Regulación de la expresión

génica en eucariotas

La regulación génica es más compleja en

eucariotas

Procariotas Eucariotas

ADN desnudo cromatina

N° cromosomas 1 muchos

Asociación sí no

transcr.-traducc.

Interruptor sec. activadoras condensación cromatina

+ sec. activadoras

Regulación post-transcripcional de la

expresión génica en eucariotas

Acoplamiento/separación de etapas

- Procariotas:

- la transcripción y la traducción

están acopladas.

-Eucariotas

- separación espacial de la

transcripción (nuclear) y la

traducción (citoplásmica)

Procariotas

Genes

- Procariotas:

- colinealidad (continuidad) entre genes y proteínas

- n° de nucleótidos proporcional al n° de aa.

-Eucariotas

- discontinuidad en la mayoría de los genes

- mucho más ADN que el necesario para codificar ARNs

ARNm eucariótico

• monocistrónico

• Presencia de exones e intrones en el pre-ARNm

Procesamiento postranscripcional

- 60% de los transcritos de genes humanos son

procesados de maneras diferentes

Procesamiento postranscripcional del

ARNm eucariótico

- Adición de un casquete o caperuza en 5´

- Poliadenilación en 3´

-Empalme o splicing de exones

-Edición de secuencia

Adición del casquete 5´

Se adiciona un nucleótido modificado:

Guanosina

+ metilo

= 7-metil-guanosina

Enlace 5´- 5´

Adición del casquete 5´

- estabilidad del mensajero

- enzima sólo asociada a pol. II

- no existe casquete en ARNr ni ARNt

Rol del casquete 5´ en el inicio de la

traducción

- unión de proteínas de reconocimiento del

casquete

- unión al ribosoma

- iniciación de la traducción

Poliadenilación

• Reconocimiento de secuencia consenso: AAUAAA

• Corte a 10-30 pb hacia 5´de la sec. Consenso

• poli-A polimerasa + factores de poliadenilación: 50 a

250 residuos de Adenina

• no están codificados en la secuencia de ADN

Poli-A

• Estabilidad del mensajero (vida media)

• unión al ribosoma

http://www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/transcripcion/transcripcion.html

Corte y empalme

- Posterior a la poliadenilación

- reconocimiento de secuencias intrónicas

- eliminación de intrones

Corte y empalme: alternativos

Tipos de intrones

tipo I genes de ARNr autocorte y empalme

tipo II genes q cod. proteínas autocorte y empalme

en mt. y clorop.

Pre-ARNm genes q cod. proteínas corte por empalmosoma

nuclear en núcleo

ARNt genes de ARNt corte por enzimas

Autocorte y Empalme

- Intrones tipo I y II, actúan como ribozimas

- Gasto de ATP

- Pliegue y formación de

estructuras secundarias

complejas; autocorte y

empalme

- ARNr procariotas, ARNm mt.

de hongos y ARNm de

bacteriófagos

Tipo I Tipo II

Empalme del Pre-ARNm nuclear

3 secuencias consenso intrónicas:

- Sitio 5´ : GU

-Sitio 3´ : AG

-Punto de ramificación : A entre 18-40 nt hacia 5´ del sitio

3´ y 3 pirimidinas

Empalmosoma

snARN: U1, U2, U4, U5, y U6

+

300 proteínas

=

snRNPs : ribonucleoproteínas nucleares

pequeñas

Acción del Empalmosoma

- Corte en 5´ y liberación del

exón 5´

- Unión G-5´ con A del punto

de ramificación (bucle)

- Corte en 3´

- Linearización y degradación

del intrón

Intrones de ARNt o tipo IV

Enzimas independientes del

empalmosoma

Empalme alternativo

Múltiples

ARNm de un

solo

transcrito

primario

Ejemplo de empalme alternativo

• Cerebro: poliadenilación después del 6to.exón.

Exones 1, 2, 3, 5, y 6 = Péptido Relacionado con el

Gen de la Calcitonina = CGRP

gen de la Calcitonina

Ejemplo de empalme alternativo

• Glándula tiroides: exones 1, 2, 3 y 4 presentes =

hormona calcitonina

gen de la Calcitonina

Corte y empalme trans

• Unión de exones ubicados en diferentes ARNm

• Platelmintos,

• Nematodes, Drosophila,

vertebrados

Edición de los ARN

• Genes nucleares y mitocondriales

• Luego de la transcripción, poliadenilación, corte y

empalme, la secuencia se altera

• Comprende conversiones, inserciones y deleciones

Mecanismos de edición de ARN

• ARN guías:

parcialmente

complementarios, se

aparean con el ARN a

modificar. Lo modifican

y unen los extremos

cortados.

