Què passa quan un iogurt caduca?

Anàlisi microbiològic del iogurt

Alicia Espiña Bou

2batxA Curs 2015-2016

Tutora: Carol Fernández

Data de presentació: 10/12/2015

Àmbit: Científic

1

Índex

1. INTRODUCCIÓ……………………………………………………………………………….……..…2

2. ASPECTES TEÒRICS

2.1. Introducció a la microbiologia………………………………………………………………..……..……4

2.2. Tècniques d’identificació de bacteris………………………………………………………..………..5

2.3. Medis de cultiu…………………………………………..…………………………………………………..….6

2.4. Iogurt………………………………………………………………………………………..………………..….....7

2.5. Bacteris del iogurt……………………………………………………………………………………….………9

3. ASPECTES PRÀCTICS

3.1. Objectius i hipòtesi..................................................................................................12

3.2. Material...................................................................................................................13

3.3. Procediment............................................................................................................16

3.4. Resultats..................................................................................................................26

3.5. Conclusions........................................................... .................................35

4. AGRAÏMENTS…………………………………………………………………………………..……..……..38

5. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………..……..…….39

2

1. INTRODUCCIÓ

Des de petita he estat interessada per la ciència, considerava treballar a un laboratori un

procés màgic d’investigació per trobar totes les respostes. Aquest sentiment va incrementar-se

en el moment que vaig decidir estudiar el batxillerat científic i continua augmentant ara que

tinc la intenció de dedicar-me a la ciència. Fa un parell d’anys vaig començar a interessar-me

específicament per l’àmbit de la nutrició. Seguir una dieta adequada és la millor recepta per

tenir una vida llarga i saludable. I és per això que moltes vegades dubtem si un producte

caducat és o no bo per a la nostra salut. Són aquestes les raons que em van fer triar un treball

que combinés la recerca en un laboratori amb la nutrició.

Aquest treball de recerca té com a objectiu mostrar una comparació microbiològica entre

iogurts caducats i no caducats. Vaig triar la data de caducitat com a variable a tenir en compte

perquè considero molt interesant veure els canvis que hi ha dins d’un producte caducat.

Sempre he sentit dir que a partir d’aquell moment un iogurt no es pot menjar, pot estar

contaminat i pot perjudicar la salut. Però... Què és el que passa per a que un producte estigui

perfecte i a les 24 hores ja s’hagi de llençar? Hi ha un canvi tant significatiu? Aquest treball

intenta respondre aquestes preguntes.

Aquest projecte es divideix en dues parts; la teòrica i la pràctica. Als aspectes teòrics s’exposen

conceptes bàsics imprescindibles per poder entendre la part pràctica, com nocions de la

microbiologia, els tipus de medi de cultiu i el iogurt i els seus bacteris entre d’altres. La part

pràctica, d’altra banda, està dividida segons l’estructura bàsica d’un projecte científic; hipòtesi,

material, procediment, resultats i conclusions. Aquesta part la vaig dur a terme al laboratori de

microbiologia de la facultat de veterinària de la universitat autònoma de Barcelona (UAB) on

vaig fer un anàlisi microbiològic bàsic per detectar els bacteris dins de cada iogurt i

paral·lelament vaig comparar la viabilitat d’un patogen en aquests mateixos iogurts.

La meva intenció amb aquest treball és que la propera vegada que tinguem un iogurt a les

nostres mans pensem que allà dins hi ha vida.

3

2.ASPECTES TEÒRICS

4

2.1 INTRODUCCIÓ A LA MICROBIOLOGIA:

La microbiologia és la ciència que estudia microorganismes o microbis; organismes tan petits

que no poden ser observats a simple vista. Es poden trobar per tots llocs en quantitats

enormes i moltes vegades no hi som conscients, fins i tot desconeixem la seva gran varietat i

utilitat. Podem arribar a trobar alguns que ens perjudiquen produint malalties, algunes d’elles

mortals com per exemple el bacteri Mycobacterium tuberculosis causant de la major part dels

casos de tuberculosi1. No obstant això, els microorganismes no han de ser tractats com

proscrits; el seu paper en l'ecosistema, com a recicladors de matèria els fan guanyar molts

punts. A més, són indispensables en alguns processos industrials i investigacions científiques.

La microbiologia engloba aspectes d’identificació i classificació dels microorganismes,

l'explicació del seu origen i la seva evolució i l'observació de les interaccions que es produeixen

entre ells o amb altres éssers vius.

Aquesta ciència va començar i es va desenvolupar lligada a dos grans esdeveniments. El primer

d'ells va ser l'aparició de grans epidèmies que assolaven Europa, el que va portar als científics a

preguntar-se qui eren els causants d'aquestes. El segon va ser el desenvolupament d'una

adequada tecnologia per procedir a l'estudi d'aquests éssers; aquesta tecnologia va ser la

microscòpia. Aquests fets van incentivar als científics a investigar cap a aquesta branca de la

biologia.

En microbiologia s'estudien altres estructures que no s'inclouen dins de cap taxonomia, ja que

no són éssers vius. Aquestes estructures són els virus , els viroides i els prions. La seva inclusió

dins d'aquesta branca de la biologia es deu la seva petita mida i a la capacitat per generar

infeccions dins dels éssers vius que envaeixen.

1 Extret d’un article publicat en l’edició d’abril de 2013 de la revista QUO.

5

2.2 TÈCNIQUES PER DETECTAR BACTERIS AL LABORATORI

La identificació bacteriana és un procés indispensable per a qualsevol projecte de

microbiologia. De bacteris hi ha moltíssims i per tots llocs, es podria arribar a dir que són

omnipresents, és difícil posar un exemple d’un lloc totalment esterilitzat.

Per fer aquest projecte vaig utilitzar principalment una única tècnica per detectar bacteris; la

tinció de gram. Tot i això també cal esmentar la prova de l’oxidasa i catalasa i l’API, un

mecanisme que consta de diverses proves bioquímiques per identificar bacteris.

La tinció Gram és un dels processos més utilitzats a l'hora de determinar al microscopi òptic la

filogènia d'un microorganisme sent una de les primeres proves que es fan per classificar a un

possible patogen.

- Teoria de la tinció:

El procediment es pot resumir de la següent manera: s'afegeix el colorant violeta de genciana,

el qual es deixa en contacte per 2-3 minuts. Posteriorment es renta l'excés de colorant amb

aigua, després s'afegeix lugol, que actua com a mordent, i es deixa en contacte per un 1 minut.

Això forma un compost que precipita a l'interior de la cèl·lula; aquest es pot extreure fàcilment

amb alcohol etílic en les gram negatives, però no s’elimina en les gram positives. Un cop

realitzada la decoloració s'afegeix el colorant de contrast, la safranina (colorant vermell), la

qual es deixa en contacte

per 2-3minuts; l'excés de

colorant s'elimina amb

aigua.

Finalment, les mostres

s'assequen a temperatura

ambient o amb l'ajuda del

bec de bunsen.

