Proy Molecular

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SISTEMA DE GESTIÓN DE LA CALIDAD

FORMATO PARA LA PRESENTACIÓN DEPROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

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1. TITULO: Análisis de los transcritos primarios (ARNm) de la tiroxina hidroxilasa (TH) encélulas madres mesenquimales humanas GFP+ durante el proceso dediferenciación a un linaje dopaminergico

2. AUTORES:

Ítem Nombres Cargo Identificación1 Astrid Milena Perdomo G Estudiante de maestría2345678910

3. GRUPO DE INVESTIGACIÓN:GRUPO DE MODELOS EXPERIMENTALES PARA LAS CIENCIASZOOHUMANAS- ME-CZH

4. LÍNEA DE INVESTIGACIÓN:

Neuroprotección y Neuroreparación

5. RESUMEN (1000 palabras):Con el rápido avance de las neurociencias, se han desarrollado ensayos in vitro con células madre que han permitido considerarlas como un tratamiento paradiferentes enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson(EP), mediante la terapia de sustitución celular, que se basa en la diferenciacióndel tipo adecuado de célula madre hacia el fenotipo celular que se desea, es decir que produzcan una cantidad considerable de tirosina hidroxilasa para garantizar laproducción de dopamina, para trasplantarlas en la zona donde se espera quereemplacen la función de las neuronas desaparecidas.

En la terapia de sustitución celular ¨el trasplante¨ de las células madredirectamente en la zona donde se espera que realicen su acción terapéutica en elcaso de la EP, se debe asegurar. (1) la supervivencia de las células implantadas,la diferenciación al linaje neuronal deseado o la conservación del fenotipoadoptado previamente en el caso de prediferenciación in vitro; (2) que las célulastrasplantadas sean capaces de efectuar las interacciones adecuadas con los





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axones de su inmediata vecindad y secretar dopamina de forma local y tónica;finalmente (3) que el proceso restaurativo se pueda traducir en un mejoramiento

significativo del desempeño motor de quien recibe el trasplante (Rossi y Cattaneo.2002).

En el presente estudio se pretende evaluar la diferenciación de células madremesenquimales humanas GFP+ a linaje dopaminérgico mediante la aplicación dediferentes protocolos de diferenciación. A las células diferenciadas se lescuantificarán los transcritos primarios de mRNA para TH y de paso el número derepeticiones del gen, esto con el fin de poder seleccionar las células que cumplancon estos parámetros, considerándose como células aptas para ser utilizadas enterapia de reemplazo celular de forma experimental.

6. COSTO:

U.T.FondoInvestigaciones

Otros Total

7. DURACIÓN: 2 años ______ meses





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8. JUSTIFICACIÓN: (1 Página: Arial 12 espacio sencillo)La Enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa

más común en el mundo (Federación Española de Parkinson), después de laenfermedad de alzheimer (García., 2009); los datos de incidencia de estaenfermedad provienen en su mayoría de países desarrollados, donde parece tener una alta prevalencia. La EP se caracteriza por la pérdida de célulasdopaminérgicas en la sustancia nigra pars compacta, lo cual conlleva a un déficiten el suministro de dopamina a nivel de los ganglios basales (Quintero., 2003).Dado que es más frecuente a partir de los 60 años, es difícil brindar un diagnósticoacertado en las etapas iniciales de la enfermedad, ya que los signos y síntomasiniciales se pueden considerar como indicios de otros trastornos o los efectos delenvejecimiento normal; por esta razón, el diagnóstico temprano de la enfermedadestá basado en la historia del paciente y el examen físico. (Savitt et al 2006).

