PRT-024

Fecha emisión: Octubre 2002 Revisión: 4

PROCEDIMIENTO METODO DE

RECUENTO EN PLACA DIRECTO STAPHYLOCOCCUS AUREUS BAM ON

LINE 2001 Fecha revisión: 27-05-2008

Sección Microbiología Alimentos

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1. OBJETIVO

Detectar el número de unidades formadoras de colonias (ufc.) de S. aureus presentes en muestras de alimentos y agua 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

Aplicar este procedimiento para

2.1. Analizar alimentos y agua en los cuales se espera un recuento > 100 células /g o mL 3. FUNDAMENTO

Los Staphylococcus son microorganismos que viven en estrecha relación con el hombre y la gran mayoría de las cepas son potencialmente capaces de causar enfermedad.

Staphylococcus aureus es un microorganismo fácilmente destruido por tratamientos térmicos con altas temperaturas y por todos los agentes sanitizantes. Por lo cual la presencia de esta bacteria o sus toxinas en alimentos procesados o en equipos, generalmente indica falta de sanitización o contaminación cruzada.

Los alimentos se analizan para pesquisar S.aureus por las siguientes razones:

• Confirmar que este microorganismo fue el agente causal de la intoxicación alimentaria.

• Determinar qué alimentos o ingredientes de alimentos son fuente de contaminación de Staphylococcus aureus.

• Demostrar contaminación post proceso los cuales usualmente se deben a contacto humano con alimentos procesados o exposición del alimento a superficies inadecuadamente sanitizadas.

Los alimentos comúnmente asociados a intoxicaciones son: carne (vacuno, cerdo, pollo), productos cárneos (jamón, salame, vienesas) ,ensaladas (papas, porotos verdes, jamón, pollo), productos de pastelería (cremas) y productos lácteos (queso, queso de cabra ,etc)






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4. REFERENCIAS 4.1 Bacteriological Analytical Manual Online Enero 2001. 4.2 Técnica de coagulasa en tubo PRT-712.02-026. 4.3 Prueba de termonucleasa en cepa de S. aureus PRT-712.02-027 5. TERMINOLOGÍA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 MATERIALES

6.1.1 Pipetas bacteriológicas de 1 mL.graduadas en 0,1.estériles

6.1.2 Rastrillos de vidrio o de plástico autoclavable estériles, de 3-4 mm de diámetro, 15-20 cm de largo con ángulo de diseminación de 45-55 mm.

6.1.3 Placas Petri de vidrio o desechables de 90-100 mm estériles.

6.1.4 Tubos de 13 x 100 mm con tapa rosca, estériles

6.2 EQUIPOS

6.2.1 Estufa de incubación regulada a 35 º C ± 1ºC

6.2.2 Agitador de tubos

6.3 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

6.3.1 Agar Baird Parker pH 6,8-7,0 distribuido en Frascos Schott con 475 mL (o medio completo plaqueado)

6.3.2 Solución yema de huevo 50%.

6.3.3 Telurito de potasio al 1% (se puede utilizar solución yema de huevo comercial con telurito de potasio).

6.3.4 Solución sulfametazina 0,1% (opcional para inhibir desarrollo Proteus).

6.3.5 Agar soya tripticasa pH 7,3 ± 0.2






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6.3.6 Caldo infuso cerebro corazón pH 7,4 ± 0.2 en tubo tapa rosca de 13x100 mm

6.3.7 Plasma de conejo con EDTA o plasma fresco diluido 1:3 con agua destilada estéril.(usar preferentemente plasma comercial)

6.3.8 Agar T B-DNA

6.3.9 agar triptona extracto de levadura M 165 BAM para preparar agar glucosa y agar manitol

6.3.10 Lisostafina

6.3.11 Aceite mineral estéril

6.3.12 Peróxido de hidrógeno al 3%

6.3.13 Agar conservacion de cepas pH 7,2 en tubo 10x75 mm

6.3.14 Cepa control coagulasa positiva: S. aureus.

6.3.15 Cepa control coagulasa negativa: S. epidermidis 7. DESARROLLO

7.1 RECEPCIÓN DE LA MUESTRA EN EL LABORATORIO 346

7.1.1 Recibir en el Laboratorio de Recuentos, las muestras procesadas en el Laboratorio de Recepción de Muestras (dilución 10-¹ ) según PRT-712.01-002.

