Simposio LAS/ANS 2007 / 2007 LAS/ANS Symposium XVIII Congreso Anual de la SNM / XVIII SNM Annual Meeting XXV Reunión Anual de la SMSR / XXV SMSR Annual Meeting

Copatrocinado por la AMEE / Co-sponsored by AMEE Cancún, Quintana Roo, MÉXICO, del 1 al 5 de Julio 2007 / Cancun, Quintana Roo, MEXICO, July 1-5, 2007

Reducción del Daño Inducido por Radiación Gamma (60Co ) por el Metilgalato en Leucocitos de Ratón in vivo.

Morales Ramírez, P., Cruz-Vallejo V.L. Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares

Carretera México Toluca Km 36.5. Edo de México pmr@nuclear.inin.mx; vlcv@nuclear.inin.mx

Zarco-Mendoza, A.

Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares Carretera México Toluca Km 36.5. Edo. de México

unidrak@yahoo.com.mx

Resumen

El presente trabajo tiene los objetivos de establecer si el metilgalato tiene actividad radioprotectora en leucocitos de ratón in vivo y determinar a través del comportamiento de las curvas de inducción de daño y reparación en el ADN por radiación gamma de 60Co, si la actividad antioxidante del metilgalato simula la radioprotección obtenida mediante la respuesta adaptativa. Se establecieron 4 grupos de ratones con diferentes tratamientos, Al primer grupo se le administró 0.4 ml de una solución DMSO: H2O (1:8) . En el segundo grupo el metilgalato se disolvió en una mezcla de DMSO: H2O (1:8) y se administraron 0.4 ml a una dosis de 0.1 µM/g de peso corporal. El tercer grupo fue tratado con radiación gamma a una dosis de 1.0 Gy de 60Co. Finalmente, al cuarto grupo se le administró el metilgalato 30 minutos previos a la irradiación. La curva promedio de los animales tratados con metilgalato antes de la irradiación, muestra una reducción de un 15% en la frecuencia de células dañadas. Esta diferencia se mantiene más o menos constante a lo largo del período que duró el experimento y es estadísticamente significativa. Se observaron diferencias entre las curvas de células dañadas con respecto al tiempo, inducidas por 60Co en el presente experimento y las inducidas por 137Cs en un experimento previo. La más relevante es que la frecuencia de células dañadas por la exposición con 60Co se mantienen constantes alrededor de 30% durante el tiempo que duró el experimento, en cambio ésta frecuencia tiende a disminuir y es del 10% a los 90 minutos en los animales expuestos a 137Cs. Se puede concluir que el metilgalato tiene actividad radioprotectora en leucocitos de ratón in vivo, y que las curvas de inducción de daño contra tiempo establecidas mediante electroforesis unicelular en gel, pueden ser un modelo para determinar diferencias en cuanto al tipo de lesiones inducidas por radiación electromagnética de diferente energía.