Recientemente se han desarrollado ensayos in vitro con células madre, los cualeshan permitido considerarlas como un posible tratamiento para ésta enfermedadmediante la terapia de sustitución celular (Jin H et al., 2006); sin embargo para ellose debe asegurar la correcta diferenciación hacia el linaje dopaminérgico y lasecreción de dopamina de forma local y tónica (Rossi y Cattaneo. 2002). Unaforma de corroborar esta diferenciación se puede lograr determinando laproducción de tirosina hidroxilasa (TH), una enzima clave y limitante en laproducción de dopamina (Zhong, N et al., 2006). En cuanto a verificación de laproducción de la TH y por ende la producción de dopamina, se han realizadoestudios recientes, inicialmente en líneas celulares de ratones, en donde los

protocolos de diferenciación no han tenido mucho éxito para la obtención decélulas para trasplante, sino para estudios fisiológicos rápidos y estudiosfarmacológicos, esto ha sido corroborado mediante la cuantificación de laproducción de la TH por medio de (Reacción en Cadena de la Polimerasa conRetrotranscriptasa Reversa) RT-PCR y Western blot (Tremblay et al., 2010); por otro lado, en humanos los estudios avanzan hacia el establecimiento de losprotocolos de diferenciación con fines de obtención de células para terapiacelular, mediante la comprobación del gen que codifica para la TH, entre otrosgenes, ayudados igualmente de la RT-PCR (Katarzyna et al, 2007: Katarzyna et al2009).

La implementación de herramientas moleculares tales como la Reacción enCadena de la Polimerasa en Tiempo Real, una técnica que permite cuantificar lostranscritos de ARNm del gen de estudio, en este caso el gen codificante de TH,permitiendo calcular así la cantidad de enzima producida, y correlacionarlo conuna mayor producción de dopamina, lo que finalmente conllevará a concluir laefectividad de la terapia, y a un proceso restaurativo que traduce en unmejoramiento del desempeño motor de quien recibe un trasplante.





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9. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA: (1 Página: Arial 12 espacio sencillo)En los países industrializados la prevalencia de la EP es estimada entre el 1 al 3%

de las personas mayores de 60 años (Blum et al., 2001; Nussbarum y Ellis, 2003;Yuan et al., 2004) y del 1.6% en 25 personas mayores de 65 años o másdesarrollan esta enfermedad sin embargo, el diagnóstico precoz ha sido hastaahora un reto en la clínica (Federación Española de Parkinson). En Colombia,según el estudio de prevalencia de enfermedades neurológicas, realizado en 1996(último estudio realizado), hay una incidencia para EP de 4.7 por cada 1.000habitantes, siendo más alta que en otros países (Pradilla et al., 2003). Hasta elmomento se han utilizado diversos tratamientos para la EP entre los queencontramos la utilización de fármacos como Levodopa principalmente y lautilización de trasplantes celulares (Federación Española de Parkinson). Lascélulas madre y especialmente las mesenquimales tienen mayor potencial para

reemplazo celular debido a su fácil obtención de médula ósea, su expansión invitro y su bajo potencial para transformarse en células malignas (Bianco P et al.,2001) convirtiéndolas en las mejores candidatas para terapia celular de la EP.Estudios en pacientes con EP después del trasplante intraestriatal de tejidomesencefálico fetal humano, rico en neuronas dopaminérgicas postmitóticas, handado prueba del principio de que el reemplazo neuronal puede operar en elcerebro humano. Los injertos son capaces de normalizar la liberación dedopamina en el estriado y revertir el daño de la activación cortical, por lo que, lasneuronas dopaminérgicas pueden llegar a ser funcionalmente integradas dentrode circuitos en el cerebro (Lindvall, 2004). Adicionalmente es importante tener encuenta que la profundización en el estudio de esta enfermedad ha evidenciado

que además del trastorno motor marcado en los pacientes también se muestra enla mayoría de ellos alteraciones cognitivas, en comparación con controlesnormales (Braak et al., 2000 y Kumar et al., 2009).