7.1.2 Anotar en cuaderno de inscripción, número de las muestras a sembrar y la clave interna.

7.1.3 Identificar 3 placas Petri con número, dilución de la muestra y clave interna.

7.1.4 Marcar en cada dilución el volumen a sembrar en cada una de las placas Petri : 0,3 0,3 y 0,4 Ml.

7.1.5 De cada dilución transferir 1 mL de suspensión a tres placas de agar Baird Parker distribuyendo 1 mL equitativamente en las tres placas (0,3 , 0,3 y 0,4 mL).

7.1.6 Extender el inóculo mediante rastrillo estéril, hasta que la superficie esté seca. Retener las placas en posición no invertida hasta que el inóculo se absorba ( aprox 10 minutos).

7.1.7 Si el inóculo no está completamente absorbido dejar las placas sin invertir en la incubadora por 1 hora. Incubar las placas invertidas a 35 º C durante 45-48 horas.

7.2 LECTURA Y REGISTRO






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7.2.1 Recuento Presuntivo

7.2.1.1 Seleccionar las placas que contengan entre 20-200 colonias.

7.2.1.2 Realizar recuento de todas las colonias circulares, brillantes, convexas, de 2-3 mm de diámetro, de color negro azabache o gris oscuro, con margen claro (blanco), rodeado por zona opaca y fuera de ella una zona clara, de consistencia cremosa cuando son tocadas con el asa de inoculación. Ocasionalmente en varios alimentos y productos lácteos pueden encontrarse cepas de apariencia similar a S. aureus no lipolíticas, salvo que las zonas claras y opacas alrededor de la colonia están ausentes. Cepas aisladas de productos deshidratados o congelados almacenados por largos períodos desarrollan colonias menos negras que las colonias típicas y pueden desarrollar apariencia rugosa y textura seca.

7.2.1.3 Anotar el recuento obtenido en cada tipo de colonia y dilución en el "Registro análisis de nuestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos" Código RG-712.00-023.

Recuento presuntivo = Lectura x Factor de dilución

7.2.2 Registro

7.2.2.1 Si son observados muchos tipos de colonias con apariencia similar a S. aureus en todas las placas sembradas, registre el número de colonias contadas de cada tipo separadamente.

7.2.2.2 Cuando placas de diluciones bajas tienen < 20 colonias, use este valor.

7.2.2.3 Si las placas contienen > 200 colonias de apariencia típica y en diluciones más altas no hay colonias típicas, utilizar estas placas para el recuento y no cuente las colonias no típicas.

7.2.2.4 Seleccionar más de una colonia ( 3 a 5) para cada tipo de colonia contada y realizar test de coagulasa y termonucleasa.

7.3 PRUEBAS CONFIRMATIVAS

7.3.1 Estudiar las colonias o un número significativo de ellas si el recuento es alto. El test de producción de coagulasa es específico para la especie. Se pueden realizar otras pruebas auxiliares como, catalasa, utilización anaeróbica de glucosa, utilización anaeróbica de manitol, nucleasa termoestable, sensibilidad a la lisostafina. La termonucleasa es tan específica como la coagulasa pero menos subjetiva y es muy útil para complementar y confirmar los test de coagulasa registrados con lecturas de 3+, 2+ y 1+.






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7.3.2 Ensayo de coagulasa en tubo. Aplicar PRT-712.02-026.

7.3.3 Producción de nucleasa termoestable. Aplicar PRT-712.02-027.

7.4 EXPRESION DE RESULTADOS

7.4.1 Según la proporción de colonias coagulasa positivas calcular el número de ellas por gramo de la muestra.

7.5 CALCULO

Recuento de S. aureus = Rto presuntivo X Nº de colonias confirmadas

Nº de colonias repicadas

7.6 INFORME

7.6.1 Se expresa en ufc de S. aureus por g o mL de producto analizado

8. REGISTROS

Identificación del registro

Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición

Registro control de Ambiente código RG-712.00-009.

Archivador verde Registros Laboratorio N° 346 Sección Microbiología Alimentos

Acceso restringido al personal Sección Microbiología

Papel 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos

Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis Laboratorio 346 código RG-712.00-010.

Archivador verde Registros Laboratorio N° 346 Sección Microbiología Alimentos








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Identificación del registro

Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición

Registro análisis de muestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos código RG-712.00-023.

Archivador azul Registro de Lecturas e informes de resultado de laboratorio Recuento aerobios mesófilos, S. aureus,Mohos y levaduras Sección Microbiología Alimentos



Registro de entrega diaria de muestras a los laboratorios código RG-712.00-037.

Archivador Registros Entrega diaria Laboratorio N° 346 Sección Microbiología Alimentos



9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág.