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1. INTRODUCCIÓN

Recientemente se ha intensificado el estudio de la acción antioxidante de extractos y compuestos derivados de plantas (1). Considerando que el efecto de la radiación gamma sobre las células es a través de la producción de radicales libres, principalmente radicales hidroxilo y que por esta razón se explica que las moléculas antioxidantes pueden actuar como radioprotectores, resulta interesante probar la actividad radioprotectora de estos agentes. El metilgalato (MeG) esta presente en diferentes plantas que contienen actividad antioxidante (1), de hecho hay evidencia de que este compuesto en particular tiene propiedades antioxidantes (2) y radioprotectoras e inclusive de que actúa a través de la captura de radicales libres in vivo (3). Por otra parte, en estudios previos obtuvimos evidencia de que los leucocitos de ratón in vivo son capaces de reparar el daño inducido por 1.0 Gy de radiación gamma (137Cs). Este resultado fue obtenido mediante el análisis de curvas de inducción de daño y reparación del ADN empleando la técnica de electroforesis unicelular en gel, también denominada ensayo cometa (4). El estudio indicó que ocurre un proceso temprano y muy rápido de reparación de rupturas en el ácido desoxiribonucleíco (ADN) después de la irradiación, el cual reduce el daño substancialmente en los primeros 15 minutos. Nuestros estudios subsecuentes nos permitieron establecer que la preexposición de los animales a una dosis baja (0.01 Gy), capacita a los leucocitos de ratón para responder más eficientemente a la sucesiva exposición a una dosis de 1.0 Gy (5, 6). Estos resultados indicaron la existencia de una respuesta adaptativa, explicada en términos de dos posibilidades no excluyentes que serían, la inducción de las enzimas responsables de la reparación del ADN o la estimulación de las enzimas involucradas en la respuesta al estrés oxidativo. La presencia de un mecanismo de reparación tan eficiente, dificultó la conclusión respecto a la observación de una disminución en el daño inicial que podría ser indicativo de un mecanismo relacionado con la reducción de radicales libres. El presente trabajo tiene los objetivos de establecer si el metilgalato tiene actividad radioprotectora en leucocitos de ratón in vivo y determinar a través del comportamiento de las curvas de inducción de daño y reparación en el ADN por radiación gamma de 60Co, si la actividad antioxidante del metilgalato simula la radioprotección obtenida mediante la respuesta adaptativa.

2. MATERIALES Y METODOS

2.1 Protocolo Se establecieron 4 grupos de ratones con diferentes tratamientos y antes de cada tratamiento a los ratones se les tomó una muestra de sangre de la cola para que cada organismo tuviera su propio testigo y después a los tiempos indicados en los protocolos. La administración de las soluciones se realizó por vía intraperitoneal. Se hicieron curvas de frecuencia de células dañadas con

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respecto al tiempo, que se establecieron animal por animal hasta juntar 5 animales por tratamiento. Al primer grupo se le administró 0.4 ml de una solución DMSO: H2O (1:8). En el segundo grupo el MeG se disolvió en una mezcla de DMSO: H2O (1:8) y se administraron 0.4 ml a una dosis de 0.1 µM/g de peso corporal. El grupo tratado con radiación gamma recibió una dosis de 1.0 Gy de 60Co. Finalmente al cuarto grupo se le administró el MeG 30 minutos previos a la irradiación. 2.1.1 Animales Se emplearon ratones machos de aproximadamente 30g de la cepa Balb/C, mantenidos con comprimidos para ratones Lab Diet y agua ad libitum. Los animales fueron reproducidos en el bioterio del Departamento de Biología del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares bajo condiciones controladas de temperatura (23-25 oC y períodos de luz-obscuridad (12 h). 2.1.2 Substancias químicas Las substancias usadas en el presente estudio se adquirieron con los siguientes proveedores: Agarosas de punto de fusión (APFN) normal y bajo (APFB) en Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA); Tris, cloruro de sodio, N-lauril-sarcosina, dimetil sulfóxido, cloruro de potasio, bromuro de etidio, EDTA, tritón X-100 e hidróxido sodio en Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA); Metilgalato de laboratorio Fluka (México). 2.1.3 Condiciones de Irradiación Los animales se colocaron en un tubo de plástico y se expusieron a la fuente de radiación gamma (60Co Gammacell). La dosis total fue de 1.0 Gy. La cual fue corroborada por dosimetría termoluminiscente (TLD). 2.1.4 Muestras Los animales fueron confinados en un brete y se obtuvieron dos muestras de 4 μl sangre de la cola a cada uno de los siguientes tiempos postratamiento: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 y 120 minutos. Excepto el grupo pretratado con metilgalato en el cual las muestras se tomaron a los mismos tiempos antes indicados postirradiación. Cada muestra es recuperada en un tubo de centrífuga conteniendo 1 ml de solución de Hanks y mantenida en hielo. 2.1.5 Electroforesis Unicelular en Gel A esta técnica también se le conoce como ensayo cometa debido a que evidencia el daño producido al ácido desoxiribonucleíco (ADN) como rupturas en las cadenas mostrando una imagen al microscopio que semeja a un cometa, por lo que las células dañadas reciben este nombre. Básicamente se uso la técnica previamente descrita por Singh y colaboradores en 1988 (7), con algunas modificaciones (8). Brevemente: las muestras de sangre se mezclaron con APFB al 0.5% y se distribuyeron sobre portaobjetos que tenían previamente una película seca de APFN al 0.75 %. Se colocaron en solución de lisis a 4°C durante 1 hr. Después las laminillas se

