1

ÍNDICE

Justificación, antecedentes y marco teórico

- ¿Qué es la β-galactosidasa?

- ¿Por qué nos interesa estudiar esta enzima?

Objetivo

Método

- Método empleado para la selección de cepas productoras de β-galactosidasa

- Método empleado para conocer la actividad de la β-galactosidasa producida por los

microorganismos

- Grado de homología entre el gen de β-galactosidasa en A. niger y L. mesenteroides

Resultados

- Resultados del método empleado para la selección de cepas productoras de β-

galactosidasa

- Resultado del método empleado para conocer la actividad de la β-galactosidasa

producida por los microorganismos

- Resultado del método empleado para caracterización bioquímica de la β-

galactosidasa

Conclusiones

Agradecimientos

Bibliografía

2

JUSTIFICACIÓN, ANTECEDENTES Y MARCO TEÓRICO

¿Qué es la β-galactosidasa?

La β-galactosidasa o lactasa, es una enzima que cataliza la hidrólisis de la lactosa en monosacáridos. Los monosacáridos que forman la lactosa son la galactosa y glucosa, que

se encuentran unidos por un enlace O-glucosídico β 1,4 (Figura 1).

Figura 1. En la parte superior se muestra la reacción de hidrólisis que produce la β-galactosidasa sobre la lactosa. En la parte inferior izquierda se muestra la estructura de la β -galactosidasa de Penicillum. En la parte inferior derecha se representa el mecanismo de acción de la β -galactosidasa (Corral, 2005).

Lactosa + Agua Galactosa + Glucosa

3

¿Por qué nos interesa estudiar esta enzima?

La lactosa es un azúcar que se encuentra en elevadas concentraciones en la leche (por encima del 5%). En el mundo existen numerosos sectores de población con deficiencias para metabolizar lactosa. Cuando la actividad de la β-galactosidasa intestinal es deficiente, la mayor parte de la lactosa en el intestino atrae agua, provocando un cuadro diarreico que puede llegar a ser muy agudo, incluso conducir a la muerte del consumidor. La industria láctea también se ve afectada negativamente por la presencia de lactosa, producto de solubilidad limitada que dificulta la producción de helados, leche condensada y otros productos lácteos, porque favorece la cristalización. La hidrólisis de la leche, previa a su fermentación en procesos de producción de quesos, también ofrece ventajas, al acelerar el proceso de maduración. La solución ideal es la hidrólisis previa de la lactosa en glucosa y galactosa. De esta forma, además de dar un cierto sabor dulce a la leche, se evitan los problemas de intolerancia y de cristalización. Por ello, hay que buscar enzimas capaces de hidrolizar este producto, y las β-galactosidasas son la respuesta. Estas enzimas hidrolizan de forma específica los enlaces β 1→4 de la lactosa que no alteran el resto de los componentes de la leche. Las enzimas que se encuentran disponibles comercialmente proceden de muy distintas fuentes (Tabla 1). A pesar del interés de esta reacción, la baja estabilidad de las preparaciones comerciales y la fuerte inhibición que se produce por los productos (que llega a evitar hidrólisis totales de la lactosa) están limitando su aplicación industrial.

Tabla 1. Principales fuentes de microorganismos de los cuales se obtiene la β-galactosidasa: Aspergillius niger, Aspergillius oryzae, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Escherichia coli, Lactobacillus thermophilus y Streptococcus thermophilu.s. (http://theindustrialenzymologist.blogspot.com.es, 2015)

Por todo ello, es de interés para la industria láctea encontrar nuevos microorganismos que produzcan β-galactosidasa más estable y con un menor grado de inhibición. (Costa, 2002)