Font: http://bit.ly/1XB6ale

6

El perquè els bacteris gram positius retenen el tint violeta i les gram negatives no, ha estat un

tema molt controvertible. Una de les explicacions que es donen manté que el gruixut

embolcall cel·lular de les gram positives, es deshidrata i s’encongeix per l'efecte de l'alcohol, i

això ocasiona el tancament dels porus la qual cosa impedeix la sortida del tint violeta. Doncs la

gran diferència entre els bacteris gram positius i gram negatius rau en els components de la

paret cel·lular.

2.3 MEDIS DE CULTIU

Els microorganismes necessiten una aportació constant de nutrients per viure. Generalment

obtenen aquests requeriments nutritius del medi on habiten, però quan s’intenta fer créixer

microorganismes al laboratori cal aportar-los a través de medis artificials de creixement. El

medi de cultiu ha de ser un conjunt de nutrients i factors que creïn les condicions necessàries

per al creixement dels microorganismes.

Hi ha moltíssims tipus de medis de cultiu però a continuació s’explicaran breument els que es

van utilitzar per a dur a terme aquest projecte.

- Medi TSA: El TSA Agar és un medi d'ús general que permet el creixement tant de

microorganismes exigents com no exigents. Com és un medi general, hi haurien de

créixer tots els microorganismes.

- Medi MRS: És un medi que evidencia un bon creixement de bacteris de l’àcid làctic;

Streptococcus thermophilus i Lactobacillus bulgaricus.

- Medi S: El medi Sabouraud és aquell on creixen els fongs, la seva temperatura òptima

és 28º.

- Medi MK: Aquest medi s'utilitza per l'aïllament de bacils Gram negatius. És el medi

ideal per enterobacteries.

- Medi TSN: És un medi selectiu que detecta un bacteri en concret: Clostridium

perfringens. S’inocula una quantitat de 1mL i necessita un medi anaeròbic.

Aquest bacteri és una de les causes més comunes d'intoxicació alimentària que genera

prop d'un milió de malalties per any.

- Medi BK: Baird-Parker és un medi moderadament selectiu que detecta Staphylococcus

aureus en la mostra a analitzar.

7

2.4 IOGURT

El iogurt es defineix com el producte de llet coagulada obtingut per fermentació làctica amb

bacteris Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus, que continguin com a mínim

deu milions de colònies (107) per gram o mil·lilitre de producte.2

Dins del procés d’obtenció del iogurt hem de distingir dues grans fases:

1. Fermentació làctica

La fermentació és el pas més important per a fer un iogurt, és el procés de la transformació del

piruvat cap a l’àcid làctic propi del iogurt. Aquesta fermentació làctica la duen a terme

Streptococcus i el Lactobacillus.

La formació de l’àcid làctic produeix una acidificació que modifica les característiques físiques

de la llet, el producte es coagula formant una textura semi-sòlida i el pH baixa a causa de la

incorporació del àcid, provocant un canvi de sabor, aroma y consistència.

2. Pasteurització

El iogurt es composa de bacteris incorporats en la fermentació làctica i de llet pasteuritzada o

higienitzada. La llet pasteuritzada és aquella que ha sofert un tractament tèrmic d‘escalfament

a com a mínim 60ºC durant vint minuts per eliminar gairebé tots els microorganismes, incloent

els patògens. Tot i això els bacteris esporulats segueixen vius. Aquesta és la diferència entre la

llet pasteuritzada i l’esterilitzada, on el 100% dels microorganismes moren3.

Un iogurt pot ser pasteuritzat abans o després de la fermentació. Els primers son aquells que,

una vegada la llet està pasteuritzada o higienitzada, es fermenten amb Lactobacillus bulgaricus

i Streptococcus thermophilus i per tant es coagulen i baixen el pH. Macroscòpicament es pot

veure la formació d’una pel·lícula de consistència semi-sòlida.

Els pasteuritzats després de la fermentació son aquells productes que, com a conseqüència de

l’aplicació de calor posterior a la fermentació, els bacteris làctics moren. D’aquesta manera es

perden tots els beneficis dels bacteris obtinguts a la fermentació. A simple vista, es pot

distingir perquè no formen una superfície llisa com l’altre (la llet no s’ha coagulat del tot). A

més, no necessiten estar a la nevera i la seva data de caducitat pot durar mesos. Aquest tipus

2 Definició extreta de: http://www.boe.es/boe/dias/2003/02/18/pdfs/A06448-06450.pdf

3 MANS, Cl. 2006. “Llet i productes làctics”. A: Els secrets de les etiquetes. La química els productes de casa.

Barcelona: focus. P.212

8

de postres es ven a Espanya sota el nom “postres làctics” ja que no compleixen la definició

prèviament formulada i per aquesta raó no ens podem referir a ells amb el terme de iogurt.

2.1. Bacteris esporulats

Els bacteris amb espores o endospores són aquells que poden resistir condicions extremes;

temperatures molt altes, i és per això que durant la fermentació no són eliminats, medis molt

àcids o molt bàsics i també poden resistir

radiacions X i gamma. La seva funció primària

és assegurar la supervivència en temps de

tensió ambiental.

Els més habituals són els del gènere Bacillus.

La seva temperatura òptima de creixement

oscil·la entre els 28 i 40 ºC encara que

existeixen alguns, que poden desenvolupar-se

a 55 ºC i fins i tot 70 ºC.

Les endospores són difícils d'observar al

microscopi a causa de la impermeabilitat de la seva paret que evita l'entrada dels colorants

emprats en les tincions ordinàries. D’aquesta manera es veu tot el bacteri tenyit menys una

part descolorida (l’espora). A causa d'això va sorgir la tècnica coneguda com Tinció de Möller,

que permet que es mostri la endospora en color vermell, mentre que la resta de la cèl·lula

roman en color blau com s’observa en la fotografia anterior

Font: http://bit.ly/1MYeEhi

9

2.5 BACTERIS QUE CONTENEN ELS IOGURT

Al mercat hi ha molts tipus de iogurt; amb bífidus, amb L.casei... Però en aquest treball ens

centrem en el iogurt blanc natural, i aquests incorporen dos bacteris utilitzats en la

fermentació làctica: Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus.

Lactobacillus bulgaricus.

El primer bacteri que trobem al iogurt és l’anomenat Lactobacillus bulgaricus, aquest és capaç

de degradar el piruvat i obtenir àcid làctic. Per a la fermentació necessita unes condicions

anaeròbiques, aquelles on no hi ha oxigen, tot i que el bacteri és tolerant a aquest gas doncs

és un bacteri anaeròbic aeroresistent.

Podem destacar 4 característiques del Lactobacillus bulgaricus.

- És un bacteri bacil: en forma de bastó (fig2.)

- Reacciona negativament a la catalasa:

La catalasa és un enzim que descompon el peròxid

d'hidrogen en oxigen i aigua.

Si un bacteri és positiu a la catalasa reacciona amb el

peròxid d’hidrogen formant aigua i oxigen que surt en

forma de bombolles.

Aquest bacteri no posseeix aquest enzim.

- Reacciona negativament a la oxidasa:

Aquesta prova serveix per determinar la presència d'enzims oxidases. S’utilitzen tires de paper

impregnades amb un reactiu que s’oxida per l’enzim la oxidasa. Si els bacteris tenen aquest

enzim el reactiu de la tira de paper canvia a un color blau-violeta. Si no el posseeix, no canvia

de color.

- És un bacteri gram-positiu: explicat a l’apartat 2.

