado
2. La magnitud de la r/ es relacionada con la dosis
La 2nda subyace de 3 supuestos:
a) Existe un sitio diana molecular con el que interactúa el químico para iniciar la r/
b) La producción y el grado de la respuesta son relacionados con la concentración del químico en el sitio diana
c) La concentración en el sitio está relacionada con la D administrada
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3. Existen métodos cuantificables con precisión significativa para expresar la toxicidad
Supuestos de la relación D/R
• Si no hay mecanismo de acción se toman medidas de toxicidad claras de “biomarcadores relacionados a los efectos” (effects-related biomarkers)
• Químicos nuevos →Toxicidad Aguda D Única → diseño de estudio cuidadoso, disciplinado, observación comportamental y fisiológica detallada →animal intacto por 14 días, luego análisis histológicos de los principales órganos
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Ej: ALT y AST en daño hepático
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Evaluación de la relación D/R
• ED = Dosis Efectiva
• TD = Dosis Tóxica
• LD = Dosis Letal
• Paralelismo como sugerencia de identificación del mecanismo
• Pruebas que respalden cada caso en particular
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Evaluación de la relación D/R
• Índice Terapéutico (Therapeutic Index)
• TI = TD50/ED50
• Márgenes de Seguridad y Exposición (Margin of safety)
• MOS = TD1/ED99
• Índice de Cronicidad (Chronicity index)
• CI = TD50 1D/TD50 90DDonde D es dosis
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TIA = 1,18 TIB = 5 Seguridad Relativa
¿Y qué pasa con las pendientes?
CIA = 1 CIB = 90
Grado de Acumulación
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Evaluación de la relación D/R
• Potencia vs. Eficacia
• A > B; potencia además contempla el rango de D en el que↑ la r/
• A = B y C < D; eficacia máxima contempla el límite superior de r/
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Potencia Eficacia máxima
Variación en las Respuestas Tóxicas
Se debe a 3 componentes principales:
I. Toxicidad selectiva
II. Diferencias de especie
III. Diferencias individuales
• Toxicidad selectiva: el químico produce daño en una clase de ser viviente sin dañar la otra forma de vida aunque ambas existan en íntimo contacto
• “Uneconomic form” (indeseable)
• “Economic form” (deseable)
• Ej: Los Antibióticos (sulfonamidas y PABA)
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Variación en las Respuestas Tóxicas
• Diferencias de especie: diferencias cualitativas y cuantitativas en la r/ a sustancias químicas pueden ocurrir entre especies diferentes
• Ej: Ratones (10 mil ppb) ↑ resistencia a hepatocarcinomas por la Aflatoxina B respecto a ratas (15 ppb)
• Diferencias individuales: pueden ocurrir por sutiles diferencias genéticas
• Diferencias hereditarias en un gen (más de 1% de la población) se llaman Polimorfismos Genéticos y son los responsables de las reacciones idiosincráticas
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Ensayos de Toxicidad Descriptiva en Animales
• Existen 2 principios subyacentes a estos ensayos:
1. Los efectos producidos por un componente en animales de laboratorio, (bien calificados) son aplicables a humanos
2. La exposición de animales experimentales a químicos en D altas es un método válido y necesario para descubrir riesgos en humanos
• Pruebas de Toxicidad Aguda
• Pruebas de Irritación dérmica y ocular
• Pruebas de Sensibilización
• Pruebas de Toxicidad Sub-Aguda
• Pruebas de Toxicidad Sub-Crónica
• Pruebas de Toxicidad Crónica
• Pruebas de Toxicidad sobre el Desarrollo y la Reproducción
• Mutagenicidad
• Bioensayos de Oncogenicidad
• Evaluación de Neurotoxicidad
• Evaluación de Inmunotoxicidad
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Ensayos de Toxicidad Descriptiva en Animales
• La Conferencia de Armonización Internacional(ICH) para el registro de productos farmacéuticos en humanos → lineamientos →
registro