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sumergieron en una cámara de electroforesis (PS250-1, Techware Sigma Chemical, St. Louis MO, USA) con buffer alcalino a 4 °C por 40 minutos para permitir el desenrrollamiento del ADN y la expresión de sitios lábiles al álcali. El corrimiento electroforético se realizó durante 40 min a 25 volts y 300 miliamperes. Finalmente las laminillas se enjuagaron con buffer Tris de neutralización (0.4 M Tris, pH 7.5) y se deshidrataron por inmesión en metanol puro y puestas sobre una superficie plana hasta que se secaron y se mantuvieron en una caja cerrada a temperatura ambiente. Para su análisis al microscopio de fluorescencia, se hidratan con amortiguador Tris y cada laminilla es teñida con 70 μl de bromuro de etidio (2.0 μg/ml) y cubierta con cubreobjetos. Las laminillas fueron observadas no más de 24 h después de la tinción. 2.1.6 Análisis de células dañadas El daño al ADN se determinó contando el número de células con cauda en 300 células por laminilla, utilizando un analizador de imágenes Zeiss Image y un microscopio de fluorescencia con filtro de excitación de 515-160 nm y filtro barrera de 590 nm, con el objetivo de 50 x. 2.1.7 Índice de daño Se hicieron tres conteos de 100 células al azar y se determinó el porcentaje de células con cauda. Estos conteos se hicieron por ratón en cada tiempo y en cinco animales por tratamiento. 2.1.8 Estadística Para determinar las diferencias estadísticas en el porcentaje de células dañadas se utilizó la prueba de Dunnett para comparación múltiple (9) con una α de 0.05.

3. RESULTADOS Considerando que el DMSO era uno de los solventes a elección para el metilgalato, un estudio preliminar consistió en establecer si en nuestras condiciones experimentales el DMSO tenía algún efecto sobre el daño en el ADN inducido por la radiación gamma. En la Tabla 1 y Figura 1 se muestran los resultados que indican que 23.46 µM/g de DMSO no tiene ningún efecto sobre la inducción de daño por la radiación gamma.

Tabla 1. Comparación de la inducción de cometas producidos por el tratamiento combinado con DMSO + 1 Gy de radiación y solamente con 1 Gy de radiación

DMSO + Rad γ (1Gy) Rad γ (1Gy) Tiempo (min) Promedio 300 células ± d.e N Promedio 300 células ± d.e. N

0 8.4 ± 1.6 3 8.4 ± 1.6 3 2 68.9 ± 2.0 3 67.9 ± 9.2 3 5 52.2 ± 2.9 3 48.8 ± 6.6 3 10 39.8 ± 3.9 3 37.3 ± 0.3 3 Diferencia no significativa en todos los casos Dunnet α 0.05; N = número de ratones

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0 5 10 150

10

20

30

40

50

60

70

% d

e co

met

as

Tiempo (min)

DMSO + Radiación Radiación

Figura 1. Efecto del DMSO sobre la inducción de daño producido por radiación gamma.

La Figura 2, muestra las curvas de frecuencia de células con daño en el ADN en función del tiempo. Para los grupo de ratones tratados con DMSO, tratados con metilgalato, irradiados con 1.0 Gy o tratados con metilgalato e irradiados 30 minutos después con 1.0 Gy de radiación gamma de 60Co.

