Alergol Inmunol Clin 2003; 18: 91-111

91

HONGOS EN NUESTRO AMBIENTE

J. M. Torres R odríguez

Grup de Recerca en Micología Experimental i Clínica.IMAS/IMIM. Facultat de Medicina, Universitat Autónoma deBarcelona.

Aunque el impacto de los hongos ambientales en la

alergia respiratoria todavía se conoce poco en España,

existe un interés creciente por el tema. Uno de los elemen-

tos imprescindibles a determinar es la distribución geográ-

fica y estacional de las esporas de los principales hongos

transportados por el aire y conocer su concentración de las

mismas en el medio exterior. No obstante, hay que consi-

derar la localización intradomiciliaria en muchos casos,

por lo que también es interesante realizar un recuento e

identificación de los hongos que se encuentran en el hábi-

tat domiciliario de determinados pacientes.

Los sistemas de estudio aerobiológico de los hongos,

con una metodología similar a la que se emplea en los pó-

lenes, presentan serias limitaciones atribuibles al propio

método y sobre todo a las características de estos organis-

mos, entre ellas:

1. El ciclo biológico, a veces muy complejo, de cier-

tas especies.

2. La similitud entre algunas esporas pertenecientes a

diferentes grupos de mohos y levaduras que dificulta una

identificación precisa.

3. La presencia de fragmentos de micelio que si bien

también pueden sensibilizar al enfermo atópico, no permi-

ten conocer a qué hongo pertenece.

Estos hechos conducen a que sea necesario asociar a

los métodos palinológicos las técnicas microbiológicas de

cultivo e identificación microscópica y bioquímica de las

especies.

A su vez, los métodos micro-micológicos de cultivo

también tienen sus limitaciones debido a:

• La imposibilidad de cultivar ciertas especies en me-

En esta sección se publican lostrabajos presentados en las reu-niones científicas organizadaspor Sociedades Regionales deAlergología e Inmunología Clí-nica. En este número se publicanlas comunicaciones presentadasen la Jornada de Clausura de laAsociación Valenciana de Aler-gología e Inmunología Clínica,celebrada en Oliva el 22 de juniode 2002.

Punto de Encuentro

ASOCIACIÓN VALENCIANADE ALERGOLOGÍA E

INMUNOLOGÍA CLÍNICA

Algunas apreciaciones sobre losmétodos de estudio

3 Los m étodos aerobiológicos son ú tiles paradeterminar la exposición a esporas exteriores

3 Son elúnico sistema para demostrar esporas dehongos no cultivablesen medios artificiales

3 Los m étodos microbiol ógicos son útiles paracultivar esporas, sobre todo, intradomiciliarias

3 El cultivoes mucho más discriminativo paraidentificar los hongos ambientales.

3 Los métodos volumé tricos evitan sesgosindeseables.

Esquema de la técnica micológica

Siembra de la muestra

Examen directo

Incubación de la placa

Observación de la colonia

Identificación final

J. M. Torres Rodríguez

92

dios artificiales, principalmente los basidiomicetos parási-

tos de plantas y las "setas".

• El desconocimiento de cuáles son las mejores con-

diciones de cultivo para las especies halladas con menor

frecuencia en el ambiente.

• El fenómeno de pleomorfismo que en algunas espe-

cies ocasiona la pérdida de la capacidad de esporular y ello

dificulta enormemente la identificación.

Los métodos micológicos de aislamiento por cultivo

e identificación se basan en la aplicación de las claves ta-

xonómicas, de origen botánico, que suelen ser complejas y

consumidoras de tiempo. Por ello muchas veces apenas se

alcanza a identificar un hongo al nivel del grupo o el géne-

ro, excepto los más comunes en que se suele realizar un

"reconocimiento identificativo" basado en las característi-

cas morfológicas más sobresalientes de las especies comu-

nes.

Estos hechos condicionan la obtención de conoci-

mientos sobre la importancia alergénica de los hongos co-

mo grupo global, que se han limitado a unas pocas espe-

cies, principalmente aquéllas en las que se ha demostrado

su relación causa-efecto en la alergia respiratoria, y aqué-

llas de más fácil manipulación. Entre estas especies desta-

can las siguientes: Alternaria alternata, Cladosporium her-

barum, Aspergillus fumigatus, Penicillium chrysogenum.

En menor proporción también se han estudiado especies de

Helminthosporium, Aureobasidium, Curvularia, Fusarium,

Botrytis, Candiday hongos dermatofitos como Trichophy-

ton mentagrophytes.

Las especies de Alternaria constituyen un género fu-

liginoso con paredes y esporas pigmentadas que origina

colonias marrón oscuro y se describe como la principal

causa de alergias respiratorias en la mayor parte del mun-

do, incluido nuestro país. La especie más común es A. al-

ternata. Sus caracteres morfológicos microscópicos son

muy característicos y su identificación suele ser relativa-

mente fácil.

En otro hongo pigmentado es Cladosporium sp., por

Observación microscópicametódica:OBSERVACIÓN

rr Levadura rr Pseudohifas

rr Micelio rr ClamidoconidioConidios:

rr Microconidios rr Macroconidios

rr Otras estructurasDIBUJO DE LAMICROSCOPÍA

§ Tinción:

§ Aumentos :

Alternaria

Hongo fuliginoso

§ Conidios multitabicados .

§ Dictiosporas (muriformes)

§ Dispuestos en cadena.

Género Cladosporium

Hongo fuliginoso§ Conidioforo poco

ramificado.

§ Células conidiogénicasproducen conidios en doso más puntos.

§ Conidios unicelulares,irregulares.

Aspergillus

Hongohialino y tabicado

§ Conidioforo terminalacabado en vesículaglobosa.

§ Células conidiógenas(fiálides) naciendo en lavesícula.

§ Conidios unicelulares.

Aspectos clínicos de la alergia al polen de olivo

93

lo general su identificación a nivel de género no ofrece di-

ficultades, aunque sí puede haberlas a nivel de especie. Es-

te hongo es muy prevalente en la atmósfera por el gran nú-

mero de esporas que produce; en los países nórdicos, se ha

descrito como principal hongo alergénico.

Las esporas de los hifomicetos no pigmentados o hia-

linos Aspergillus y Penicillium son similares y también in-

diferenciables de otras especies vecinas como Paecylomy-

cesy Verticillium, por lo que en aerobiología, las esporas

observadas se suelen denominar como "aspergiláceas". So-

lamente a través del cultivo se puede llegar a una identifi-

cación y clasificación adecuada al nivel del género y la es-

pecie.

Es imprescindible aplicar los métodos aerobiológicos

asociados a los micológicos basados en cultivos para deter-

minar la exposición ambiental a las esporas de hongos en

los pacientes con alergias respiratorias.

El paso siguiente habrá de ser el disponer de antíge-

nos bien estandarizados, específicos, y eficaces para el

diagnóstico de los procesos de hipersensibilidad frente a

los hongos.

ASPECTOS CLÍNICOS DE LA ALERGIA AL

POLEN DE OLIVO

F. Florido López, J. Quiralte Enriquez, E. Mart ín

Casañez

Unidad de Alergología. Complejo Hospitalario de Jaén.

El olivo (Olea europaea) es un árbol originario de

Asia Menor que desde hace más de 5.000 años se cultiva

en todo el área mediterránea donde ha alcanzado gran im-

portancia económica por su fruto, la aceituna, y el aceite

que de ella se extrae. O. europaeapertenece a la familia

botánica Oleaceae, que comprende 29 géneros de los que

sólo seis tienen interés económico u hortícola1. Cuatro de

ellos se cultivan con propósitos ornamentales o alimenta-

rios: Olea (Olivo), Ligustrum(Aligustre), Jasminum(Jaz-

mín) y Syringa(Lila) y otros dos crecen de forma silvestre:

Fraxinus(Fresno) y Phyllyrea(Agracejo).

El cultivo del olivo en España se extiende por todas

las regiones a excepción de la zona norte, donde su presen-

cia es testimonial. Pero a pesar de su extensión, el olivo se

concentra sobre todo en Andalucía donde está presente en

casi el 60% del total de hectáreas cultivadas. En algunas

comarcas de Andalucía, como por ejemplo la provincia de

Jaén, el olivo domina la tierra agrícola en detrimento de

otros cultivos como los cereales que antaño tenían una im-

portante representación, especialmente en las zonas limítro-

fes de la depresión del Guadalquivir o los cultivos de rega-

dío en torno a los valles fluviales2. Sin embargo, la mayor

rentabilidad del olivar animada por una política subsidiaria

procedente de la Comunidad Europea, ha contribuido y

continúa haciéndolo, al incremento espectacular de éste

frente a otros tipos de cultivos.

