pruebasbioqumicas

8/10/2019 pruebasbioqumicas

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PRUEBAS BIOQUÍMICASPARA ENTEROBACTERIA

Susana Go

CATEDRÁTICO: M.C. JHOADAN B. ROCÍO LUJÁN LÓ



IDENTIFICACIÓN MICRO

Se entiende por identificación microbiana al conjunto de técnicasprocedimientos que se aplican para establecer la identidad de unmicroorganismo.



MÉTODOS DE IDENTIFICABACTE

Los métodos más utilizados para la identificación microbiana, los pclasificar en:

1. Métodos basados en criterios morfológicos

2. Métodos basados en tinción diferencial

3. Métodos basados en pruebas bioquímicas4. Métodos basados en tipificación con fagos

5. Métodos basados en pruebas serológicas

6. Métodos basados en detección molecular



En la mayoría de los casos la identificación no se realiza con base método, sino a la combinación de más de uno.



MÉTODOS BASADOS EN CRIMORFOLÓ

Los rasgos morfológicos han ayudado a los tamuchos años a clasificar organismos.

Los organismos superiores tienen rasgos an

diferentes que pueden ser fácilmente utclasificación, pero con respecto a los microorglucen bajo el microscopio tan similares que clasificación.



Sin embargo, aun cuando la morfología celular dice poco sobre relaciones filogenéticas, sigue siendo útil para la identificación bac

Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localización resulta dutilidad en la identificación de bacilos esporulados.



MÉTODOS BASADOS EN TIDIFERE

La mayor parte de las bacterias, teñidas con Gram, las podemcomo gram positivas o gram negativas, otras tinciones diferenciaácido resistente, se aplican a otro tipo de bacterias.

Un examen microscópico de una lámina teñida por medio de gratinción diferencial es útil para obtener una información rápidcalidad de un ambiente clínico.



MÉTODOS BASADOS EN TIPIFICCON

La interacción entre un virus bacteriofago (fago) y su célula sensible es sumamente específica, ya que el proceso de aencuentra mediado por receptores específicos tanto en el virus célula bacteriana.



El uso de fagos específicos permite identificar y subclasificarbacterias dentro de una misma especie.



MÉTODOS BASADOS EN ENSEROLÓ

Los métodos serológicos, implican la utilización de preparinmunoglobulinas específicas provenientes del suero o de un reapueden ser de gran utilidad en la identificación microbiana en muo en muestras biológicas.



MÉTODOS BASADOS EN BIOMOLE

Modernamente adquiere más importancia el uso de métodos biología molecular donde, a través de procedimientos y reactivosdetectar determinadas secuencias de ADN que son propdeterminado agente microbiano.



MÉTODOS BASADOS EN PRBIOQUÍ

Las pruebas bioquímicas han sido autilizadas para diferenciar bactpruebas se fundamentan en demmicroorganismo es capaz deazúcares, la presencia de edegradación de compuestos, la procompuestos coloreados, etc.



Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en ddiferentes con base a pruebas bioquímicas.

Por ejemplo, las bacterias entéricas gram negativas, forman ungrande y heterogéneo cuyo hábitat natural es el tracto gastrohumanos y otros animales. Esta familia, Enterobacteriaceae, inclpatógenos que causan síndromes diarreicos.



Existen flujogramas, para la identificación bacteriana, medianbioquímicas de microorganismos.

Por ejemplo, la presencia de un coco bacilo gram negativo, fermentador de glucosa, oxidasa negativo, nos indica la presenenterobacteria, para determinar su género podemos seguir esquema.



PRUEBAS BIOQUÍ

• Citrato

• Ureasa

• Voges-Proskauer

• Rojo de metilo

• Sulfuro Indol Movilidad (SIM)

• Movilida, Indol, Ornitina (MIO)

• Triple azúcar Herro (TSI)

• Agar Lisina Hierro (LIA)



COLOR: VERDE

INDICADOR: AZUL DE BROMOCRESOL

SUSTRATO PRINCIPAL: CITRATO DE SODIO



PRIN

Es una sal del acido cítrico.

Algunas bacterias pueden obtener energía de fuentes distfermentación de los hidratos de carbono, con el citrato como úde carbono.

La medición de esta característica es importante para identifimiembros de la familia Enterobacteriaceae. Cualquier medio detectar la utilización del citrato por las bacterias que se van a pcarecer de proteínas e hidratos de carbono como fuente de carb



La utilización del citrato por labacteria que se va a probar sedetecta en el medio de citrato porla producción de subproductosalcalinos.