0 20 40 60 80 100 120

0

10

20

30

40

50

60

% d

e co

met

as

Tiempo (min)

DMSO MG/DMSO RAD MG/DMSO + RAD

Figura 2. Efecto del metilgalato sobre el daño producido por radiación gamma.

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Se observa que el metilgalato per se es capaz de inducir un leve incremento en la frecuencia de células dañadas en comparación con el grupo control (DMSO). La curva obtenida después de la exposición con 1.0 Gy de radiación gamma muestra que 2 minutos después de ésta, la frecuencia de células con daño es del 60% y 15 minutos después cae rápidamente a sólo el 25%, luego se produce un leve incremento y se mantiene alrededor de 30-35% a lo largo del período experimental que fue de 120 minutos. La curva promedio de los animales tratados con metilgalato antes de la irradiación, muestra una reducción de un 15% en la frecuencia de células dañadas. Esta diferencia se mantiene más o menos constante a lo largo del período que duró el experimento y es estadísticamente significativa (Tabla2).

Tabla 2. Efecto del metilgalato sobre el daño producido por radiación γ en leucocitos de sangre periférica de ratón in vivo.

Tiempo DMSO Metilgalato (0.1 µM/g)

Radiación γ (1 Gy)

Metilgalato + Radiación γ

0 7.3 ± 1.3 9.7±1.7 8.9 ± 2.1 9.9 ± 1.9 2 5.6 ± 1.2 11.1±1.9 67.0 ± 7.5* 55.9 ± 3.9* 5 5.7 ± 1.1 10.3±2.2 49.4 ± 4.5* 40.9 ± 3.5* 10 8.1 ± 4.3 13.2±2.7 34.5 ± 4.4* 31.8 ± 3.1* 15 8.3 ± 4.8 13.2±0.8 33.9 ± 3.0* 32.6 ± 4.4* 20 5.5 ± 1.1 12.5±4.2 38.8 ± 6.0* 28.1± 3.4* 25 7.9 ± 3.9 13.2±2.0 40.5 ± 8.9* 31.4 ± 4.1* 30 7.2 ± 2.8 13.1±2.4 38.61 ± 7.3* 33.6 ± 2.7* 40 7.1 ± 2.2 10.3±2.1 38.1 ± 6.0* 32.6 ± 2.5* 50 7.8 ± 1.8 12.5±1.8 35.5 ± 4.2* 31.8 ± 3.2* 60 9.3 ± 4.2 14.6±1.5 43.2 ± 8.4* 35.9 ±2.6* 70 9.7 ± 2.0 14.9±1.0 44.3± 7.2* 31.4 ± 2.3* 80 10.3 ± 2.7 11.3±3.0 39.9 ± 6.6* 30.6 ± 3.2* 90 10.6 ± 3.7 11.7±0.6 50.5 ± 6.7* 41.2 ± 2.3* 100 8.6 ± 2.9 12.4±1.4 41.5 ± 9.8* 32.5 ± 4.6* 110 8.4 ± 2.0 16.0±1.1 36.9 ± 9.0* 34.4 ± 2.9* 120 10.9 ± 4.1 14.6±4.5 35.9 ± 7.4* 33.0 ± 4.2*

“Dunnet” α 0.05, diferencia significativa con respecto al mismo tiempo del grupo tratado con DMSO.; n = 5 ratones por tratamiento

4. DISCUSION

Los resultados claramente indican que el perfil de las curvas de los animales irradiados y las de los animales irradiados y pretratados con metilgalato se mantienen prácticamente iguales a lo largo del tiempo analizado pero, con una diferencia de aproximadamente 15% en el número de células dañadas. Esto se puede interpretar en el sentido de que el daño inicial y el daño

