PROYECTO DE INVESTIGACIÓN EVALUACIÓN DEL PROTOCOLO...

TALLER DE TÍTULO

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

EVALUACIÓN DEL PROTOCOLO DE MICROPROPAGACIÓN DEL PORTAINJERTO CLONAL VLACH DE NOGALES

FRANCESCA ORIELLE GUERRA HENRÍQUEZ

QUILLOTA, CHILE

2019

ÍNDICE

1 Resumen ................................................................................................................... 1

2 Problema u oportunidad ............................................................................................. 2

3 Hipótesis .................................................................................................................... 4

4 Objetivos .................................................................................................................... 4

4.1 Objetivos generales ............................................................................................. 4

4.2 Objetivos específicos ........................................................................................... 4

5 Estado de arte ............................................................................................................ 5

5.1 Descripción del nogal .......................................................................................... 5

5.2 Problema fitosanitario .......................................................................................... 5

5.3 Portainjertos clonales .......................................................................................... 5

5.4 Tipo de propagación de los portainjertos de nogales ........................................... 6

5.4.1 Método tradicional ........................................................................................ 6

5.4.2 Métodos vegetativos ..................................................................................... 6

5.4.2.1 Propagación por estaca ......................................................................... 6

5.4.2.2 Micropropagación .................................................................................. 7

5.5 Etapas o fases críticas de la micropropagación de portainjerto de nogales ......... 7

5.5.1 Desinfección del material vegetal ................................................................. 7

5.5.2 Establecimiento in vitro ................................................................................. 8

5.5.3 Multiplicación in vitro .................................................................................... 8

5.5.4 Condiciones para generación de raíces ........................................................ 9

5.5.5 Condiciones para la etapa de aclimatación ................................................. 10

6 Metodología ............................................................................................................. 11

6.1 Obtención del material vegetal .......................................................................... 11

6.2 Desinfección del material vegetal ...................................................................... 11

6.3 Ensayo 1: Establecimiento de los medios de cultivos ........................................ 11

6.4 Ensayo 2: Multiplicación o proliferación de los brotes ........................................ 11

6.5 Ensayo 3: Enraizamiento in vitro........................................................................ 12

6.6 Ensayo 4: Aclimatación ..................................................................................... 13

7 Análisis Estadístico .................................................................................................. 13

8 Bibliografía ............................................................................................................... 14

9 Plan de trabajo ......................................................................................................... 16

9.1 Etapa 0: Planificación del proyecto .................................................................... 16

9.2 Etapa 1: Cultivo in vitro ...................................................................................... 16

9.3 Etapa 2: Difusión del proyecto ........................................................................... 16

10 Resultados Esperados ............................................................................................. 17

11 Organización ............................................................................................................ 18

11.1 Descripción de los cargos .............................................................................. 18

12 Presupuesto ............................................................................................................. 19

13 Anexos ..................................................................................................................... 20

13.1 Anexo 1: Tabla Composición Medios de Cultivos DKW y RUGINI ................. 20

13.2 Anexo 2: Ensayo 1. Evaluación de medios de Cultivos .................................. 21

13.3 Anexo 3: Ensayo 2. Proliferación de Brotes ................................................... 21

13.4 Anexo 4: Ensayo 3. Evaluación de Enraizamiento in vitro .............................. 22

13.5 Anexo 5: Parámetros por evaluar en los ensayos de enraizamiento in vitro ... 23

13.6 Anexo 6: Ensayo 4 aclimatación .................................................................... 24

13.7 Anexo 7: Ensayo 4 aclimatación .................................................................... 24

13.8 Anexo 8: Carta Gantt con detalles de Actividades en la etapa 1 .................... 24

13.9 Anexo 9: Carta Gantt con detalles del proyecto ............................................. 25

13.10 Anexo 10: Organización del proyecto ............................................................. 26

13.11 Anexo 11: Presupuesto total por año (MM$) .................................................. 27

1

1 Resumen El nogal (Juglans regia L) se cultiva en Chile desde la III Región de Atacama hasta la XI

Región de Aysén del General Carlos Ibáñez del Campo. Estos últimos años ha alcanzado

37.568 hectáreas, siendo una de las especies frutales con mayor superficie en Chile.

Esta especie ha presentado un problema sanitario como es la pudrición de raíces y cuello

de la planta, causada por hongos del género Phytophthora. Estudios han demostrado que

los suelos chilenos presentan 93,3% de la presencia de la enfermedad pero que solo ha

prevalecido en el 15,7% de los árboles. Se ha demostrado que el problema está asociado

al portainjerto Juglans regia debido a la susceptibilidad del portainjerto a la enfermedad.

Durante los últimos años, se han introducido patrones clonales que presentan tolerancia

y/o resistencia a esta enfermedad. Estos portainjertos son Vlach, Rx1 y Vx211,

encontrándose los dos últimos portainjertos protegidos.

Esta especie requiere de mejoras en los manejos agronómicos para aumentar la calidad de

producción. La principal técnica de propagación de los portainjertos en Chile es a través del

uso de semillas de Juglans regia, estos portainjertos presentan un alto grado de

heterogeneidad. Por otra parte, la propagación vegetativa por estaca presenta dificultades

para generar raíces adventicias (material recalcitrante).

Por otra parte, la propagación clonal de la especie se ha comenzado a estudiar con la

finalidad de propagar estos portainjertos clonales, debido a que esta técnica de producción

genera plantas genéticamente iguales a la planta madre. Hoy en día se han realizado

diferentes estudios para propagar de manera comercial la especie, pero solo se ha

alcanzado 56% de plantas con raíces.

Con el siguiente estudio se espera determinar el protocolo de micropropagación del

portainjerto clonal Vlach, donde se propone que a partir de modificaciones en las diferentes

etapas del proceso de micropropagación se podrá alcanzar la propagación comercial del

portainjerto mencionado.

En las diferentes fases de la micropropagación se realizarán diversos ensayos con la

finalidad de aumentar el número de plantas sobrevivientes, es así, como el uso de diferentes

reguladores de crecimiento en las fases de multiplicación y enraizamiento aumentaría el

número de raíces y plantas sobrevivientes. Por otra parte, se evaluarán diferentes sistemas

de aclimatación para obtener el mayor número de plantas al finalizar la aclimatación.