2.Font:http://museodelaciencia.blogspot.

com.es/2008/09/microorganismos-que-

no-te-quiten-el.html

10

Streptococcus thermophilus

El segon bacteri present al iogurt és Streptococcus thermophilus que és juntament amb el

Lactobacillus bulgaricus responsable de la fermentació del iogurt.

Les seves característiques són les següents:

- És un coc

Els cocs són bacteris amb forma d’esfera. En algunes

espècies apareixen agrupades seguint diferents

patrons; Streptococcus (formant cadenes),

Staphylococcus (en forma de raïm) ...

- Reacciona negativament a la oxidasa i

catalasa

- És gram-positiu

Autora: Mariana Ruiz LadyofHats.

Font: wikipedia.org

11

3. ASPECTES PRÀCTICS

12

3.1 OBJECTIUS i HIPÒTESI

Els objectius d'aquest treball són els següents:

(1) Analitzar microbiològicament el iogurt i veure els seus bacteris al microscopi.

(2) Comparar les diferències del nombre de bacteris d'un iogurt normal, d'un caducat

d'un dia i d'un altre caducat d'un mes i mig.

(3) Analitzar i comparar la capacitat de reducció d'un patogen incorporat a un iogurt

caducat i a un no caducat.

(4) I per últim, com a objectiu personal, aprendre tècniques de laboratori i la

microbiologia

En el moment de fer aquesta pràctica s'ha de tenir molt en compte les possibles variables dels

iogurts. S’utilitzaran 3 iogurts de la mateixa marca i del mateix tipus (iogurts naturals sense

sabor ni edulcorant) l’única variant que entra en joc és la data de caducitat. Hi haurà iogurts no

caducats (aquests seran utilitzats de control), iogurts caducats d'un dia i caducats de mes i mig

aproximadament. A continuació s’explicaran breument de què tracten aquests objectius

esmentats prèviament.

El primer objectiu d’aquesta pràctica és ser capaç de veure al microscopi els bacteris del iogurt.

Aquests, com s’han explicat als aspectes teòrics, són Streptococcus i Lactobacillus utilitzats per

a la fermentació de la llet. Doncs s’observarà el seu comportament i el d’altres bacteris que

provinguin de la llet i no s’hagin eliminat durant la pasteurització. S’espera que no hi hagi cap

tipus de canvi, pel que fa a la morfologia, en cap dels tres iogurts i que en tots aquests s’hi

trobin els mateixos bacteris.

Pel que fa a l’objectiu 2, es compararà el nombre de colònies dels bacteris dels tres iogurts

amb dates de caducitat diferents. El resultat que s'espera obtenir és una lleugera disminució

del nombre de colònies a la placa MRS (on hi ha l'àcid làctic i on es trobaria els bacteris

Streptococcus i Lactobacillus) això és perquè es considera que un iogurt caducat té una pitjor

qualitat microbiològica i d’aquesta manera els seus bacteris trigarien més a créixer.

Esperaríem també un augment de colònies a la placa TSA, de medi general, on sortirien tota

mena de bacteris, no procedents de la fermentació làctica, ja siguin bacteris patògens,

13

esporulats o contaminants. Doncs la qualitat bacteriana disminuiria amb el temps de caducitat,

des d’unes perfectes condicions del iogurt no caducat fins a unes lleugerament més nefastes

del iogurt caducat de mes i mig.

Paral·lelament, s'espera que la vida útil dels bacteris tingui relació amb la incorporació del

patogen (l’objectiu 3 del treball), això significa que, si trobem menys unitats formadores de

colònies de l’àcid làctic al iogurt caducat, hi hauria més possibilitats que aquest quedés

contaminat. Doncs a més bacteris, més protecció.

3.2 MATERIAL

TREBALL AL LABORATORI

Per dur a terme aquest projecte vaig treballar a un laboratori de microbiologia de la

Universitat Autònoma de Barcelona i tot el material utilitzat, menys les pròpies mostres del

iogurt, ha sigut proporcionat per la mateixa universitat.

Cal tenir en compte que per a treballar en un projecte científic com aquest s’ha de tenir molta

cura amb el material i intentar no desaprofitar-ho ni malgastar-ho, per aquesta raó no vaig fer

tantes rèpliques com m’hagués agradat, sinó que vaig optar per fer les estrictament

necessàries.

Per últim vull emfatitzar la importància de

l’esterilització a l’hora de treballar en un laboratori.

Esterilitzar significa destruir la totalitat dels

microorganismes que hi ha en un objecte, un

producte, un medi o un ambient. Aquest pas és el més

important de tots, ja que podem trobar

microorganismes per tot arreu i el simple fet de posar

el iogurt a un recipient no esterilitzat pot distorsionar

tots els resultats.

Per evitar tot això hem de treballar amb material completament esterilitzat com pots de

plàstic, hisops... però tot i això hem d’intentar treballar sempre amb guants i vora al foc com es

pot veure a la fig(1) realitzada per mi mateixa al laboratori.

1. Font: Pròpia

14

LLISTAT DEL MATERIAL PER ORDRE ALFABÈTIC

. Alcohol per netejar i esterilitzar

. Bec de bunsen

. Guants i bata de laboratori

. Llapis per retolar les mostres de la tinció

. Medis de cultiu TSA, MRS, MK, S, TSI i BK

. Nansa de Kolle

. Nansa de digralsky

. Oli d’immersió (pel microscopi)

. Parafilm

. Pipeta electrònica blava (1mL) i groga (1µL)

. Portaobjectes

. Pots de plàstic estèrils

. Provetes amb Ringer per a fer bancs de dissolució

. Puntes blaves i grogues de la pipeta electrònica

. Retolador permanent per retolar les plaques

. Components per fer la tinció de gram: Violeta de Genciana, Lugol, Alcohol acetona,

Safranina i aigua

Maquinària

Campana de

flux laminar

És un aparell que empra un

ventilador que proporciona

aire net a la zona de treball,

lliure de partícules de fins a

0.1 micres.

Font: http://www.ecogen.com/producto.asp?id=188

15

Estufes i

neveres

Són aparells amb una

temperatura idònia per al

creixement de cultius.

Es van utilitzar estufes de

37ºC, 28ºC, 5%CO2,

anaeròbiques i neveres de 4ºC

Font:http://www.mushiberica.es/equipamiento/segu

nda_mano.php

Microscopi

olympus CX21

És un instrument que s’utilitza

per a observar bacteris.

L’augment principal que vaig

utilitzar era x100

Font:http://www.olympuslatinoamerica.com/spanish/

seg/seg_product_detail_esp.asp?g=904&s=11&c=53&

d=2#

pH-metre És l’instrument electrònic de

mesura que s'utilitza per

determinar el pH d'un líquid.

Font: Pròpia

16

Vòrtex És un agitador que s'usa

comunament en els

laboratoris per homogeneïtzar

el contingut de petits tubs de

líquid.

Font:http://www.vortex-mixer.com/

Llevat d’això s’utilitzen els iogurts caducats, no caducats i el microorganisme patogen

Staphylococcus aureus que és proporcionat pel laboratori de microbiologia de la UAB.