• Nuevos químicos → estudios iniciales → cuidadosa evaluación química: pureza, estabilidad, solubilidad y otros factores fisicoquímicas
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Pruebas de Toxicidad Aguda
• Administración de D única
• Una o más rutas de administración
• Una o varias especies
• Hembras y machos adultos
• Ayuno la noche previa a la D
• Medidas de mortalidad, peso, conducta y alimentación
• Periodo de 14 días
• LD50 ahora se caracteriza más como un rango de magnitudes
• 6 a 9 animales por método de Bruce
• 40 a 50 tradicional
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Pruebas de Toxicidad Aguda
• La ICH (1991) elimina LD50 para fármacos (excep. pesticidas) por la alta variabilidad
• Objetivos:
a. Estimar la toxicidad intrínseca (LD50)
b. Informar órganos blanco y manifestaciones clínicas
c. Identificar diferencias de especies y susceptibilidad
d. Establecer reversibilidad de la r/ tóxica
e. Dar información para el diseño y la selección de D para estudios a largo plazo
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Pruebas de Toxicidad Aguda (TA)
• LC50 por exposición en el medio indicando el t (Ej: Peces-Agua)
• TA Dérmica:
• Sitio de aplicación afeitado
• Contacto ocluido en piel por 24 horas
• Limpieza al final y observación por 14 días (máx. 2g/Kg)
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• En TA la información más significativa viene de las observaciones clínicas y los exámenes postmortem del animal
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Pruebas de Irritación dérmica y ocular
• “Draize test” remoción del pelaje de la espalda
• 0.5 mL o 0.5 g sobre la piel cubierta con 4 parches de gaza (1 pulg2)
• 2 sitios con abrasión y 1 intacto durante 4 horas
• Instilación en un ojo (0.1 mL o 100 mg) para cada conejo
• Control ojo contra lateral
• Observaciones varias veces después de la aplicación
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Pruebas de Sensibilización
• Pruebas de hipersensibilidad tardía como el de Draize
• En Cobayos
• Aplicación tópica, intradérmica o ambas en una zona rasurada
• Múltiples administraciones en un periodo de 2 a 4 semanas
• Luego a 2 o 3 semanas del último tratamiento los animales son desafiados (↓ Conc.)
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Pruebas de Toxicidad Sub-Aguda
• Usadas para establecer las D de estudios Subcrónicos
• 3 o 4 D diferentes mezcladas en el alimento
• Ratas 10 por sexo; perros 3 o 4 por sexo
• Química clínica e histopatología son hechas después de 14 días de exposición
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Pruebas de Toxicidad Sub-Crónica
• Su duración usual es de 90 días
• Sus metas son: establecer el NOAEL e identificar y caracterizar los órganos específicos afectados después de la administración repetida
• Se obtienen también los “lowest observed adverse effect level” (LOAEL)
• Usualmente en 2 especies (rata y perro FDA; ratón para EPA) por la vía de exposición (oral)
• 3 D (1era alta; toxicidad <
10% muertes, 3era baja; sin efectos tóxicos aparentes y 2nda; intermedia)
• 10 a 20 roedores y 4 a 6 perros por sexo y D
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Pruebas de Toxicidad Sub-Crónica
• Solo animales saludables
• Alojamiento individual
• Administración en la dieta con razón de consumo y de cambio de peso
• Observación cuidadosa para signos de toxicidad 1 o 2 veces por día
• Registro de drogas → estudios Agudos y Subcrónicos deben estar completos antes que la compañía ponga una carpeta para IND (Investigational New Drug) en la FDA
• Si aprueban la IND (FDA), los estudios clínicos Fase I, II y III pueden comenzar al mismo tiempo que las pruebas de toxicidad crónica en animales
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Pruebas de Toxicidad Crónica
• Son similares a las P. Subcrónicas excepto por el periodo de exposición
• En roedores va de 6 meses a 2 años
• En otras especies usualmente 1 año, pero puede ser más
• La D más alta debe ser estimada como la D Máxima Tolerable (MTD)