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10. MARCO TEÒRICO Y ANTECEDENTES: (3 Páginas: Arial 12 espaciosencillo)

ENFERMEDAD DE PARKINSON

Es la pérdida del control motor debido a la degeneración selectiva de las neuronasdopaminérgicas mesencefálicas de la sustancia nigra par s compacta (Lindvall etal., 2004). La causa principal de esta enfermedad es la perdida de las neuronasdopaminèrgicas de la sustancia nigra par s compacta, la cual está asociada con laacumulación de -sinucleína formando inclusiones interneurales eosinofílicasllamadas cuerpos de Lewi (Tretiakoff, 1919)

En cuanto a los estudios moleculares sobre esta enfermedad, Dagmar y

colaboradores en el 2003 analizaron la expresión del ARNm de la aldehídodeshidrogenasa citosolica (ALDH1), la cual se creía presuntamente involucrada enla degradación de la dopamina, concluyendo que el ARNm de la ALDH1 estáespecífica y marcadamente regulado en neuronas dopaminérgicas de la sustancianigra en la enfermedad de Parkinson. No obstante, Shizuma y colaboradores en el2010, enfocaron su investigación al estudio del papel del gen DJ-1 en la regulaciónde la transcripción del gen de la tirosina hidroxilasa (TH) en humanos,encontrando que la actividad de unión del ADN por medio del factor de splicing(PSF) fue atenuada por el gen DJ-1 de manera dosis-respuesta. Ellos observaronque el gen DJ-1 estimulaba la actividad del promotor de la TH en humanos sin ladeleción, sugiriendo un sistema de regulación de la expresión del gen para la TH

por medio del gen DJ-1; (Shizuma et al., 2010). Por otro lado, Güney Bademci ycolaboradores en el 2010, encontraron una deleción en el gen que codifica para laTH afectando su expresión en el ARNm, en un paciente con la enfermedad deParkinson, sugiriendo que esa mutación incrementa el riesgo de sufrir laenfermedad, además de que existan pequeñas deleciones en el gen TH enpacientes con la enfermedad (Güney Bademci et al., 2010).

IMPORTANCIA DE LA TIROSINA HIDROXILASA (TH)

La TH también conocida como tirosin 3-monooxigenasa (EC 1.14.16.2), es la

enzima limitante en la biosíntesis de neurotransmisores catecolaminergicos comola noradrenalina, la adrenalina y la dopamina (DA) (Ressler et al., 1999). Ladopamina se sintetiza en dos pasos: 1. La tirosina es convertida a L-DOPA por laTH, y la L-DOPA es convertida a dopamina por la L-DOPA descarboxilasa; conbase en ello se dice que la TH es la enzima clave para la biosíntesis de dopaminay es usada como marcador para neuronas dopaminergicas (Zhong et al., 2006).Su actividad es regulada no solo por la fosforilación de la subunidad de la serina40, sino también por la fosforilación de catecolaminas y la fosforilación de tres delas cuatro subunidades de la molecula de la TH (Fujisawa et al., 2005).





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Se conoce que la actividad regulada de la enzima TH juega un papel crítico en la

actividad funcional del sistema catecolaminérgico (Ressler et al., 1999). Enestudios realizados por Ai Ling Fu y colaboradores en el 2006, se confirmomediante ensayos de inmunofluorescencia que la TH no podía pasar la barrerasanguínea del cerebro. Adicionalmente, el trasplante de neuronas TH positivas enpacientes deficientes en catecolaminas, regula la actividad de la TH dando luz altratamiento de la enfermedad de Parkinson (Kazuhiro et al., 1999). Igualmente, ladisminución en los niveles de TH son asociados con una disminución equivalenteen los niveles de ARNm de la enzima, lo cual se puede dar debido a ineficacia delos antidepresivos; sin embargo, el mejor hallazgo es que la TH es la enzima claveen la síntesis de catecolaminas, mediada por la proteína, lo que puedeincrementar los niveles de la enzima en neuronas (Ai Ling et al., 2006).