Modificada Motivo del cambio Fecha

Aprobación 3 1 Se elimina página 1 por cambió en formato

documento institucional. 27/05/2008

3 1 a 10 Se cambió formato del encabezado de página en todo el documento. Se corrige PRT-702.02-024 por “PRT-712.02-024”. Se cambió número de revisión por 3 por revisión N° 4 y el total de páginas.

27/05/2008

3 1 En el punto 1 se agregó ... “en muestras de alimentos y agua”.

27/05/2008






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Revisión Nº Pág.


Aprobación 3 1 En la frase del punto 2.1 se agregó: ...”y agua...se

espera un recuento...”. 27/05/2008

3 1 Se deja pie de página sólo en página 1 y se actualizan los cargos.

27/05/2008

3 1 En el punto 3. se corrigió staphylococcus por Staphylococcus

27/05/2008

3 2 En el punto 4.2. se corrigió PRT-702.02-026 por PRT-712.02-026.

27/05/2008

3 3 En el punto 4.3 se corrigió PRT-702.02-027 por PRT-712.02-027.

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3 3 En el punto 6.0 se agregó al listado : solución de yema de huevo al 50%, solución telurito de potasio 1%,( se puede utilizar solución yema de huevo comercial con telurito de potasio),Solución de sulfametazina 0,1% (opcional para inhibir el desarrollo de Proteus), lisostafina y aceite mineral estéril. En el punto plasma s eagregó ...(usar preferentemente comercial). En el punto Baird Parker se agregó ...(o medio completo plaqueado).

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3 4 En el punto 7.1.1 se cambió PRT-702.01-002 por PRT-712.01-002.

27/05/2008

3 4 En los puntos 7.1.2 y 7.1.3 se agregó ...”y clave interna”.

27/05/2008

3 4 En el punto 7.1.4 se corrigió ml por mL. 27/05/2008 3 4 En el punto 7.1.5 se eliminó la palabra “plaqueada” 27/05/2008 3 4 En el punto 7.1.6 se agregó la frase:.. “el inóculo”.. 27/05/2008 3 4 En el punto 7.2.1.2 se agregó : en varios alimentos y

productos lácteos pueden encontrarse cepas de apariencia similar a S. aureus no lipolíticas, salvo que las zonas claras y opacas alrededor de la colonia están ausentes.

27/05/2008

3 4 En el punto 7.2.1.3 se cambió RG-702.00-023 por RG-712.00-023.

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3 5 Se agregó el punto 7.2.2 Registros y lo ítemes 27/05/2008






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Aprobación 7.2.2.1 al 7.2.2.4.

3 5 En el punto 7.3.1 se agregó: “El test de producción de coagulasa es específico para la especie”.... ...”sensibilidad a la lisostafina. La termonuclesa es tan específica como la coagulasa pero menos subjetiva y es muy útil para complementar y confirmar los test de coagulasa registrados con lecturas de 3+, 2+ y 1+.”

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3 5 En los puntos 7.2.2 y 7.2.3 se cambío por PRT-702.02-026 y PRT-702.02-027 por PRT-712.02-026 y PRT-712.02-027 respectivamente.

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3 5 Se cambió el punto 8. 0 RESPONSABLES por REGISTROS.

27/05/2008

3 5 Se cambio el punto 9.0 DISTRIBUCION por TABLA DE MODIFICCAIONES

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3 6 En el punto 10.1 se cambió RG-702.00-009 por RG-712.00-009 En el punto 10.2 se cambió RG-702.00-010 por RG-712.00-010. En el punto 10.3 se cambió RG-702.00-023 por RG-712.00-023. En el punto 10.4 se cambió RG-702.00-037 por RG-712.00-037. Se agregó tabla de registros

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3 6 El punto 10.0 REGISTROS se cambió a ANEXOS y sus ítemes.

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3 10 Se modificó anexo N° 3 en Primera viñeta: ....”almacenado hasta 1 mes en refrigeración”. Segunda viñeta: - si se ha almacenado a temperatura ambiente

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Aprobación (20°C a 25° C ) por más de 5 días. -si el medio plaqueado ha perdido la opalescencia inicial.

3 10 Se agregó hoja anexo N°5 RG-712.00-023

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3 10 En ítem solución stock sulfametazina se corrigió Proteus por Proteus sp.

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10. ANEXOS

Anexo N°1 Esquema recuento S. aureus Técnica Recuento en placa por siembra en superficie.

Anexo N°2 Caracterización de los diferentes medios de cultivo utilizados para la detección de S. aureus en alimentos.

Anexo N°3 Precauciones en la preparación del medio Baird Parker.

Anexo N°4 Secado de placas con agar Baird Parker.

Anexo N°5 Hoja Registro análisis de muestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos código RG-712.00-023.