Aspectos clínicos de la polinosis por Olea europaea

La polinización del olivo se realiza a través de insec-

tos (entomófila), pero existe una importante polinización

secundaria al viento (anemófila) cuando la producción de

polen es abundante.

En la familia Oleaceae, el polen más alergénico es el

producido por Olea europaea que en la zona mediterránea

suele estar presente en el aire en los meses de mayo y ju-

nio. No obstante, la polinización del olivo está influenciada

por sus variedades y por factores climáticos y geográficos

aunque para una zona determinada su duración no va más

allá de un mes (Fig. 1)3.

Es frecuente encontrar en la literatura una mayor pre-

valencia de síntomas nasales y conjuntivales causados por

O. europaea, pero este polen también es capaz de inducir

síntomas bronquiales, incluso de intensidad moderada y en

ocasiones grave, que en zonas como Jaén llegan a pade-

cerla más del 60% de la población sensibilizada4,5.

En un estudio ya clásico, Davies y Smith6 demostra-

ron que concentraciones más altas de 50 granos/m3 de polen

Fig. 1.

F. Florido López, et al

94

de gramíneas podían considerarse altas y, por tanto, capaces

de desencadenar síntomas en pacientes sensibles a las gra-

míneas. Con una metodología similar, se investigó en Jaén el

nivel umbral de la concentración de polen de olivo necesaria

para producir síntomas nasales y/o conjuntivales en pacientes

monosensibilizados. Tras obtener una buena correlación entre

la puntuación media de los síntomas y el recuento diario de

polen de olivo en los dos años que duró el estudio (1994:

r=0,8463 p<0,001; 1995: r=0,8366 p<0,001) se encontró que

eran necesarios alrededor de 400 granos/m3 de polen de O.

europaeapara que la mayoría de los pacientes sufran, al me-

nos, síntomas naso-oculares de intensidad leve (Figs. 2 y 3)7.

Estas observaciones clínicas realizadas durante la ex-

posición natural al polen de olivo son compatibles con

otras obtenidas durante la exposición controlada en la prue-

ba de test provocación bronquial específica (PPBE).

En 1996, durante la elaboración de un estudio para

evaluar la eficacia de la ITE con un extracto de Oleaestan-

darizado biológicamemente y cuyos resultados sirvieron

para la confección de la memoria de Tesis Doctoral de la

Dra. Purificación González8, pudimos observar que durante

el PPBE con Olea europaea, en aproximadamente la mitad

de los casos aparecía una respuesta dual. Además, la inten-

sidad de la fase tardía estuvo muy relacionada con la inten-

sidad del asma bronquial observada durante el período pri-

maveral, y fue más intensa cuanto más gravedad

presentaba el asma estacional.

Por otro lado, también observamos que en aquellos

pacientes que recibieron ITE, la PC20 pasó de 9,20 a 50,2

BU/ml tras dos años de tratamiento. Reduciéndose casi a la

mitad la frecuencia de aparición de reacciones tardías en la

PPBE.

En nuestra área, la alergia al polen de olivo es la

principal causa de polinosis. La monosensibilización a este

polen es rara (menos del 15% de los casos); es más fre-

cuente la sensibilización concomitante al polen de Grami-

neaey de Chenopodiaceasy más del 60% de los pacientes

sensibilizados sufren asma bronquial.

Reactividad cruzada del polen de Olea europaeaconotros pólenes (Fig. 4)

El polen de olivo presenta reactividad cruzada con

otros miembros de la familia Oleaceae, como por ejemplo

son la lila (Syringa vulgare), el aligustre (Ligustrum vulga-

re) y el fresno (Fraxinus excelsior). Estos pólenes contie-

nen proteínas de 20 kDa que son reconocidas por los sue-

ros de los pacientes alérgicos al polen de olivo y los

anticuerpos policlonales frente a Ole e 1. De hecho, se han

aislado y secuenciado los alergenos principales del aligus-

tre (Lig v 1) y del lilo (Syr v 1) y presentan una alta simili-

Fig. 4.

Fig. 2.

Fig. 3.

Aspectos clínicos de la alergia al polen de olivo

95

tud con Ole e 1, lo cual puede explicar el elevado grado de

reactividad cruzada.

También se ha demostrado la reactividad cruzada en-

tre algunos alergenos de polen de olivo y proteínas de

otros tipos de pólenes con idéntica función biológica. Por

ejemplo, un alergeno perteneciente a la familia de las pro-

teínas ligadoras del calcio (polcalcinas), el Ole e 3, ha

mostrado una elevada reactividad cruzada con otras proteí-

nas de la misma familia de Gramineae, de pino, de ciprés

y de Artemisa artemisiifolia.

Como más adelante tendremos oportunidad de co-

mentar otros alergenos del polen de olivo a presentar es

una profilina (Ole e 2) por su homología con otras profili-

nas de origen vegetal, y una elevada reactividad cruzada

con diferentes especies vegetales no relacionadas. Por

ejemplo, presenta una elevada reactividad cruzada con las

profilinas de algunas Gramineae, como Phleum pratense.

En este sentido, recientemente hemos comunicado la exis-

tencia de reactividad cruzada entre Olea europaeay Che-

nopodium album. Esta observación puede explicarse al me-

nos parcialmente, por la existencia de bandas comunes en

el immunoblottingcon una masa molecular aparente de 14

kDa (compatible con la que muestra la profilina), de 17-19

kDa (en las cifras de masa molecular de Ole e 1), y de 27,

33 y 44 kDa.

Alergenos de polen de olivo: aspectos básicos

La respuesta inmunitaria al extracto completo del po-

len de olivo es muy heterogénea, y se observan al menos

20 bandas de diferente masa molecular aparente, que se

han caracterizado parcialmente a lo largo de estos 10 últi-

mos años, desde la observación inicial de Lauzarica et al9, 10

en la que se identificaron bandas en el immunoblottingen-

tre 17 y 62 kDa. La evaluación de cada alergeno se esta-

blece en términos de análisis de estructura y secuencia-

ción11, 12, estudio de la probable función biológica y

actividad inmunológica in vitro y, si es posible, in vivo

(Fig. 5)13.

Ole e 1

El análisis electroforético del Ole e 1 purificado reve-

la la presencia de 2 variantes principales: una glucosilada

de 20 kDa y otra no glucosilada, de masa molecular apa-

rente de 18.5 kDa. La importancia clínica de este radical

glucídico, radica en que se comporta como un epítopo aler-

génico en aproximadamente un 60% de los pacientes.

La función biológica de Ole e 1 es desconocida. No

presenta similitud con otras proteínas alergénicas, aunque

su secuencia tiene un 36% de identidad con la de otras pro-

teínas de las anteras del tomate y del polen del maíz, que

se han involucrado en el crecimiento del tubo polínico; por

esta razón, este alergeno puede estar involucrado en funcio-

nes reproductivas.

Ole e 2

Se ha aislado y caracterizado la profilina del polen

del olivo, el Ole e 2, como un alergeno significativo.

Ole e 2 presenta una masa molecular aparente de 15

kDa y los pacientes con alergia al polen del olivo exhiben

IgE específica frente a Ole e 2 en un 24% de los casos,

aunque este porcentaje de sensibilización es posible que

pueda fluctuar de forma importante dependiendo de la

existencia de otros síndromes asociados a la polinosis, co-

mo es la alergia a las frutas.

Ole e 3

Ole e 3 es una proteína de 9,2 kDa, de pI 4,2-4,3, y

que exhibe una capacidad de fijación de IgE de aproxima-

damente un 20% en la mayoría de las poblaciones estudia-

das. El Ole e 3 es, como ya hemos dicho, una proteína li-

gadora de Ca2+,14, un mensajero intracelular importante

implicado en numerosas vías de transmisión de señales y

otros procesos biológicos, como es la contracción muscu-

lar.

La secuencia de aminoácidos de Ole e 3 es muy simi-

lar a la de alergenos presentes en otros pólenes como son elFig. 5.

F. Florido López, et al.

96

aliso (Alnus glutinosa) Aln g 4, el abedul (Betula verrucosa)

Bet v 4, el de ciertas gramíneas como la grama (Cynodon

dactylon) Cyn d 7 y el de Phleum pratensePhl p 7.