ESTUDIOS MOLECULARES REALIZADOS EN TH

Actualmente la TH con relación a la enfermedad de Parkinson ha sidoprincipalmente utilizada como marcador inmunohistoquímico para identificar células dopaminérgicas o comprobar que los grupos celulares inician unadiferenciación hacia dicho linaje. Sin embargo, anteriormente se habían realizadoalgunos estudios que ayudaban a dilucidar, mediante herramientas de biologíamolecular, el comportamiento de la enzima a través de estudios sobre el mRNA,tales como un estudio donde concluyeron que la expresión del mRNA de la TH, laactividad y los niveles de catecolaminas fueron significativamente más altos en

médula adrenal con sensibilidad espontánea en rata (SHR) que en médula adrenalde ratas Wistar de Kyoto (WKY) (Kumai., 1994).

Hacia el 2008 Barzilay et al, realizó un estudio donde aplicó protocolos deinducción a la diferenciación de MSCh hacia linaje dopaminérgico, con los cualesno obtuvo resultados positivos pero si demostró la efectividad de la PCR en tiemporeal para cuantificar los niveles de expresión de la TH en éstas célulasdiferenciadas, los cuales estaban moderados por los protocolos de inducción a ladiferenciación (Barzilay et al., 2008); adicionalmente se conocen variantes delmRNA para la TH detectadas por RT-PCR bajo condiciones altamenteastringentes y un set de primers entre el exón 5 y 12, la región constante del gen,

estos resultado han sido usados para detección de neuroblastoma, el tumor máscomún extracraneal en niños, para el monitoreo de de mínimos residuos de laenfermedad en sangre periférica y medula ósea (Parareda et al., 2003). Jin ycolaboradores en el 2006 realizaron estudios en muestras de raton y humanosutilizando transfección del DNA. Wester blot y PCR en tiempo real para detectar lano dependencia de la regulación del gen de la TH del gen Nurr 1, ayudando aentender las implicaciones para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos y elestudio de la patogénesis de enfermedades neurogenerativas, principalmente laenfermedad de Parkinson (Jin et al., 2006).





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Por otro lado, se han realizado intentos del establecimiento de protocolos para la

diferenciación de MSCh hacia linaje dopaminérgico, comprobando la existencia delgen que codifica para la TH con ayuda de RT-PCR y Wester blot (Katarzyna et al,2007: Katarzyna et al 2009) sin embargo aun queda trabajo por hacer.





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11. OBJETIVOS: (1/2 Página: Arial 12 espacio sencillo)

OBJETIVOS GENERALES Analizar los transcritos primarios de TH en células madre mesenquimaleshumanas durante su diferenciación a células dopaminérgicas para determinar siexisten diferencias entre dos tratamientos con factores neurotróficos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

y Determinar mediante PCR en Tiempo Real el número de transcritos de THy los niveles de expresión de las células diferenciadas.

y Amplificar el ADNc de los transcritos primarios, para verificar mediante

clonación y secuenciamiento su correspondencia con la enzima TH ycorroborar si existen diferencias.

12. HIPÓTESIS: (1/2 Página: Arial 12 espacio sencillo)

Ho: Se logra determinar mediante PCR en Tiempo Real el número de transcritosde TH y los niveles de expresión de las células diferenciadas.Hi: No se logra determinar mediante PCR en Tiempo Real el número detranscritos de TH y los niveles de expresión de las células diferenciadas.

Ho: Se amplifica exitosamente el ADNc de los transcritos primarios, y se verifica

mediante clonación y secuenciamiento su correspondencia con la enzima TH, y secorrobora la existencia de diferencias.Hi: No se amplifica exitosamente el ADNc de los transcritos primarios, así mismono hay correspondencia del segmento clonado y secuenciado con la enzima TH, eigualmente no se corrobora la existencia de diferencias.