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2 Problema u oportunidad El nogal (Juglans regia L) es posible de cultivar en Chile, a partir de la III Región de Atacama

hasta la XI Región de Aysén del General Carlos Ibáñez del Campo. Según los catastros

frutícolas regionales se llegó a 37.568 hectáreas en el año 2016 y se estima llegar a 41.274

hectáreas en el año 2020. La Región Metropolitana es la principal zona de plantación con

14.120 hectáreas y con mayor crecimiento anual de 1.000 hectáreas siendo esta la que

aporta con 34% del crecimiento anual, posterior a ella se encuentra la Región de Valparaíso

con 6.785 hectáreas que aporta en el crecimiento con 14%, la Región de O’Higgins y Maule,

con 6.474 y 5.012 hectáreas, respectivamente (ODEPA, 2017).

El problema sanitario más importante del nogal, es la pudrición de raíces y cuello de la

planta, causado por hongos del género Phytophthora que habitan en los suelos de Chile.

Con el objetivo de identificar y determinar que especie de Phytophthora ataca a este cultivo

en Chile, se realizó un estudio en el año 2015 en la Escuela de Agronomía de la Pontificia

Universidad Católica de Valparaíso. Según Guajardo et al., (2017), el muestreo realizado

determinó que existe 93,3% de presencia de la enfermedad en suelos chilenos, pero esto

no significa que la misma cantidad de plantas estén con Phytophthora, solo existe una

prevalencia media de 15,7% de los árboles. Las regiones más afectadas son O’Higgins y

Valparaíso, con una prevalencia de 18,4 y 28,4%, respectivamente. La principal especie

detectada es Phytophthora cinnamomi y en forma secundaria P. citrophthora ambas

capaces de causar pudrición de raíces y una lesión cancrosa a nivel del cuello. En este

estudio se concluyó que el problema del nogal está asociado al portainjerto Juglans regia

debido a que es susceptible a este patógeno. Cabe destacar que en Chile el 95% de los

nogales se encuentra sobre el patrón Juglans regia.

En los últimos años se han introducido a Chile portainjertos clonales de nogal,

principalmente Vlach, Rx1 y Vx211, estos dos últimos portainjertos se encuentran

protegidos por lo que están sujetos a restricciones para su propagación y comercialización

en Chile.

Estos portainjertos clonales provienen de Estados Unidos, país que presenta problemas de

Phytophthora en sus suelos y estos portainjertos se han convertido en la solución del ataque

de este patógeno. Por este motivo, se ha investigado si la tolerancia o resistencia a la

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enfermedad se manifiesta del mismo modo en las condiciones de Chile (investigación en

proceso).

En Chile, el vivero Natividad es quien tiene la exclusividad del material de los portainjertos

clonales Vx211 y Rx1. Este material proviene de la compra directa en California (EE. UU.)

para su comercialización en el país (Red Agrícola, 2018).

La principal técnica de propagación de los portainjertos de nogales en Chile es a través del

uso de semillas de Juglans regia, estos portainjertos presentan un alto grado de

heterogeneidad. Asimismo, Achim y Botu (2001), indicaron que la propagación por semilla

de los portainjertos de nogales produjo un gran número de híbridos naturales con diversas

características en los huertos de nogal. Por otra parte, se encuentra la propagación

vegetativa por estaca, tal como indicaron Stevens y Pijut (2017), este material es

recalcitrante y tiene dificultad para generar raíces adventicias.

De esta manera, la propagación in vitro de esta especie se ha comenzado a estudiar con la

finalidad de propagar los portainjertos clonales, ya que, es una técnica de producción de

plantas genéticamente iguales a la planta madre.

Los problemas más importantes de la micropropagación de nogales son: I) la sensibilidad

a la oxidación del componente fenólico en explantes, II) contaminación dentro de los

explantes, III) adaptación al medio de cultivo, IV) multiplicación, V) enraizamiento y VI)

dificultades relacionadas con la aclimatación (Kepenek y Kolagasi, 2016).

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3 Hipótesis A partir de modificaciones en las diferentes etapas del proceso de micropropagación será

posible obtener plantas del portainjerto clonal Vlach de nogal

4 Objetivos

4.1 Objetivos generales

Establecer el protocolo de micropropagación de nogales para el portainjerto clonal Vlach

4.2 Objetivos específicos

I. Evaluar los medios de cultivos DKW (Driver and Kuniyuki, 1984) y Rugini (Rugini,

1984) para el establecimiento in vitro de explantes de nogal

II. Evaluar diferentes concentraciones de Thidiazurón (TDZ) para mejorar la

proliferación de los brotes del portainjerto Vlach de nogal.

III. Evaluar el efecto de las diferentes concentraciones de ácido indolbutírico (AIB) y la

aplicación de quelatos de hierro para el enraizamiento de microestacas de nogal.

IV. Evaluar el efecto de diferentes sistemas de aclimatación para la sobrevivencia de

las plantas del portainerto Vlach de nogal.

5

5 Estado de arte 5.1 Descripción del nogal El nogal es un árbol caducifolio, muy vigoroso, alcanza tamaños de 27-44 metros de altura.

Tiene un sistema radicular muy desarrollado que consta de una raíz principal y un sistema

secundario de raíces superficiales. Hojas grandes y color verde opaco (ChileNut, 2018).

5.2 Problema fitosanitario El problema sanitario más importante del nogal en Chile, es la pudrición de raíces y cuello

de la planta, causado por hongos del género Phytophthora. Estos patógenos colonizan y

descomponen el sistema vascular de raíces, corona y cuello de la planta, la debilitan,

dificultando su crecimiento y desarrollo, por lo cual ésta puede llegar a morir, disminuyendo

la productividad del huerto, acortando su vida útil y afectando la sanidad del suelo para el

mismo o para futuros cultivos.

En estudios realizados por la Escuela de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica

de Valparaíso, se demostró que los portainjertos clonales presentan tolerancia y/o

resistencia a Phytophthora, con índices de daño aéreo y radicular iguales a plantas no

inoculadas de cada portainjerto o plantas no inoculadas de J. regia. Mientras que las plantas

inoculadas de J. regia, con ambas especies de Phytophthora, presentan daño radicular y

aéreo mayor, con muerte total de las plantas y 100 % de pudrición de raíces (Guajardo et

al., 2017).