Ole e 4 y Ole e 5

En 1998 se describieron simultáneamente 2 alergenos

de polen de olivo: uno principal, el Ole e 4 y otro secunda-

rio, el Ole e 5. El Ole e 4 reveló una elevada capacidad de

unión a la IgE (aproximadamente el 80%).

Ole e 5 mostró una capacidad de fijación de IgE más

moderada (35%). En este alergeno se ha determinado la se-

cuencia N-terminal (29 residuos) que mostró una identidad

de secuencia de entre 65% y 79% con diversas superoxido-

dismutasas de origen vegetal presentes en la espinaca, la

batata, maíz y el tomate.

Ole e 6

Ole e 6 es una cadena polipeptídica única de 50 ami-

noácidos con una masa molecular de 5,8 kDa. Ole e 6 es

un alergeno principal en regiones en donde se cultiva el

olivo de forma intensiva, como es la provincia de Jaén, con

una frecuencia de fijación de IgE in vitro superior al 60%.

Ole e 7

Ole e 7 es un alérgeno de polen de olivo que presenta

homología con las proteínas transportadoras de lípidos.

Presenta una frecuencia de fijación de IgE que, al igual que

Ole e 6, es dependiente del área geográfica que analize-

mos. Por ejemplo, el 60% de los pacientes de Jaén presen-

tan IgE frente a Ole e 7, mientras que la cifra baja del

20% cuando estudiamos a los pacientes de Madrid sensi-

bles al polen del olivo.

Ole e 8

Ole e 8 es junto a Ole e 3 un alergeno perteneciente a

la familia de las proteínas ligadoras de Ca2+. La frecuencia

de IgE frente a Ole e 8 se ha establecido en un 15% en una

población de pacientes alérgicos al polen de olivo.

Ole e 9

Ole e 9 es una proteína de 45 kDa de masa molecular

aparente que se ha descrito recientemente. La secuencia-

ción de péptidos originados por la digestión proteolítica ha

permitido establecer una homología con la β-1-3-glucanasa

de origen vegetal. Se ha determinado una prevalencia de

IgE frente a Ole e 9 del 60%.

Aplicación clínica de los conocimientos actuales acercade los alergenos del polen de olivo

Respuestas IgE específicas frente a alergenos del polen

de olivo en pacientes con polinosis

En los últimos años, diferentes estudios realizados en

pacientes alérgicos al polen de olivo han demostrado una

gran diversidad de alergogramas con diferentes patrones de

fijación de IgE específica cuando los sueros se analizan de

forma individualizada, arrojando por tanto diferentes fre-

cuencias de sensibilización para cada alergeno15.

No obstante, estas frecuencias de sensibilización se

han obtenido analizando sueros procedentes de pacientes

de diferentes áreas geográficas con distinta exposición aler-

génica y escasa caracterización clínica: por ejemplo, tipo e

intensidad del síndrome alérgico y/o la asociación con

otros trastornos atópicos. Por ello, nuestro grupo diseñó un

estudio para evaluar la actividad inmunológica de algunos

alergenos purificados del polen de olivo en una población

de pacientes polínicos expuestos a concentraciones eleva-

das de este polen, con métodos in vivo e in vitro.

Material y métodos:Se incluyó a 119 pacientes que cumplían

los siguientes criterios: 1) rinitis, asma bronquial o ambas

durante el período de finales de abril a junio. 2) prueba de

prick positiva frente al extracto completo de Olea europaeay

3) que no hubiesen recibido inmunoterapia específica con

extracto de olivo.

Prueba del prick: Se realizaron con los 5 alergenos de

polen de olivo Ole e 1, 2, 3, 6 y 7. También se realizaron

pruebas del prick con un grupo de alergenos comunes que

incluía: Der pteronyssimus, cucaracha germánica, epitelios

de perro y gato, Alternaria, Aspergillusy Cladosporium,

Lolium, Cynodon, Cupressus sempervirens, Platanus, Arte-

misia, Chenopodium, Salsola kaliy Parietaria judaica.

La determinación de la IgE específica se realizó me-

diante ELISA.

Resultados:Tanto Ole e 1 como Ole e 2 pueden ser

considerados en nuestra población como alergenos

principales. Para Ole 6 y 7 la frecuencia de sensibilización

en ambos casos se situó en el 47,9% y para Ole e 3 en el

37,8% (Fig. 6).

Aspectos clínicos de la alergia al polen de olivo

97

La expresión clínica de estas sensibilizaciones a nivel

respiratorio se traducía en rinitis y asma en el 78,4% de los

casos y sólo en rinitis en el 25,2%.

Los pacientes con una polinosis concomitante tuvie-

ron concentraciones significativas de IgE específica frente

a Ole e 2, 3, 6, y 7; en cambio Ole e 1 no se asoció signifi-

cativamente a otras polinosis.

Valor diagnóstico de la prueba del prick con alergenos del

polen de olivo

En nuestra población se describen hasta 77

combinaciones diferentes de positividad frente a entre uno

y cinco alergenos del polen de olivo. El 54,6% presenta un

perfil de sensibilización que afecta a tres de ellos.

En cuanto al valor diagnóstico de estas combinacio-

nes, podemos observar que la combinación de Ole e 1 y 2

con Ole e 6 ó 7 alcanza una sensibilidad y especificidad

del 100%; es decir, que utilizando sólo 3 alergenos se ob-

tiene el mismo resultado que usando el extracto completo

de polen de olivo (Fig. 7).

Un alergeno del polen de olivo (Ole e 7) está asociado a

la anafilaxia por alimentos de origen vegetal

Otro ejemplo de la utilidad clínica de los conocimien-

tos actuales acerca de los alergenos del polen de olivo, lo

tenemos en el estudio de los síndromes polen-frutas, que se

sustentan en la homología entre las proteínas presentes en

ambas fuentes alergénicas.

Nosotros hemos evaluado en pacientes alérgicos a

frutas o frutos secos el perfil de sensibilización frente aler-

genos del polen de olivo y además hemos investigado si la

expresión clínica de la alergia alimentaria en forma de Sín-

drome de Alergia Oral (SAO) o de anafilaxia se asocia con

alguno de estos alergenos.

Fig. 6. Fig. 7.

Alergia a alimentos: aspectosclínicos

• Síndrome oral• 21 pacientes

• Anafilaxia

• 19 pacientes

Rosáceas

Kiwi

Melón

Rosáceas

Melón

Frutos secos

Grupo control: 94 pacientes polínicos sinhistoria de alergia a frutas

Distribución de los alergenos de polen deDistribución de los alergenos de polen deolivo en los pacientes con alergia aolivo en los pacientes con alergia a

alimentosalimentos

81

58

73

43

80

47

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Ole e2 O le e 7

SOAAnafilaxiaControl

Fig. 9. Fig. 8.

F. Florido López, et al.

98

Material y Métodos:Estudiamos a 134 pacientes derivados

a la Unidad de Alergia del Hospital Ciudad de Jaén por

presentar de forma estacional rinitis y/o asma bronquial

durante los meses de abril a junio.

Todos tenían una prueba de prick positiva frente al

olivo y, dependiendo de si además habían presentado algún

tipo de reacción adversa con alimentos de origen vegetal y

de su intensidad, se les asignó a uno de los tres grupos si-

guientes (Fig. 8):

GRUPO A: veintiún pacientes con síntomas compati-

bles con SAO, el cual fue confirmado por al menos una

provocación oral a doble ciego controlada con placebo

(PODCCP) positiva con alguna fruta perteneciente a las fa-

milias de las rosáceas (melocotón o pera), cucurbitáceas

(melón) o actinidiáceas (kiwi).

GRUPO B: en este grupo se incluyó a 19 pacientes

con una anamnesis compatible con una anafilaxia desarro-

llada tras la ingestión de frutas pertenecientes a las familias

antes citadas o de frutos secos y cuya sensibilización se

confirmó mediante una prueba de prick.

GRUPO C: noventa y cuatro pacientes alérgicos al

polen de olivo, sin antecedentes de reacciones adversas con

alimentos vegetales y una prueba del prick negativa frente

a frutas y frutos secos.

MÉTODOS: Realizamos pruebas cutáneas (en prick)

con los alergenos naturales purificados de polen de olivo

Ole e 1, 2, 3, 6, 7 y la forma recombinante del Ole e 8. Se

probaron también los extractos comerciales de almendra,

cacahuete, nuez, y avellana y mediante prick-prick: el me-

locotón, la pera, el melón y el kiwi.