3.3 PROCEDIMENT

Per a dur a terme aquest treball pràctic vaig assistir a la universitat cada matí durant gairebé 4

setmanes, tot i això, vaig fer algunes pràctiques prèvies per a poder aprendre a treballar a un

laboratori i saber gestionar els diversos aparells i eines.

Considero que aquest treball té dues branques ben diferenciades però alhora molt

relacionades; l’objectiu 1 i 2 on es mira allò que hi ha dins del iogurt, i l’objectiu 3 que es

centra en la incorporació d’un microorganisme extern dins el iogurt. Per aquesta raó dividiré la

part procedimental en aquests dos camins diferents però que ens guien a un resultat comú.

En aquest apartat es detallarà pas a pas tots els processos que es van seguir en el moment de

realitzar l’experiment

17

OBJECTIU 1 i 2

1.0 Introducció.

Tant per l’objectiu 1 i el 2 primer de tot s’havia d’analitzar microbiològicament el iogurt. Per

fer-ho s’ha de posar el producte a analitzar a diferents medis de cultiu (MRS, TSA, MK...) per a

poder veure, uns dies més tard, quin ha sigut el creixement i poder contar les colònies.

Una de les condicions per poder posar el producte a una placa és que aquest sigui en un estat

més aviat líquid o en una dissolució. En tot cas, com el iogurt natural té una consistència

parcialment sòlida es va sacsejar fins a obtenir una mescla completament líquida. Una vegada

així, el producte està llest per a començar la inoculació, la implantació dels bacteris del iogurt

al medi.

A partir d’aquest moment s’ha de treballar al costat de la flama del bec de bunsen o en una

campana de flux laminar per a assegurar la no-contaminació de cap mostra. A continuació

dividirem el contingut d’un iogurt en dos pots esterilitzats. Per tant, obtindrem dues rèpliques:

1 i 2. fig(2).

Una vegada tenim els dos pots retolats amb la meitat del iogurt (aproximadament) és hora de

posar-ho en plaques. Es divideix aquest procés en dos parts; quan s’inocula i per tant queda

una petita mostra dins de la placa i quan s’expandeix.

1.1 Inoculació

Un pas previ a la inoculació és retolar les plaques. Com s’ha vist a l’apartat anterior, vaig dividir

el contingut del iogurt en dos pots diferents (1 i 2) però eren encara poques rèpliques i el

resultat no seria gaire significatiu. Doncs vaig decidir repetir cada placa dues vegades (A i B)

D’aquesta manera obtindria 4 resultats en 4 plaques diferents; (1A, 1B i 2A, 2B).

Inocular, segons el diccionari de l’institut d’estudis català, és el fet d’implantar microbis o altre

material sèptic a un medi de cultiu. Es fa mitjançant una pipeta elèctrica i les seves puntes

corresponents. En aquest projecte només utilitzarem dues de diferents; les pipetes grogues,

2. Font: Pròpia

18

que agafen 100μL, i les blaves, que agafen 1mL. Una vegada es té la quantitat necessària la

deixem anar a cada placa.

A continuació hi ha un llistat dels medis utilitzats a les diverses condicions i la quantitat

corresponent.

- Medi TSA:

Es va posar aquesta placa a 37º i 4º. Es fa aquesta distinció per a

buscar totes les possibilitats de trobar bacteris.

4º : La placa que es guardarà a 4º per simular el

medi ideal que trobaria un bacteri dins de la

nevera.

37º: A 37º en canvi es vol veure el creixement de

tots els bacteris que poden créixer en un medi

ideal però fora de la nevera.

A aquestes plaques s’inocula una quantitat de 100µL.

Font: Pròpia

Font: Pròpia

19

- Medi MRS:

Al medi MRS es faran 3 distincions pel que fa a les condicions de respiració.

5%CO2

Anaeròbiques o sense oxigen

Aeròbiques o amb oxigen

- Medi S:

- Medi MK:

- Medi TSN: A aquesta placa s’inocula una quantitat de 1mL

1.2 Extensió per la mostra

Un cop tenim la placa amb una gran gota de la mostra, s’ha d’estendre per tot el medi. Per a

fer-ho es necessita una nansa de digralsky i un petit plat o un recipient amb alcohol.

El procediment és bastant mecànic, primer de tot s’ha de submergir la nansa a l’alcohol, de

manera que la part que forma un triangle quedi impregnada. Seguidament es passa aquesta

nansa amb alcohol pel foc, en aquest moment es crearà una flama que s’alimentarà de

l’alcohol durant una estona. Un cop el foc hagi consumit tot l’alcohol, la flama s’apagarà i per

tant la nansa estarà esterilitzada. fig(3)

3. Font: https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-

microbiologia/indice/esterilizacion/Asepsia-y-esterilizacin

A aquestes plaques s’inocula una quantitat de 100µL

20

A continuació s’obra la placa i refredem la nansa a la tapa, si no ho féssim podríem matar als

bacteris a causa de l’elevada temperatura. Després passem la nansa per tota la placa amb

l’objectiu d’estendre la petita mostra de iogurt per tots llocs, un cop fet això, retornem la

nansa al recipient amb l’alcohol i tanquem la placa. Les posem a les estufes corresponents, ja

sigui 37º, 5%CO2… I esperem el temps necessari.

1.5. Temps d’espera

Un cop hem posat les plaques a les seves condicions corresponents de temperatura i d’oxigen

cal esperar fins al seu creixement.

Els bacteris de les plaques TSA (de medi general) triguen a créixer entre 24h-48h. Els de les

plaques MRS (àcid làctic) triguen 48h i els fongs de les plaques S triguen entre 5 a 7 dies

aproximadament. El pas següent és contar les colònies i anotar el creixement de cada placa.

1.4. Contar colònies

El següent pas és el de contar les colònies. Les colònies són un conjunt d’individus de la

mateixa espècie estretament relacionats entre ells, de disposició i forma característica.

Contar colònies és el pas més feixuc però alhora el més important, es recomana contar les

colònies d’una placa si hi ha 30 o 300 d’aquestes. Doncs si trobem una placa amb més de 300

colònies, s’hauria de dur a terme un banc de dissolucions, que s’explicarà en l’apartat 2.1. En

aquesta següent fotografia fig(4) es pot determinar que només hi ha dues colònies malgrat la

seva forma irregular.

4. Fotografia d’una colònia al medi TSA. Font: Pròpia

21

Tot i això, si tenim una placa amb molta població, es pot fer una divisió d’aquesta i contar les

colònies de la meitat de la placa i més tard multiplicar aquest resultat per dos i així obtenir una

aproximació de totes les colònies de la placa. Es poden fer 2, 4 i fins a 8 divisions per a què

sigui més fàcil contar les colònies. Tot i això, cada vegada que es fa una divisió es perd

exactitud.

Hi ha diversos tipus de colònies i de diferents formes. A continuació veiem dues plaques amb

que creen, com es pot observar, formes completament diferents.

