Recuento de bacterias heterótrofas totales (PCA)

a. Medios de cultivo Agar recuento en placa (PCA) Triptosa 5 g Glucosa 1 g Extracto de levadura 2.5 g Agar-Agar 15 g H2O destilada 1 l

b. Preparacion del Material Preparar en botella tipo Gatorade de a 300 ml por botella, según las indicaciones del fabricante y esterilizar en autoclave.

b. Procedimiento- Siembra en profundidad.

Poner a fundir la botella de PCA en el microondas, controlando que no se hierva. Dejar enfriar.

Trabajar en flujo laminar. Se rotulan las placas por muestra por duplicado. Por cada muestra, agitar la muestra y con pipeta estéril colocar 1 ml por placa.

Controlando que el PCA esté tibio al tacto, agregar entre 12-15 ml del medio sobre la gota de la muestra en la placa (el agar debe cubrir toda la placa). Mezclar suavemente las gotas con el medio, rotando las placas 5 veces en el sentido de las agujas del reloj y 5 veces en sentido contrario.

Esperar hasta la solidificación completa (sin tapar la placa para evitar condensación) e incubar a 35-37º C por 48 hs.

c. Conteo e informe: Seleccionar las placas que presenten entre 30 y 300 colonias. Contar las colonias de cada placa, hacer el promedio del duplicado y expresar los resultados en UFC/ml.

Determinación de bacterias coliformes totales (Standard Methods 1998)

2.1- Determinación del número más probable (NMP) de bacterias coliformes totales a. Medios de cultivo Caldo lauril sulfato (LST)

Triptona 20 g Lactosa 5 g K2HPO4 2,75 g KH2PO4 2,75 g NaCl 5 g b. Preparacion del Material El medio se prepara a partir del polvo deshidratado pesando el doble de la cantidad indicada por el fabricante para obtener el doble de concentración final (2X). Una vez disuelto se fracciona de a 10 ml en tubos de ensayo de 30 ml (Grande-Tapa Verde) conteniendo campanas de Durham, se esteriliza en autoclave 15 min. a 121ºC. c. Procedimiento 1) Sembrar 10 ml de muestra (agitar la botella previamente), con pipeta estéril, una serie de 10 tubos conteniendo 10 ml de caldo LST, de forma de procesar 100 ml totales de muestra. Los 10 tubos de cada muestra se siembran utilizando una misma pipeta estéril. Cuando cambio de muestra, cambio de pipeta. 2) Vortear los tubos sembrados. 3) Incubar los tubos a 37ºC. Después de 24+/-2 hs determinar desarrollo y producción de gas en cada tubo. En caso de no observarse producción de gas incubar los tubos hasta 48+/-3 hs. d. Interpretación Aquellos tubos en los que se observe producción de gas y crecimiento al cabo de 48+/-3 hs se consideran una reacción positiva presuntiva del ensayo. La ausencia de producción de gas se considera una reacción negativa. A partir del número de tubos positivos y utilizando la tabla I, informar el NMP de bacterias coliformes totales en 100 ml de muestra.

Los resultados obtenidos se corroboran sembrando en BRILA los tubos positivos de LST (sigo el mismo procedimiento que para coliformes fecales) e incubando los tubos a 37ºC. Aquellos tubos en los que se observe producción de gas y crecimiento al cabo de 48+/-3 hs se consideran una reacción positiva del ensayo. Teniendo en cuenta los tubos que fueron positivos tanto en LST como en Brila se determina el NMP/100 ml de muestra usando la tabla I.

Tabla I.

