PRUEBA DE LA REDUCTASAPRUEBA DE LA REDUCCION DEL AZUL DE METILENO (TRAM)

I. INTRODUCCION La complejidad bioqumica de la leche en su composicin y su elevada actividad de agua la convierte en una de los alimentos naturales donde proliferan fcilmente la mayor parte de los microorganismos y bien se podra catalogar como un medio universal de cultivo.Los microorganismos en la leche tienen varias orientaciones. Unos son beneficiosos por las transformaciones que producen y otros perjudiciales y su control presenta aspectos sanitarios y comerciales, el primero se refiere al riesgo que el alimento puede suponer para la salud del consumidor cuando es portador de microorganismos patgenos o de sus toxinas y el segundo a las caractersticas de conservacin de la misma que viene determinada por la presencia de un mayor o menor nmero de flora saprofitita, est en elevadas concentraciones puede producir defectos y disminucin de las propiedades nutritivas y organolpticas del producto.Existen grupos de microorganismos (M.O) que son tomados como indicadores en la Industria Lctea, pues su presencia permitir comprobar el cumplimiento de la aplicacin de las buenas prcticas higinicas.M.O indicadores: Bacterias aerbicas Mesfilas Coliformes totales y fecales Enterobacterias totales EnterococosEl desarrollo de mtodos rpidos y/o automatizados en el diagnostico de la calidad higinico sanitaria de la leche y sus productos constituye en los ltimos aos una necesidad enfocada en lo fundamental en la obtencin de la respuesta en el menor tiempo posible para tomar las medidas correctivas sobre las posibles brechas en la higiene de algunas de las fases de la cadena productiva antes de que el producto sea liberado en el mercado.Estos mtodos rpidos de diagnstico bacteriolgico en leche se han clasificado atendiendo a diferentes puntos de vistas, no obstante, en lo fundamental han tomado como base los aspectos siguientes: Rapidez con que se obtienen las respuestas, la actividad metablica de los microorganismos, posibilidades de automatizacin y principios de medicin en que se basan las lecturas.Teniendo en cuenta la diversidad de estas clasificaciones y para una mayor inclusin de mtodos rpidos empleados en el diagnstico microbiolgico de la leche, estn agrupados en tres grupos: mtodos directos, indirectos y en mtodos para diagnstico de microorganismos especficos.El mtodo usado en esta prctica es un mtodo indirecto, el mtodo de reduccin de colorantes (Reductasa), usando azul de metileno.En el procedimiento se utilizan patrones de azul de metileno o Resazurina y se observa el proceso de reduccin del colorante (de azul a blanco para el azul de metileno; de azul apizarrado a rosa o blanco para la Resazurina). El tiempo necesario para que se produzca la reduccin del colorante est relacionado con el nmero de microorganismos de la muestra.Teniendo en cuenta que los mtodos de reduccin no funcionan eficazmente en leches refrigeradas, se ha sugerido la sustitucin de estas por otras tcnicas rpidas.II. OBJETIVO Conocer y aplicar el mtodo de TRAM en la leche fresca Interpretar los resultados

Determinar la calidad de las leches frescas por mtodos rpidos y sencillos. Analizar la importancia del control de la calidad de la leche cruda como materia prima de la Industria lctea. Determinar la calidad de la leche para comprobar si es apta o es apta para el consumo humano.III .MARCO TEORICO Determinacin de la Calidad Microbiolgica en la Leche Cruda

1. Sedimento: el sedimento obtenido por el mtodo de lactofiltracin mide la calidad sanitaria. La presencia de abundante partculas de sucio y su tipo (heces, insectos, tierra, restos de alimentos), puede indicar el cuidado que se ha tenido durante el ordeo y almacenamiento de la leche cruda.

2. Temperatura: la determinacin de la temperatura en la recepcin muestra el cuidado que se haya podido tener durante el trasporte y almacenamiento de la leche. Sin embargo una leche que se encuentre la temperatura ptima de refrigeracin (4-5 C) no confirma que sea de buena calidad, ya que es posible que durante las fases que estn desde el sitio de produccin hasta la industria la misma haya sufrido fluctuaciones de temperaturas que hayan permitido la multiplicacin microbiana.

3. Lactofermentacin: esta prueba permite observar las caractersticas del coagulo obtenido de la fermentacin de una muestra de leche incubada a temperatura ambiente (35-37 C) por 24 horas. Segn las caractersticas observadas se puede presumir acerca del tipo de bacterias predominantes, ya que un coagulo homogneo sin o con pequeas burbujas de gas, indicara predominio de bacterias lcticas homofermentativas, por el contrario un coagulo grumoso con abundante gas puede indicar la presencia de bacterias coliformes.