5.3 Portainjertos clonales Las características de los portainjertos clonales de nogal son:

- Vlach: Es el primer portainjerto clonal de nogal que se produjo. Es vigoroso, tiene

buen crecimiento, tolerancia a las enfermedades debido a su vigor (Leslie y

McGranahan, 2014).

- Rx1: Este portainjerto es genéticamente resistente a Phytophthora. Además está

reportado que es resistente a condiciones salinas. Es ideal para plantaciones en

6

zonas con condiciones limitantes, árbol menos vigoroso que el Vx211 (Leslie y

McGranahan, 2014).

- Vx211: Este portainjerto es altamente vigoroso. Es tolerante a nematodos y como

genera un gran crecimiento radicular y aéreo es resistente también a enfermedades

(Leslie y McGranahan, 2014).

5.4 Tipo de propagación de los portainjertos de nogales 5.4.1 Método tradicional

Consiste en la propagación del portainjerto a partir de semillas y la posterior injertación con

la variedad comercial. La propagación sexual de los portainjertos es un método que consiste

en la germinación de la semilla, para ello, se deben dar condiciones adecuadas de luz,

temperatura y humedad. En la propagación de esta especie se debe utilizar una técnica de

estratificación que consiste en la imbibición y acumulación de horas frío en la semilla para

mejorar el porcentaje de germinación, debido a que estas poseen latencia fisiológica o

cubiertas duras.

Un aspecto negativo de la obtención de plantas por semillas lo constituye la juvenilidad.

Fisiológicamente, este estado constituye el periodo de la planta en la cual crece

exponencialmente pero que es incapaz de inducir el proceso de floración. Este estado de

juvenilidad es mucho más largo en plantas propagadas por semillas y retrasa la entrada a

producción. Otro problema es que las plantas procedentes de semillas presentan un

elevado grado de heterogeneidad (Pina, 2008).

5.4.2 Métodos vegetativos

5.4.2.1 Propagación por estaca El nogal desafortunadamente es recalcitrante y tiene dificultad de generar raíces

adventicias. Stevens y Pijut (2017), indicaron que la edad ontogénica de las estacas son

los factores que controlan la formación de raíces, debido a que las estacas maduras no

enraízan, la mayor mortalidad se debe a que no se forman raíces adventicias.

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La propagación por estaca fracasa debido a la ausencia de células progenitoras

competentes y del anillo continuo de células de fibra del floema debido a que elimina los

posibles sitios de origen de raíz adventicia. Este hallazgo explica el mecanismo anatómico

de la dificultad en la formación de raíces adventicias en nogales (Stevens y Pijut, 2017).

5.4.2.2 Micropropagación Consiste en una técnica de propagación asexual que, a partir de un pequeño fragmento o

explante de la planta madre, se obtiene una descendencia uniforme, con plantas

genéticamente idénticas. Se controlan estrictamente las condiciones ambientales y

nutricionales (Doménech et al., 2008). Durante el proceso de propagación in vitro existen

varias fases o etapas, las cuales son: Obtención y desinfección del material,

establecimiento in vitro, multiplicación o proliferación, enraizamiento y aclimatación.

La principal ventaja que ofrece este sistema es la obtención de plantas en grandes

cantidades y menor tiempo, además se trabaja en condiciones asépticas. Sin embargo,

estas plantas tienen limitaciones en la aclimatación, etapa en la que se producen las

mayores pérdidas, debido a que son sensibles a los cambios ambientales, de manera que

el éxito o el fracaso del proceso depende de la aclimatación de las plantas obtenidas

(Castillo et al., 2014).

5.5 Etapas o fases críticas de la micropropagación de portainjerto de nogales 5.5.1 Desinfección del material vegetal

El material obtenido del plantel madre se transfiere al laboratorio y luego se lava con agua

durante 30 min, luego se transfiere a una solución con antioxidantes polivinilpirrolidona

(PVP) 500 mg/l, cisteína 20 mg/l, ácido ascórbico (AA) 5 mg/l y una solución de fungicida

Captan 1 g/l y benomyl 1g/l (Kepenek y Kolagasi, 2016).

Posterior a ello, al obtener el explante desinfectado se debe hacer una inmersión en una

solución de etanol (70%) durante unos minutos (2 min), a continuación, por 20 min se deben

colocar los explantes con hipoclorito de sodio al 2% con dos gotas de tween 20 por 100 ml

de agua. Para finalizar se deben realizar cuatro lavados con agua destilada estéril y

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agitación continua por 15 min. Luego, las puntas de los brotes se sumergen en una solución

acuosa antioxidante de PVP (500 mg / l) y AA (150 mg / l) o L-cisteína (50 mg / l) durante

dos horas, esto debe ser antes de que el cultivo se transfiera a los medios de cultivo,

secando los explantes con papel filtro (Kepenek y Kolagasi, 2016).

5.5.2 Establecimiento in vitro

La micropropagación de J. regia es posible a través del cultivo de segmentos nodales,

cotiledones, cotiledones inmaduros, óvulos, embriones maduros y meristemas, yemas o

brotes axilares.

Los explantes del nogal obtenidos de embriones somáticos tienen mejores respuestas al

establecimiento in vitro (Ríos et al., 2007), no obstante, el nivel de juvenilidad es muy alto,

y la planta tarda más en entrar en producción. Debido a lo anterior, se indica que los

explantes de segmentos nodales producidos in vitro tienen mayor precocidad que las

plantas injertadas en portainjerto de semillas. Por otro lado, Kepenek y Kolagasi (2016),

indicaron que la producción de plantas a partir de yemas o brotes axilares también es un

método confiable.

Los medios de cultivos con mayor eficiencia en la propagación in vitro de nogales son los

medio DKW (Driver and Kuniyuki, 1984) y Rugini (Rugini, 1984) (Anexo 1). El medio DKW

y Rugini deben estar complementados con baja concentración de benciladenina (BA) 2.2

μM, esta dosis da como resultado una mayor longitud y mayor número de yemas axilares

después de 21 días. El medio de cultivo que presentó mayor eficiencia fue Rugini, por lo

tanto, el contenido diferencial de nutrientes en los medios de cultivo puede tener un efecto

significativo en el desarrollo de brotes (Tuan et al., 2017).