Nº de tubos positivos en LST

NMP /100 ml Límite inferior de confianza (95%)

Límite superior de confianza (95%)

0 <1.1 0 3.0

1 1.1 0.03 5.9

2 2.2 0.26 8.1

3 3.6 0.69 10.6

4 5.1 1.3 13.4

5 6.9 2.1 16.8

6 9.2 3.1 21.1

7 12.0 4.3 27.1

8 16.1 5.9 36.8

9 23.0 8.1 59.5

10 >23.0 13.5 Infinito

2.2- Determinación de presencia o ausencia de bacterias coliformes fecales. a. Medios de cultivo Caldo Verde Brillante Lactosa Bilis (BRILA) peptona 10 g lactosa 10 g Oxgall 20 g verde brillante 0.0133 g H2O destilada 1 l Preparar el medio a partir del polvo deshidratado según indicaciones del fabricante. Fraccionar de a 5 ml en tubos de ensayo comunes con campana de Durham, y luego de colocar el tapón bacteriológico se esteriliza en autoclave 15 min. a 121ºC. b. Procedimiento 1) Vortear los tubos positivos del ensayo presuntivo en LST. 2) Sembrar una ansada de los tubos positivos mencionados, en tubos de caldo BRILA

(tubos comunes con medio verde y campana). 3) Incubar los tubos a 44ºC. De preferencia usar el baño que está en el mismo mueble que

el agua destilada. Calentar agua destilada en un erlenmeyer de 500 ml en el microondas el tiempo necesario para que esté caliente (no es necesario que hierva). Agregarla en el baño y completar con agua destilada fría hasta del mismo, verificando que el agua tape el contenido de los tubos. Prender el aparato y constatar que la perilla de temperatura indique 44ºC. Después de 24+/-2 hs determinar desarrollo y

producción de gas en cada tubo. En caso de no observarse producción de gas incubar los tubos hasta 48+/-3 hs.

c. Interpretación Aquellos tubos en los que se observe producción de gas y crecimiento al cabo de 48+/-3 hs se consideran una reacción positiva del ensayo, por lo tanto se informa presencia de bacterias coliformes fecales. La ausencia de producción de gas y/o crecimiento en todos los tubos se considera una reacción negativa, y resulta en ausencia de bacterias coliformes fecales.

2.3- Identificación de E coli a. Medios de cultivo

Agar EMB (Eosina - Azul de Metileno - Lactosa): selectivo y diferencial. Peptona 10 gr Hidrógenofosfato dipotásico 2 gr Lactosa 10 gr Eosina amarillenta 0,4 gr Azul de metileno 0.065 gr Agar-agar 13,5 gr Agua destilada c.s.p. 1000 ml PH = 7

b. Procedimiento e interpretación de resultados Se realiza con el objeto de confirmar y determinar la cantidad de coliformes fecales en 100 ml de agua (en particular E. coli). Consiste en hacer aislamientos en Agar EMB a partir de uno de los tubos positivos de BRILA a 44ºC, para lo cual, con ansa en anillo, hacer 4 estrías quemando el ansa entre estrías. Incubar la placa a una temperatura de 37ºC por 24 hs. y observar las características de las colonias presentes. Las características de desarrollo de las bacterias más comunes en esta medio son: E. coli: colonias de 2 o 3 mm de diámetro, separadas, de superficie plana o cóncava, de centros oscuros casi negros, de apariencia metálica. E aerogenes: colonias de mayor tamaño, convexidad pronunciada, de centro no tan oscuro y sin apariencia metálica. Sobre las colonias aisladas se practicará el test de IMVIC (Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato). En el caso de encontrar más de un tipo de colonia oscura, sembrar todas en PCA inclinado, por separado, rotulando con el Nº de muestra y un subíndice adecuado. Incubar a 37ºC, 24 hs.

Concepto de IMVIC: esta sigla reúne las cuatro pruebas bioquímicas básicas: Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato, que se realizan sembrando las bacterias en los medios correspondientes e incubándolas a 37ºC. En todas las pruebas bioquímicas las bacterias serán sembradas en medios de cultivo que posean un sustrato (ó más), que por acción metabólica bacteriana será desdoblado originando sustancias que se evidenciarán por medio de reactivos o de indicadores de PH.

1- Prueba de Indol.

a. Medios de cultivo Caldo de Triptofano o Peptona Peptona 10 gr Cloruro de sodio 5 gr Triptofano 10 gr Agua destilada 1000 ml

Distribuir 2 ml en tubo de hemólisis. Autoclavar a 121ºC 15 min.

b. Procedimiento e interpretación de resultados Inocular tubos con caldo triptofano o agua peptonada, a partir de cultivos puros e incubar los tubos sembrados a 37ºC 48 hs. Añadir a cada tubo 2 gotas de reactivo de Kovacs. Esperar unos minutos y realizar la lectura. Indol (+) = anillo rosado en la superficie Indol (-) = no hay cambio de color (amarillo) No considerar negativo hasta 15 min. de agregado el reactivo. No mover el tubo para detectar las reacciones débiles positivas.