La PODCCP se realizó en aquellos pacientes que re-

ferían en la anamnesis síntomas compatibles con alergia

oral provocados por al menos una de las frutas selecciona-

das para este estudio.

Resultados: Todos los pacientes estaban sensibilizados al

extracto completo de polen de olivo y al menos a uno de sus

alergenos. Únicamente resultó significativa la asociación

entre la sensibilización al alergeno purificado Ole e 7 y la

anafilaxia como expresión clínica de la alergia a frutas

(Tabla I).

En el grupo A de pacientes, aquellos con SAO como

manifestación clínica de su alergia a las frutas, el resultado

positivo de la prueba de provocación coincidió con la po-

sitividad de la prueba del prick en más del 50% de los ca-

sos independientemente de la fruta estudiada. En este gru-

po no encontramos ninguna asociación significativa entre

la presencia de sensibilización a frutas con síntomas clíni-

cos como el SAO y la sensibilización a alergenos de polen

de olivo, en especial a la profilina del polen de olivo, Ole e

2 (Fig. 9).

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13. Quiralte J, González E, Arias de Saavedra JM, V illalba M, Florido JF,

Tabla I. Frecuencia de la sensibilización al polen de O. europaea

Grupo de alergia n Ole e 1 Ole e 2 Ole e 3 Ole e 6 Ole e 7 Ole e 8

a alimentos

A (OAS) 21 19 (90,5) 17 (81) 10 (47,9) 9 (42,9) 9 (42,9) 2 (9,5)

B (AX) 19 19 (100) 11 (57,9) 10 (52,6) 12 (63,2) 15 (78,9) 1 (5,3)

C (Control) 94 86 (91,5) 64 (68,1) 35 (37,2) 49 (52,1) 49 (52,1) 7 (7,4)

NS NS NS NS NS NS

Sáenz de San P edro B, et al. Immunological activity of recombinant Ole e1 in patients with Olea eur opaea pollinosis. Int Arch Allergy Immunol2000; 122: 101-107.

14. Batanero E, Villalba M, Ledesma A, Puente XS, Rodriguez R. Ole e 3,an olive-tree allergen, belongs to a widespread family of pollen proteins.Eur J. Biochem 1996; 241: 772-778.

15. R odríguez R, Villalba M, Monsalve R, Batanero E, Ledesma A, Gon-zález E, et al. Olive pollen allergens. Current T opics in Biochemical Rese-arch 2000; 2: 171-178.

PARIETARIA JUD AICA Y LTP

D. Barber Hernández

Director de I+D. ALK-Abelló, S.A. Madrid.

La Parietaria es una planta perenne de la familia de

las Urticaceas. Se conocen varias especies de Parietaria,

entre las que destacan la P. judaicay la P. officinalis. La

planta se caracteriza por su tallo erecto, poco ramificado,

con pelos y de una longitud que oscila entre los 30 y los

100 cm. Las hojas son ovales o lanceoladas, acuminadas y

con dos o cuatro nervios secundarios. Presenta flores axila-

res aglomeradas.

El polen tiene una forma ovalada esferoidal, con un

tamaño aproximado de 16 µmx13. Triporado y a veces te-

traporado, con poros pequeños y opérculos bien individua-

lizados. La exina es fina con pequeñas espinas en disposi-

ción rugulada.

La planta poliniza durante un período amplio de

tiempo, entre marzo y septiembre. Se distribuye por el cen-

tro y sur de Europa y se encuentra en lugares rocosos, mu-

ros y baldíos.

Las mayores concentraciones se alcanzan en Italia,

donde son frecuentes recuentos de entre 100 y 200 granos

por metro cúbico. En España, la mayor concentración se en-

cuentra en el arco mediterráneo, pero las concentraciones

máximas raramente superan los 50 granos por metro cúbico.

A pesar de su concentración relativamente baja, la

prevalencia de sensibilización y sintomatología alérgica

asociada a la Parietaria es elevada. El amplio período de

polinización hace que en la práctica se instaure un trastor-

no perenne que se relaciona más con los alergenos intrado-

miciliarios que con otros pólenes.

El estudio y caracterización alergénica del polen de la

Parietaria se inicia a principios de los ochenta, principal-

mente por grupos españoles e italianos. La mayor parte de

la reactividad alergénica del polen de la Parietaria se aso-

cia a un alergeno principal denominado Par j 1. Esta proteí-

na tiene un tamaño pequeño, 10,5-15 kDa. La presencia de

cuatro puentes disulfuro en la molécula le confiere una ele-

vada estabilidad. En experimentos de inhibición sobre el

extracto completo, Par j 1 es capaz de inhibir el 85% de la

unión de la IgE.

Durante varios años, la alergia a la Parietaria se ha

considerado independiente de otros trastornos alérgicos. La

inexistencia de otros alergenos con reactividad cruzada fren-

te a Par j 1 y las pruebas clínicas de monosensibilizaciones

avalaban esta hipótesis. Recientemente se ha descrito la exis-

tencia de una nueva familia de alergenos denominada genéri-

camente proteínas de transferencia de lípidos (LTP). Se han

identificado LTP alergénicas en alimentos vegetales y en va-

rias especies de pólenes (olivo y Artemisia). La comparación

de la secuencia de Par j 1 con las de distintas LTP ha permi-

tido establecer la relación estructural entre ambas y la asig-

nación por tanto de Par j 1 a la superfamilia de las LTP.

Parietaria judaica y LTP

99

D. Barber Hernández

100

Parietaria judaica y LTP

101

D. Barber Hernández

102

Las LTP presentan unas características estructurales

comunes. Son proteínas con una masa molecular baja (9

kDa de media). La presencia de 4 puentes disulfuro les

confiere una gran estabilidad térmica y resisten igualmente

el tratamiento con enzimas proteolíticas. Forman parte de

polímeros lipídicos extracelulares en tejidos externos como

la piel de los frutos. Las proteínas de transferencia de lípi-

dos se han estudiado ampliamente por su participación en

el mecanismo de defensa vegetal. Presentan propiedades

antifúngicas en estudios "in vitro", hecho éste que ha per-

mitido considerar la producción de plantas transgénicas

con genes de LTP. Las LTP se encuentran ampliamente dis-

tribuidas en especies y tejidos vegetales. Se han descrito

alergenos de la familia en pólenes (olivo, Artemisia, plata-

nero, Parietaria) y en distintos alimentos, tanto frescos

(Rosáceas, espárragos, semillas…..) como procesados (vi-

no, cerveza). La identidad estructural de las proteínas de

esta familia varía del 25% al 95%. Es interesante señalar

que normalmente niveles de identidad inferiores al 50%-

60% implican un nivel bajo de reactividad cruzada.

El hecho más característico de la sensibilización a las

LTP es su mayor prevalencia en el sur de Europa, donde

las LTP son los principales alergenos asociados a las frutas.

Por el contrario, en los países del centro y norte de Europa

la sensibilización a las LTP es poco frecuente; allí suelen

estar implicados alergenos homólogos a Bet v 1. La apari-

ción tardía de la sensibilización a frutas en comparación al

resto de alimentos, según los datos del Estudio Alergológi-

ca 92, sugiere que una sensibilización previa por vía inha-

latoria a las LTP de los pólenes podría ser un factor de

riesgo de la sensibilización alimentaria.

El perfil de sensibilización a las LTP o Bet v 1 es ex-

traordinariamente relevante, dado que la sintomatología clí-

nica varía desde un síndrome de alergia oral (frecuente en

sensibilización a análogos de Bet v 1) hasta reacciones gra-

ves, incluida la anafilaxia, en la sensibilización a las LTP.

Recientemente hemos demostrado la gran estabilidad de las

LTP de Rosácea. Después de 24 horas en jugo gástrico, to-

davía permanece inalterado el 50% del alergeno. Esta ele-

vada estabilidad, junto a su capacidad para interaccionar

con fosfolípidos y, probablemente, de atravesar membranas

celulares, podrían ser el origen de la gravedad de síntomas

asociados a la sensibilización a las LTP.

Diversos autores han señalado la asociación existente

entre la sensibilización a polen de Artemisiay a Rosáceas.

