Una consideración importante para la selección de un conservante antimicrobiano para una formulación parenteral es el "periodo de utilización" o las condiciones de almacenamiento y el tiempo después de la retirada inicial del producto. Algunas formulaciones parenterales de usos múltiples, debido a la estabilidad química o microbiana, deben utilizarse en un plazo de 24 horas, mientras que otros pueden permanecer almacenado durante un máximo de 1 semana a 2-8 C después del uso inicial (1).   El Ph. Eur. requiere pruebas de actividad antimicrobiana a los 6 y 24 horas después de la exposición microbiana. Esta actividad se asegura de que cualquier microorganismo añadidos inadvertidamente al producto mueren antes de repetir la administración. Sin embargo, las pruebas USP están diseñados para evaluar la actividad antimicrobiana después de 7 días.

Una vez que un conservante ha sido elegido y la formulación final del producto farmacéutico se ha establecido, los niveles de conservantes en el producto fármaco se ensayan químicamente a intervalos de tiempo de estabilidad para asegurar que el conservante se mantiene en concentraciones eficaces en el producto fármaco durante la vida útil. También es un requisito reglamentario para medir la eficacia de los conservantes utilizando las pruebas de eficacia de conservación sobre el producto fármaco en su recipiente final a través de caducidad. Para establecer las especificaciones de caducidad inferior eficaces, el producto se formula a 100%, 75% y 50% de la concentración conservante etiquetados y su eficacia en estas concentraciones confirmó usando el AET (cuatro - seis).   Basándose en estos hallazgos, el futuro comercializa pruebas de la estabilidad del producto puede llevarse a cabo utilizando el ensayo de química y no la prueba de provocación microbiológica.

Los capítulos compendio dividir el tipo de productos a ensayar en categorías tales como preparaciones estériles de dosis múltiples, productos tópicos, productos orales no estériles, etc. Este artículo de revisión se centra en las multidosis productos farmacológicos parenterales estériles que son categoría 1 productos en USP <51>, 5.1.3.1 productos en Ph Eur, y 1 en JP (.. cuatro - 6).

Resumen de la prueba

La AET se realiza por clavar un panel de microorganismos reto (que representan cocos Gram-positivos, bacilos Gram-negativas, levadura y moho) de forma individual en el producto y la determinación de la reducción logarítmica de organismos a intervalos de tiempo prescritos para evaluar cuantitativamente la eficacia de la conservante antimicrobiano para prevenir la proliferación microbiana y / o matar a los organismos (4 - 6).

Preparación del reto Microorganismos

Los inóculos de microorganismos de provocación se preparan típicamente a partir de cultivos madre frescas, recién cultivadas. Cada compendios recomienda el uso de

cultivos frescos ya que esto asegura que las células en fase de registro se utilizan para desafiar el producto. Existen diferencias sutiles entre los compendios con respecto a cómo estos cultivos frescos deben estar preparados, pero ninguna de las diferencias son científicamente significativa con respecto al crecimiento de los organismos de desafío saludables.

El USP y JP lista el uso de cinco organismos de desafío para la AET de parenterales multidosis estériles (4, 6).   Estos organismos son Staphylococcus aureus (Gram-positiva coccus), Pseudomonas aeruginosa (bacilo Gram-negativo), Escherichia coli (bacilo Gram-negativo), Candida albicans (levadura), y Aspergillus brasiliensis (moho). El Ph. Eur. especifica los mismos organismos, pero no lo hace de E. coli obligatorio para administración parenteral multidosis estériles y no lo recomiendo como apropiado para líquidos orales (5).Cada compendios también enumera las cepas de origen para cada organismo de las principales colecciones de cultivos cepa (Tabla  I;   4  - seis).   Estas cepas se consideran (8).   Sin embargo, si se utiliza la fuente de la American Type Culture Collection (ATCC), el cumplimiento de los tres compendios está asegurada.