La unitat del sistema internacional per indicar el nombre de colònies és UFC/mL. Doncs cal

multiplicar per 10 els resultats de les plaques on es va inocular amb µL. A continuació veiem un

exemple:

5 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠

𝑒𝑛 100µ𝐿∙

1000µ𝐿

1𝑚𝐿= 50

𝑈𝑛𝑖𝑡𝑎𝑡𝑠 𝐹𝑜𝑟𝑚𝑎𝑑𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐶𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠

𝑚𝐿

Cal emfatitzar la importància de contar les colònies correctament en aquest treball, perquè un

dels grans objectius d’aquest projecte és, de fet, fer una comparació entre el nombre de

bacteris de iogurts caducats i no caducat. Doncs es van contar les colònies de les 4 rèpliques i

es va fer una mitja aritmètica seguint la següent formula:

` Font: Pròpia

La primera fotografía (placa TSA) mosta 3 colònies irregulars en forma i tamany. La segona placa (BK) mostra colònies regulars

totalment rodones.

22

�̅� =∑ 𝑥𝑖

𝑛→1

𝑁 ; �̅� =

𝑥1+𝑥2+𝑥3+𝑥4…+ 𝑥𝑛

𝑁

1.6. Identificació de bacteris

Un cop tenim totes les colònies localitzades, és hora d’identificar els microorganismes que la

formen. Per fer això hi ha dos procediments diferents depenent de si es tracta de fongs i

llevats o de bacteris. I ja que el iogurt és un producte sense fongs ni llevats, només utilitzarem

la tècnica per detectar bacteris. Aquesta tècnica és la tinció de gram que s’ha explicat dins

l’apartat 2 dels aspectes teòrics.

Tot i això, utilitzant la tinció de gram no s’identifiquen els bacteris, sinó que és una tècnica per

poder determinar si aquests són gram positiu o negatiu. A més amb aquesta tinció podem

veure la forma que tenen al microscopi i, això, és de gran ajuda en el moment d’identificar

bacteris. Podem determinar si es tracten de cocs, bacils… però no es pot certificar el nom

exacte complet. El que s’hauria de fer en aquest cas és utilitzar un API (Analytical Profile

Index). Aquest és un mètode d’identificació de bacteris ràpid i eficaç, que t’identifica el bacteri

exacte (tipus i subtipus). Malgrat això, aquest és un sistema molt car i no era completament

essencial utilitzar-ho. Però mitjançant diverses proves bioquímiques vaig poder arribar a la

mateixa conclusió i identificar els bacteris que vaig trobar a les meves plaques.

Un cop contades les colònies i identificats els bacteris, ja podem dir que hem complet

l’objectiu 1 i 2.

OBJECTIU 3

Paral·lelament al procediment que vaig seguir per a poder analitzar i comparar els nombres de

bacteris dels iogurts, vaig fer un petit apartat on vaig incorporar un patogen anomenat

Staphylococcus aureus al iogurt no caducat i al que estava caducat per 1 mes i mig. Doncs el

principal objectiu d’aquest nou apartat era veure i analitzar la diferència del percentatge de

reducció d’aquest patogen. A continuació esmentaré tots els passos que vaig seguir per a

poder dur a terme aquesta recerca.

23

5.Font:http://www3.udg.edu/publicacions/vell/electroniques/Int

roduccio_Biotecnologia_practica/pdf/01_introduccio_al_laborat

ori_microbiologic.pdf

2.1. Fer una solució amb el patogen establert

Per a incorporar alguna cosa amb una pipeta elèctrica a una placa cal que aquest producte

sigui líquid i per això és essencial preparar una dissolució amb el patogen. S’agafa amb la

nansa de Kolle una de les colònies del Staphylococcus que vaig trobar a una placa i la barregem

amb una proveta que conté 9mL de Ringer. El Ringer una dissolució de diverses sals dissoltes

en aigua amb el propòsit de crear una solució isotònica.

Una vegada tenim la colònia dissolta amb el Ringer (es pot utilitzar el vòrtex per fer la barreja)

és moment de fer el banc de dissolucions. Un banc de dissolucions és una tècnica que

consisteix a disminuir la quantitat de

solut d’una dissolució. Trobo que la

millor manera d’explicar-ho és

mitjançant aquesta fotografia fig(5).

En aquest cas veiem que la mostra

mare és el recipient més gran.

D’aquest, s’agafa 1mL i el deixem anar

a una proveta de 9mL de Ringer, per

tant, la mostra que teníem queda

rodejada d’un dissolvent estèril.

Aquesta seria una mostra de 10-1 més

petita que la original. D’aquesta

mostra es torna a agafar 1mL i s’aboca

a una altra proveta de 9mL, aquesta

seria la mostra 10-2. Aquest

procediment es fa contínuament fins a

arribar a una solució de 10-4, que es va

considerar suficientment dissolt.

Una vegada tenim la mostra mare i les dissolucions és moment de posar-les en plaques. Això

es fa per a què, més tard, puguem contar les colònies i tinguem una xifra bastant exacta del

nombre de colònies que hi ha. Doncs sembrem 5 plaques: la mostra mare, la 10-1, 10-2, 10-3 i

10-4 seguint el procediment d’inoculació i extensió per la placa de l’apartat 1.1. El medi

24

corresponent per a sembrar el Staphylococcus és Baird-Parker. A continuació es veu una

fotografia que fa d’exemple a un banc de dissolucions fig(6).

2.2. Incorporació del patogen dins el iogurt.

El que es volia simular amb aquest petit experiment és veure el que passaria si un iogurt que

està a la nevera ha quedat, per qualsevol motiu, infectat amb un bacteri perjudicial. Per fer-ho

primer de tot s’ha d’incorporar el patogen dins el iogurt.

Hi ha diverses maneres d’incorporar-ho, però vaig intentar fer el més natural sense manipular

gaire el producte, ja que, si ho hagués fet, els resultats no serien gens realistes i això és el que

he intentat evitar.

Doncs l’objectiu era posar el patogen sense arribar a obrir la tapa del iogurt, per tant, es va

refregar un tros de paper mullat amb alcohol a la tapa del iogurt de manera que la tapa queda

completament neta. A continuació es va fer un petit forat amb la pipeta i es va incorporar

100µL de la dissolució mare al iogurt. Ràpidament es posa Parafilm rodejant el iogurt i es tanca

el màxim que es pugui.

2.3 Temps d’espera

A partir d’aquest instant vaig esperar dos dies per veure que passa dins el iogurt. Durant

aquests dos dies el iogurt romandrà dins la nevera.

6. Font: Pròpia

25

2.4 Sembrar el iogurt amb el patogen

Dos dies després, traiem el iogurt i el sembrem. Per a saber quant ha variat, es tronarà a fer un

banc de dissolucions com la fig(5).

Agafem 5 plaques de Baird-Parker i

sembrem una directament (mostra

mare) i a continuació fem un banc

de dissolucions tal com s’ha

explicat abans, de manera que

tenim una placa 10-1, 10-2, 10-3 i 10-4

Aquesta fotografia fig(7) es va fer

moment abans de començar a

sembrar el iogurt amb el patogen a

les plaques. Es pot veure el iogurt

amb el patogen envoltat amb Parafilm, els tubs amb Ringer, les plaques Baird-Parker a

l’esquerra per a fer el banc de dissolucions i les puntes blaves i grogues a la dreta. Sempre

recordant que les puntes blaves (1mL) són per fer el banc de dissolucions i les grogues per a

posar la dissolució a la placa (100µL).

2.5 contar colònies i comparar.