El medio contiene citrato de sodio, que es un anión, como úniccarbono, y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Lque pueden utilizar el citrato también pueden extraer nitrógeno amonio, con producción de amoniaco (NH+), lo que palcalinización del medio por conversión del NH a hidróxido

(NH4OH).



El indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo dazul por encima de pH 7,6.



MEDIO DE C

El medio para citrato utilizado con mayorfrecuencia es la formula de Simmons.

El medio se coloca en tubos inclinados

(agar en pico de flauta).



La formula del medio de citrato deSimmons es la siguiente:

• Fosfato de amonio dihidrogenado 1 g

• Fosfato dipotasico 1 g

• Cloruro de sodio 5 g

• Citrato de sodio 2 g

• Sulfato de magnesio 0 ,20 g

• Agar 15 g

• Azul de bromotimol 0 ,08 g

• Agua destilada 1 L

• pH final = 6,9



PROCEDIM

Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio deprimario y se siembra en forma de estría única en el pico de inclinado) del tubo de agar citrato.

El tubo se inc

durante 2



RESUL

La prueba positiva esta representaproducción de color azul oscuro en e24 a 48 horas, que indica que el micen prueba ha sido capaz de utiliza

contenido en el medio, con forproductos alcalinos.



•

La prueba también puede considerarse positiva sinque haya color azul, si hay desarrollo visible en laestría de siembr a. Esto es valido porque para que eldesarrollo sea visible, el microorganismo debióhaber ingresado en la fase logarítmica decrecimiento, lo que solo es posible si ha asimiladocarbono y nitrógeno.



Microorganismos Positivos

• Salmonella

• Arizona

• Citrobacter

• Enterobacter

• Klebsiella

• Serratia licuefaciensis

• Pseudomonas cepacia

Microorganismos N

• Edwarsiella

• Yersinia enterocolítica

• Escherichia coli

• Shigella

• Yersinia pseudotubercul

• Otras especies de Mora

• Proteus morganii



UreasCOLOR: ROSADO

INDICADOR: ROJO FENOL

SUSTRATO PRINCIPAL: UREA



PRIN

Es una diamida del acido carbónico

Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con liberación de amondióxido de carbono.

El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amproduce alcalinización y aumento de pH del medio.



MEDIOS DE C

Los dos medios utilizados con mayor frecuencia son el caldo urea de Stuart de Christensen.CALDO UREA DE STUART AGAR UREA DE CHRISTENSENExtracto de levadura 0,1 g Peptona 1 9Fosfato monopotasico 9,1 g Glucosa 1 gFosfato disodico 9,5 g Cloruro de sodio 5 gUrea 20 g Fosfato monopotasico 2 g

Rojo fenol 0,01 g Urea 20 gAgua destilada 1 L Rojo fenol 0 ,012 g

Agar 15 gAgua destilada 1 L

pH final = 6,8 pH final = 6,8



PROCEDIMEl medio liquido se siembra con un ansa de cultivo puro del mic

por probar.

La superficie inclinada del agar (pico de flauta) se siembra en emicroorganismo por probar. Ambos medios se incuban a 35 °C d24 horas.



RESUL

Los microorganismos que hidrolizan la urea rápidamente puedreacciones positivas en l o 2 horas; las especies menos activrequerir 3 días o mas. Las reacciones son las siguientes:



1. Caldo de Stuart:

Un color rojo en todo el mealcalinización e hidrolisis de la urea.



2. Agar de Christensen:

Degradadores rápidos de la urea (especies de Proteus): color rojmedio.

Degradadores lentos de la urea (especies de Klebsiella): inicialmensolo en el pico de flauta, que gradualmente se extiende a todo el



3. Ausencia de hidrolisis de la urea: econserva su color amarillo original.



Microorganismos positivos

• Klebsiella

• Proteus (rápido)

Microorganismos ne


• Providencia



VogeProskau



PRIN

Voges-Proskauer es un epónimo doble, en honor de dos microbtrabajaron a principios del siglo xx. Estos investigadores fueron losobservar la reacción de color rojo producida en medios adecuados después del tratamiento con hidróxido de potasiodescubrió que el producto activo del medio, formado por el mbacteriano, es el acetil metil carbinol, producto de la vía del butile



• El acido pirúvico, se metaboliza da como resultado la produccióacetoina (acetil metil carbinol).