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13. DISEÑO METODOLÓGICO: (3 Páginas: Arial 12 espacio sencillo)

MSCh-GFP+: Las MSCh-GFP+ (Células madre mesenquimales humanastransfectadas con proteína verde fluorescente), donadas por CECOLFES (CentroColombiano de Fertilidad y Esterilidad), se mantienen a 37°C en medio DMEM(Dulbelcco's Modified Eagle Medium) bajo en glucosa, 10% suero fetal bovino(SFB) y 1 % de penicilina/estreptomicina en el Laboratorio de Biotecnología

Animal de la Universidad del Tolima (LABIOUT). Las MSCh-GFP+ obtenidas deun donante sano, previa aprobación por el comité institucional de ética, fueronGFP-transducidas utilizando la tecnología lentivirus.

Extracción de mRNA: El cuidado preventivo que se utilziará para evitar ladegradación del mRNA incluye el uso de guantes de polipropileno, limpieza de las

superficies con RNasa (Ambion). El mRNA será extraído de cada uno de loscultivos celulares tratados utilizando el kit RNAqueous-4PCR (Ambion), el métodoestá basado en la ruptura celular de la muestra en una solución de lisis quecontiene tiocianato de guanidina, posteriormente se adicionará una solución deetanol y se llevará a una columna de silica gel selectiva para el mRNA y el RNAribosomal, luego el filtro será lavado para remover residuos de DNA, proteína yotros contaminantes para ser tratado con una DNasa, finalmente el RNA seráeluído en agua libre de nucleasas grado RT-PCR (Ambion, AM9935) yalmacenado a 4ºC para su posterior uso en RT-PCR.

Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transciptasa Reversa (RT-PCR):

La síntesis del ADNc se realizará con SuperScript III reverse Transcriptase(Invitrogen). Los primers que serán empleados para amplificar la región de latiroxina hidroxilasa (TH) serán: F-5¶ CCAGTATATCCGCCAC 3¶, R-5´GTCTGGTCTTGGTAGG 3´ reportados por Katarzyna et al, 2007, cada reaccióntendrá los siguientes parámetros: denaturación a 95°C por 2 minutos; 95°C 30segundos; hibridización 45°C±62°C por 30 segundos a 1 minuto; extensión 72°C,30 segundos por 40 ciclos; 72°C por 10 minutos. Para verificar la calidad y lacantidad de la muestra se realizará una medición con el nanodrop 2000c.

Clonación: Para verificar el producto de amplificación de la RT-PCR, se clonará elsegmento que codifica para la TH por medio del kit TOPO TA Cloning (Invitrogen),

puesto que el vector tiene colas poli T, y para la sintesis del ADNc hubo unaextensión final de 10 minutos con una polimerasa sin la corrección proofreading,lo cual implica que el producto de amplificación tendría colas poli-A, por lo quehabría una complementariedad total. Se utilizarán para la transformación célulascompetentes de E scherichia coli , serán cultivadas en un medio agar enriquecido,luego, la incubación se llevará a cabo durante toda la noche a 37ºC y al cabo deéste tiempo, se almacenarán a 4ºC para su posterior resiembra y purificación conel kit Pure Link Quick Plasmid Miniprep (Invitrogen) para lo cual primero serealizará una cosecha de las células la cual consiste en la obtención de la mayor





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cantidad de células competentes con el inserto en una menor cantidad posible devolumen, posteriormente el volumen obtenido se adicionará en una columna de

silica selectiva, proporcionada por el kit, seguidamente se adicionarán el buffer delisis y de precipitación y finalmente se lavará por tres veces para conservarlo enTE.. Posteriormente se llevará a secuenciar por el método de Sanger. Luego deobtenida la secuencia se realizará un BLAST para verificar que es el segmentoesperado.

Diseño de Primers y Sonda para PCR en tiempo real: El diseño de primers serealizará con el Sofware de Applied Biosystem para PC versión 1.4 patch 2, tantopara el gen normalizador como para el ADNc; igualmente, el diseño de la sondaacoplada TaqMan, también se realizará con éste software. Posteriormente, con elfin de verificar la complementariedad de los primers diseñados, se les realizará un

BLAST (www.NCBI.nml.nih.gov).