5.5.3 Multiplicación in vitro

Durante esta fase los explantes que sobrevivieron en las primeras fases originan brotes (de

procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En cada base de la hoja existen yemas

que se desarrollan a partir del contacto con el medio de cultivo. Los brotes se deben

subcultivar en medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros

recipientes adecuados. Se realiza en cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que

permita mantener las condiciones de asepsia (Álvarez et al., 2001).

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Por otra parte, Álvarez et al., (2001) indicaron que el número de plantas que se obtiene

dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de

plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos

exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido

optimizados.

Por otra parte, Kepenek y Kolagasi (2016), indicaron que los explantes de nogales con

mayor supervivencia se obtienen con la combinación de reguladores de crecimiento como

es el thidiazuron (TDZ) 2,5 mg/l y de ácido indolbutírico (AIB) 2,5 mg/l. Por otra parte, los

explantes deben ser individualizados y subcultivados cada 6 semanas, así, se obtienen 3

repiques. En general, a medida que aumenta el número de subcultivos disminuye la longitud

de los explantes y después del tercer repique existe un periodo de incidencia de necrosis

apical.

La mayor tasa de regeneración de brotes se obtiene con la combinación de 5 mg/l TDZ más

5 mg/l AIB, pero, esto tiene efectos significativos sobre el índice de producción de callos,

es decir, aumenta cuando las dosis de TDZ e IBA son mayor a 5 mg/l (Kepenek y Kolagasi,

2016).

5.5.4 Condiciones para generación de raíces

Peixe et al., (2015), indicaron la necesidad de un medio de inducción con alta concentración

de auxinas, donde los explantes se encuentran entre 7 a 12 días en oscuridad, seguidos

por una transferencia a un medio de expresión de enraizamiento sin reguladores de

crecimiento. Este medio de expresión consiste en ¼ del medio de cultivo más vermiculita o

turba humedecidos en una cámara de crecimiento con temperatura día de 26°C y noche de

23°C, además de un fotoperiodo de 16 horas (350 μmol m-2 s-1) y una humedad relativa del

90% a 100%.

Por otro parte, Vahdatia y Aalifar (2016), indicaron que agregar quelatos de hierros como

EDDHA (96 - 182 mg L-1) sería afectivo en la tasa de crecimiento y porcentaje de

enraizamiento de explantes de nogales.

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Además, Tuan et al., (2017), sugirieron realizar microcortes en los explantes para estimular

el crecimiento de raíces en la fase de inducción con temperaturas de 27ºC durante 5 días

en oscuridad antes de la transferencia al medio de expresión de la raíz. Esto aumenta el

porcentaje de explantes enraizados. El medio de inducción se debe complementar con 12

μM de AIB, 30 g de glucosa L-1 y 7 g de agar respectivamente. Posterior a esto, transferir

al medio de expresión de raíz.

5.5.5 Condiciones para la etapa de aclimatación

La aclimatación de plantas in vitro a condiciones naturales es un proceso crítico para

muchas especies. Se debe mantener la humedad relativa al 80% dependiendo de las

condiciones anatómicas y fisiológicas de las plantas previamente desarrolladas in vitro.

Del mismo modo, Vahdati et al., (2014), indicaron que se debe controlar la intensidad

lumínica. Esto ya que plantas provenientes de un ambiente con baja intensidad lumínica

son expuestas a alta intensidad, por lo tanto, se debe regular para evitar la fotoinhibición

del sistema fotosintético. Con el fin de disminuir el efecto, se recomienda el uso de mallas

de diferentes porcentajes de sombreo, entre 30-70%, con la finalidad de adaptar

gradualmente la planta en esta etapa.

Los factores críticos para la sobrevivencia de las plantas son:

- Hojas con estomas y cutículas deficientes; altamente sensibles a desequilibrios en

el mecanismo estomático y, en consecuencia, los brotes más tiernos manifiestan

estrés hídrico (Vahdati et al., 2014).

- El tallo posee escaso tejido de soporte, causando quebraduras y muerte de tejidos.

- Raíces son poco funcionales y existe escasez de pelos radicales.

La eficiencia de la aclimatación es trascendental para la propagación in vitro de nogales,

según los resultados obtenidos en esta fase, se determinará la eficiencia total del proceso.

Por ello, Tuan et al, (2017), indicaron que para la aclimatación de las plántulas de J. regia

se deben colocar directamente en una mezcla de turba más perlita (1:1) con un sistema de

neblina intermitente y la humedad relativa en el invernadero debe ser del 100% del día 1 al

14, seguido del 90% del día 15 al día 21. Por otra parte, se deben controlar las

temperaturas, lo recomendable es 24°C en el día y 21°C por la noche.

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6 Metodología Los ensayos se realizarán en el Laboratorio de Propagación Profesor Gregorio Rosenberg

de la Escuela de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Estos

ensayos seguirán el protocolo clásico de la propagación in vitro.

6.1 Obtención del material vegetal Se obtendrán plantas de nogal de var. Vlach como plantas madre provenientes del vivero

Natividad, estas plantas serán mantenidas al aire libre durante la temporada 2019 en la

Escuela de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. De estas plantas

madre se obtendrá el material con crecimiento activo, se extraerán estacas para

posteriormente obtener los segmentos nodales de 0,5 - 0,8 cm de diámetro y de entrenudos

3-5 cm de longitud con 2 a 3 yemas por explante (Kepenek y Kolagasi, 2016).

6.2 Desinfección del material vegetal El material vegetal será desinfectado de acuerdo con el protocolo descrito por Kepenek y

Kolagasi (2016).

6.3 Ensayo 1: Establecimiento de los medios de cultivos Se utilizarán los medios de cultivo Rugini y DKW (anexo 1), con 7 gl-1 de agar y 30 gl-1 de

sacarosa en frascos de cultivos con 10 ml del medio, a los cuales se les agregará AIB (0,2

mg l-1) y BA a distintas concentraciones. Una vez realizado esto, se ajustará el pH (5,6-5,8),

con hidróxido de potasio (KOH) 0,1 N. Posterior a esto, los frascos de cultivo se sellarán y

esterilizarán en autoclave a 121°C durante 20 min.