Mecanismos de edición de ARN

• ARN guías: adición o

deleción de uracilos

Mecanismos de edición de ARN

• Conversión enzimática de bases:

• Desaminación de Citosina

• Metilación de Uracilo =

Ribotimidina

• Cambio de unión ribosa-

Uracilo = Pseudouridina

• Desaminación de Adenina

Silenciamiento postranscripcional de

genes: microARNs = miRNAs

• moléculas cortas de ARN

• altamente conservados en organismos eucariotas

(levaduras, plantas, hongos y animales)

ARN pequeños

Inhibición de la expresión génica por ARN cortos:

- micro ARN (miRNA)

- ARN interferentes pequeños (siRNA)

Descubiertos por A. Fire y C. Mello

Premio Nobel 2006 en Fisiología y

Medicina

ARN pequeños

- ARN doble cadena

- moléculas de ARN cortas, aprox. 21 nt.

- pueden reprimir la transcripción (núcleo) o la

traducción (citoplasma)

Animales: interferencia

Plantas: silenciamiento postranscripcional

ARN-polimerasas en eucariotas

ARNr

ARN pol. I

ARN pol. II

ARN pol. III

ARNt ARNm

ARNr28S; 5,8S; 18S Genes codif.. de proteínas

miARN, snARN

ARNt, ARNr5S, snARN,

snoARN

miRNA

• transcripción de

miARNs Primarios

de doble cadena,

por la ARN-pol. =

Pri-miRNA

miRNA

• procesamiento del

poli-A por la

ribonucleasa

Drosha =

Pre-miARN

miRNA

• Trasporte al

citoplasma por una

exportina

miRNA

• clivaje por la

enzima Dicer

miRNA

• Selección de una

de las dos hebras

del miRNA maduro

y asociación al

complejo RISC

(complejo de

silenciamiento

inducido por ARN)

Silenciamiento de ARNm por miARN

• En asociación con

el complejo de

endonucleasa

RISC

• Clivaje del ARNm

Estabilidad del ARNm eucariótico

• Vida media más larga que el ARNm procariótico

• Mayor estabilidad

• Aumenta la posibilidad de regulación de la traducción

Regulación global del inicio de la

traducción en eucariotas

• En situaciones de estrés o escasez de nutrientes

• Reducción global de la traducción

• Por inhibición de eIF2. Fosforilación de eIF2, impide

unión a GTP.

• Ante la falta de eIF2-GTP, se impide la unión del

ARNt iniciador al sitio P.

Degradación de ARNms erróneos

• Mecanismo de monitoreo de la integridad de los

ARNm en eucariotas

• Detección de codones stop prematuros generados

por mutación o error de empalme

• Remoción de la caperuza 5´ o de la cola poliA

• Degradación del ARNm desprotegido por

exonucleasas

Degradación de ARNms erróneos

• Detección de ARNms sin codón stop

• El ribosoma continúa traduciendo hasta poliA

• Genera poli-lisina

• Reconocimiento por proteínas asociadas a eRF1 y 3

• liberación del ribosoma y degradación por

exonucleasas

Utilización de Drosophila

melanogaster para estudios

de expresión génica en

eucariotas

Moscas GAL4-UAS

- origen mixto: levaduras-drosofilas

- permite expresar in vivo cualquier gen, proveniente

de cualquier especie, de manera dirigida y

específica

- en cualquier órgano o tejido de la mosca

- en cualquier etapa del ciclo vital

Línea de moscas GAL4

Expresa GAL4 con un patrón específico de

tejido o de células

Promotor

endógeno

GAL4

Sin efecto fenotípico para la mosca

Expresión de GAL4

- factor de transcripción eucariótico, de levaduras

- activa genes con la secuencia de reconocimiento

UAS (ausentes en la mosca)

- Puede asociarse a:

- un promotor débil: se mantiene inactivo a

menos que tenga un amplificador

cercano.

- un promotor específico de tejido: el

sistema se expresará en un tejido

particular

- promotor de un gen “house-keeping”: gen

que se expresa en todos los tejidos

Línea de moscas UAS

Posee la secuencia UAS =upstream activation

system, que se mantiene “apagada” en ausencia de

GAL4

Sitio UAS de

unión para GAL4

Gen efector

Sin efecto fenotípico para la mosca

Gen efector aguas abajo de UAS

Puede ser:

- Reporter: “marca” las células que expresan el

sistema. GFP (green fluorescent protein), lac-Z

(beta-galactosidasa), etc.

- Activador: ej. factor de transcripción

- Inhibidor: ej. toxina de tétanos para inactivar

neuronas

Cruzamiento moscas GAL4 x UAS

La descendencia expresa GAL4.

GAL4 activa la expresión del gen precedido por UAS

Sitio UAS de

unión para GAL4

el gen se

expresa

Promotor

endógeno

GAL4

X

Utilidad

Permite estudiar la regulación espacial en el

organismo y temporal a lo largo de la ontogenia de

distintos genes

Ejemplo

Ojos supernumerarios por

activación de eyeless en

distintas regiones del

cuerpo

Gen eyeless: cascada genética para la construcción

de un ojo

Sitio UAS de

unión para GAL4 gen eyeless

Promotor de Dpp (se

expresa en varios

tejidos) GAL4