PCR en tiempo real: La reacción se llevará a cabo en un termociclador de Applied Biosystem referencia 7300 utilizando una sonda TaqMan. Todas lasreacciones serán realizadas por triplicado. La cuantificación de la cantidad detranscritos se evaluará con relación a la expresión de gen housekeeping para elGliceraldeil 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (García Quiroz et al., 2010). Paracada par de primers las condiciones serán optimizadas.

Calculo del Valor Ct: Se calculará el valor Ct usando el software de AppliedBiosystem para PC versión 1.4 patch 2. Primero se obtendrán los valores av que

arrojará el sofware para el gen housekeeping y para los grupo de tratamientos,luego con éstos valores se calculará el valor Ct para el normalizador y para cadauno de los grupos de células tratados con los protocolos de diferenciación,posteriormente la diferencia de ellos será el Ct (eficiencia de la reacción) paracada muestra sometida a tratamiento. Finalmente se aplicará la fórmula FOLD = 2 ±Ct para cada uno de los tratamientos, estableciendo así el número de vecesque se expresa el gen que codifica para la enzima tiroxina hidroxilasa.

Análisis Estadísticos: Se realizará una prueba de normalidad de la distribuciónde los datos t-student, con un nivel de significancia del 5% (p<0.05). La cantidadrelativa de TH será calculada para cada muestra, por la expresión correspondiente

a los niveles de mRNA con respecto a los niveles de mRNA de GAPDH. Lareproducibilidad de los resultados será determinada por la medición por triplicadode cada alícuota de ADNc preparada de cada muestra de RNA.





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14. BIBLIOGRAFÍA:

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FORMATO PARA LA PRESENTACIÓN DE PROYECTOS DEINVESTIGACIÓN

Teléfono: 2669182 ± Página web: www.ut.edu.co/investigaciones - E-mail: din@

15. CRONOGRAMA*:

Actividad Tiempo (meses)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Revisión BibliográficaX X X X X X X X X X X X X X X X X

Compra de materiales,reactivos y equipos

X X X

Expansión ymantenimiento ydiferenciación de MSCh

X X X X

Extracción de mRNA, RT-PCR, clonación,secuanciación yCuantificación detranscritos.

X X X X X X X X X X

Análisis y procesamientode los resultados

Informe final

Socialización y publicación

*Si requiere más tiempo, anexe hoja adicional del cronograma.






1. PRESUPUESTO*: ____________________________________________________________________

Cuadro 1.- Descripción de costos de personal

Nombre deInvestigadores

FormaciónFunción enel proyecto1

TiempoDedicación(H/Semana)

Duración

C o s t o sU.T. Adm.Central $

FondInvesU.T.

Astrid MilenaPerdomoGonzález

Bióloga Investigadora-estudiantede maestría

40 24meses

Total Costo de Personal

1 Debe identificar el nivel de investigador Principal, coinvestigador, auxiliar, consultor

* En los cuadros de presupuesto se pueden adicionar filas si son necesarias.






Cuadro 2.- Descripción de los equipos requeridos:

No.Equipo

Justificación uso enproyecto

No.Unidad

Adquisición

Arriendo


FondInvesU.T.

1 Micropipeta 0.1-10 µl 1 x 1.0002 Micropipeta de de 10.1-100 1 x 1.0003 Termociclador RT-PCR 1 x 4 Fuente de poder 1 x 5 Termociclador qPCR +

sofware1 x

6 Equipo de secuenciación 1 x

Totales $2.000

Cuadro 3. Descripción de viajes (Sólo se incluyen viajes relacionados con la me

No. Lugar Valor PasajeEstadía(días)

Justificación1

C oU.TCe

Totales1 Debe incluir el nombre o nombres de los usuarios de los viajes.






Cuadro 4. Descripción de Insumos y Materiales:

No.Equipo

Justificación uso en proyectoNo.

Unidad

Adquisición

Arriendo

U.T. Adm.

Central $

FondInvest.