Microorganismo Peso

molecular pH óptimo T óptima (ºC) Activadores

Aspergillius niger 124 K 3-4 55-60 Mg2+

Aspergillius oryzae 90 5 50-55 Mg2+

K. fragilis 201 6.6 37 Mg2+, Mn2+, K+

K. lactis 135 6.9-7.3 35 Mg2+, Na+

Escherichia coli 540 7.2 40 Mg2+, Na+ , K+

Lactobacillus thermophilus

530 6.2-7.1 55-57 -

Streptococcus thermophilus

500-600 7.5 55 -

4

OBJETIVO Como hemos mencionado en el apartado anterior las enzimas que presentan los microorganismos de los que se obtiene la β-galactosidasa se encuentran afectadas por su baja estabilidad y una fuerte inhibición. En consecuencia, es de interés para la industria láctea encontrar nuevos microorganismos que produzcan β-galactosidasa más estable y con un menor grado de inhibición. En este sentido, el objetivo del proyecto consiste en estudiar la producción de β-galactosidasa por Leuconostoc mesenteroides. El motivo por el cual centramos nuestro estudio en L. mesenteroides es porque pertenece al orden de los Lactobacillales, grupo de bacterias que llevan a cabo procesos de fermentación láctica de azúcares a bajas temperaturas y bajo pH.

MÉTODO El estudio sobre L. mesenteroides consta de tres fases: (1) Selección de cepas productoras de β-galactosidasa (2) Medida de la actividad β-galactosidasa (3) Grado de homología entre el gen de β-galactosidasa en A. niger y L. mesenteroides

Método empleado para la selección de cepas productoras de β-galactosidasa En este ensayo se trató de averiguar si la cepa de L. mesenteroides con la que íbamos a trabajar era capaz de producir β-galactosidasa. Para el desarrollo de este método se decidió emplear tres tipos de microorganismos. En primer lugar, Aspergillus niger, debido a que hay muchas referencias bibliográficas sobre la producción de β-galactosidasa por este microorganismo. Está claro que era un buen elemento de control, ya que se esperaba una respuesta positiva en los experimentos que se diseñaron. En segundo lugar, Bacillus subtilis, la cepa que se empleó en los experimento carecía del gen de la β-galactosidasa, por lo era de esperar una respuesta negativa. Y, por último, Leuconostoc mesenteroides, que era el microorganismo en estudio.

Los tres microorganismos presentan metabolismos diferentes, A. niger es de tipo respiratorio (Reyes-Ocampo et al., 2013); B. subtilis es un organismo facultativo que respira en presencia de oxígeno y fermenta en condiciones anaeróbicas (Espinosa, 2005); y L. mesenteroides es de tipo fermentativo microaerófilo. Esta característica había que tenerla en cuenta a la hora de seleccionar el tipo de incubadora donde se iban a cultivar. Frente a los microorganismos respiradores y facultativos, con los que se empleó una cámara de cultivo normal, con los fermentadores se utilizó una incubadora de CO2. El medio de crecimiento era también específico para cada microorganismo (Tabla 2).

5

Una vez preparados los medios, se autoclavaron y se dejaron atemperar. Se abrieron en cabina de bioseguridad de tipo 2, L. mensenteroides y B. subtilis, la cabina para hongos, A. niger. A continuación, el medio se vertió en placas Petri. Dentro de dichas cabinas se plaquearon y se sembraron las placas de los tres microorganismos (Figura 2).

A. niger L. mesenteroides B. subtilis

Medio NaNO3 (0,5 g/l)

MgSO4 x 7H2O (0,01 g/l) FeSO4 x 7H2O (0,01 g/l) K2HPO4 (1 g/l) Peptona (digerido de proteínas que se emplea como fuente de nitrógeno) (0,2 g/l)

Extracto de levadura (10 g/L) Triptona (digerido de caseína que se emplea como fuente de nitrógeno) (5 g/l)

Extracto de levadura (10 g/l) Peptona (5 g/l) NaCl (5 g/l)

Lactosa + X-gal (80 µg/ml) Lactosa + X-gal( 80 µg/ml) Lactosa + X-gal (80 µg/ml)

PH

7 6,5 7

Cultivo Agar (1.5 %)

Agar (1.5 %) Agar (1.5 %)

Tabla 2. Composición de los medios de crecimiento empleados.

Figura 2. En la fotografía de la izquierda se muestra el autoclave utilizado. En la de la derecha el interior de una cabina de bioseguridad tipo 2.

Se prepararon cuatro placas de cada medio, de las que se sembraron dos con 50 µl, una con 100 µl y una con 200 µl de las cepas microbianas con una micropipeta. Una vez añadido el cultivo a la placa Petri se extendió utilizando un asa de siembra. A. niger y B. subtilis se incubaron a 30ºC, mientras que L. mesenteroides se incubó a 26ºC en incubador de CO2.