Gua General para la Clasificacin de la Leche segn su SaborClasificacinPuntajeDescripcin del sabor especifico

Excelente40 - 45Sin criticismo

Buena38 - 39, 5Sabor ligeramente astringente y salado, carente de frescura, sabor ligero o definido a cocido, a pienso o sin sabor.

Regular36 - 37,5Sabor ligeramente a "establo" y oxidado; definitivamente astringente y salado carente totalmente de frescura, pronunciado sabor a cocido o sin sabor.

Pobre35,5 o menosSabor ligero o definido a cido, rancio y sucio; ligero, definido o pronunciado a "establo", amargo, extrao, a ajo/ cebolla, a malta, metlico; definido o pronunciado a establo y oxidado; pronunciado astringente, a pienso y salado.

InsalubreSin PuntajeSabor pronunciado cido, rancio y a sucio.

Tomado de Nelson and Trout (1964): p 96. Se estima normal un Puntaje de 31 - 40.

4. Acidez Titulable y pH: ya se ha estudiado estas dos propiedades de la leche en el tema de fsico qumico. Esta claro que la fermentacin microbiana modifica estos valores, aumentando la acidez y reduciendo el pH. Sin embargo hay que tener en cuenta que ciertos microorganismos proteolticos pueden causar la coagulacin dulce de la leche, es decir, sin acidez o con alcalinizacin de la leche.

5. Reduccin de Colorantes: estas pruebas se fundamentan en como por el metabolismo microbiano hace variar el potencial de xido reduccin de la leche. Para ello se utilizan como indicador el azul de metileno y la Resazurina, los cuales van variando su coloracin a medida que se van reduciendo. PRUEBA DE LA REDUCTASA O REDUCCIN DEL AZUL DE METILENO

El mtodo de reduccin del azul de metileno es un mtodo indirecto para calcular el contenido total de bacterias de la leche. De manera que en lugar de contar las bacterias se establece una correlacin entre el tiempo que se necesita para reducir el colorante de Azul de Metileno en la leche a una forma incolora y la probable poblacin bacteriana de la muestra.Por lo general, el tiempo que se necesita para la reduccin del colorante, es inversamente oro al nmero de bacterias presentes en a leche.

Este mtodo puede adaptarse para el examen de gran nmero de muestras en un tiempo corto, pero sin embargo, si la poblacin bacteriana es alta, ste mtodo no nos da informacin de la probable fuente de contaminacin.

No hay necesidad de que los utensilios de vidrio utilizados para esta prueba sean estriles, pero su contaminacin puede reducirse al mnimo tratndolos con agua hirviente o vapor que circule libremente.

Tal como existe en la ubre, la leche posee un potencial de oxidacin-reduccin suficientemente bajo para reducir inmediatamente el azul de metileno. La incorporacin de oxgeno durante el ordeo, enfriamiento, trasvase, etc. eleva el potencial Redox aproximadamente de + 0.06 a 0.01 voltios.Se cree que en el mecanismo de la reduccin del colorante durante la prueba, intervengan varios factores relacionadas entre s, pero lo que si es seguro que el proceso respiratorio de las bacterias, elimina oxgeno de la leche, provocando un cambio en el potencial de Oxido-Reduccin, puesto que, por lo general, el oxgeno mantiene un potencial positivo, y que, a medida que el potencial va cayendo, el hidrgeno pasa de los elementos constitutivos de la leche y de los metabolitos a1 azul de metileno, causando su reduccin.La prueba del azul de metileno, por su sencillez y la rapidez con que se obtienen los datos, es fcil, prctica y econmica, sin embargo, este mtodo tiene sus limitaciones y son las siguientes:

La temperatura de incubacin de 37C (98.6F) no es favorable para el metabolismo de todas las bacterias contenidas en la leche. Las distintas bacterias tienen capacidades diferentes en lo que respecta a rebajar el potencial de Oxido- reduccin de la leche.Por las siguientes razones:Las bacterias termodricas permanecen inactivas durante la prueba, y esta es la objecin ms importante ya que estas bacterias son las que constituyen el mayor problema para el elaborador.

Las bacterias sicrfilas y termfilas tendrn muy poca o ninguna actividad durante la prueba.

Los materiales inhibidores de la leche impedirn tambin la proliferacin de muchas bacterias y harn que la prueba d indicacin de una calidad ms alta que la realmente existente.