Aquest és l’últim pas, on s’han de contar les colònies. Com es van fer bancs de dissolució és

fàcil contar-les sempre recordant que cal escollir la placa amb entre 30-300 colònies.

A continuació mitjançant un exemple es podran veure tots els càlculs que cal seguir per a

obtenir el resultat amb les unitats correctes del sistema internacional:

7. Font: Pròpia

8. Font: Pròpia

26

Placa aeròbica, amb un 5% de CO2 i anaeròbica

respectivament

3.4 RESULTATS

Una vegada tot el procediment està explicat, ens centrarem en els resultats obtinguts.

Objectiu 1

L’objectiu 1 consisteix a analitzar

microbiològicament el iogurt i poder veure els

seus components al microscopi. Tots els

procediments per fer-ho s’han explicat

prèviament.

Vaig obtenir gairebé els mateixos resultats als

tres iogurts pel que fa l’aparició dels bacteris,

doncs, a tots els iogurt s’hi trobava el mateix,

amb una petita excepció que s’explicarà més

endavant.

Primer de tot, es parlarà de la placa MRS. Vaig

posar les plaques a tres condicions diferents;

aeròbic, anaeròbic i amb un 5% de CO2. A

continuació s’exposaran les diferències

morfològiques entre elles.

Com es pot observar les tres plaques hi ha dos

tipus diferents de bacteris; bacils (forma de

bastó) i cocs (forma rodona) que es consideren

que són Lactobacillus i Streptococcus

respectivament. A l’apartat 1.6 (identificació de

bacteris) s’ha fet un petit incís a aquest

resultat. No es pot determinar que aquests

bacils i aquests cocs siguin Lactobacillus i

Streptococcus, per poder-ho fer hauríem

d’utilitzar un API. Tot i això, als continguts

teòrics s’ha explicat les característiques

27

químiques d’aquests bacteris en concret i els de la placa MRS les compleixen també. És per

això que es pot afirmar amb un marge gairebé nul d’error que aquests són el Lactobacillus i

Streptococcus.

Pel que fa a la morfologia, la diferència de les condicions de respiració és molt important. El

medi aeròbic no és el més favorable per al correcte creixement de aquests bacteris. La seva

condició ideal és un medi anaeròbic. Això es veu reflectit en el moment de comparar la forma

dels bacils d’una colònia cultivada amb O2, sense O2 i amb 5% de CO2. En els medis on l’oxigen

no és el protagonista els bacils es mostren en una forma més “rígida” (petits i rectes) mentre

que el medi amb més oxigen els bacils fan corbes i altres formes. Aquestes diferències a la

forma de mostrar-se els bacteris de la placa MRS és constant a tots els iogurts, sigui caducat o

no caducat.

Aquestes són petites curiositats pel que fa a la morfologia dels bacils, en canvi, els cocs no

canvien gairebé de forma.

Per altra banda, també vaig tenir creixements a la placa TSA, allà van haver diverses colònies

de bacils. Aquests són bacils gram positius amb espores.

28

Es pot afirmar que es van trobar els mateixos bacteris a tots els iogurts, però es va veure una

colònia molt curiosa al medi general del iogurt caducat de mes i mig.

Aquest és un bacteri molt diferent de tots els que havia vist i molt poc comú, doncs, vaig

demanar ajuda per a poder-ho identificar. S’anomena Epicoccum nigurus. És un contaminant

ambiental d’origen vegetal. Normalment es troba al voltant de fruites i vegetals i lògicament

aquest iogurt es va contaminar molt abans que jo l’hagués tractat, ja que, no es pot trobar

aquest per l’aire del laboratori. Penso que es pot haver contaminat a la nevera o a la seva

producció, una cosa és clara, com més temps s’espera més possibilitats té a quedar infectat. I

aquest iogurt feia ja gairebé 2 mesos que estava a la nevera. Tot i això, aquest bacteri es

trobava a petites dosis (però suficients per fer aquest incís) i per tant no era perjudicial per la

salut.

29

Objectiu 2

L’objectiu 2 feia referència a comparar el nombre de colònies de tots els medis en tots els

iogurts. Per fer-ho, considero que la millor manera de veure els resultats és mitjançant una

taula com la següent:

No caducat Caducat d’un 1

dia

Caducat d’un 1

mes i mig

TSA 4º Bacteris

esporulats

0

TSA 37º 45 UFC/mL 62.5 UFC/mL 56.7 UFC/mL

MRS Aeròbic

Bacteris

incorporats en la

fermentació

3,1x105 UFC/mL ≤10 ≤10

MRS CO2 7,06 x107 UFC/mL 2,505x106

UFC/mL

6,8x105 UFC/mL

MRS Anaeròbic 7,08 x107 UFC/mL 6,56x106 UFC/mL 1,73x105 UFC/mL

TSN Negatiu Negatiu Negatiu

MK 37º Enterobacteries 0

S 28º Fongs 0

** Els resultats senyalats de blau són aquells on no va créixer res a la placa, i per tant,

es considera que no hi ha cap tipus de població que es desenvolupi a aquestes

condicions. Però, tot i això, no podem assegurar que no hi hagi creixement en tot el

iogurt, ja que només s’ha analitzat 100µL d’aquest.

Només hi ha dos aspectes a comentar, primer de tot es pot veure que hi ha una població

constant, amb xifres molt semblants a cada iogurt, de bacils esporulats a la placa TSA. Aquests

bacils, lògicament, resisteixen molt a qualsevol canvi com és el de la data de caducitat i el pH i

és per això que hi ha aquesta estabilitat durant gairebé dos mesos. Cal emfatitzar que aquestes

colònies només creixen a una temperatura d’uns 37º i no als 4º d’una nevera.

Medi de cultiu

Iogurt

30

A continuació es pot comparar el creixement de les plaques TSA a 37 i les de 4 fig(9). Les

quatre primeres plaques corresponen a les que es van deixar a una estufa de 37º i les quatre

de la dreta corresponen a plaques cultivades a 4º

Plaques a 37º Plaques a 4º

Pel que fa a la placa MRS sí que trobem molts aspectes a comentar. Hi ha una gran diferència

entre el creixement al medi aeròbic, anaeròbic i amb un 5%de CO2.

Aquests bacteris creixen molt més als cultius anaeròbics, tal i com era lògic, doncs són

anaeròbics aeroresistents. Això fa que les del medi aeròbic siguin molt petites, gairebé

inexistents. Aquesta és la raó per la qual no he posat un resultat a la graella de MRS Aeròbic.

Em va costar molt poder contar les colònies, tot fent bancs de dissolucions, perquè eren tan

petites que no es podia fer el recompte però suficientment grans per a adonar-se que hi eren

presents. A més, com més caducat era el iogurt, eren menys evidents. Per aquest motiu, no

s’ha fet una anàlisi quantitativa, sinó un qualitatiu en aquesta graella de MRS Aeròbic.

Tant a les condicions de 5%CO2 i les anaeròbiques, el creixement d’un iogurt no caducat a un

caducat varia notablement, però això és deu principalment a què als bacteris dels iogurts

caducats els hi “costa més” créixer. És a dir, un bacteri d’un iogurt caducat té una vida útil més

baixa i és per això que triga a desenvolupar-se i ho fa menys evident (amb colònies més

petites).