• Los microorganismos del grupo Klebsiella- Enterobacter-Hafnia-Seproducen acetoina como producto metabólico final principal dmetabolismo de la glucosa y forman cantidades pequeñas de ámixtos.

•

En presencia de oxigeno atmosférico e hidróxido de potasio al 4acetoina se convierte a diacetilo y el a-naftol sirve de catalizadoproducir un complejo de color rojo.



MEDIOS DE C

A. Caldo VP/RM

• Polipeptona 7g

• Glucosa 5 g

• Fosfato dipotasico 5 g• Agua destilada 1 L

• pH final = 6,9

B. Reactivos

• oc-naftol al 5%. intensificad

• a-naftol 5 g

•

Alcohol etilico absoluto 10• Hidroxido de potasio al

oxidante

• Hidroxido de potasio 40 g

• Agua destilada 100 mL

El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojoVoges-Proskauer (MR/VP) segun la formula de Clark y Lubs.



PROCEDIM

Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del microorprobar. Incubar 24 horas a 35 °C.

Finalizada la incubación, transferir 1 ml del caldo a un tubo de enAgregar 0,6 ml de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%

Es esencial que los reactivos sean agregados en ese orsuavemente el tubo para exponer el medio al oxigeno atmosférictubo en reposo durante 10 a 15 minutos.



RESULPositivo: desarrollo de color rojo 15 minutos o mas después del alos reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el producto dde la acetoina.

La prueba no debe leerse mas allá de una hora después de dejarreposo, porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden color cobrizo, que se puede interpretar como un positivo falso.




• Klebsiella pneuminiae

• Yersinia enterocolítica

Microorganismos n


• K. ozaenae



Rojo dMet



PRIN

El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (am(rojo). El pH al cual el rojo de metilo detecta los ácidos es muchque el pH correspondiente a otros indicadores utilizados en mediobacteriológicos. Por lo tanto, para provocar un cambio dmicroorganismo en estudio debe producir grandes cantidades dsustrato de hidratos de carbono que se utilice.

La prueba del rojo de metilo es una prueba cuantitativa de la proacido, que requiere que los microorganismos positivos produzfuertes (lactico, acetico, formico) de la glucosa.



MEDIOS DE C

A. Caldo VP/RM

• Polipeptona 7g

• Glucosa 5 g

• Fosfato dipotasico 5 g• Agua destilada 1 L

• pH final = 6,9

B. Reactivos

• Indicador de pH rojo de

• Rojo de metilo, 0,1 g e

alcohol etílico al 95%.• Agua destilada, 200 ml.

El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojoVoges-Proskauer (MR/VP) según la formula de Clark y Lubs.



PROCEDIM

1. Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del microorestudio. Incubar el caldo a 35 °C durante 48 a 72 horas (no mhoras).

2. Finalizada la incubación, agregar 5 gotas del reactivo de rojdirectamente al caldo.



RESUL

Positivo: El desarrollo de color rojoestable en la superficie del medio indicala suficiente producción de acido comopara disminuir el pH a 4,4.



• Negativo: Como otros micropueden producir pequeñasde acido del sustrato probaobservarse un color naranjaentre amarillo y rojo. Esto no

prueba positiva.





• Especies de Yersinia

Microorganismos n

•

Enterobacter aerógene• Enterobacter cloacae

• Klebsiella



SIM: Sulfuro indol movilidad

MIO: Movilidad indol ornitinaIndo



PRIN

Es uno de los productos de degradación metabólica del triptófano.

La prueba del indol se basa en la formación de un complejo dcuando el indol reacciona con el grupo aldehídodimetilaminobenzaldehido.

En la practica se utilizan medios combinados, como el medio de para motilidad (SIM), el medio para motilidad indol omitina (MIOindol nitrato.



SIM: SULFURO INDOL MOV

• Determinar si un organismo es móvil o icapaz de liberar ácido sulfhídrico enzimática de los aminoácidos que contproduciendo una reacción visible de copor último la capacidad de desdoblar emolécula de triptófano.



•

Producción de ácidosulfhídrico

• Producción de Indol

• Movilidad

PRODUCCIÓN DE Á



PRODUCCIÓN DE ÁSULFHÍ

La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de ude reducción que da un sulfito y un sulfato.

El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato férricopara producir un precipitado negro insoluble, sulfato ferroso.