La caracterización de la LTP del polen de Artemisiay di-

versos análisis serológicos usando LTP de Rosáceahan

permitido establecer la reactividad cruzada existente entre

ambos grupos de LTP. En un estudio "in vivo" por prueba

cutánea utilizando cuatro LTP filogenéticamente alejadas,

hemos podido establecer la existencia de distintos patrones

de sensibilización a las LTP. Alrededor del 25% de los pa-

cientes reconocen en la prueba cutánea un amplio espectro

de LTP, mientras que aproximadamente la mitad restringen

este reconocimiento a las LTP de Rosácea. Este hecho pa-

rece indicar una evolución en el perfil de sensibilización a

este grupo de panalergenos. Un paciente con un elevado re-

conocimiento de LTP podría presentar reacciones graves

prácticamente con cualquier alimento de origen vegetal, in-

cluidos el vino o la cerveza.

La sensibilización a la Parietaria no se encuentra apa-

rentemente asociada a la sensibilización a Rosácea, sin embar-

go, podría representar un factor de riesgo al extender el espec-

tro de reconocimiento a estos panalergenos. Es interesante

señalar también la presencia de LTP en el polen de olivo, se-

gundo alergeno junto a la Parietaria, con un perfil netamente

mediterráneo. Habrá que determinar si la asociación a los pó-

lenes de perfil mediterráneo explica o no el distinto perfil de

sensibilización norte-sur. Otras posibles causas, como distintos

patrones estacionales de consumo de Rosácea, podrían expli-

car tal vez estas diferencias.

ALERGIA A POLEN DE SALSOLA

C. Colás Sanz

Servicio de Alergia. Hospital Clínico. Zaragoza.

Salsola kali o pestifer pertenece taxonómicamente a la

familia de las Chenopodiáceas que junto a la familia de las

amarantáceas pertenecen al orden Centrospermales, superor-

den Monochaamydeae, subclase Archichlamydeae, clase Di-

cotiledóneas. Dentro de la familia de las Chenopodiáceas

existen cerca de 110 géneros de los cuales los más impor-

tantes a nivel clínico son Chenopodium y Salsola.

Es una maleza, denominada comúnmente salsola, ca-

pitana (en Aragón), pincho, espinardo, rodadera, espantalo-

bos (en Soria) etc., se distribuye ampliamente por las re-

giones templadas; su hábitat son los suelos removidos, los

barbechos y las áreas litorales.

El nombre de salsola procede del latín sallere que

significa salar en referencia a la alta tolerancia que presen-

ta este tipo de plantas para vivir en suelos salinos. Se ha

descrito como causa importante de polinosis especialmente

Alergia a polen de salsola

103

C. Colás Sanz

en ambientes con una baja pluviosidad de la mitad oeste de

EE UU, Irán, Arabia Saudí, sur de Europa y norte de Áfri-

ca.

Según diferentes autores, en el género salsolase in-

cluyen entre 100 y 200 especies con una gran variabilidad

de hábitats y características propias. S. kali es una planta

anual que se desarrolla durante el verano y parte del otoño.

Morfológicamenteson arbustos de tamaño variable y esfé-

ricos y que tras florecer adquieren un tono marrón grisá-

ceo. A finales del verano, la planta se seca y el tallo se

rompe a ras del suelo, convirtiéndose en una planta rodado-

ra que es empujada por el viento dispersando entre 20.000

y 50.000 semillas en su recorrido. La polinización se reali-

za entre los meses de junio y octubre, las mayores cotas se

alcanzan durante el mes de agosto y septiembre.

Es prácticamente una planta cosmopolita que se ex-

tiende por la mayoría de las regiones costeras de Europa y

de los países del Mediterráneo y por ambas costas de los

EE UU. En España está ampliamente distribuida, sobre to-

do en la costa, Aragón y regiones de precipitaciones no

muy elevadas, particularmente en el valle del Ebro y en re-

giones interiores del sudeste. En estas zonas el polen puede

representar hasta un 5% del total de pólenes del área.

En el área de Zaragoza las mayores concentraciones

de polen se registran a finales de agosto y primeros de sep-

tiembre, aunque también se observa un pequeño pico entre

mayo y junio que produce síntomas leves o moderados en

los pacientes más sensibles.

En el Servicio de Alergología del Hospital Clínico de

Zaragoza se tabularon todos los polínicos atendidos por pri-

mera vez en el año 1993, de los cuales algo más del 40%

eran sensibles a polen de Salsola kali, lo que sitúa a este

polen en segundo lugar en frecuencia de sensibilizaciones

junto al polen de olivo. Si comparamos estos datos con los

de Alergológica 92, se observa la gran diferencia en el por-

centaje de sensibilizaciones a polen de Salsola kalien toda

España (algo más del 10%) y Aragón (40%). Estos porcen-

tajes se corroboraron en un nuevo recuento de la frecuencia

de sensibilización a pólenes en 1.400 polínicos vistos en el

Servicio de Alergología del Hospital Clínico Universitario

de Zaragoza durante el período 2000-01. La frecuencia de

sensibilización al polen de Salsola kalientre los polínicos

de Zaragoza se situó de nuevo en el 40% (Fig. 1).

La importancia del polen de Salsola kalien Aragón

se refleja también en que el 32% de las vacunas adminis-

tradas en esta región a pacientes polínicos en el año 2001

llevaban en su composición polen de Salsola kali.

A consecuencia de la importancia de este polen en

nuestra zona y la escasez de publicaciones sobre él, se inició

un estudio en el que colaboraron tres grupos de trabajo: el

departamento I+D de CBF Leti (liderado por Dr. Fernández-

Caldas), el Servicio de Inmunología de la Fundación Jiménez

Díaz (dirigido por el Dr. Carlos Lahoz) y el Servicio de Aler-

gología del Hospital Clínico de Zaragoza, en el que el autor

actuó como investigador principal.

Como resultado de todo ello se identificó el alergeno

principal de S. kaliy se estableció su secuencia de amino-

ácidos; ahora se encuentra en fase de desarrollo una proteína

recombinante de este polen. Paralelamente se ha realizado

seguimiento clínico de los pacientes, durante la época de

máxima polinización, con objeto de evaluar la eficacia de un

tratamiento con inmunoterapia específica en un diseño a do-

ble ciego controlado con placebo. Los datos se presentaron

en la última reunión de la Asociación Aragonesa de Alergia

(Alergoaragón) y se publicarán próximamente. Se resumen a

continuación algunos resultados de estos estudios.

Los extractos de S. kalipresentan una gran cantidad de

bandas proteicas, de las cuales la más predominante es una

banda de 43 kDa. Esta banda representa en torno al 25% del

contenido proteico (medido por densitometría) y se ha des-

crito y nombrado como un alergeno principal del polen de S.

kali. Sal k 1 presenta 6 isoformas con puntos isoeléctricos

comprendidos entre 5,5 y 7. Presenta una alta frecuencia de

reconocimiento in vitro (66%) en pacientes sensibilizados a

S. kaliy una frecuencia de reconocimiento del 100% in vivo.

El seguimiento de los pacientes alérgicos a polen de

salsola muestra que los pacientes presentan los síntomas

más intensos en los últimos días de agosto y la primera

quincena de septiembre. Resulta sorprendente el fenómeno

del desfase que se observó entre las concentraciones máxi-

mas y los niveles máximos de síntomas, que se estableció

entre dos y tres semanas (Fig. 2).

104

SENSIBILIZACIÓN A PÓL ENES

C OM PARACIÓN CON LOSDATOS DE ALER GOLOGICA92

Servicio de Alergia. Hospital Cl íni co. Zaragoza

Gramíne as Olivo Ch enop/sal Artem. Pl ant ago Parietaria o tros0

20

40

60

80

100%

HCU ALERGOL92

* *

**

*Chi2p<0.001

Fig. 1.

Otros pólenes alérgicos en el sudeste español

El tratamiento con un extracto despigmentado y polime-

rizado de Salsola kali(CBF Leti) durante 10 meses ha produ-

cido una reducción significativa en los recuentos de síntomas,

y en los cuestionarios de calidad de vida, a falta de ultimar el

análisis de otras variables. En la figura 3 se representa la me-

dia diaria de síntomas en los dos grupos, se observa cómo en

la época de máxima polinización el grupo placebo duplica en

la cuantía de los síntomas del grupo tratado (p<0,05).