Tabla ILas cepas de Major Culture Collection recomendados para la prueba (4- 6)

Subcultivo múltiple y el número de pasajes de los cultivos madre se convierten en un parámetro importante en el control de esta prueba, ya que las células que se propagan de forma continua podría conducir a cambios en la expresión fenotípica, la susceptibilidad especial a los antimicrobianos. Por esa razón, tanto la USP y JP recomiendan el uso de células recientemente cultivadas que no son más de cinco pasajes de las células madre(4, 6).   El Ph. Eur. no establece específicamente el número de pasajes, pero el estado para mantener los pasajes celulares al mínimo (5).   Un pasaje se entiende como la transferencia de organismos de una cultura establecida a un medio fresco. La USP es la única compendios mencionar el uso de cultivos congelados y almacenados "stock" preparados a partir de cepas de origen como ATCC (4).   El uso de cultivos madre congelados o inóculos estandarizados comprado es a menudo la práctica para los laboratorios especialmente durante el desarrollo de formulación. Tanto la USP y JP también mencionan el uso de ambos caldos de cultivo y las culturas de los medios sólidos para preparar las células, mientras que el Parlamento Europeo no menciona específicamente caldos de cultivo (4 - 6).   Células derivadas de medios sólidos son más

fáciles de cosechar y estandarizar como uno tiene que recoger por centrifugación y se lavan las células de caldo de derivados para eliminar el medio de crecimiento.

Parámetros para condiciones microbianas de crecimiento, tiempos y temperaturas, así como los medios de comunicación recomendadas se definen en cada compendio. El propósito de estos parámetros es hacer crecer células viables sanas para desafiar el conservante en el producto. Existen diferencias menores entre los compendios, ninguno de los cuales son significativos. Una estrategia única preparación puede ser empleado que satisfaga todas las necesidades (ver Tabla  II).Para todos los compendios, las bacterias se cultivan a 30 a 35 ° C durante 18 a 24 h en medio de soja-caseína Digest. Este período de tiempo asegura que las células sean viables y en crecimiento en la fase de registro, minimizando la cantidad de células muertas cosechado y normalización de la respuesta a los agentes antimicrobianos. La levadura se cultiva a 20-25 ° C que es una temperatura subóptima y requiere un período de tiempo más largo. La USP afirma 44-52 h, la Ph. Eur. States 48 h, y la JP afirma 40-48, h (4 - seis).   En cualquier momento alrededor de 48 h es adecuada, pero no debe exceder de 52 h (4 - 6).   Los moldes se hacen crecer "hasta que se obtenga una buena esporulación" (cuatro -6).   Se tarda aproximadamente 6-7 días para observar un césped copiosa de negro A. brasiliensis esporas en medios sólidos. Puesto que las esporas de moho se utilizan para el reto microbiano, se hacen intentos para cosechar la mayor cantidad de esporas como sea posible. Las células de esporas se pueden cosechar en cualquier momento entre los 6 y 10 días dependiendo de la observación visual de la cultura (cuatro - seis).   El medio de cultivo para el crecimiento de la levadura y el moho es generalmente Sabouraud Dextrosa Agar aunque otros medios pueden ser utilizados como se especifica por la JP (4 - seis).

Tabla IIRecomendada Challenge Organismo Preparación inóculos (4 - seis)

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Recoger las células

Cada cultura se "cosechan" después de que ha sido cultivado por la cantidad de tiempo apropiado. Después de la cosecha, las suspensiones de células son luego "estandarizada" para proporcionar un inóculo de aproximadamente 10 8 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml (4 - 6).   La USP establece estandarizar aproximadamente 1 × 10 8  UFC / ml, mientras que el EP y JP son menos específicos y el estado de la estandarización de ser

aproximadamente 10 8  UFC / ml (ver Tabla  III)   (4  - 6).   Para esta prueba, no hay ninguna diferencia significativa. Todo el estado de tres compendios que las culturas deben ser cultivadas en medios sólidos y, a excepción de A. brasiliensis, se recogieron usando solución salina estéril (0,9% de solución salina)  (cuatro - seis).   Recolectar las células a partir de medios sólidos se lleva a cabo mediante la adición de un poco de diluyente (solución salina) a los medios y raspando las células de la superficie con una herramienta estéril. Las células se diluyeron a continuación hasta el aproximada 10 8  CFU nivel / ml usando el mismo diluyente (es decir, solución salina estéril) (4 - 6).   Por lo general, las mediciones espectrofotométricas se utilizan para normalizar el nivel de uso con lecturas de turbidez (porcentaje de transmitancia o absorbancia). Cuando la cosecha A. brasiliensis esporas de moho, el diluyente contiene 0,05% de polisorbato 80 que se añade para ayudar a dispersar las células de esporas y evitar la aglutinación(cuatro - seis).   La JP también menciona que 0,1% de agua de peptona se puede utilizar en lugar de solución salina estéril (6).   El uso de solución salina estéril contra el agua de peptona 0,1% no tiene impacto en la prueba de eficacia de conservación.