2- Prueba del Rojo de Metilo (RM) y Voges Proskauer (VP)

a. Medios de cultivo y reactivos Medio de Clark y Lubs (RM/VP)

Polipeptona o una peptona tamponada 7 gr Glucosa 5 gr Fosfato de potasio 5 gr Agua destilada 1000 ml

Distribuir 4 ml en tubos de hemólisis. Esterilizar 121ºC 15 min.

b. Procedimiento e interpretación de resultados Inocular tubos con medio de Clark y Lubs (caldo RM-VP), a partir de cultivos puros e incubar los tubos sembrados a 37ºC 48 horas. Después de la incubación

dividir el contenido en dos tubos, en uno revelar para RM y en el otro para VP. Para RM añadir 5 gotas de la solución acuosa de RM al 0.04% y agitar. Reacción positiva: color rojo en la superficie del medio. Reacción negativa: color amarillo en la superficie del medio. Un color rojo indica que el medio es lo suficientemente ácido como para permitir que el reactivo mantenga un color rojo (pH 4.4), y un color amarillo indica que el medio no posee un pH menor a 4.4, límite de viraje del indicador, sino que mantiene un pH por encima de 6. No agitar durante la lectura para detectar reacciones positivas débiles. Para revelar VP utilizar el tubo con la otra porción de medio de cultivo crecido. Añadir 6 gotas de solución de α-naftol y 2 gotas de KOH, agitar bien los tubos y dejarlos reposar 5 minutos inclinados, si es necesario aflojar el tapón de los tubos para que haya una buena difusión de oxígeno. No leer antes de los 10 minutos. Reacción positiva: disco rosado en la superficie. Reacción negativa: color amarillo en la superficie (mismo color del reactivo)

4-Prueba del citrato

a- Medios de cultivo y reactivos Medio de Simmons Sulfato de magnesio 0.2 g Fosfato de amonio dihidrogenado 1g Fosfato dipotásico 1g Citrato de sodio 2g Cloruro de sodio 5g Azul de Bromotimol 0.08 g Agar-agar 15 g Agua destilada 1000 ml

Distribuir en tubos de hemólisis de a 2 ml y autoclavar a 121ºC 15 minutos. Dejar enfriar los tubos en posición inclinada.

b- Procedimiento e interpretación de resultados Inocular un tubo con agar citrato Simmons usando ansa recta haciendo estrías en superficie, NO sembrar por punción. Incubar a 37ºC por 48 hs. Reacción positiva: viraje del medio que es verde a azul, producto de la alcalinización del medio, pH 7.6. Reacción negativa: sin cambio de color.

Diferenciación de enterobacterias usando IMVIC: TIPO INDOL RM VP CITRATO Escherichia coli +(V) + - - Enterobacter aerogenes - - + + Citrobacter - + - + Klebsiella - - + +

3- Determinación de Pseudomonas aeruginosa.

a- Medios de cultivo y reactivos Caldo nutritivo 10X Peptona de carne 5g Extracto de carne 5g Agar-agar 15g