Colaboraciones

Departamento de I+D de los Laboratorios C.B.F. LE-

TI S.A., doctores Fernández-Caldas E. y Carnés Sánchez

J., y con la colaboración de los doctores Alonso C., y Ma-

rina C; del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa,

CSIC-Universidad Autónoma de Madrid, de los doctores

Lahoz C., Civantos E., del Pozo V., Cárdaba B., Vivanco

F., Mas S. y Durán C., del Dpto. de Inmunología de la

Fundación Jiménez Díaz de Madrid, y de los doctores Le-

zaun A., Venturini M. y Monzón S., del Servicio de Aler-

gia del Hospital Clínico "Lozano Blesa" de Zaragoza, así

como del resto del personal del mismo, Lara S., Reichelt

C., Domínguez M.A., Fraj J., Duce F., Abadía C., Sobrino

L., Bretos A., Roche V. y Saldaña J.

Referencias bibliográficas

1. Pola P ola J, Zapata Jiménez C, Sanz T urón E. P olinosis en el áreade Zaragoza. Rev Esp Alergol Inmunol Clin 1998; 13: 135-139.

2. Libro de R esúmenes de P onencias de la VI R eunión Anual de Aler-goaragón. Formigal 3-8 de febrero de 2002. P rimera P onencia: "Po li-nosis por Salsola kali: Diagnóstico y tratamiento" (en prensa).

OTROS PÓLENES ALERGÉNICOS EN EL

SUDESTE ESPAÑOL

J. García Sellés, M. Munuera Giner

Servicio de Alergia. Hospital Virgen de la Arrixaca. Murcia.

Aproximadamente el 20% de la población murciana

sufre de polinosis, que en nuestra región presenta tres pa-

trones clínicos bien definidos: primaveral, de estación pro-

longada e invernal.

Las dificultades encontradas para llegar a un diagnós-

tico etiológico en la primera etapa de nuestra unidad, nos

llevaron a plantearnos la necesidad de realizar un calenda-

rio polínico que abarcara todo el año y durante un período

de seis años, con la finalidad de identificar todos los póle-

nes que aparecen en la atmósfera de Murcia y así poder es-

tablecer una batería diagnóstica de pólenes, adecuada a la

realidad aerobiológica de nuestro medio (Figs. 1-4).

Muchos de los 93 tipos de pólenes aerotransportables

que se encuentran en el área de Murcia aparecen con patro-

nes aerobiológicos notablemente distintos a los descritos en

otros lugares de España y en los calendarios polínicos eu-

ropeos.

El clima particular en el área de Murcia (temperatura

media de 16,8º C) permite florecer a muchas especies de

manera repetida durante el año. Esta es la razón por la que

algunas especies de pólenes (Fig.5) muestran estaciones

polínicas especialmente largas que raramente se han descri-

to o, en el caso de Phoenix y Artemisia, no se han descrito

nunca fuera del sudeste de España1. La alta incidencia de

Chenopodiaceae-Amaranthaceaeen Murcia (49,5%) se de-

be probablemente a estas concentraciones altas de polen.

105

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

03- jul 13-jul 23 -jul 02-ago 12-ago 22-ago 01-sep 11-sep 21-sep02468101214161820

PLACEBO PÓLENES

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

12-ago 17-ago 22-ago 27-ago 1-sep 6-sep 11-sep 16-sep 21-sep

ACTIVO PLACEBO

Fig. 2. Las concentraciones máximas de pólenes preceden en más dedos semanas a las exacerbaciones de los síntomas en el grupo place-bo. Recuentos de polen proporcionados por el Comité de Aerobiologíade la SEAIC (Estación de Zaragoza, Drs. P ola y Zapata).

Fig. 3.

J. García Sellés

Brassicaceaeraramente es considerado un polen aerotrans-

portado y normalmente aparece durante períodos que no

superan un mes, pero en Murcia este polen aparece conti-

nuamente durante cinco meses.

Otras especies (Fig. 6) son inusuales porque florecen

fuera de las épocas "clásicas". El polen de Casuarina apa-

rece en febrero y junio (no descrito hasta ahora en Europa)

y Artemisia muestra una estación polínica otoñal y otra

muy importante invernal que no ocurre fuera del sudeste de

España, causada por un endemismo, la Artemisia barrelie-

ri2; éstas son las especies de pólenes "fuera de la estación"

más interesantes y destacables.

Finalmente, deben considerarse algunos tipos de polen

únicos (Fig. 7), que raramente se consideran aerotransporta-

dos como es Robinia pseudoacaciao que están totalmente

ausentes en otras localidades. Entre estos están Zygophy-

llum que solo se ha descrito en la región de Murcia y que

recientemente se ha identificado como alergeno3. Los re-

cuentos de pólenes de Caryophylliaceaeson unas 37 veces

más altos en Murcia que en zonas de Italia y cuatro veces

más altos que los recogidos en otras localidades españolas.

Si tenemos en cuenta la batería de pruebas cutáneas

en prick-test con pólenes que realizábamos en nuestra con-

sulta hasta 1995 (Fig.8 ), nos encontramos que no se inclu-

yen de forma habitual más de siete tipos de pólenes, princi-

palmente Artemisia (incidencia del 23,5%),

Chenopodiaceae(49,5%), Olea (68,4%), Parietaria

(51,0%), Plantago (17,9%), Poaceae(55,1%), y Rumex

(9,7%), y que se puede ignorar de forma sistemática hasta

21 especies de pólenes que aparecen en concentraciones hi-

potéticamente lo suficientemente altas como para provocar

enfermedades alérgicas locales o regionales. Nueve de ellas

se han identificado como alergenos que afectan a la pobla-

ción de Murcia: Acer (incidencia del 10,2%), Cupressus

(2,5%), Mercurialis (9,7%), Morus (8,7%), Pinus (1,0%),

Platanus(11,2%), Quercus(2,5%), Robinia (7,6%), y re-

cientemente Zygophyllum(15,3%). Todavía se desconoce

la incidencia de otras 12 especies: Apiaceae, Brassicaceae,

106

Fig. 1. Calendario polínico de la R egión de Murcia.

Fig. 2. Calendario polínico de la R egión de Murcia.

Fig. 3. Calendario polínico de la R egión de Murcia.

Fig. 4. Calendario polínico de la R egión de Murcia.

Otros pólenes alérgicos en el sudeste español

Caryophylliacae, Casuarina, Cyperaceae, Eucalyptus, Fra-

xinus, Ligustrum, Phoenix, Pistacia, Populusy Thymelaea.

En la figura 9 se propone una nueva batería de póle-

nes a considerar para el diagnóstico de la polinosis en

nuestro medio, el sudeste español, en la que además de los

pólenes considerados principales (Artemisia, Chenopodia-

cae-Amaranthaceae, Olea, Poaceae y Parietaria), por su

incidencia y por las monosensibilizaciones existentes, se

incluyen otros taxones. Algunos de ellos (Cupresus, Pinus;

Plátanus y Quercus) pueden participar en procesos alérgi-

cos de carácter general, mientras que otros menos abundan-

tes (Brassicaceae, Casuarina, Eucalyptus, Mercurialis,

Morus, Ligustrum, Phoenix, Populus, Robinia y Zygophy-

llum) podrían estar provocando problemas por proximidad,

más localizados pero no menos importantes, particularmen-

te si consideramos no solo las concentraciones de sus póle-

nes en la atmósfera, sino también los largos períodos de

tiempo en los que pueden encontrarse contenidos en el aire

que respiramos.

Referencias bibliográficas

1. Munuera Giner M. P atrones de variación polínica en la atmósfe-ra de Murcia. Tesis Doctoral. Universidad de Murcia.

2. Munuera M, Carrión JS, García Sellés J. Aerobiology Ar temisiaairborne pollen in Murcia (SE Spain) and its relationship with whe-ather variables: annual and intradiurnal variations for three differentspecies. W ind vectors as a tool in determining pollen origin. I nt JBiometeorol 1999; 43: 51-63.

3. Belchí Hernández J, Moreno Grau S; Sánchez Gascón F. Sensti-zation to Zygophyllum fabago pollen. A clinical and immunologystudy. Allergy 2001; 56: 241-248.

107

Floraciones extemporáneas

PoaceaePoaceae

ChenopodiaceaeChenopodiaceae

PlantagoPlantago

ArtemisiaArtemisia

CasuarinaCasuarinaEne.Ene.

CorylusCorylus

MayMay Jun.Jun. Jul.Jul. Ago.Ago. Sep.Sep.Feb.Feb. Mar .Mar. Abr.Abr. Oct.Oct. Nov.Nov. Dic.Dic.