6

Como podemos observar en la Tabla 2, todos los medios de cultivo poseían la lactosa como única fuente de carbono. Esto quiere decir que, para crecer, debían ser capaces de metabolizarla o, lo que es lo mismo, producir β-galactosidasa. Para conocer la actividad β-galactosidasa, se empleó X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido), que es un compuesto orgánico sustrato de la enzima β-galactosidasa, de forma que si la enzima estaba activa, hidrolizaría la molécula de X-Gal liberando galactosa y un colorante azul que teñiría las colonias (Figura 3 ).

Figura 3. Reacción β-galactosidasa en presencia de X-Gal.

Método empleado para conocer la actividad de la β-galactosidasa producida por los microorganismos La actividad enzimática de un extracto se define como la cantidad de producto que es capaz de formar por unidad de tiempo y de volumen. Para realizar este ensayo se hizo una siembra en medio líquido de A. niger y L. mesenteroides incubándose en agitación orbital a 30ºC . Los microorganismos al crecer en el medio líquido segregaron la enzima β-galactosidasa que luego se utilizó para medir su actividad. El ensayo suponía mezclar 0,25 ml de solución de enzima obtenida de los cultivos con 0,7 ml de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) en 3 ml de tampón citrato fosfato.

7

Tabla 3. Composición de los medios de crecimiento empleados.

En este ensayo la actividad enzimática se basó en la determinación colorimétrica a 420 nm del o-nitrofenol (ONP) liberado por la acción catalítica de la β-galactosidasa sobre un sustrato artificial, ONPG (Figura 4).

Figura 4. Reacción de la β-galactosidasa en presencia de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG). ONP (o-nitrofenol) Las muestras preparadas por triplicado se taparon y se sometieron a incubación durante 30 minutos a 30ºC con agitación orbital (150 rpm). Se incluyó una muestra control por duplicado en la que las enzimas fueron sustituidas por tampón. Una vez finalizada la incubación, la reacción se detuvo mediante la adición de 0,7 ml de carbonato de sodio. Finalmente, se midió la absorbancia a 420 nm en el espectrofotómetro (Figura 5).

Microorganismo A. niger L. mesenteroides

Medio

NaNO3 (0,5 g/l)

MgSO4 x 7H2O (0,01 g/l) FeSO4 x 7H2O (0,01 g/l) K2HPO4 (1 g/l) Peptona (0,2 g/l)

Extracto de levadura (10 g/l) Triptona (5 g/l)

Lactosa (80 µg/ml ) Lactosa (80 µg/ml)

PH

7 6,5

8

Figura 5. En la fotografía de la izquierda se pueden ver las muestras por triplicado y las dos muestras control de A. niger (A. niger) y L. mesenteroides (Lm). En la fotografía de la derecha se muestra la incubadora Para conocer dicha actividad fue necesario construir previamente una recta patrón donde se estableció una relación entre diferentes concentraciones de ONP y valores de absorbancia a 420 nm que nos dio el espectrofotómetro (Figura 6).

Figura 6. En la fotografía de la izquierda se muestra el espectrfotómetro utilizado. La gráfica de la derecha establece mediante una recta patrón la relación entre la absorbancia a 420 nm y la concentración de ONP en ppm