$1 KitRNaqueuos 1 X 1.0002 Agua grado RT-PCR sin

nucleasas1

X900.0

3 Kit de clonación 1 X 2.500

4 SuperScript III reverseTranscriptase 1 x 2.000

5 Sintesis de primers 6 X 1.2006 Puntas para micropipetas 2 c/u x 200.0

7Guantes

2cajas

x 20.0

8 Secuanciación y reactivos 1 x

Total 7.820

Puede considerarse como insumos: muestras vegetales, de fauna, flora, reactivos, bi






Cuadro 5.- Descripción Servicios Técnicos:

Nombre JustificaciónCantidad


Fondo deInvest. U.T.$

Ot$

Totales

Cuadro 6. Descripción de Construcciones:

Nombre Uso Cantidad


Fondo deInvest. U.T.$

Ot$

Totales






Cuadro 7. Publicación y social de resultados:

Item Justificación C o s t o sU.T. Adm.Central $

Fondo deInvest. U.T. $

Otros$

1 Revistas internacionales 2.000.000 2 Socialización en congresos 2.000.000

Totales 4.000.000 Cuadro 8.- Costo total del proyecto:Los rubros parciales deben trasladarse al formato del Costo Total:

NombreU.T. Adm. Central $ U.T. Fondo de Invest.

$Otros

Personal $ 18.000.000 Equipo $2.000.000 $262Insumos y Materiales $8.320.000 ViajesServicios TécnicosConstruccionesMantenimientoPublicaciones y socialización $4.000.000

Administración *(% valor delproyecto)Totales $28.320.000 $262

* Hasta un 10% del valor del Proyecto.





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18. RESULTADOS ESPERADOS (3 páginas: Arial 12 espacio sencillo)

Con éste proyecto se pretende lograr la cuantificación de transcritos primarios delmRNA para TH en MSCh para futuros trasplantes encaminados a tratamiento deterapia celular en pacientes con la enfermedad de parkinson.

Se espera encontrar cantidades significativas de repeticiones del gen para THdemostrando asi, la eficacia de los protocolos de diferenciación.

Se logra corroborar mediante el uso de herramientas moleculares la cuantificacióndel gen de la tiroxina hidroxilasa, teniendo en cuenta que a mayor cantidad delmismo, mayor será su producto de expresión, por lo cual se producirá másdopamina por parte de las MSCh GFP+ diferenciadas. Todo lo anterior debido aque la interacción del DNA con el ambiente da como resultado un fenotipo mejor ymás indicado para el medio. Sin embargo, esto se debe apoyar con otros estudioscomo los fisiológicos e inmunohistoquímicos.

Los resultados de éste proyecto será uno de los primeros peldaños en eldesarrollo de protocolos de diferenciación MSCh a linaje dopaminérgico, dandofiel reporte de que éstas células serán capaces producir dopamina ya que sucomposición genética lo permite, esto gracias a que ha sido corroboradamolecularmente.

Finalmente se pretende que el presente proyecto sea fuente de formación para yun estudiante de maestría y un estudiante de pregrado, además de la adquisiciónde experiencia en elaboración de proyectos de investigación y la adquisición dehabilidades en la socialización de los mismos, en encuentros científicos y en laescritura de un artículo científicos.





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19. TRAYECTORIA DE LOS INVESTIGADORES

Astrid Milena Perdomo GonzálezInvestigadora principal.Bióloga

Areas de la investigación: Cultivo celular.Integrante del Grupo Modelos Experimentales para las Ciencias Zoohumanasdesde el 2006 hasta la fecha.

MERITOS Y GALARDONES

TESIS MERITORIA, 2009, otorgado por la Universidad del Tolima.