IV. MATERIALES Muestras de leche sin conservantes Tubos de ensayo Azul de metileno Alcohol Agua destilada Pipetas

V. PARTE EXPERIMENTAL Prueba de la reduccin del azul de metileno Se pipete 10 mL de leche contenida en un tubo de ensayo estril y se le agreg 1 mL de la solucin de azul de metileno. Agitamos para mezclar bien e incubar a37 C en la estufa Luego, rotulamos los dos tubos, Revisar cada 30 min. Para determinar la calidad de la leche tenemos q tomar en cuenta lo siguiente

Leche excelente: No se decolora en ocho horas. Contiene menos de 20000 microorganismos/ml. Leche buena: Se decolora en menos de ocho horas, pero no en menos de 6 horas. Contiene menos de 10000 microorganismos/ml. Leche regular: Se decolora en menos de seis horas pero no en menos de dos horas. Contiene unos 3000.000 microorganismos/ml. Leche mala: Se decolora en menos de dos horas, contiene ms de 3000.000 microorganismos/ml. Si el color desaparece en pocos minutos, la leche contiene unos 100.000.000 microorganismos/ml.

> 8 horas< de 20000 microorganismos/mlExcelente (A)

< 8 horas< de 10000 microorganismos/mlBuena (B)

< 6 horas3000.000 microorganismos/ml.Regular (C)

< 2 horas.>de3000.000 microorganismos/ml Si desaparece el color contiene 100.000.000 microorganismos/ml.

Mala (D)

Importante

1. El colorante azul de metileno el cual es un indicador de oxido-reduccin, es azul cuando est oxidado e incoloro cuando est reducido.2. Varias especies de bacterias, no todas las que pueden contaminar la leche, tienen la capacidad de secuestrar el oxgeno presente en el medio y por lo tanto generar la reduccin del azul de metileno con la consecuente prdida del tono azul.3. Bsicamente la velocidad con la cual se reduce el azul de metileno depende del nmero de microorganismos que tienen el efecto reductor, es decir que a mayor nmero de bacterias con esa propiedad, menor ser el tiempo necesario para que se produzca el cambio de color en el tubo. Esto es lo que comnmente se describe en bacteriologa como un recuento metablico indirecto. Internacionalmente la tabla de interpretacin del TRAM se relaciona con las siguientes recuentos de bacterias /mL.

TRAM (minutos) No Bacterias /mL.

< 30 minutos 20 - 30 millones

30 min - 2 horas 4 - 20 millones

2 - 6 horas 0,5 - 4 millones

> 6 horas < 500.000

Como se puede ver en la tabla las variaciones pueden ser de nmero de bacterias para determinado rango de variacin es muy variable, razn por la cual la prueba a nivel mundial ha perdido aplicacin como elemento para medir el nmero de bacterias.A lo anterior se suma el hecho de que un gran nmero de bacterias que hacen parte de la contaminacin de la leche durante el ordeo tienen poca actividad reductora del azul de metileno y los nmeros de bacterias para un determinado TRAM se ven incrementado en forma muy significativa, en aquellos ordeos donde las practicas de higiene son deficientes. Trabajos realizados para comprobar la tabla internacional de TRAM a dado resultados muy diferentes en los pases de Latinoamrica como se muestra en la siguiente tabla:TRAM (minutos) recto mesfilos aerobios (UFC)

< 30 min > 600 millones

30 min - 1 hora 100 - 600 millones

1 - 2 horas 25 - 100 millones

2 - 3 horas 10 - 25 millones

3 - 4 horas 5 - 10 millones

4 - 5 horas 3 - 5 millones

5 - 6 horas 2 - 3 millones

6 - 7 horas 1.5 - 2 millones

7 - 8 horas 1 - 1.5 millones

Como se puede observar mientras que en la tabla internacional, 6 horas de TRAM significan menos de 500.000, en nuestro medio ese mismo tiempo corresponde aproximadamente a 2 millones de bacterias. Estas grandes diferencias se originan en la diversidad de fuentes de contaminacin a que se ve sometida la leche cuando fallan las prcticas de higiene y se facilita la contaminacin con microorganismos provenientes del intestino de los animales, que en general tienen muy poca actividad reductora, comparativamente con bacterias de los gneros Streptococcus y Lactobacillus que son habitantes normales de la glndula mamaria y que a travs de ella pueden llegar a la leche.