Pólenes de estación prolongada

C henopodiaceaeC henopodiaceae

PoaceaePoaceae

ParietariaParietaria

Artemis iaArtemis ia

PhoenixPhoenix

C upressusC upressus

MayMay Jun.Jun. Jul .Jul . A go.A go. Sep.Sep.Ene.Ene. Feb.Feb. Mar .Mar . Abr .Abr. Oct.Oct. Nov.Nov. Dic.Dic.

Cary ophyllacea

Zygophyllum

Robinia

Lygeum

Brassicaceae

Thymelae

Presencias originales

Ene. Feb. Mar . Abr. May Jun Jul Ago. Sep. Oct. Nov. Dic.

Fig. 5. Pólenes de estación prolongada en la Región de Murcia.

Fig. 6. Pólenes recogidos fuera de la estación habitual en la Regiónde Murcia.

Fig. 7. Pólenes no habituales recogidos en la Región de Murcia.

Fig. 8. Batería de pólenes utilizados entre 1982-1995.

Fig. 9. Propuesta de una nueva batería de pólenes para la Región deMurcia.

ÁrbolesÁrbolesOlea

ArbustosArbustosArtemisiaSalsola

HierbasHierbasPhleumCynodonPhragmitesPlantagoParietariaChenopodiumRumex

Batería de pólenes. 1982-95

ÁRBOLES

OleaCupressusPinusQuercusPlatanusMorusAcerRobiniaCasuarinaEucalyptusLigustrumPopulusPhoenix

ARBUSTOS

ArtemisiaSolsola

HIERBAS

PhleumCynodonPhragmitesPlantagoParietariaChenopodumRumexMercurialisBrassicaceaeZygophyllum

Tabla nuevos tiposPropuesta para la batereía de extractos a cosiderar en las pruebas de alergia

I. Cortegano, et al.

CUP A 3: UN NUEVO ALERGENO DE LA

FAMILIA PR-5 DEL POLEN DE CUPRESSUS

ARIZONICA

I. Cortegano, E. Civantos, E. López, V. del Pozo,

B. Cárdaba, S. Gallardo, P. Palomino, A. del

Moral*, C. Lahoz

Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez DíazMadrid. *Departamento de Alergia. Hospital Virgen del ValleToledo.

Las plantas de la familia de las Cupresáceas se en-

cuentran presentes en toda la geografía española. Es fre-

cuente su utilización como plantas ornamentales, en jardi-

nes y en los márgenes de las carreteras. Las más

conocidas son los cipreses, arizónicas y tuyas. El género

Cupressus tiene 20 especies, entre las que destacan: C.

sempervirens(ciprés común), C. arizonica(arizónica), C.

funebris (ciprés llorón) y C. lusitanica(ciprés de Portu-

gal). Estas especies causan importantes alergias en dife-

rentes áreas geográficas (Norteamérica, Sur de África,

Austria y otros países mediterráneos como Francia, Italia,

España e Israel1. En el caso de España, se ha descrito una

alergenicidad significativa en la ciudad de Córdoba (13%),

donde existen concentraciones elevadas de polen de Cu-

presáceas en los meses de enero a abril2. Según los datos

del Comité de Aerobiología de la Sociedad Española de

Alergología e Inmunología Clínica, entre todas las ciuda-

des españolas que tienen instalados captadores de pólenes,

las concentraciones más elevadas de Cupresáceas durante

los últimos 5 años se han recogido en Madrid, Barcelona

y Toledo.

Las razones por las cuales se supone que ha aumen-

tado la alergia al polen de las Cupresáceas son varias: el

aumento de la exposición a estas plantas3, la subestima-

ción de su prevalencia real por confundirse con los cata-

rros invernales4 y el efecto adyuvante de la contaminación

ambiental5.

Las Cupresáceas carecen de verdaderas flores y la

polinización se realiza generalmente a través del aire, mé-

todo poco especializado que conlleva un gran gasto de po-

len. Los pólenes de la familia de las Cupresáceas son esfe-

roidales sin aperturas y con un tamaño de 20-40 µm.

Los pacientes con alergia a los pólenes de las Cupre-

sáceas presentan diferentes síntomas en los meses de in-

vierno, dependiendo del órgano afectado (prurito y enroje-

cimiento ocular y lagrimeo e incluso inflamación de los

párpados, estornudos, prurito nasal y rinorrea con sensa-

ción de obstrucción nasal y raras veces afectación de los

bronquios con tos y sensación de falta de aire). Debido a

la aparición de estos síntomas durante los meses de invier-

no, a veces es difícil distinguir la de un catarro común.

Para confirmar si un paciente es alérgico a los pólenes de

las Cupresáceas, además de presentar los síntomas referi-

dos antes en los meses de invierno, es necesario la confir-

marlo mediante pruebas cutáneas6.

Los extractos obtenidos a partir del polen de Cupre-

ssus arizonicaposeen dos características fundamentales,

su bajo contenido proteico y su alto porcentaje de carbohi-

dratos7. Numerosos grupos han trabajado para obtener un

extracto en óptimas condiciones con el fin de identificar

sus componentes alergénicos. Se ha descrito la presencia

de un alergeno principal predominante en cuanto a intensi-

dad y frecuencia de reconocimiento por la IgE de los pa-

cientes alérgicos que es una glucoproteína de 41-45 kDa

de masa molecular8. Este alergeno principal ha sido clona-

do en nuestro laboratorio, siendo denominado Cup a 19.

Esta proteína se ha expresado en bacterias E. coli como

proteína de fusión GST-Cup a 1 utilizando el plásmido

pGEX-5X-1. En la molécula de Cup a 1 se encuentran

presentes posibles sitios de glucosilación, y además la pro-

teína tiene actividad pectato-liasa, característica esta últi-

ma que comparte con proteínas muy homólogas (Jun a 1,

Cha o 1 y Cry j 1). Todas estas proteínas pertenecen a pó-

lenes de especies de la misma familia.

En el patrón proteico del extracto del polen de Cu-

pressus arizonicaaparecen otras proteínas que no se han

identificado todavía y que podrían ser importantes por su

alergenicidad, ya que algunos pacientes no reconocen Cup

a 1, pero sí el extracto completo del polen.

Existe una elevada homología entre las proteínas de

los pólenes de Juniperus asheiy Cupressus arizonicay,

por lo tanto, el patrón proteico de ambos extractos es muy

similar. En los dos pólenes aparece una banda de 25-30

kDa que reacciona con el suero de los pacientes. Esta pro-

teína (en el caso de Juniperus ashei) ya se ha clonado y se

ha denominado Jun a 3. Debido a la gran homología exis-

tente entre los dos pólenes pensamos que la banda del ex-

tracto de Cupressus arizonicapodría ser muy similar a Jun

a 310. La proteína del extracto de Cupressus arizonicare-

acciona con un porcentaje importante de los sueros de los

pacientes (30%), motivo por el que nos planteamos como

objetivo su clonación y expresión.

Para la clonación de esta proteína seguimos el proto-

108

Cup a 3: un nuevo alergeno de la familia PR-5 del polen de Cupressus arizonica

colo que se describe a continuación. En primer lugar, par-

tiendo del ARN del polen de Cupressus arizonica, se sin-

tetizó el ADNc y se realizó una PCR con unos cebadores

obtenidos en función de la secuencia de Jun a 3. Se obtu-

vo una banda de aproximadamente 597 pb que se insertó

en el plásmido pBluescript con el que se transformaron

bacterias E. coli. Se seleccionaron las colonias positivas

mediante un cribado con PCR y se mandaron a secuenciar.

De una de estas colonias se obtuvo una secuencia que per-

tenecía a una proteína completa y que se denominó Cup a

3 (número de acceso al Genbank: AJ294411). La masa

molecular aproximada es de unos 23 kDa y el pI de 4.82.

Esta proteína no tiene zonas teóricas de glucosilación pero

sí de fosforilación.

En la figura 1 se muestra la secuencia de nucleótidos

de Cup a 3, debajo de ésta aparece la secuencia de amino-

ácidos. Los aminoácidos marcados en rojo forman parte

de la secuencia susceptible de fosforilación y el aminoáci-

do marcado en azul es el que se fosforila.

Se ha obtenido un modelo teórico de la posible es-

tructura secundaria de la proteína Cup a 3 (Fig. 2). Se

muestra una tabla de homología de Cup a 3 con otras pro-

teínas clonadas.