Fraccionar en frascos de mermelada a razón de 10 ml por frasco, se debe pesar diez veces la masa especificada por el fabricante para ese volumen. Agar Cetrimide: selectivo Peptona de gelatina 20 g Cloruro de magnesio 1.4 g Sulfato de Potasio 10 g N-cetil-N,N,N-trimetilamonio bromuro(cetrimide) 0.3 g Agar-agar 13.6 g Glicerina 10 ml Agua destilada 1000 ml Preparar 300 ml en botella y plaquear en el momento en que se usa (se trabaja en flujo laminar. Fundir en microondas el medio de la botella y plaquear. Esperar que se sequen las placas antas de taparlas, para evitar condensación). b- Procedimiento e interpretación de resultados 1.1 Sembrar 100 ml de la muestra original en frasco con 10 ml de caldo nutritivo (10X). Llenar el frasco con la muestra hasta la marca, lo cuál se ajusta al volumen aproximado a agregar. 1.2 Incubar a 37ºC por 24 hs. 1.3 Realizar la lectura de la siembra en caldo, siendo positiva aquella que presente turbidez. 1.4 Hacer aislamiento en agar cetrimide. A partir de cada frasco con crecimiento, con ansa en anillo, hacer 4 estrías en la placa de agar cetrimide, quemando el ansa entre estrías. 1.5 Incubar a 37ºC por 48 hs. 1.6 Realizar la lectura de siembra en agar, siendo positiva la aparición de un pigmento verde azulado y fluerescente al UV, que forman las colonias de Pseudomona aeruginosa.

1.7 Identificación definitiva. Se realizan determinadas pruebas bioquímicas: 1- Prueba de oxidación-fermentación. Permite determinar la capacidad de un microorganismo de oxidar o fermentar un determinado hidrato de carbono. La fermentación es un proceso metabólico que no requiere O2. Se caracteriza por la fosforilación inicial del hidrato de carbono y requiere un compuesto orgánico como aceptor final de electrones. Los procesos oxidativos son estrictamente aeróbicos. El proceso de oxidación directa del hidrato de carbono, que se da en el grupo fluorescente del género Pseudomonas, no requiere de la fosforilación del azúcar. La glucosa se oxida a ácido glucónico o posteriormente se fosforila y degrada a ácido pirúvico. a. Medios de cultivo b. Procedimiento A partir del cultivo puro de 24 hs se inoculan con ansa recta dos tubos del medio OF. Un tubo se inocula directamente “Tubo abierto”. El segundo tubo es purgado previamente para eliminar el O2 mediante el calentamiento a Baño de María durante 15 minutos. Luego se enfría bajo canilla y se siembra por punción. Inmediatamente se cubre con 1 cm de parafina o vaselina líquida estéril, “Tubo cerrado”. Ambos tubos se incuban a 35ºC durante 48 hs. Algunos microorganismos requieren hasta 2 semanas de incubación. c. Interpretación de resultados:

Tipo de metabolismo “Tubo abierto” “Tubo cerrado”

Oxidativo Acidez (amarillo) Neutro (verde) Fermentativo Acidez (amarillo) Acidez (amarillo) Fermentativo Neutro (verde) Acidez(amarillo) Inactivo Neutro (verde) Neutro (verde)

2- Prueba de la enzima citocromo oxidasa. Se realiza para determinar la presencia de la enzima. Se utiliza para separar el grupo oxidasa positiva de la familia Pseudomonadaceae del grupo oxidasa negativa de la familia Enterobactereaceae. Esta enzima actúa, en presencia de oxígeno, activando la oxidación del citocromo “reducido” de la cadena transportadora de electrones.

citocromo reducido + O2 --------------- citocromo oxidado + H2O Un sustrato artificial puede sustituir al dador natural dentro de la cadena transportadora. Existen varios reactivos que pueden actuar como dadores artificiales de electrones. Indofenol, p-fenilendiamina, como ejemplo. Estos reactivos al ser oxidados dan un producto coloreado en forma inmediata, indicando la presencia de la enzima. Reactivo reducido + O2 --------------- reactivo oxidado + H2O a. Procedimiento Para la realización de la prueba se utilizan discos comerciales que contienen el reactivo. Se prepara una suspensión densa del microorganismo en 0,2 ml de agua (destilada o corriente). Colocar el disco en contacto con la suspensión, la aparición de color rosado en menos de 1 minuto indica Oxidasa Positivo. 3- Prueba de reducción de Nitratos. Permite determinar la capacidad de un microorganismo de reducir nitratos a nitritos, a nitrógeno o a amoníaco. La reducción de los nitratos ocurre generalmente bajo condiciones anaeróbicas. La respiración anaeróbica es un proceso donde un compuesto inorgánico es el último aceptor de electrones de la cadena respiratoria. En la reducción de nitratos las posibilidades del producto final son varias. El producto final dependerá de la especie bacteriana. El más común es el N2 y según las condiciones ya no es asimilado en el metabolismo unicelular y se elimina del medio. La reducción a N2 y N2O se denomina desnitrificación. En otra condiciones puede producirse NH3 y ser asimilado en componentes celulares que contengan nitrógeno (proteinas y ácidos nucleicos). Para poner en evidencia la capacidad de reducir el nitrato se emplea el Caldo Nitrato. a. Medios de cultivo