9. Font: Pròpia

31

A continuació veurem unes fotografies on es compara dues plaques de medi MRS, la primera

és d’un iogurt no caducat i la segona d’un caducat. Es pot observar clarament un gran descens

entre el nombre de colònies del no caducat al caducat.

En la següent fotografia es veu el resultat d’unes plaques d’un banc de dissolucions

A

32

Objectiu 3

Pel que fa al tercer objectiu, havíem de calcular el percentatge de reducció d’un patogen. La

fórmula utilitzada és la següent:

𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑠 − 𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑠𝑢𝑙𝑡𝑎𝑛𝑡𝑠

𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑠× 100

IOGURT NO CADUCAT

A continuació veiem una fotografia dels resultats fig(10).

La imatge A correspon al banc de dissolucions fet per a poder contar les colònies que es van

posar dins el iogurt.

La imatge B, en canvi, correspon al banc de dissolucions fet dos dies després d’haver posat el

patogen al iogurt. És a dir, és un banc de dissolucions fet a partir del iogurt. A simple vista es

pot veure un gran descens del nombre

de colònies.

Imatge A

A continuació es faran els càlculs per a

obtenir la xifra exacta del nombre de

colònies que es van injectar. Com és

lògic, es va començar a fer els càlculs des

de la placa amb l’asterisc (*) que

correspon a una mostra 10-4 unitats més

petites.

Vaig fer un recompte de 336 colònies a

aquesta placa. Aquestes es converteixen

a 33600000UFC/mL que són dividides

amb la massa del iogurt total (125gr).

Finalment, ens dóna un resultat de

10. Font: Pròpia

33

26880 colònies per a cada mL del iogurt total

336 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 10−4

100µ𝐿∙

1000 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑚𝑎𝑟𝑒

1 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑎 𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 10−4⋅

1000µ𝐿

1𝑚𝐿

∙1

125 𝑚𝐿 𝑖𝑜𝑔𝑢𝑟𝑡 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙= 26880 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑒𝑠 𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡 𝑒𝑙 𝑖𝑜𝑔𝑢𝑟𝑡

Imatge B

Per calcular la quantitat final de colònies del patogen dos dies després d’haver injectat 26880

colònies dins el iogurt s’han de seguir les següents operacions:

Vaig contar 159 colònies a la placa 10-1 i aquestes es converteixen a 15900 UFC/ml. Tot aquest

procés és el mateix que l’anterior, amb una única variable que és que no ho dividim entre 125.

Això no cal fer-ho perquè la quantitat inoculada ja estava repartida per tot el iogurt des d’un

principi (vam posar el patogen al iogurt i vam barrejar-ho manualment).

159 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 10−1

100µ𝐿∙

10 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑚𝑎𝑟𝑒

1 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑎 𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 10−1∙

1000𝑚𝐿

1µ𝐿

= 15900 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑒𝑠 𝑝𝑒𝑟 𝑡𝑜𝑡 𝑒𝑙 𝑖𝑜𝑔𝑢𝑟𝑡

Una vegada ja tenim tots els resultats, és hora d’omplir la fórmula per a esbrinar el

percentatge de reducció del patogen del iogurt no caducat.

𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑠 − 𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑠𝑢𝑙𝑡𝑎𝑛𝑡𝑠

𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑠× 100

26880 − 15900

26880 ∙ 100 = 40.85%

El patogen es va reduir un 40.85% en el iogurt no caducat.

34

IOGURT CADUCAT

El procediment és exactament el mateix que hem vist a l’apartat anterior del iogurt no

caducat.

La imatge A senyala el banc de dissolucions de les colònies que vam injectar dins del iogurt. Es

van començar els càlculs a partir de la placa amb l’asterisc (*)

La imatge B, en canvi, mostra el nombre de

colònies que hi havia al iogurt dos dies després. Es

pot veure que el medi de cultiu de la imatge B no

és el mateix que el de la imatge A o els de

l’apartat amb el iogurt no caducat.

Això és deu a què el dia que havia de fer aquesta

pràctica, ja no quedaven més plaques de Baird-

Parker, medi en què el Staphylococcus aureus es

manifesta de color negre i això fa que sigui molt

més fàcil contar les colònies. De totes maneres,

vaig agafar un medi general on el Staphylococcus

es manifesta amb colònies més petites i

blanquinoses com es pot veure a la fotografia B.

1064 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 10−4

100µ𝐿∙

1000 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑚𝑎𝑟𝑒

1 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑎 𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 10−4⋅

1000µ𝐿

1𝑚𝐿

∙1

125 𝑚𝐿 𝑖𝑜𝑔𝑢𝑟𝑡 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙= 85120 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑒𝑠 𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡 𝑒𝑙 𝑖𝑜𝑔𝑢𝑟𝑡

Pel que fa a les colònies que es van trobar al iogurt dos dies després s’ha de fer el següent

càlcul:

11. Font: Pròpia

35

78 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎 𝑚𝑎𝑟𝑒

100µ𝐿∙

1000µ𝐿

1𝑚𝐿= 780 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑒𝑠 𝑝𝑒𝑟 𝑡𝑜𝑡 𝑒𝑙 𝑖𝑜𝑔𝑢𝑟𝑡

Una vegada ja tenim tots els resultats, és hora d’omplir la fórmula per a esbrinar el

percentatge de reducció del patogen del iogurt caducat de mes i mig.

𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑠 − 𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑠𝑢𝑙𝑡𝑎𝑛𝑡𝑠

𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ò𝑛𝑖𝑒𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑠× 100

85120 − 780

85120 ∙ 100 = 99.08%

El patogen es va reduir 99.08% en el iogurt caducat de mes i mig.

3.5 CONCLUSIONS

L’últim pas d’aquesta part pràctica al laboratori és redactar les conclusions, aquest és el pas on

s’afirmen o es neguen les hipòtesis plantejades prèviament i es dona una possible explicació

raonable.

Objectiu 1

Primer de tot ens centrarem a l’objectiu 1. Pel que fa a la hipòtesi, s’esperava que no hi hagués

cap tipus de canvis morfològics i que en tots tres s’hi trobés els mateixos bacteris. Part

d’aquesta afirmació és certa; als tres iogurts, caducats i no caducats, s’hi va trobar els mateixos

bacteris amb la mateixa aparença, només es va trobar un altre microorganisme al iogurt

caducat.

Arran d’això, vaig preguntar-me els llocs possibles de contaminació aquest iogurt. No creia que

fos en la seva producció, doncs, teòricament tot el material està esterilitzat i es té molta cura

pel que fa a aquest aspecte. També vaig pensar que es va contaminar al mateix laboratori on

l’analitzava jo, però, com he esmentat a l’apartat de resultats de l’objectiu 2, no s’hi troba

36

aquest tipus de bacteri per l’aire del laboratori. Doncs considero que l’única possible font de

contaminació és mentre estava a la nevera.

Tant al supermercat com a casa meva, aquest iogurt va passar gairebé dos mesos al mateix lloc

i va estar en contacte amb moltes altres substàncies. És possible que aquest contacte hagi

esdevingut tan proper que d’alguna manera s’ha contaminat. No puc afirmar la manera, el lloc

o la data exacta del moment de contacte amb aquest bacteri, tampoc es pot afirmar que hagi

estat durant el temps de refrigeració. Doncs tot això són només especulacions.