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persistente son reducidos por el tratamiento con el metilgalato, lo que se demuestra su efecto radioprotector in vivo en leucocitos de ratón. En la Figura 3 se muestra la comparación de los resultados aquí obtenidos con 60Co y los reportados previamente de nuestros experimentos de respuesta adaptativa usando 137Cs (6). Se observa que aunque la dosis de radiación gamma en ambos casos es la misma, el 137Cs induce inicialmente mayor cantidad de daño que el 60Co, posteriormente sigue una cinética similar hasta los 50 min, después se observa claramente que las lesiones inducidas por la exposición con 60Co se mantienen constantes alrededor de 30% de células dañadas, en cambio con 137Cs disminuyen hasta un 10% a los 90 minutos. Esto implica que un porcentaje de las lesiones que producen los rayos gamma de 60Co en el ADN son difícilmente o no son reparadas, a diferencia de las lesiones generadas por el 137Cs, que son casi totalmente reparadas.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 900

10

20

30

40

50

60

70

80

% d

e C

élul

as D

añad

as

Tiempo (min)

60Co 137Cs

Figura 3. Comparación de las curvas de inducción de células dañadas respecto al tiempo inducidas por la exposición a 1.0 Gy de radiación gamma de 60Co y 137Cs.

Estos resultados abren la posibilidad de ahondar sobre las diferencias en el comportamiento de las lesiones en el DNA inducidas por radiación ionizante de diferentes energías usando para ello el análisis de las curvas de daño contra tiempo empleando la electroforesis unicelular en gel.

5. CONCLUSIONES Se puede concluír que el metilgalato tiene actividad radioprotectora en leucocitos de ratón in vivo, y que las curvas de inducción de daño contra tiempo establecidas mediante electroforesis unicellar en gel, pueden ser un modelo para determinar diferencias en cuanto al tipo de lesiones inducidas por radiación electromagnética de diferente energía.

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AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Dr. Pedro González por el apoyo en la dosimetría, así como a Angel Reyes P. y Perfecto Aguilar por su asistencia técnica.

6. REFERENCIAS

1. Lee SC, Kwon YS, Son KH, Kim HP, Heo MY. “Antioxidative constituents from Paeonia lactiflora”. Arch Pharm Res. 28, p. 775-83 (2005).

2. Hsieh TJ, Liu TZ, Chia YC, Chern CL, Lu FJ, Chuang MC, Mau SY, Chen SH, Syu YH, Chen CH. “Protective effect of methyl gallate from Toona sinensis (Meliaceae) against hydrogen peroxide-induced oxidative stress and DNA damage in MDCK cells”. Food Chem Toxicol. 42, p. 843-50 (2004).

3. Takeshita K, Fujii K, Anzai K, Ozawa T. “In vivo monitoring of hydroxyl radical generation caused by x-ray irradiation of rats using the spin trapping/EPR technique”. Free Radic Biol Med. 36, p. 1134-43 ( 2004).

4. Mendiola-Cruz, M.T. y Morales-Ramírez, P. “Repair kinetics of gamma-ray induced DNA damage determined by the single cell gel electrophoresis assay in murine leukocytes in vivo”. Mutation Res. 433, p. 45-52 (1999).

5. Mendiola-Cruz, M.T. y Morales-Ramírez, P. “Damage-repair kinetics and early adaptive response induced by gamma rays in murine leukocytes in vivo”. Somat. Cell Mol. Genet. 25, p. 287-299 (2002).

6. Morales-Ramírez, P. y Mendiola-Cruz, M.T. “Kinetics of the early adaptive response to gamma rays: Induction of a cellular radioprotective mechanism in murine leukocytes in vivo”. Bioscience Reports. 24, p. 609-616 (2005).

7. Singh, P. N., McCoy M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. “A simple technique for quantification of low levels of DNA damage in individual cells”. Exp. Cell Res. 175, p. 184-191 (1988).

8. Eriksson S. Nygren J. “Preparing dried slides”. Comet Workshop, Prague, Aug 19-20 (1995). 9. Cheung, S. H. and B. Holland. “Extensión of Dunnett´s multiple comparison procedure with

differing simples size to the case of several groups”. Comput. Stat. Dat. Anal. 14, 165-182 (1992).

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