En el ensayo 1 se realizarán 4 tratamientos (anexo 2) para cada medio de cultivo Rugini y

DKW. Se realizarán 10 repeticiones por tratamiento: T1 (testigo; medio de cultivo sin

regulador de crecimiento); T2 (1 mg l-1 de BA); T3 (2 mg l-1 de BA); T4 (3 mg l-1 de BA)

Los parámetros que serán evaluados en este ensayo serán los siguientes:

i) Porcentaje de plantas viables ii) Tipo de contaminación de los explantes

6.4 Ensayo 2: Multiplicación o proliferación de los brotes Durante esta etapa los explantes que sobrevivieron en las primeras fases se mantendrán

en cámara de crecimiento con un fotoperiodo de 16 horas y temperaturas de 27 ± 1 °C bajo

lámparas fluorescentes a 75 μmol m-2s-1.

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En el ensayo 2 se realizarán 5 tratamientos (anexo 3) con diferentes concentraciones de

TDZ complementado con AIB (5 mg l-1) en los medios de cultivo (DKW y Rugini). Se

realizarán 10 repeticiones por tratamiento: T1 (testigo; medio de cultivo sin regulador de

crecimiento); T2 (1,5 mg l-1 de TDZ); T3 (2,5 mg l-1 de TDZ); T4 (3,5 mg l-1 de TDZ); T5 (5

mg l-1 de TDZ)

Los parámetros por evaluar en los ensayos de multiplicación serán los siguientes:

ii) Número de brotes por explantes ii) Longitud de los brotes iii) Número de hojas por brote

6.5 Ensayo 3: Enraizamiento in vitro El enraizamiento de los explantes requiere de una fase inductiva de raíces y una fase de

expresión de raíces que corresponde a un medio de cultivo diluido en un cuarto de su

concentración complementado con vermiculita.

En el ensayo 3 (anexo 4) se evaluarán el efecto de los reguladores de crecimiento con 10

días de etiolación y posterior transferencia a medios de expresión antes de la aclimatación

con el fin de promover la formación de raíces durante 30 días. Los explantes deben tener

un tamaño de 3-5 cm con 2-4 hojas expandidas.

Ensayo 3.1: Efecto de las diferentes concentraciones de AIB y lesionado

Tratamientos: T1 (Testigo; medio de cultivo sin regulador de crecimiento); T2 (6

mg l-1 AIB); T3 (12 mg l-1 AIB)

Ensayo 3.2: Efectos de las diferentes concentraciones de Quelatos de hierro y lesionado

Tratamientos: T1 (Testigo; medio de cultivo sin regulador de crecimiento); T2 (80

mg l-1 EDDHA); T3 (96 mg l-1 EDDHA)

Ensayo 3.3: Efecto del medio expresión con diferentes concentraciones de reguladores de

crecimiento

Tratamientos: T1 (Testigo; Medio de cultivo diluido en un cuarto de su

concentración más vermiculita); T2 (12 mg l-1 de AIB); T3 (96 mg l-1 de EDDHA)

Los parámetros que serán evaluados en los ensayos de enraizamiento se presentan en el

anexo 5.

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6.6 Ensayo 4: Aclimatación

Este ensayo se realizará con las plantas obtenidas del ensayo de enraizamiento in vitro y

en cada tratamiento se utilizarán plantas homogéneas.

En el ensayo 4 se realizarán 2 tratamientos (anexo 6 y 7) con los distintos sistemas de

aclimatación en las diferentes mezclas de sustrato en evaluación (perlita y turba; turba y

fibra de coco). Se realizarán 10 repeticiones por tratamiento: T1 (Contenedor de 20 cm x

20 cm); T2 (Túnel de 100 cm x 100 cm con niebla artificial intermitente)

Los parámetros que se evaluarán en este ensayo serán:

I. Sobrevivencia en aclimatación (%): Se calculará registrando aquellas plantas vivas

(tejido verde) en cada tratamiento, en relación con el total de plantas trasplantadas.

Las evaluaciones serán realizadas a los 15, 30 y 45 días.

En el tratamiento T1, los contenedores irán disminuyendo su humedad relativa (HR)

paulatinamente, esto comenzará a los 15 días desde el ingreso de las microestacas a los

contenedores. La disminución consiste en la realización de un corte en la parte extrema del

contenedor (extremo superior izquierdo), posterior a esto cada 5 a 10 días se irán realizando

cortes en los extremos del contenedor, para disminuir paulatinamente la humedad relativa.

En el tratamiento T2, se irá disminuyendo paulatinamente la humedad relativa de los

túneles. Transcurrido este tiempo se realizará la última medición de las plantas.

Los parámetros por evaluar en este ensayo serán: i) Porcentaje de sobrevivencia ii) Altura

de las plantas (mm), iiii) Diámetro de las plantas (mm), iv) Número de hojas con una lámina

superior a 8 mm v) Número total de hojas y color.

7 Análisis Estadístico

Se utilizará el Diseño Completamente Aleatorio (DCA). En el caso del ensayo 1, 2 y 4 este

diseño será con arreglo factorial. Una vez obtenidos los resultados, se realizará un Análisis

de Varianza (ANOVA). Se deberá utilizar el Test de Tukey con significancia al 5% para

detectar diferencias entre las medias de los diferentes tratamientos evaluados en estos

ensayos.

14

8 Bibliografía Achim, Gh., and I. Botu. 2001. Results in walnut propagation by using different methods.

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327.

16

9 Plan de trabajo El proyecto se llevará a cabo durante un periodo de dos temporadas, comenzando en marzo

de 2019 y finalizando en diciembre de 2020. Constará de una planificación al inicio (etapa

0), se procederá a realizar el cultivo in vitro de la especie (etapa 1) para finalizar con la

difusión de los resultados obtenidos (etapa 2). La secuencia cronológica de las actividades

se detalla en la figura 1 y en el anexo 9.

9.1 Etapa 0: Planificación del proyecto Se comenzará con la elaboración y firma de contrato con la entidad que financiará el

proyecto. Posterior a esto se realizarán los contratos de personal y arriendo del laboratorio

de propagación; la compra de insumos, materiales y equipos para el proyecto, además de

la obtención de plantas madre del portainjerto de nogales var. Valch.