PRODUCCIÓN DEEl triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciert

para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolacét

La formación de indol se produce solamente en aquellos capaces de fermentar los hidratos de carbono.



MEDIOS Y REAC

Caldo triptofano (triptofano al 1%)• Peptona o digerido pancreatico de caseina (tripticasa) 2 g• Cloruro de sodio 0,5 g• Agua destila da 100 mlReactivo de Kovac• Alcohol amilico o isoamilico puro 150 ml• p-dimetilaminobenzaldehido 10 g

• HCI concentrado 50 mlReactivo de Ehrlich• p-dimetilaminobenzaldehido 2 g• Alcohol etílico 190 ml• HCI concentrado 40 ml



PROCEDIM

Sembrar el caldo triptófano con el microorganismo por probar e i°C durante 18 a 24 horas.

Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivque se deslicen por la pared del tubo.

Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este paso debe ser preceagregado de 1 mL de xilol. Esto no es necesario con el reactivo de



RESUL

Ácido sulfhídrico:Positivo: ennegrecimiento del medio

Negativo: Sin ennegrecimiento

Indol:

Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio



j p

Negativo: No se produce color /Color naranja en la superficieindica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede sde la formación de indol.

La reacción positiva después de 24 horas indica una prueba comp

Si el cultivo de 24 hrs es negativo deberá incubarse otras 24 horala prueba.



MovilidadPositiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y en el medio provocando turbiedad.

Negativa: Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea d



Bacterias Producción H2S Producción Indol

Salmonella typhi +/- -

Salmonella +/- -

E. coli - +

Klebsiella - +/-

Enterobacter - -

Citrobacter + -

Shigella - +/-



MOVILIDAD, INDOL, ORComposición del medio:

• Extracto de levadura

• Peptona

• L-Ornitina

• Dextrosa

• Agar

•

Agua• Indicador de pH: púrpura de bromocresol

• Ácido: amarillo pH 5.2• Alcalino: Púrpura pH 6.8• Medio no inoculado: Púrpura intenso brillante pH 6.0



PRIN

El MIO se utiliza para la identificación de enterobacteriassobre la base de movilidad, la producción de ornitinadescarboxilasa e indol.

1. Descarboxilación de ornitina

2. Producción de indol

3. Movilidad



•

Descarboxilación de ornicapacidad enzimática dorganismo para descarboaminoácido para formar con la consiguiente alca



•

Producción de indol: El triptófano es unaminoácido que puede ser oxidadopor ciertas bacterias para formar tresmetabolitos principales: indol, escatole indolacético.

OC



PROCEDIM

Inoculación: picadura en forma verticalTiempo: 28-48 hrs

Temperatura 35 -37°C

RESUL



RESUL

Ornitina descarboxilasaPositivo: color púrpura del medio

Negativo: color amarillo en el fondo del tubo que puede ser púrpu

Indol:

Positivo: anillo rojo en la superficie del medioNegativa: No se Produce color / Color naranja en la superficieindica desarrollo de escatol



Movilidad:

Positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y en el medio provocando turbiedad.

Negativa: crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea d



Microorganismos ornitinapositivos

• Especies de Enterobacter

• Proteus mirabilis

• Proteus morganii

• Yersinia enterocolitica

Microorganismos ornegativos

• Especies de Klebsiella

• Enterobacter aglomeran

• Proteus vulgaris

• Proteus rettgeri

• Yersinia pestis

• Yersinia pseudotubercul



Bacterias Producción Indol Movilidad Pro

Salmonella typhi - +

Otras Salmonellas - +

E. coli + +/-

Klebsiella +/- -

Enterobacter - +

Citrobacter - +

Shigella +/- +/-



TSI: Triple azúHie

MEDIO DE C



MEDIO DE C

Agar hierro de klinger (AHK)

Composición:

Estracto de carne Extracto de levadura

Peptona Proteasa

Lactosa Dextrosa

Sulfato ferroso Cloruro de Na

Tiosulfato de Na AgarAgua destilada Indicador: Rojo fenolÁcido: amarilloAlcalino: RojoMedio no inoculado: naranja rojizo, p

PRIN



PRIN

Determina la capacidad de un organismo de atacar unhidrato de carbono específico incorporado en un medio decrecimiento básico, con producción o no de gases, juntocon la determinación de posible ácido sulfhídrico.