Tabla IIIRecomendado Preparación del inóculo (4 - seis)

Una vez que las células han sido cosechados y estandarizado, las células deben ser usados dentro de la cantidad especificada de tiempo para asegurar un desafío de células viables saludable para el producto. Dos objetivos se quieren alcanzar durante la prueba. El primer objetivo es enumerar las células para un número de CFU línea de base contra la cual se mide la eficacia de conservación del producto. El otro objetivo es para clavar las células sanas en el producto para el AET real. El estado USP y JP utilizar las células dentro de 2 h o refrigere durante hasta 24 h (4, 6).   Los estados del PE a utilizar las células inmediatamente y menciones no hay condiciones de almacenamiento (5).   La USP establece que el cosechado A. brasiliensis esporas pueden almacenarse a 2-8 ° C durante un máximo de 7 días (4).   El EP y JP guardan silencio con respecto a A.brasiliensis almacenamiento de esporas (5, 6).   Una vez que las células se recogen y estandarizada, todas las pruebas de enumeración y clavar producto debe ocurrir dentro de un período de 8 horas de tiempo y las células deben ser almacenado a 2-8 ° C cuando no esté en uso. A. brasiliensis esporas se han almacenado con éxito a temperaturas de refrigeración durante 7 días sin perder viabilidad.

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Enumerando las CÉLULAS

Un resultado enumeración de referencia de tiempo cero para los cultivos celulares desafío enteros utilizados para el producto clavar debe ser establecido. Los organismos se diluyen hasta el nivel en que son teóricamente dentro de los rangos contables. Esto se realiza haciendo diluciones (por lo general diez veces) de cada organismo en la dilución de fluido (es decir, solución salina estéril) y el uso de la técnica de verter la placa para establecer cuantitativamente la enumeración de la cultura madre de trabajo en términos de unidades formadoras de colonias por mililitro de conformación. Los organismos se diluyen Del 10 8  / ml de la UFC a un número contable (25 a 250 UFC por bacterias y levaduras, 8-80 UFC para el molde; cuatro - 6).Una alícuota de 1 ml del organismo diluido se añadió a una placa estándar de 100 × 15 mm Petri. Medios templado hasta aproximadamente 45 ° C se añade a la placa (véase la Tabla  IV).Los laboratorios pueden realizar variaciones de este método de enumeración, por ejemplo, repartidas placas o métodos de filtración de membrana, pero el resultado sería el mismo. La temperatura de incubación y la duración del crecimiento microbiano en las placas de Petri para cada organismo se define en cada compendios y difiere sólo ligeramente en texto (véase la Tabla  V;   4  - seis).   Los organismos deben crecer lo suficiente como para ser contados visualmente como colonias. Bioluminiscencia de ATP, citometría de flujo, u otros métodos rápidos se han utilizado que detectará colonias antes de que puedan ser contados por el ojo desnudo. En general, el crecimiento por períodos más largos de tiempo es de ningún perjuicio como colonias no va a "desaparecer". Sin embargo, es posible que el moho que ser "precounted" 1-2 días antes estas colonias tienden a esporular y se extendió por lo tanto haciendo la diferenciación colonia difícil si la placa está cubierta. Cada unidad formadora de colonia está teóricamente deriva de una célula.

Tabla IVCriterios USP para microorganismos ensayados (4)

Tabla VLas condiciones de incubación (cuatro - seis)

A pesar de que existen pequeñas diferencias entre los diferentes compendios en el texto de la duración de la incubación la placa, la buena práctica científica es incubar las placas de tiempo suficiente para que todas las células que se han propagado en colonias

que pueden contarse por el ojo desnudo. Como se ha mencionado antes, los métodos microbiológicos rápidos se han desarrollado y se pueden utilizar para detectar las células antes de que puedan ser vistos a simple vista.

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REALIZACIÓN DE LA PRUEBA eficacia antimicrobiana