9.2 Etapa 1: Cultivo in vitro Se realizará la preparación del material vegetal que consistirá en la desinfección de material

vegetal (15 días), los ensayos en las etapas de establecimiento in vitro (30 días),

multiplicación in vitro (150 días), enraizamiento in vitro (30 días) y aclimatación (45 días)

(anexo 8). Los hitos del proyecto son: Establecimiento in vitro y Aclimatación.

9.3 Etapa 2: Difusión del proyecto Se realizará la difusión de los resultados obtenidos a revistas científicas y a la entidad

financiera del proyecto.

Figura 1: Secuencia cronológica resumida de las actividades entre los años 2019-2020. Fuente: Elaboración propia, 2018

17

10 Resultados Esperados Los resultados esperados se basarán en el cumplimiento de la hipótesis planteada en el

proyecto. Se pretende que, a partir de modificaciones en las diferentes etapas, se obtendrá

plantas del portainjerto clonal Vlach de nogal, de esta manera la micropropagación de la

especie se podrá realizar con fines comerciales.

En el ensayo 1, el portainjerto de nogal deberá establecerse y desarrollarse con mayor éxito

en el medio de cultivo Rugini, esto complementado con la concentración de BA (2 mg l-1)

resultarán explantes con mayor longitud de brotes y yemas axilares.

Por otra parte, en el ensayo 2, se espera que el portainjerto de nogal tenga una proliferación

de brotes exitosa, mediante la aplicación de IBA (2,5 mg l-1) + TDZ (2,5 mg l-1) obteniendo

una tasa de multiplicación de 3,6 y una supervivencia alta (80%) y una mayor tasa de

regeneración alcanzando un máximo de 4 repiques.

Para el ensayo 3 de enraizamiento, se espera que con los procedimientos descritos

anteriormente (fase de inducción y fase de expresión) se genere el enraizamiento in vitro,

superando un 56%, siendo la mejor concentración la combinación de AIB (12 mg l-1) + 10

días de etiolación y microcortes (lesionado) en los explantes antes de la transferencia a un

medio de expresión sin reguladores de crecimiento.

En el ensayo 4, se espera que los explantes durante la aclimatación presenten 75% de éxito

debido al enraizamiento in vitro. Estos explantes continuarán con el crecimiento vegetativo

vigoroso. A la vez, la mejor condición del invernadero para el proceso de aclimatación será

la mezcla de sustrato turba y perlita (1:1) con un sistema de niebla artificial intermitente y la

disminución cada 15 días de la humedad relativa, alcanzando la aclimatación en 45 días.

18

11 Organización

Figura 2: Organigrama del proyecto. Fuente: Elaboración propia, 2018 11.1 Descripción de los cargos Director: Corresponde a un ingeniero agrónomo capacitado en micropropagación. Tendrá

las siguientes funciones

Planificación del proyecto

Supervisión de los procesos de la micropropagación y de los ensayos

Administración financiera del proyecto

Elaboración del informe y publicación de la revista científica

Ejecutor: Este cargo corresponde a un técnico agrícola con conocimiento en propagación

in vitro. Realizará las siguientes funciones

Realizar la micropropagación de la especie

Realizar los ensayos 1, 2, 3 y 4 y tabular los datos

Analista estadístico: A cargo de un estadístico, profesional a quien se le entregarán los

datos de los ensayos para los análisis de varianza (ANOVA) y test de Tukey. También se

tendrá a un alumno ayudante de laboratorio, quien ayudará al ejecutor en los ensayos y en

la tabulación de los datos de cada ensayo realizado. Para mayor detalle ver anexo 10

Director

Ingeniero Agrónomo

Estadístico

Analista estadístico

Ayudante

Alumno en práctica

Ejecutador

Técnico Agrícola

19

12 Presupuesto A continuación, se presentará el presupuesto establecido para el proyecto, este será

presentado a un fondo concursable, aportando un mínimo del 20% para ser otorgado. Para

mayor detalle de cada cuenta ver anexo 11

Cuadro 1: Presupuesto con aporte del fondo concursable y el aporte de la empresa.

Cuenta FONDO CONCURSABLE APORTE EMPRESA Total (MM$)

Pecuniario No pecuniario Total Recursos Humanos 32.58 32.58

Total Subcontratos 20.15 20.15 Total Capacitación 2 2 Total Misiones Tecnológicas 5 5

Total Difusión 3 0.38 3.38 Total Gastos de Inversión 23.28 0.75 24.03

Total Gastos de Operación 5.128 5.128

Total Gastos de Administración 6.35 6.35

Imprevistos 9.862 9.862 Total (MM$) 77.72 23.28 7.48 108.48 Porcentaje de Aporte (%) 72% 21% 7% 100%

Total (MM$) 108.48 Fuente: Elaboración Propia, 2018.

20

13 Anexos 13.1 Anexo 1: Tabla Composición Medios de Cultivos DKW y RUGINI

Nutrientes Medio de Cultivo DKW RUGINI

Macronutrientes mg l-1 mg l-1 NH4NO3 1416,00 412 CaCL2 112,50 332,16

Ca (NO3)2 x 2 H2O 1664,64 -

Ca (NO3)2 - 416,92 KH2PO4 265 340 K2SO4 1559 - KNO3 - 1100

MgSO4 361,49 732,60 KCL - 500

Micronutrientes CuSO4 X 5H2O 4,80 12,40 MnSO4 X H2O 0,25 0,25

Na2MoO4 X H2O 33,80 16,90

ZnSO4 X 7 H2O 0,39 0,25 Kl - 0,83

CoCl2 x 6 H2O - 0,025 H3BO3 - -

FeNa EDTA 44,63 36,70 Vitaminas

Ácido Nicotínico 1 5 Tiamina HCL 2 0,50

Piridoxina - 0,50 Inositol 100 100 Biotina - 0,05

Ácido fólico - 0,50 Glicina 2 2

Fuente: Tuan et al., 2017

21

13.2 Anexo 2: Ensayo 1. Evaluación de medios de Cultivos Cuadro 1: Ensayo 1. Medio de Cultivo DKW

Tratamientos Dosis AIB

(mg l-1)

Dosis

BA

(mg/ l-

1)

Porcentaje de

plantas

viables

Porcentaje de

plantas

contaminadas

Tipo de

contaminación

T1

T2 0,2 1

T3 0,2 2

T4 0,2 3

Fuente: Elaboración Propia, 2018.