Basados en la actividad metablica de los diferentes microorganismos que pueden contaminar la leche, la prueba TRAM puede castigar leches que tienen poca contaminacin ambiental pero con presencia de bacterias con gran capacidad reductora, como las mencionadas, y de otra parte favorecer a leches con alto nmero de bacterias contaminantes ambientales producto de ordeos antihiginicos pero que demoran mucho en reducir el azul de metileno.Otra razn para tener largo tiempo de TRAM frente a un alto nmero de bacterias es, que la leche examinada contenga sustancias que inhiban el crecimiento bacteriano, por ejemplo, preservantes qumicos o antibiticos, compuestos que cuando se est haciendo el Recuento en Placa, por el factor de dilucin a que se somete la muestra, pierden actividad o capacidad inhibitoria.El hecho de tener cortos tiempos de TRAM y Recuentos bajos de bacterias, es posible cuando varias clulas bacterianas se encuentran agrupadas y una Colonia (UFC) es el resultado de uno de estos grupos o de una sola clula. Por esto en los recuentos de Bacterias Mesfilas se usa el trmino Unidades Formadoras de Colonia (UFC). En la Prueba de TRAM el hecho de que las bacterias estn agrupadas o separadas no influye porque independientemente cada clula cumple su accin metablica.

VI RESULTADOS

LECHE DE VACA..TRAIDA DE HUNTER Hora 2:30 PM

Hora 3:00 PM

Hora 3:30 PM

Hora 4:00 PM

Hora 4:30 PM

Hora 5:00 PM

LECHE UHT

En la muestra pasteurizada (UHT) NO CAMBIA de color porque se ha eliminado toda la flora microbiana.

Hora 2:00 PM No hay cambios

Hora 2:30 PM.. No hay cambios

Hora 3:00 PM.. Presenta un precipitado azul

Hora 3:30 PM ..Presenta un precipitado azul

Hora 4:00 PM ..Presenta un precipitado azul

Hora 4:30 PM ..Presenta un precipitado azul

Hora 5:00 PM ..Presenta un precipitado azul

Debido al tiempo transcurrido en el cambio de viraje podemos decir que nuestra muestra tenia un rango entre 3000.000 a 100.000.000 microorganismos /mL, lo cual la leche lo clasificamos como NO APTA para el consumo.

A ms tiempo que demore en virar el color de la reaccin con el azul de metileno; quiere decir que esa leche ESTA en mejores condiciones de consumo.

DEBI DE COMER MSTengo buena leche

VII. DISCUSIONES

tenerse en cuenta es que las clasificaciones dadas no siempre son apropiadas ya que existen otros factores que pueden afectar al tiempo de reduccin, entre ellos, el tipo de microorganismos, el numero de leucocitos, el tiempo de exposicin a la luz, la cantidad de oxigeno disuelto y la tendencia de la leche a elevar los microorganismos hacia la superficie a medida que se va separando la crema del tubo de prueba. As es como ciertos microorganismos ( lactococcus lactis) son ms activos en su capacidad reductoras que otros, mientras que existen especies que son menos activas en ese sentido (streptococcus agalactiae, bacillus subtilis, microorganismos termodricos)

VIII. CONCLUSIONES

La calidad higinica de la leche ocupa en estos momentos una gran prioridad, para las industrias lcticas, es por eso los productores deben de producir su producto con el ms cuidado.

La utilizacin del TRAM, tiempo de reduccin del Azul de metileno, es un mtodo practico de los tantos existentes y que nos facilitan para analizar la calidad microbiolgica de nuestra leche.

Mediante nuestra prctica realizada para lograr una coloracin cambio de color rpidamente del color azul al blanco, lo cual esto nos da a conocer que nuestra leche analizada esta dentro del rango NO PERMITIDO y lo cual NO est APTO para el consumo humano.

Logramos determinar una cantidad aproximada de microorganismos existente en nuestra leche, lo cual nos permite garantizar que nuestro producto NO est APTO para el consumo humano.

IX. BIBLIOGRAFIA http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/materialdeapoyoparapruebasdeplataforma_1693.pdf http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdf http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/notas_de_microbiologia_de_los_al.htm http://www.anmat.gov.ar/anmat/drvisapi.dll?MIval=fna_show_monog&ID=AZUL_DE_METILENO http://imb.usal.es/Practicas2/P2/Practicas2.pdf http//:www.senasa.gob.pe/ FRAZIER. W. 1992. Microbiologa de los Alimentos. 4ta edicin. Editorial Acribia. Zaragoza HARRIGAN, W. 1992. Mtodos de Laboratorio en Microbiologa de los alimentos y productos. Lcteos. 3ra Edicin. Editorial Acribia. Zaragoza.

CUESTIONARIO

2. CUALES SON LOS COMPONENTES DEL AGAR PLATE COUNTLa composicin del agar para recuento en placa puede variar, pero por lo general contiene:1. 0,5%de peptona2. 0,25%de extracto de levadura3. 0,1%de glucosa4. 1,5%de agar

se ajust el pH a neutral al 25C.

3. HAGA UNA LISTA DE LOS MICROORGANISMOS MESOFILOS

BENIFICOS

PATOGENOS