9

Grado de homología entre el gen de β-galactosidasa en A. niger y L. mesenteroides Las secuencias nucleotídicas o aminoacídicas de β-galactosidasa son registradas continuamente en bancos de datos como “Genebank” para su uso en estudios filogenéticos y, sobre todo, para su aprovechamiento en el diseño de nuevas β-galactosidasas por mutagénesis dirigida, las cuales deben cumplir las exigencias de las industrias que utilizan y comercializan enzimas. Las β-galactosidasas varían en el tamaño de las secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que la forman. Así por ejemplo Sulfobolus solfataricus tiene una β-galactosidasa de 489 aminoácidos, mientras que Bacillus licheniformis presenta una secuencia aminoacídica de 319 aminoácidos. Además, las enzimas no siempre son monoméricas como en Lactobacillus, pueden ser heterodiméricas y homotetraméricas (Arqueobacterias, Escherichia coli)(Zavaleta et al., 2013). Este ensayo se trató de determinar el grado de homología que había en la secuencia nucleotídica de los dos microorganismos empleados: A. niger y L. mesenteroides. Para extraer el ADN de los microorganismos se cultivaron los dos tipos en medio líquido en matraces de 25 ml. Las células se cosecharon por centrifugación a 13000 rpm durante 3 minutos. El precipitado celular fue tratado con lisozima que rompe las células permitiendo la liberación de los ácidos nucleicos. La lisozima se dejó actuar durante 20 minutos en a temperatura ambiente. Los ácidos nucleicos obtenidos se purificaron añadiendo fenol/cloroformo al sobrenadante, centrifugando, tomando el sobrenadante, añadiéndole etanol al 70% y volviendo a centrifugar. Tras varios ciclos, se secó el pellet al vacío. Por último, se añadió 50 μl de TE (tampón tris- EDTA, pH 8). A continuación, se procedió a la amplificación de los genes de β-galactosidasa. Para ello se tomaron 10 ng del ADN genómico, que se amplificaron mediante PCR hasta un volumen final de 25 μl. Los tubos de 0,2 ml estériles contenían la siguiente mezcla de reacción: MgCl2 50 mM, desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 10 mM, Taq ADN polimerasa 5 u/ μl, Cebador 1 y Cebador 2 10000 nM de cada tipo, solución tampón 10 mM. Una vez preparada la mezcla, se cerraron bien los tubos y se introdujeron en el termociclador (Figura 7). Los cebadores se diseñaron a partir de secuencias nucleotídicas del gen de la β-galactosidasas del género L. mesenteroides y A. niger, utilizando un programa informático online de libre acceso: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast. Los cebadores seleccionados se detallan en la Tabla 4.

10

Especie Cebador 1 Cebador 2 Tamaño amplicon (pb)

A. niger BgalAn_F TCTTCGTCAGTTGTGGTCGG

BgalAn_R GTTCCGTTCAGCCAGACAGA

671

L. mesenteroides

BgalLm_F ATTTGGCGATGAAGGTCGGT

BgalLm_R TGGCCTTATCCCGGTCTGGTA

652

Tabla 4. Secuencia de cebadores. (Ye et al., 2012) Las condiciones de cada ciclo de reacción, programadas en un termociclador, son desnaturalización a 95ºC por 30 s, hibridación a 50ºC por 1 min y polimerización a 72ºC por 10 minutos. Este ciclo se repitió 35 veces (Figura 7). Figura 7. Las fotografías muestran los diferentes equipos que se emplean en un laboratorio para la amplificación del ADN. De izquierda a derecha tenemos una centrífuga y un termociclador.

Los productos de PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa. Los geles contenían un buffer TBE (Tris (45 mM), Borato (2,75 g/l) EDTA (1mM)) y en la preparación se añadió SYBR Safe, sustancia que incrementa notablemente la tasa de emisión fluorescente del ADN. Durante la preparación del gel se utilizó un peine que creó unos pocillos donde se introdujeron las muestras de ADN. Una vez preparados los geles, se introdujeron en el equipo de electroforesis. En cada pocillo del gel de agarosa se cargó un volumen de 20 μl de la mezcla de ADN amplificado con tampón de carga (azul de bromofenol (4 mg/ml), glicerol (40%)). Se conectó a una fuente de alimentación, separando el ADN a voltaje constante de 80 V. Posteriormente se transfirió el gel al transiluminador de UV y se fotografió (Figura 8).

11

Figura 8. Equipos empleados en el estudio del grado de homología del gen de la β-galactosidasa. En la fotografía de la izquierda, un aparato de electroforesis. En la de la derecha, un transiluminador de UV.