Cuadro 2: Ensayo 1. Medio de Cultivo RUGINI

Tratamientos Dosis

AIB (mg

l-1)

Dosis

BA (mg

l-1)

Porcentaje de

plantas

viables

Porcentaje de

plantas

contaminadas

Tipo de

contaminación

T0

T1 0,2 1

T2 0,2 2

T3 0,2 3


13.3 Anexo 3: Ensayo 2. Proliferación de Brotes Cuadro 3: Ensayo de Proliferación de Brotes

Tratamientos Dosis TDZ

(mg l-1)

Dosis

AIB (mg

l-1)

Número de

brotes por

explantes

Longitud de

los brotes

Número de

hojas por

brotes

T0

T1 1,5 5

T2 2,5 5

T3 3,5 5

T5 5 5


22

13.4 Anexo 4: Ensayo 3. Evaluación de Enraizamiento in vitro

Cuadro 4: Ensayo 3.1 Fase de inducción con diferentes concentraciones de AIB y lesionado

Tratamientos Dosis AIB (mg l-1)

Días de etiolación

Porcentaje de enraizamiento

Número de raíces

Longitud de raíces

Altura de la planta

Vigor de la planta

Formación de callo

T0

T1 6 10

T2 12 10


Cuadro 5: Ensayo 3.2 Fase de inducción con diferentes concentraciones de EDDHA y

lesionado Tratamientos Dosis

EDDHA (mg l-1)

Días de etiolación

Porcentaje de enraizamiento

Número de raíces

Longitud de raíces

Altura de la planta

Vigor de la planta

Formación de callo

T0

T1 80 10

T2 96 10


Cuadro 6: 3.3 Efecto del medio expresión con diferentes concentraciones de reguladores

de crecimiento complementado con lesionado Tratamientos Dosis Días de

etiolación Porcentaje de enraizamiento

Número de raíces

Longitud de raíces

Altura de la planta

Vigor de la planta

Formación de callo

T1 (medio de

expresión)

T2 12 mg l-1 de

AIB

10

T4 96 mg l-1 de

EDDHA

10


23

13.5 Anexo 5: Parámetros por evaluar en los ensayos de enraizamiento in vitro Parámetros por evaluar en los ensayos de enraizamiento in vitro

Parámetros:

Porcentaje de

enraizamiento (%)

Se determinarán cuantas plantas enraizaron en cada

tratamiento, en relación con el total de plántulas establecidas.

Número de raíces (n°) Se contará la cantidad de raíces en cada planta.

Longitud de raíces

(cm)

Se medirá la longitud de cada raíz desde la base del callo, y se

obtendrá un promedio por planta.

Altura de la planta

(cm)

Se medirá la altura de cada planta desde la base del tallo hasta

la última hoja.

Vigor de la planta Se aplicará una escala numérica y se clasificarán las plantas

según la vigorosidad de las raíces presentes y de la parte aérea.

Esta variable se medirá al finalizar el ensayo de enraizamiento

in vitro.

Formación de callo Se hará una escala numérica con la que se clasificarán las

plantas según el grado de desarrollo de callo. Esta se medirá al

momento de pasar las plantas desde la etapa de enraizamiento

a la etapa de aclimatación


24

13.6 Anexo 6: Ensayo 4 aclimatación Cuadro 7: Ensayo 4. Mezcla de sustrato perlita y turba

Tratamientos Sustrato (1:1) Sobrevivencia

15 días

Sobrevivencia

30 días

Sobrevivencia

45 días

Altura de

las plantas

N° de

hojas/planta

T1 (Contenedor 20

cm x 20 cm)

perlita y turba

T2 (Túnel de 100

cm x 100 cm con

niebla intermitente)

perlita y turba


13.7 Anexo 7: Ensayo 4 aclimatación Cuadro 8: Ensayo 4. Mezcla de sustrato turba y fibra de coco

Tratamientos Sustrato (1:1) Sobrevivencia

15 días

Sobrevivencia

30 días

Sobrevivencia

45 días

Altura de

las plantas

N° de

hojas/planta

T1 (Contenedor 20

cm x 20 cm)

Turba y Fibra

de coco

T2 (Túnel de 100

cm x 100 cm con

niebla intermitente)

Turba y Fibra

de coco


13.8 Anexo 8: Carta Gantt con detalles de Actividades en la etapa 1

Figura 1: Detalles de la etapa 1 del Proyecto de Evaluación del Protocolo de

Micropropagación del Portainjerto Clonal Vlach de Nogales.


25

13.9 Anexo 9: Carta Gantt con detalles del proyecto

Figura 2: Detalles del Proyecto de Evaluación del Protocolo de Micropropagación del Portainjerto Clonal Vlach de Nogales.


26

13.10 Anexo 10: Organización del proyecto Cuadro 9: Detalles de la organización del proyecto

Nombre del

profesional

Formación/grado académico

Cargo en el

proyecto

Costo del

personal (MM$)

Aporte FONDO CONCURSABLE

(MM$)

Aporte Empresa

(MM$)

F. Guerra Ingeniero Agrónomo

Director 22.8 22.8 -

N. N Técnico Agrícola Ejecutador 13.2 7.2 6

N. N Estadístico Análisis estadístico

0.35 - 0.35

N. N Alumno Universitario

Practicante 2.58 2.58 -

Total Costo (MM$)

38.93 32.58 6.35


27

13.11 Anexo 11: Presupuesto total por año (MM$) Cuadro 10: Detalles del presupuesto del proyecto

Cuenta Año 1 Año 2 Total (MM$) Total Recursos Humanos 16.075 16.505 32.58 Total Subcontratos 9.6 10.55 20.15 Total Capacitación 2 0 2 Total Misiones Tecnológicas 2.5 2.5 5 Total Difusión 1.69 1.69 3.38

No Pecuniario 0.19 0.19 Total Gastos de Inversión 21.37 2.66 24.03

Pecuniario 20.62 2.66 No Pecuniario 0.75 0

Total Gastos de Operación 5.128 0 5.128 Total Gastos de Administración 3 3.35 6.35

No Pecuniario 3 3.35 Imprevistos (10%) 4.931 4.931 9.862 Total (MM$) 66.294 42.186 108.480