Caldo Nitrato Extracto de carne 3gr Peptona 5gr

NO3 1gr Agua destilada 1000 ml

Se envasa en tubos y se coloca una campanita de Durham. b. Procedimiento e interpretación Se siembra con un inóculo denso y se incuba 24hs.Luego se determina la presencia de NH3, N2 y NO2. Presencia de N 2: se verifica la presencia de gas en la campanita. Presencia de NH3: agregar a una porción del cultivo 1 ml del reactivo de Nessler (Iodomercuriato de potasio). Un precipitado color ladrillo que se observará rápidamente indica un resultado positivo. Presencia de NO2: agregar a una porción del cultivo 2 gotas del reactivo Nit-1 y luego 2 gotas del reactivo Nit-2. La aparición de un color rojo en la superficie indica reacción positiva. En caso de reacción negativa, agregar una pizca de Zn. Si permanece incoloro la reacción es positiva habiéndose liberado todo el nitrato y liberado como nitrógeno. Si aparece el color rojo confirma una reacción negativa, pues el nitrato fue reducido a nitrito en presencia del Zn, reaccionando posteriormente con los reactivos Nit-1 y Nit-2. 4- Prueba de licuefación de la gelatina

Permite determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas del tipo proteolítico (gelatinasas). Para poder ingresar a la célula bacteriana las proteínas deben ser primero catabolizadas a compuestos más pequeños. Las enzimas exocelulares de tipo proteolítico, gelatinasas, son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar las proteínas. El catabolismo puede ser considerado en dos etapas: Proteinasas

Proteínas + H2O ▬▬▬▬▬▬▬▬► polipéptidos Peptidasas

Polipéptidos + H2O ▬▬▬▬▬▬▬▬► aminoácidos

a. Medios de cultivos Gelatina nutritiva Extracto de carne 3gr Peptona 5gr Gelatina 120gr Agua destilada 1000 ml Se envasa y esteriliza.

b. Procedimiento e interpretación

Se siembra por punción. Luego se incuba a temperatura durante 24 hs a 14 días. Observar la presencia de desarrollo y licuefacción comparando con un tubo control.

5- Pseudomonas agar F Ver fundamentos en Mac Faddin Este medio con el agregado de glicerina se usa para detectar y diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras pseudomonas basado en la producción de fluoresceína. Conocido también como medio King B. Fórmula (en gramos por litro) Tripteina 10.0 Peptona de carne 10.0 Fosfato dipotásico 1.5 Sulfato de magnesio 1.5 Agar 15.0 pH final: 7.2± 0.2 Instrucciones Suspender 38 g del polvo en un litro de agua destilada. Agregar 10 ml de glicerina. Calentar con agitación constante para homogeneizar el producto. Llevar a ebullición para que se disuelva por completo. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 121 ºC. Control de calidad

Microorganismos Crecimiento Producción de pigmento

Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853 Bueno Verde amarillento

Pseudomonas cepacia Bueno No pigmenta

Pseudomonas agar P Este medio con el agregado de glicerina se usa para detectar y diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras pseudomonas basado en la producción de piocianina. Conocido también como medio King A. Fórmula (en gramos por litro)

Peptona de gelatina 20.0 Sulfato de potasio 10.0 Cloruro de magnesio 1.4 Agar 15.0 pH final: 7.0± 0.2 Instrucciones Suspender 46.4 g del polvo en un litro de agua destilada. Agregar 10 ml de glicerina. Calentar con agitación constante para homogeneizar el producto. Llevar a ebullición para que se disuelva por completo. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 121 ºC. Control de calidad

Microorganismos Crecimiento Producción de pigmento

Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853 Bueno Azul

Pseudomonas cepacia Bueno No pigmenta