RESULTADOS Resultados del método empleado para la selección de cepas productoras de β-galactosidasa. Después de un periodo de incubación de cuarenta y ocho horas se obtuvieron los siguientes resultados de las siembras de placas Petri con 50 µl, 100 µl y 200 µl de las cepas microbianas (Tabla 5). Se consideró el resultado positivo cuando la placa adquirió un color azul, es decir, el microorganismo producía la enzima β-galactosidasa que hidroliza la molécula de X-Gal liberando galactosa y un colorante que teñía las colonias. Un resultado negativo suponía que el microorganismo no producía la β-galactosidasa por lo que no hidrolizaba el X-Gal y, al no liberarse el colorante, las colonias quedaban sin teñir (Figura 19).

Microorganismo Placas con 50 µl, Placa con 100 µl Placa con 200 µl

A. niger positivo positivo positivo

B. subtillus negativo negativo negativo

L. mesenteroides positivo positivo positivo

Tabla 5. Resultados del cultivo de microorganismos en placas con X-Gal.

Como podemos comprobar en la Tabla 5, A. niger producía β-galactosidasa, lo cual era de esperar, pues este microorganismo es empleado como fuente de esta enzima a nivel industrial. B. subtillus no producía β-galactosidasa, aunque existen especies de Bacillus que la producen (Zavaleta et al., 2013). Se escogió una cepa que se sabía que carecía del gen de la β-galactosidasa, lo cual sirvió para testar estos resultados. Por último la cepa de L. mesenteroides que empleamos en los experimentos resultó ser productora de β-galactosidasa al teñir las colonias de azul (Figura 9).

12

A. niger

B. subtilis

L. mesenteroides

Figura 9. Las fotografías que se muestran en las tres series superiores ilustran los resultados obtenidos en cada uno de los microorganismos para detectar la presencia de β-galactosidasa. Las fotografías de la izquierda muestran las placas antes de incubarlas y las de la derecha después de 48 horas. Todas las placas corresponden al cultivo de 50 µl.

Resultado del método empleado para conocer la actividad de la B-galactosidasa producida por los microorganismos En la Tabla 6 que se muestra a continuación se indican las lecturas realizadas con el espectrofotómetro después de incubar durante 30 min a 30º C con agitación orbital (150 rpm) los cultivos en medio líquido de A. niger y L. mesenteroides así como las muestras control que solo contenían tampón en vez de cultivos.

13

Muestras Abs420 [ONP] (ppm) [ONP] (ppm) Actividad (U ml-1)

Lm m1 0,300 17,52

17,38

0,213

Lm m2 0,297 17,36

Lm m3 0,295 17,25

Lm mb1 0,016 2,57 5,04

Lm mb2 0,011 7,57

An m1 0,099 6,49

6,81

0,075

An m2 0,095 6,73

An m3 0,096 6,78

An mb1 0,014 2,46 2,46

An mb2 0,014 2,46

Tabla 6. Resultados de la actividad de β-galactosidasa en A. niger y L. mesenteroides. Cálculos realizados sobre una recta patrón y = 0,019x-0,028.

Se define 1 unidad de actividad (U) como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 μmol de ONP (el peso molecular del ONP es de 139,11 g/mol) por minuto en las condiciones de la reacción. Teniendo en cuenta que se utilizaron 4,65 ml para el medio de reacción y 2,25 ml de extracto enzimático durante media hora, haciendo las transformaciones oportunas se llegó a la conclusión de que la actividad enzimática en el extracto de L. mesenteroides es de 0,23 U ml-1 y en A. niger de 0,075 U ml-1 . Por tanto, la actividad de L. mesenteroides era mayor que la de A. niger para las mismas condiciones experimentales.

Resultado del método empleado para determinar el grado de homología entre el gen de β-galactosidasa en A. niger y L. mesenteroides.

Después de realizar la extracción del ADN, se propusieron diferentes ensayos a la hora de amplificarlo con los cebadores. Primero se amplificó el ADN en la PCR utilizando los cebadores de cada una de las especies sobre el ADN extraído de la misma especie, por ejemplo los cebadores de L. mesenteroides sobre el extracto de ADN de L. mesenteroides. En segundo lugar, se amplificó el ADN utilizando los cebadores de una especie sobre el extracto de ADN de la otra, por ejemplo los cebadores de L. mesenteroides sobre el extracto de ADN de A. niger. El ADN amplificado en los cuatro casos fue sometido a un proceso de electroforesis. Los resultados se pueden observar en la Figura 10.