La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condicione(pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior )

El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y conceveces mayor de lactosa. Las enterobacterias y los fermentadorescomienzan metabolizando este azúcar.

Una vez que se ha reducido toda la glucosa piruvato, este se meel ciclo de Krebs formando productos finales ácidos.



El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, roj

A 6 horas de la incubación, la zona de la estría y el fondo del tubocolor amarillo (fermentador de glucosa)



Si el fondo permanece rojo, no hay variación de pH (no fermglucosa)

Si el color rojo es mas intenso que el original, hay alcalinizamiembro de la familia enterobacteriaceae)



Al agotar la glucosa la bacteria utiliza la lactosa o sacarosa.

Después de 18-24 hrs, el medio permanece amarillo, reacción

ácido (A/A). Fermentador de lactosa.La producción de gas romperá el agar o lo empujara hacia arribA/A más gas.



Si no utiliza la lactosa, hará uso de proteínas o aminoácidos.

El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona incdonde el oxígeno es abundante.18-24 hrs de incubación: zona inclinada roja fondo del agar amari(metabolismo anaerobio de glucosa inicial). Reacción alcalina soK/A.



Las bacterias que fermentan glucosa también pueden formaalcalinos a partir de la utilización de la peptona, sobre la zonReacción K/K.

PROCEDIM



PROCEDIM

Inoculación: picadura y estría en pico de flauta.

Tiempo: 18-24 hrs

Temperatura:35-37°C

RESUL



RESUL

K/A: fermentación de glucosa solamente (Pico alcalino/profundidad ácida). Característico de bacterias no ferde lactosa como Shigella.

A/A: fermentación de glucosa y lactosa (Pico de flauta ácido/ ácida). Característicos de E. coli y grupo Klebsiella-Enterobacter.

K/K: No fermentación de glucosa y lactosa (pico alcalino/profundidad alcalina). Característico de bacterias no fercomo Pseudomas aeruginosa



Especie bacteriana Superficie Fondo Gas

Enterobacter A K ++

Klebsiella A A ++ E. Coli A A +

Shigella K A -

Salmonella typhi K A -

Salmonella paratyphi K A +

Citrobacter K A +

Proteus vulgaris K A +

Providencia K A +/-

LIA: Agar Lis



g

Hie

COLOR: LILA

INDICADOR: PÚRPURA DE BROMOCRESO

SUSATRATPOS PRINCIPALES: LISINA Y HLUC

MEDIO DE C



MEDIO DE C

Base de descarboxilasa de Moller

Composición:

Peptona Extracto de carne

Piridoxal L-lisina

Citrato de amonio Tiosulfato de sodio

Glucosa Agua destilada

Agar Indicador de pH: Purpura de bromocresolÁcido: Amarillo pH 5.2Alcalino: Púrpura pH 6.8Medio no inoculado: Purpura intenso

PRIN



PRIN

Mide la capacidad enzimática de un organismo para descaminoácido (lisina y arginina) para formar una amina con la calcalinidad.

PROCEDIM



OC

Inoculación: por picadura y estría, inóculo liviano.

Temperatura: 35-37°C

Tiempo 18-24 hrs

RESUL



A: ácido

K: alcalino

N: neutra

R: Rojo (desaminación oxidativa)



• K/K: Azul de Prusia/azul de Prusia. Desaminación oxidativa/desca

• K/A: azul de Prusia/lila. No desaminación.

• Producción de H2S: Enegrecimiento del medio

• Producción de gas: burbujas o levantamiento del medio de cultiparaedes del tubo.



Especie Bacteriana Superficie Fondo Gas

E. Coli K K/N +/-

Shigella K A -

Salmonella typhi K K -

S. paratyphi K K +/-

Enterobacter clocae K A +/-

Ag



Agsang

El agar sangre es una combinación de un agar base (agar nutritivo



El agar sangre es una combinación de un agar base (agar nutritivofuente proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) el cun agregado de 5 % de sangre ovina, (también puede usarse sang

humana, para cultivos en una placa de Agar) con una pequeña chidratos de carbono naturales y cloruro sódico.

Se usa para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos p



p p g p(que es un factor de virulencia). Observando los halos hemolíticos de las colonias se determina el tipo de hemólisis que posee:

•

Alfa: halos verdosos• Beta: halos incoloros

• Gamma: inexistencia de halos.

Hemóli



Hemólis



Hemólisis G

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