El siguiente paso de nuestro estudio fue la subclona-

ción de la secuencia de Cup a 3 en un plásmido pGEX-

5X-1 para expresarla como proteína de fusión GST-Cup a

tres en bacterias E coli. Con este sistema obtuvimos la

proteína GST-Cup a 3, pero el rendimiento en la produc-

ción de proteína fue bajo (Fig. 3). Por este motivo, pensa-

mos utilizar un nuevo sistema de expresión, la cepa de le-

vaduras P. pastoris.Para ello se utilizó el plásmido

pPCIZaA y las levaduras se transformaron mediante la

electroporación (pulso eléctrico que permite la entrada del

ADN en el interior de la levadura). Gracias al diseño del

plásmido, nuestro gen se ha insertado detrás del promotor

de la enzima alcohol oxidasa 1, lo que impide la expresión

del gen de esta enzima. Cuando en el medio de cultivo es-

tá presente el metanol, éste inducirá positivamente al pro-

motor de la enzima y como consecuencia se expresará la

proteína clonada Cup a 3. Como se muestra en la figura

4A, se obtuvo la proteína recombinante Cup a 3 en P. pas-

toris, que se purificó del sobrenadante utilizando una co-

lumna de afinidad con iones divalentes. Debido a la pre-

sencia teórica de sitios fosforilables en la molécula de Cup

a 3, se realizó una immunodetección con un anticuerpo

anti-fosfo-tirosina. Como se puede observar en la figura

4B, la proteína recombinante Cup a 3 presenta posibles si-

tios de fosforilación.

Con esta proteína recombinante obtenida en nuestro

laboratorio se realizaron inmunodetecciones con sueros de

pacientes sensibilizados al polen de Cupressus arizonica

(n=154). Estos experimentos mostraron que el 63% de la

población sensibilizada al polen de Cupressus arizonicaes

positiva por inmmunodetección a la proteína Cup a 3 re-

combinante producida en el sistema de expresión de leva-

duras.

Un dato importante de la proteína Cup a 3 es su per-

tenencia a la familia denominada PR-5, que son proteínas

relacionadas con la patogenia en las plantas y cuya expre-

sión se induce en situaciones de estrés como pueden ser

los rayos ultravioletas, las infecciones fúngicas y las partí-

culas de diesel y ozono11,12. La proteína Jun a 3 también

109

gtg aag ttt gat ata aag aac cag tgc ggg tac act gtc tgg gca V K F D I K N Q C G Y T V W Agcg ggg ttg ccc gga gga ggg aag gag ttt gac cag ggg cag aca A G L P G G G K E F D Q G Q Ttgg acg gtt aat ttg gcg gcg ggc aca gcg tcg gca agg ttc tgg W T V N L A A G T A S A R F Wgga cga acg ggc tgc act ttc gat gcg agc ggg aaa gga agc tgc G R T G C T F D A S G K G S Ccgg agc ggt gac tgc ggc ggg caa ctg agc tgc aca gtc tcc gga

R S G D C G G Q L S C T V S Ggca gtt ccc gca acg ctg gca gag tac acg cag agc gac cag gac A V P A T L A E Y T Q S D Q Dtac tac gac gtc tcc ctc gtc gat ggc ttc aac att cct ctt gcc

Y Y D V S L V D G F N I P L Aatc aac cca acc aat aca aaa tgc act gcc cct gcc tgc aag gct I N P T N T K C T A P A C K Agac att aat gca gtg tgc cct tcc gag ttg aag gtt gat ggc gga D I N A V C P S E L K V D G Gtgc aac agt gcc tgc aat gtc tta caa act gat cag tat tgc tgc C N S A C N V L Q T D Q Y C Caga aat gcg tat gtt aat aac tgc cct gcc acg aat tac tcc aag

R N A Y V N N C P A T N Y S Kata ttc aag aac cag tgc cct cag gct tat agc tat gct aag gat I F K N Q C P Q A Y S Y A K Dgac act gcc act ttc gct tgc gcc tct ggt acc gac tac agt att D T A T F A C A S G T D Y S Igta ttc tgc ccc

V F C P

A

Proteína % Homología

Juniperus ashei allergen Jun a 3 96%Juniperus virginiana pollen allergen 3-1 mRNA 95%Juniperus virginiana pollen allergen 3-2 mRNA 95%Vitis vinivera Thaumatin-like protein gene

93%Vitis vinifera Thaumatin-like protein mRNA 90%Atriplex nummularia osmotim-like protein

89%Pyrus pyrifolia mRNA for thaumatin-like protein 89%

B

Fig. 1.

Fig. 2.

I. Cortegano, et al.

pertenece a esta familia y se ha descrito que su expresión

varía dependiendo de la zona y época de recogida13.

En los últimos años se ha visto incrementada la aler-

gia a los pólenes sobre todo en las zonas industrializadas.

Una teoría que explica este fenómeno es el hecho del

efecto adyuvante de la polución ambiental. Los contami-

nantes presentes en la atmósfera podrían tener un efecto

inductor sobre la síntesis de proteínas del tipo PR-5 y la

presencia de estas proteínas en los extractos proteicos de

los pólenes sería responsable del aumento de los procesos

alérgicos en la población urbana. Por este motivo nos pa-

reció importante determinar si Cup a 3 estaba presente en

extractos del polen de Cupressus arizonicaprocedentes de

diferentes zonas. En nuestro caso contábamos con un ex-

tracto recogido en el borde de una autovía y con otro ex-

tracto recogido en el campo.

Para realizar este estudio inmunizamos a 2 conejos,

uno con extracto completo del polen de Cupressus arizoni-

ca y otro con la proteína recombinante Cup a 3 producida

en P. pastoris, con el fin de obtener antisueros. Se realizó

un PAGE-SDS en el que se cargaron las muestras de los

extractos de ambas procedencias (autovía y campo), se

transfirieron a membrana y se sometieron a inmunodetec-

ción con el antisuero del conejo inmunizado frente al ex-

tracto completo y con el antisuero del conejo inmunizado

frente a Cup a 3 recombinante.

Como se observa en la figura 5, el suero del conejo

inmunizado frente al extracto completo de Cupressus ari-

zonica reconoce una banda en el extracto recogido en la

autovía (carril 1) que no aparece en el recogido en el

campo (carril 2). Esta banda podría corresponder a Cup a

3 debido a su masa molecular. Para demostrar que se tra-

ta de Cup a 3 utilizamos el suero del conejo inmunizado

frente a rCup a 3. Como muestra el carril 3 en el extracto

recogido en la autovía, la banda es reconocida por el

suero, y por lo tanto es Cup a 3. En el caso del extracto

recogido en el campo (carril 4) no aparece ninguna ban-

da.

Las conclusiones obtenidas de este trabajo son las si-

guientes:

1. Se ha clonado un nuevo alergeno del polen de Cu-

pressus arizonicaal que se le ha denominado Cup a 3

(AJ294411), masa molecular 21-23 kDa y pI 4.82.

110

21813186

43,833

19,3

7,2

MC (kDa)

GST (32 kDa)Cup a 3 (23 kDa)

Fig. 3. Producción de Cup a 3 como proteína de fusión GST. Cup a 3en bacterias E . c ol i.MC: marcadores de masa molecular.

1 C-

2071209255,9

35,429

217

Cup a 3

MC SB E1 E2A B

Fig. 4. Producción de Cup a 3 recombinante en P. pastoris. SB: sobre-nadante de las levaduras, E1 y E2: eluídos 1 y 2 de la columna, res-pectivamente. B. 1 Inmunodetección de sitios susceptibles de fosfoti-lación en la secuencia de Cup a 3. C: Control negativo. Mc:marcadores de masa molecular.

Fig. 5. Inmunodetección con antisueros de conejo. Extractos de laautovía (1) y del campo (2) revelados con el antisuero del conejoinmunizado frente al extracto de Cupr essus arizonica. Extractos de laautovía (3) y del campo (4) revelados con el antisuero inmunizadofrente a Cup a 3. C- Control negativo.

Cup a 3: un nuevo alergeno de la familia PR-5 del polen de Cupressus arizonica

2. Es importante describir los alergenos de la familia

PR-5, ya que la procedencia del extracto puede ser deter-

minante para la realización de las pruebas a los pacientes.

3. La expresión en levaduras P. pastorises adecuada

para la obtención de una cantidad importante de proteína

recombinante. Por lo tanto es un buen método para la es-

tandarización de alergenos para su uso en el diagnóstico y

la inmunoterapia.

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111