Pecuniario 20.62 2.66 23.28 No Pecuniario 3.94 3.54 7.48


Cuadro 11: Presupuesto de los insumos de invernadero

Plantas Cantidad Valor unitario Valor total Var. Vlach 65 10000 $ 650,000

Aclimatación Cantidad/envase Valor unitario Valor total Sustrato Turba 250 l $ 25,000 $ 100,000

Perlita 100 l $ 21,000 $ 105,000 Vermiculita 100 l $ 26,800 $ 107,200

Fibra de coco 50 l $ 21,990 $ 109,950 Plástico 1 $ 1,203 $ 24,060

Contenedor plástico 150 $ 441 $ 66,150

maceteros o bolsas BOLSA 5 LITROS

(200) $ 153 $ 30,600 Malla antihelada 6 $ 4,990 $ 29,940

Tubo PVC 10 $ 1,960 $ 19,600 Madera pino impregnado 14 $ 4,790 $ 67,060

Pilar pino impregnado 14 $ 4,190 $ 58,660 Total $ 718,220


28

Cuadro 12: Presupuesto de los reactivos para los medios de cultivos Reactivos Fórmula Cantidad/envase Valor total

Medio de cultivo Nitrato de amonio NH4NO3 1 kilogramo 62509 Cloruro de calcio CaCL2 500 gramos 29498

Nitrato de calcio dihidratado Ca (NO3)2 x 2 H2O 250 gramos 72500 Nitrato de calcio Ca (NO3)2 20 gramos 212000

Fosfato monopotásico KH2PO4 500 gramos 57240 Sulfato de potasio K2SO4 500 gramos 29370 Nitrato de potasio KNO3 500 gramos 16014

Sulfato de magnesio MgSO4 1 kilogramo 51940 Cloruro de potasio KCL 500 gramos 18272

Sulfato de Cobre pentahidratado CuSO4 X 5H2O 250 gramos 20158 Sulfato de manganeso monohidratado MnSO4 X H2O 500 gramos 37582

Molibdato de sodio Na2MoO4 X H2O 100 gramos 78440 Sulfato de zinc heptahidratado ZnSO4 X 7 H2O 500 gramos 22240

Yoduro de potasio Kl 250 gramos 64167 Cloruro de hexahidratado CoCl2 x 6 H2O 25 gramos 31800

Ácido bórico H3BO3 0 0 Quelato de hierro FeNa EDTA 100 gramos 71020 Ácido Nicotínico 100 gramos 20638

Tiamina HCL 25 gramos 68900 Piridoxina 5 gramos 75260

Inositol 50 gramos 48760 Biotina 100 mg 34480

Ácido fólico 5 gramos 29394 Glicina 100 gramos 15828

Ácido indol butírico IBA 25 gramos 148400 Benciladenina BA 200 mg 447320 Thidiazurón TDZ 250 mg 163200

Quelato de hierro EDDHA 500 mg 91820 Sacarosa 1 kg 6741

Agar Agar-agar 200 gramos 175960 Total $ 2,201,451

Desinfección Polivinilpirrolidona PVP 200 gramos 99640

Cisteína 200 gramos 277340 Ácido ascórbico 400 mg 220480

Captan 500 mg 59360 Benlate Benomyl 500 mg 214129 Etanol Alcohol etilíco 1000 ml 2457

Hipoclorito de sodio NaCLO 50 ml 112000 Tween 20 50 ml 25440

Total $ 1,010,846 Otros

Base KOH 100 gramos 1646 Total reactivos $ 3,213,943


29

Cuadro 13: Presupuesto de los Insumos de Laboratorio

Insumo Laboratorio Cantidad Valor unitario Valor Total Algodón 10 unidades $ 450 $ 4,500

Bata o delantal 3 unidad $ 12,000 $ 36,000 Bisturí 3 caja (100 un) $ 8,379 $ 25,137

Botellas con tapa 500 ml 10 unidades $ 3,064 $ 30,640 Cuaderno 4 unidad $ 890 $ 3,560 Escobilla 4 unidades $ 1,500 $ 6,000

Hisopo pipeta 4 unidad $ 1,653 $ 6,612 Frasco de vidrio (340 cc) 200 unidades $ 5,590 $ 44,720 Frasco de vidrio (370cc) 200 unidades $ 7,490 $ 52,430

Tapas (340 cc) 200 unidades $ 74 $ 14,800 Tapas (370 cc) 200 unidades $ 70 $ 14,000

Lápices 50 unidades $ 200 $ 9,990 Mango Bisturí 6 unidades $ 3,400 $ 20,400

Mascarillas desechables 3 caja (100 un) $ 4,990 $ 14,970 Matraz Erlenmeyer 1 L 5 unidad $ 5,704 $ 28,520

Matraz Erlenmeyer 500 ml 5 unidad $ 3,500 $ 17,500 Papel aluminio 4 unidad $ 1,190 $ 4,760 Papel film (pvc) 4 unidad $ 6,250 $ 25,000

Papel filtro W1 (9 cm) 3 unidad $ 5,439 $ 16,317 Papel milimetrado 3 unidad $ 1,590 $ 4,770

Papel secante 10 unidad $ 1,000 $ 10,000 Pie de metro 2 unidad $ 17,590 $ 35,180

Pinza de disección 6 unidades $ 2,658 $ 15,948 Pipeta 10 ml 4 unidad $ 1,700 $ 6,800

Piseta 4 unidades $ 2,034 $ 8,136 Placa Petri 10 unidades $ 1,780 $ 17,800 Plumones 10 unidades $ 690 $ 6,900 Probeta 1L 5 unidad $ 7,516 $ 37,580

Varilla o espátula 6 unidad $ 858 $ 5,148 Vaso precipitado 100 ml 5 unidad $ 1,200 $ 6,000 Vaso precipitado 500 ml 5 unidades $ 3,200 $ 16,000

Total $ 546,118 Fuente: Elaboración Propia, 2018.

30

Cuadro 14: Costo total del aporte del Fondo Concursable


31

Cuadro 15: Costo total del aporte de la empresa


Cuadro 16: Resumen del Costo Total del Fondo Concursable


Cuadro 17: Resumen del Costo Total del Proyecto


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