• La MTD incluye la supresión ligera de la ganancia de peso, consideraciones fisiológicas, farmacocinéticas y urinarias del perfil de metabolitos
• Se prueban además ½ y ¼ de la MTD
• Se considera en estos estudios el Potencial Carcinogénico
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Pruebas de Toxicidad sobre el Desarrollo y la Reproducción
• Toxicología del desarrollo estudia los efectos adversos sobre el desarrollo del organismo durante cualquier momento de la vida
• Toxicología reproductiva estudia la ocurrencia de efectos adversos sobre los sistemas reproductivos masculinos y femeninos
• Ratas 2 o 3 por D (20 cada grupo)
• Machos 60 días y hembras 14 días antes de la copula hasta la lactancia (incluida la gestación)
• Se observa: % de embarazos, # de nacidos muertos, peso, crecimiento, sobrevivencia y condiciones generales durante las 3eras semanas de vida
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Pruebas de Toxicidad sobre el Desarrollo y la Reproducción
• La ICH da lineamientos según etapas
– Etapa A: Cópula y Concepción
– Etapa B: Concepción a Implantación
– Etapa C: Implantación a Cierre del paladar duro
– Etapa D: Cierre del paladar duro a termino del embarazo
– Etapa E: Nacimiento y Destete
– Etapa F: Destete a Madurez sexual
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Mutagenicidad
• Mutagénesis: habilidad de un químico para causar cambios en el material genético de las células y transmitir esos cambios en la división celular
• La P. in vitro de Salmonella typhimurium/
microsomas hepáticos de rata en un medio sin histidina
• Roedores ♂ expuestos a D única del compuesto
• Luego son apareados con dos hembras no tratadas, (1 día por sem) durante 8 semanas
• Las ♀ son matadas antes de llegar a término y tanto el # de embriones como el # de cuerpos lúteos son determinados
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Bioensayos de Oncogenicidad
• El potencial carcinogénico se ejecuta en ratas y ratones a lo largo de la vida de la especie (ratón 18 m a 2 a; rata 2 a 2.5 años)
• 60 ratas por grupo y por sexo para que sobrevivan 30 por D
• Exámenes patológicos gruesos y microscópicos son hechos a todos los animales
• La D usada es la MTD
• Ya existe un % basal de tumores en el grupo control
• La D diaria debe proveer 25 veces el ABC (AUC) que una D única humana produciría bajo condiciones terapéuticas (más que usar una MTD)
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Evaluación de Neurotoxicidad
• Neurotoxicidad: cambio adverso en la química, estructura o función del sistema nervioso seguido a la exposición de un agente químico
• Existen muchos sistemas in vitro como los de cultivo celular de neuronas y glia en los que se estudia neurotoxicidad, proliferación, migración, apoptosis, sinaptogenesis, etc (↓ #
animales, ↓ costo y ↑ adaptabilidad)
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Evaluación de Neurotoxicidad
• Irwin desarrollo una selección básica para función del comportamiento en ratones (Irwin, 1968) la cual ha sido refinada a una “batería observacional funcional” (FOB)
• La FOB también se usa para evaluar seguridad
• Los protocolos animales incluyen pruebas de función comportamental (alarma
auditiva, aprendizaje y memoria,
cambios en actividad motriz), exámenes neuropatológicos y morfológicos
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Evaluación de Inmunotoxicidad
• El sistema inmune nos defiende contra infecciones patógenas y ciertos tipos de cáncer
• Las alteraciones inmunológicas pueden presentarse como: hipersensibilidad, autoinmunidad o inmunosupresión
• Fallo en la r/ a infecciones, expresión de infecciones latentes, prolongados periodos de infección y la aparición de cáncer
• Evaluación de glóbulos blancos, glóbulos rojos, inmunoglobulinas y cambios de peso e histología en los órganos linfoides
• Por Ej: “Tormenta” de citoquinas como r/ a un anticuerpo monoclonal anti-CD28 (Fase I) que provocó a unos sujetos falla sistémica multiorgánica
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