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ANEXO Nº 1RECUENTO S. AUREUS

TECNICA RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN SUPERFICIE

1 mL

HOMOGENEIZADO:

9 mL AP10 g muestra

90 mL Agua peptonada 0.1%Dil 10 -1 10 -2 10 -3

SIEMBRA :

0,3 mL 0,3 mL 0,4 mL 0,3 mL 0,3 mL 0,4 mL 0,3 mL 0,3 mL 0,4 mLAgar Baird Parker

INCUBACION: 35 ºC por 48 horas

LECTURA PLACAS : Lectura de placas que contengan entre 20 a 200 ufc Colonia , negra con características de S. aureus

REAISLAMIENTO :Pruebas bioquímicas o toxinas

caldo cerebro corazón Agar estríaIncubar a 35 º C por 24 hrs

CONFIRMACION :

Prueba coagulasa en tubo Prueba de termonucleasaPlasma de conejo Agar TB-DNA






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INCUBACION: Incubar a 35 ºC por Incubar en cámara húmeda 4-18 horas a 35 ºC por 4 hrs

LECTURA PRUEBAS Leer a las 4hrs, los tubos Leer a las 4hrsCONFIRMATIVAS negativos incubar hasta 18 hrs

CÁLCULO Contar el Nº de tubos positivos de cada dilución, hacer el cálculo según tubos confirmados

INFORME Informar como Nº de UFC/g o mL de producto






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ANEXO Nº 2

CARACTERIZACION DE LOS DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA LA DETECCION DE S. AUREUS EN ALIMENTOS

Medios de cultivo Incubación Agentes selectivos

diferenciales y estimulantes Lectura

Tiempo hrs

Temp ºC

KRANEP 48 35 Cloruro de sodio cloruro de Litio Rodanuro de potasio Azida de sodio Cicloheximida Manitol Piruvato de sodio Yema de huevo

Colonias amarillas que degradan la yema de huevo

BAIRD PARKER 48 35 Cloruro de litio Telurito de potasio Glicina Piruvato de sodio Yema de huevo

Colonias negras o grises brillantes, convexas rodeadas por un halo de precipitación o áreas claras.

TPEY 48 35 Cloruro de sodio Cloruro de Litio Telurito de potasio Polimixina B Yema de huevo

Colonias negras o grises brillantes, convexos, rodeadas por la reacción yema de huevo.

AGAR SANGRE POLIMIXINA

24 35 Polimixina B Sangre de cordero

Colonias que presentan halos de hemólisis tipo β

P-CSTS * 48 35 Cloruro de sodio Piruvato de sodio

Turbidez

* P-CSTS: Caldo soya tripticasa con 10% NaCl y 1 % piruvato de sodio






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ANEXO Nº 3

PRECAUCIONES EN LA PREPARACION DEL MEDIO BAIRD PARKER

• El medio base puede ser almacenado hasta 1 mes en refrigeración. • El medio completo no debe usarse:

- si se ha almacenado a temperatura ambiente (20°C a 25° C ) por más de 5 días. - si el medio plaqueado ha perdido la opalescencia inicial.

• En períodos prolongados de almacenamiento del medio deshidratado se reduce la selectividad. Este efecto puede ser revertido por adición de 0,5 mL de piruvato de sodio al 20% p/v en la superficie del medio de cultivo plaqueado y dejar secar a 50ºC por 1/2 hora o hasta que la superficie de la placa esté seca.

• Realizar control de calidad utilizando el método ecométrico a cada partida de medio preparado (IT-712.00- 008).

Solución stock de sulfametazina • Disolver 0,5 g de sulfametazina en 25 mL de Hidróxido de sodio 0,1 N. • Enrasar a 250 mL con agua destilada. 27,5 mL de esta solución aportan 0,055 g. • Adicionar la solución de sulfametazina para reprimir el crecimiento de Proteus.

ANEXO Nº 4

SECADO DE PLACAS CON AGAR BAIRD PARKER

• Las placas a usar deben estar secas a fin de prevenir la extensión y mezcla de colonias. • El secado de las placas se puede efectuar colocando las placas: • En un horno o incubadora a 50 º C por 30 minutos, quitando la tapa y colocando la

superficie del agar hacia abajo. • En un horno o incubadora a 50 ºC por 2 horas con la tapa puesta y la superficie del agar

hacia arriba. • En una incubadora a 37 º C por 4 horas con la tapa puesta y la superficie del agar hacia

arriba. • En la mesa del laboratorio por cerca de 16 horas a la temperatura ambiente, con las tapas

puestas y la superficie del agar hacia arriba.

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