Todos los compendios prefieren que se ejecutará la prueba en el producto en su envase comercializado. La razón es que la prueba recipiente final mejor representa la contaminación del "mundo real". A menudo esto no es posible ni práctico. Suficiente material debe estar presente en el recipiente final para permitir que uno para eliminar las alícuotas a intervalos de tiempo para la enumeración. Por esta razón, todos los compendios PERMITEN para el producto que se retira de su envase final, agrupados, y se coloca en un recipiente adecuado para el ensayo (cuatro - seis).   La cantidad de inóculo u organismo desafío estandarizada añadido a desafiar el producto en conserva no debe ser un volumen que diluye el producto y sus conservantes cambiar sus concentraciones. El volumen de inóculo debe ser insignificante en comparación con el volumen total del producto de prueba. Todo estado compendios que este volumen no debe exceder de 1% del volumen total del producto a ensayar y debería resultar en un 10 cinco a 10 6  CFU desafío producto ml / (cuatro - 6).   Todos los compendios requieren que el producto contaminado desafiado ser almacenado a 20-25 ° C (temperatura ambiente) durante la duración del período de prueba, independientemente de las condiciones de conservación del producto. Las alícuotas de producto contaminado deben ser retiradas a intervalos de tiempo especificados para la enumeración (cuatro - seis).   El Ph. Eur. y JP también afirman que los contenedores de productos impugnados protegerse de la luz durante este tiempo, pero la USP se pronuncia sobre este parámetro (4 - 6).El USP y JP también mencionan registrando signos evidentes de contaminación microbiana y la proliferación tales como cambios en el color, olor y apariencia, mientras que el Parlamento Europeo se pronuncia sobre este parámetro (cuatro - 6).   En la práctica, la mayoría de los microbiólogos almacenar el material de ensayo en una incubadora a 20-25 ° durante la duración de la prueba.

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INTERVALOS DE PRUEBA Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

Los criterios de aceptación para el tipo de producto determinan los intervalos de tiempo en el que se enumeran las muestras para la reducción de registro en los niveles iniciales de inóculo tiempo cero. Los tres compendios no están armonizadas con respecto a los criterios de aceptación en términos de reducción de desafío y el nivel de significación que se expresa (cuatro - 6).   Sin embargo, una prueba puede ser ejecutado que satisface todos los intervalos de tiempo y los criterios de aceptación del compendio. La principal diferencia para formulaciones multidosis estériles es que la Ph. Eur. tiene de 6 y 24-H criterios de intervalo de tiempo mientras que la USP y JP no tienen criterios de hasta

días 7, 14, y 28 (cuatro - seis).   Teniendo en cuenta estos diferentes criterios, enumeraciones realizados a las 6 h, 24 h, 7 días, 14 días, y 28 días después de la exposición microbiana inicial satisfacen todos los requisitos compendio (4 - 6).   Estos recuentos en placa se convierten en log 10 y se compararon con el tiempo de enumeración cero a cabo en los niveles de inóculo de control de solución salina (4 - 6).

El Ph. Eur. (véase la Tabla  VI) tiene los criterios de aceptación más estrictos en que se requiere una reducción logarítmica a las 6 y 24 h para "Criterios A" eficacia conservante (5).   Estos criterios son difíciles de conseguir con muchos sistemas conservantes. A menudo, el nivel de conservante añadido para lograr estos resultados tiene efectos perjudiciales sobre el producto y / o está en niveles tóxicos. El Ph. Eur. también tiene "Criterios B" que se considera obligatoria por las agencias reguladoras de la UE y es más posible (5).   A las 24 h, se espera que el conservante para lograr al menos una reducción logarítmica 1 y prevenir la proliferación durante todo el período de 28 días (5).   El USP (véase la Tabla   IV) no tiene criterios para la aceptación hasta el día 7, y la JP (ver Tabla VII) comienza criterios en el día 014 (4, 6).   La USP también define "no aumento" en la proliferación de no más de 0,5 log más alto que el nivel medido anterior que corresponde a la variabilidad prevista de recuento en placa (4).   Preparaciones multidosis estériles de calidad deben tener un conservante que puede prevenir rápidamente la proliferación celular y destruir cualquier microorganismo inadvertidamente introducidos por varios retiros de producto a lo largo período de uso del producto. El capítulo USP es un método oficial de pruebas y aunque AET no es una especificación de lanzamiento del producto, la FDA requiere productos para satisfacer los requisitos de reducción de registro en este capítulo.

Tabla VICriterios del PE para microorganismos ensayados (5)

Tabla VIICriterios JP para microorganismos ensayados (6)

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CONCLUSIÓN

La eficacia antimicrobiana o la prueba de eficacia conservante se describe en USP <51>, EP 5.1.3 y JP 19 para los productos parenterales estériles de dosis múltiples formulados (4 - 6).   La ejecución de la prueba se armoniza esencialmente con respecto a la preparación del inóculo y la ejecución de la prueba. La armonización no se ha logrado con respecto a criterios de aceptación. Una prueba se puede realizar que satisface todos los compendios y sus criterios de aceptación.