EVENTOS CIENTIFICOS Y ACADEMICOS

XXXIX Congreso Nacional de Ciencias BiológicasIbagué, TolimaOctubre del 2004.Participante

XLCongreso Nacional de Ciencias BiológicasCali, Valle del CaucaOctubre del 2005.Participante

Simposio Intenacional Organon Andina De la Fetilización In-Vitro a las CélulasMadre Embrionarias. CECOLFESBogotá D.C

Abril 2007.Participante

XIII Congreso Colombiano de Parasitología y Medicina TropicalIbagué, TolimaNoviembre 2007.Participante

XLIIV Congreso Nacional de Ciencias BiológicasYopal, CasanareOctubre del 2008.Ponente

RESUMENES PUBLICADOS EN MEMORIAS DE EVENTOS CIENTIFICOS





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PERDOMO, G Astrid Milena; CRIOLLO, R Angel; FRANCIS, T Liliana.Sincronizacion del Ciclo Estral en Rata Wistar a Traves del Método con FeromonasMasculinas y Hormonas Femeninas Inductoras de Ovulacion.Memorias XLI Congreso Nacional de Ciencias Biológicas. 2007.

PERDOMO, G Astrid Milena; CRIOLLO, R Angel; FRANCIS, T Liliana.Ensayo de Inmunosupresion en Ratas Wistar con Ciclosporina y Prednisolona comoPreliminar para el Transplante Heterologo de Celulas Madre Embrionarias Humanas.Memorias XLI Congreso Nacional de Ciencias Biológicas. 2007.

OTROS

Entrenamiento teorico-práctico en técnicas inmunoquímicas.

Grupo de inmunoquimica.Fundación Instituto de Inmunología de Colombia.Bogotá D.C16 Julio-15 Diciembre 2007Tutor: Diana Milena Calderon. c. Ph.DCargo: pasante

Entrenamiento teorico-práctico en técnicas Cultivo Celular Grupo de inmunoquimica.Fundación Instituto de Inmunología de Colombia.Bogotá D.C16 Julio-15 Diciembre 2007

Tutor: Diana Milena Calderon. c. Ph.DCargo: pasante

Entrenamiento teorico-práctico en técnicas Cultivo Plasmodium falciparum Grupo de inmunoquimica.Fundación Instituto de Inmunología de Colombia.Bogotá D.C16 Julio-15 Diciembre 2007Tutor: Matha Forero Garnica. Quimica.Cargo: pasante

Entrenamiento teorico-práctico en técnicas de Biología Molecular

Grupo de Biología Molecular.Fundación Instituto de Inmunología de Colombia.Bogotá D.C16 Julio-15 Diciembre 2007Tutor: Carolina Vizcaino. BacteriólogaCargo: pasante

Entrenamiento teorico-práctico en mantenimiento de animales de experimentación.Grupo de Modelos Experimentales para las Ciencias Zoo-HumanasUniversidad del Tolima





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Tutor: Ph.D Liliana Francis Turner

Seminario Taller en ³Epidemiología Molecular y Cáncer Hereditario´Ministerio de la Protección Social-Instituto Nacional de CancerologíaBogotá D.CSeptiembre 1- 4 de 2008Intensidad horaria: 40 horas.Participante

EXPERIENCIA LABORAL

Establecimiento: Fundación Instituto de Inmunología de ColombiaCargo: Pasante investigador Área: Grupo de Biología Molecular, Grupo de Inmunoquímica, Laboratorio de

Inmunoquímica, Laboratorio de Cultivo Celular Dirigido a: Investigación en Ciencias BiomédicasCiudad: Bogotá D. C.Fecha: Junio-Diciembre de 2007

Establecimiento: Banco de la República-Fabrica de Moneda.Cargo: Auxiliar de LaboratorioÁrea: Grupo Control de Calidad ± Laboratorio QuimicoDirigido a: Control de CalidadCiudad: IbaguéFecha: Abril 2010 ± Junio 2010





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20. SUGERNCIA DE PARES (Proyectos de Docentes). Ingrese los datos decuatro (4) Pares Evaluadores de COLCIENCIAS que puedan evaluar suproyecto.

Nombres E-mail Teléfono

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