Objectiu 2

Pel que fa a l’objectiu 2, la meva hipòtesi era que s'esperava obtenir una lleugera disminució

del nombre de colònies a la placa MRS perquè considerava que un iogurt caducat tenia una

pitjor qualitat microbiològica i d’aquesta manera els seus bacteris trigarien més a créixer.

Aquesta hipòtesi s’ha complet, tot i que jo m’esperava un gran descens del nombre de colònies

i finalment no ha sigut tan exagerat. Cal esmentar el fet que el nombre de colònies no és

l’única variable que ha canviat, ja que, la manera de créixer (molt més petites) també ens

indica que ha perdut una mica de qualitat microbiològica.

Tot i això, microbiològicament parlant, no hi ha cap canvi molt significatiu perquè, tot i que el

nombre de colònies disminueix cal emfatitzar que

encara hi queden moltes més vives.

Objectiu 3

Per últim ens centrarem en l’objectiu 3, aquest

personalment és el que més em va cridar l’atenció. La

meva hipòtesi era que la vida útil dels bacteris tingués

algun tipus de relació amb la incorporació del patogen,

això significa que, si es trobaven menys unitats

formadores de colònies de Streptococcus i

Lactobacillus al iogurt caducat, hi hauria més

possibilitats que aquest quedés contaminat. Doncs a

més bacteris, més protecció. Malauradament, va

ocórrer tot el contrari.

12 Font: Pròpia

37

El percentatge de reducció del patogen al iogurt no caducat era de 40.85% i el del caducat de

mes i mig era d’un 99.08%. Això significa que si, per qualsevol motiu, el iogurt queda infectat

a les mateixes condicions de Staphylococcus aureus, al caducat s’hi eliminarien gairebé totes

mentre que al no caducat encara tindria més de la meitat de colònies.

Aquest fet em va sorprendre molt i al principi vaig pensar que m’havia equivocat, però una

vegada vaig repetir l’experiment i em va tornar a donar el mateix resultat vaig descartar

aquesta opció. Finalment vaig arribar a la conclusió que era possible que aquest fet tingués

relació amb el pH. Casualment, un dels primers dies que vaig treballar al laboratori, vaig

decidir mesurar el pH del iogurt no caducat amb el pH-metre i setmanes després vaig mesurar

el pH del iogurt caducat. Vaig trobar una diferència significant, el iogurt no caducat tenia una

acidesa de 4.41 i el caducat de 4.24 fig(12).

Aquesta variació de pH és a causa de la llarga presència de Lactobacillus bulgaricus i

Streptococcus thermophilus, que continuen fermentant la llet i per tant acidificant el iogurt i

baixant el pH.

Aparentment, aquesta petita variació no sembla que tingui rellevància, però sí que la va tenir.

De fet, és la principal diferència d’un iogurt caducat a un no caducat. Un pH àcid mata els

bacteris i aquesta és una possible raó per la qual Staphylococcus aureus no hagi crescut en el

iogurt caducat. El medi àcid, doncs, no és el medi ideal per al seu creixement.

Arrel d’això podem treure moltes conclusions, però què és realment el que passa a un iogurt

caducat? La resposta és simple, s’acidifica. Els bacteris incorporats en la fermentació coagulen

la llet i baixen el seu pH, si aquests bacteris romanen molt de temps dins el iogurt el

continuaran acidificant i aquesta acidesa pot ser la causant de la mateixa mort dels bacteris,

doncs un medi àcid no és òptim per a la seva viabilitat.

38

4. AGRAÏMENTS

Vull agrair la col·laboració de totes aquelles persones i institucions que han fet possible la

presentació d’aquest treball de recerca.

En primer lloc, vull agrair a la Mª Àngels Calvo, responsable del grup de microbiologia aplicada

i medi ambient de la facultat de veterinària de la UAB, per donar-me la gran oportunitat de

treballar al seu costat i obrir-me els ulls cap a una branca de la biologia que desconeixia

totalment.

Seguidament vull donar les gràcies al bioquímic Eduardo Ramírez Morales per proporcionar-

me una petita part del seu treball de fi de màster fet en 2011. Aquest és sobre l’estudi de la

diversitat poblacional de les bifidobacteries segons diverses variables concretes, la seva lectura

m’ha ajudat a entendre altres aspectes de la bioquímica del iogurt.

També vull donar les gràcies als meus pares per fer-me costat i recolzar-me en tot moment. Al

meu germà gran, Miquel Espiña, per resoldre’m qualsevol dubte i facilitar-me fonts

d’informació fiables i al meu germà petit, Victor Espiña, per treure’m un somriure sempre que

ho he necessitat.

I per últim, vull agrair a la meva tutora del Treball de Recerca, Carol Fernández, per la seva

ajuda i orientació constant. Així mateix, vull agrair la formació rebuda d’aquells professors que,

en la meva trajectòria d'estudiant, m'han anat mostrant el camí fins a arribar on sóc ara.

A tots, moltes gràcies.

39

5. BIBLIOGRAFIA

MANS, Cl. 2006. “Llet i productes làctics”. A: Els secrets de les etiquetes. La química els productes de casa. Barcelona: focus. INGRAHAN, John L.. “Introducción a la microbiologia”

[biologia.laguia2000.com]

http://biologia.laguia2000.com/microbiologia/lactobacillus-bulgaricus

http://biologia.laguia2000.com/general/la-fecha-de-caducidad-del-yogur

http://biologia.laguia2000.com/histologia/tincion-gram

[wikipedia.com]

http://es.wikipedia.org/wiki/Lactobacillus_bulgaricus

http://es.wikipedia.org/wiki/Yogur

https://es.wikipedia.org/wiki/Prueba_de_la_Oxidasa

https://es.wikipedia.org/wiki/Streptococcus_thermophilus

[youtube.com]

https://www.youtube.com/watch?v=S7uzDrgumxw – vídeo de la proba de la oxidasa

https://www.youtube.com/watch?v=ekRPD-eojd4 – vídeo API 1

https://www.youtube.com/watch?v=PXIis18qN9k –vídeo API 2

[Document amb la informació de la tinció de gram]

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Morf

olog%C3%ADa_y_Tinci%C3%B3n.pdf

[Informació dels medis de cultiu]

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mrsagar.htm

Altres pàgines webs:

http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-v/pb-v-3-catalasa_oxidasa.htm

http://lacienciaysusdemonios.com/2011/05/06/viernes-procariota-lactobacillus-

bulgaricus/

40

http://nutricion.doctissimo.es/alimentacion-saludable/probioticos/identificar-

probioticos/lactobacillus-bulgaricus.html

http://www.sabormediterraneo.com/salud/yogur_nutr.htm

http://www.fundaciondelcorazon.com/nutricion/alimentos/leche-yogur-y-queso.html

https://desverncultura.files.wordpress.com/2012/06/desenvolupament-de-la-

forc3a7a-bacteriana-del-iogurt.pdf

https://docs.google.com/presentation/d/1xHMCmE653HG1LmPNGSluzT97iQd-

ulWsVONuMMbQAtU/embed?slide=id.i23- (per la nomenclatura científica)