14

Figura 10. En la fotografía de la electroforesis en el transiluminador de UV se pueden observar 5 columnas. En la central se situan los marcadores de peso molecular en pb. Las dos columnas a la izquierda del marcador de peso molecular corresponden al ADN amplificado con cebadores de L. mesenteroides. Las dos de la derecha al ADN ampliado con cebadores de A. niger. Las columnas señaladas con Lm hacen referencia a los pocillos donde se situó el ADN ampliado de L. mesenteroides y las señaladas con An a los pocillos donde se situó el ADN amplificado de A. niger.

Como podemos ver en la Figura 10, en la parte central de la fotografía se sitúan los marcadores de peso molecular. Al lado derecho del mismo, podemos observar el ADN de A. niger y L. mesenteroides con los cebadores de A. niger . El ADN de A. niger con sus propios cebadores amplificó correctamente de acuerdo al tamaño esperado (671 pb) en una única banda. Sin embargo el ADN de L. mesenteroides con los cebadores de A. niger no amplificó. En el lado izquierdo de los marcadores del peso molecular podemos observar el ADN de A. niger y L. mesenteroides con los cebadores de L. mesenteroides. El ADN de L. mesenteroides no amplificó con sus propios cebadores lo que nos indica que el ADN de L. mesenteroides no era suficientemente puro para amplificar. El ADN de A. niger no amplificó con los cebadores de L. mesenteroides, como el ADN era puro, se llegó a la conclusión de que los genes de la β-galactosidasa de A. niger y de L. mesenteroides no eran homólogos.

Lm An ADN

Cebadores de L. mesenteroides Cebadores de A. niger

15

CONCLUSIONES Las cepas de L. mesenteroides sbsp. son productoras de la enzima β-galactosidasa. Los extractos de esta enzima presentan mayor actividad enzimática que los de A. niger. Si tenemos en cuenta que A. niger es una cepa que se utiliza en la industria como fuente de esta enzima, podremos pensar que la obtenida de L. mesenteroides podría servir como molde para mejorar las propiedades de actividad de la enzima por ingeniería de proteínas. Los genes de la β-galactosidasa en A. niger y L. mesenteroides no son homólogos por lo que la actividad enzimática de las enzimas de ambos microorganismos no puede ser igual. AGRADECIMIENTOS Este trabajo no podría haberse realizado sin la colaboración fundamental de la Dra. Sonia Ramos. Siempre estaré en deuda con esta profesora de la UBU por su paciencia para enseñarme y guiarme por todo el instrumental que se puede encontrar en un laboratorio de Bioquímica. A la Dra. Natividad Ortega gracias por ayudarme en los cálculos, a Luis de Benito por ayudarme a corregir los sucesivos borradores y a Carmelo Palacios por maquetar el proyecto. Por todo ello, gracias a todos.

BIBLIOGRAFÍA

Corral García, J.M. (2005) “Clonación, expresión y evolución dirigida de la β-galactosidasa de procariotas” Tesis. Universidad de Granada. Departamento de Genética.

Costa, B. (2002) “Ingeniería de biocatalizadores y bioprocesos: b-galactosidasa de Thermus sp. cepa T2” Tesis. Universidad Politécnica de Madrid. Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales.

Espinosa de los Monteros Fernández, J.J. (2005) “Caracterización del proceso de crecimiento de Bacillus subtilis bajo condiciones anaerobias” Instituto de Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México.

García –Vallvé, 2015. http://theindustrialenzymologist.blogspot.com.es

Reyes-Ocampo, I. González-Brambila, M.; Lopez-Isunza, F. (2013) “Un análisis del metabolismo de Aspergillus niger creciendo sobre un sustrato” Revista Mexicana de Ingenieria Química, Vol. 12 nº 41-56.

Ye I., Colouris G., Zaretskaya I., Cutcutache I., Rozen S., Madden T., (2012). Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13:134.

Zavaleta, A.I.; Ávila, J.; Chávez-Hidalgo, L. & Izaguirre, V. (2013) “Caracterización parcial del gen β-galactosidasa en Bacillus sp. MSP7 de las salinas de Pilluana, San Martín-Perú” Ciencia e Investigación, 16.