PROTOCOLO- FASE I

FASE 1.- MICROPROPAGACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

Ve a la poyata y toma un vaso de precipitados llénalo de agua destilada en el grifo.

1º.- Preparación del medio de cultivo o crecimiento:

Chopo (Populus sp. 3 meses)

Ve a la poyata donde se encuentra el agitador coloca el vaso sobre el agitador y ve añadiendo (toca cada bote) los siguientes ingredientes por este orden:

PROTOCOLO- FASE I

• 1X Murashige Skooh -S1b.• 2% Sacarosa.

• 0,8% agar, pH 5,8Ahora añadir:

Ajustar el pH a 5,8 colocando el vaso en el medidor de pH.

2º.- Pasar el medio a una botella, (ponerle una cinta de autoclave en la tapadera) y llevar al autoclave.

Llevar los brotes nuevo al fitotrón y dejarlos durante durante 6 semanas, allí estarán a 25⁰C con un fotoperiodo de luz de 16horas de luz y 8 horas de oscuridad.

•

PROTOCOLO- FASE I

4º.- Encender la cabina de flujo laminar, y poner las pinzas y tijeras que están en la cabina en el esterilizador de boles de vidrio.

3º.- Recoger bandeja con botes estériles cercanos al autoclave. Recoger ahora el bote con medio del autoclave y llevarlo a la cabina.

5º.- Una vez que el medio está atemperado. Añadir:

7º.- Sacar con las pinzas el árbol y colocarlo sobre la placa petri de cristal, cortarlo en brotes con al menos una hoja cada uno y transferir cada brote a un tubo, clavando el brote.

Ahora sal del fitotrón, vuelve a entrar y comprueba si tus plantas han crecido correctamente, si es así habrás pasado la fase I, (cada vez que

salgas y entres habrá pasado una semana de tiempo).

6º.- Repartir 2 cm del medio en cada bote estéril y dejar solidificar (cambia el color de amarillento a grisáceo).

(si el medio se endurece será imposible añadir el IAA, (0,5 mg/L ) no se debe esperar demasiado):

PROTOCOLO- FASE II

PROTOCOLO- FASE II: PCR-Clonaje-Transformación Bacteriana

Pasos a llevar a cabo:- la PCR.- la ligación.- la transformación bacteriana.

2º.- Recoge el soporte con hielo y toma del frigorífico a -20ºC :

PCR

1º.- Enciende la máquina de PCR, el termobloque tarda en calentarse.

- ADN molde a partir del cual se amplificará el gen (100ng/ul).- Oligonucleótidos (primer) derecho e izquierdo 100uM (forward and reverse).- Tampón de la enzima polimerasa.- Cloruro de Magnesio 25mM.- Mezcla standard de dNTP 1mM (dinucleótidos trifosfato).- ADN polimerasa (5u/ul).- Agua destilada.

3º.- Ve a tu poyata y en un tubo de PCR mezcla los componentes, para ello coge la pipeta de su soporte (los componentes se mezclan de forma automática).

4º.- Introduce la mezcla en la PCR (tubo verde) y pulsa start, cuando acabe la PCR, guarda el fragmento amplificado a -20ºC.

PROTOCOLO- FASE II: PCR-Clonaje-Transformación Bacteriana

LIGACIÓN

1º.- Enciende el termobloque a 16ºC.

2º.- Recoge el soporte con hielo y toma del frigorífico a -20ºC :

- ADN plasmídico (el vector).- ADN amplificado por PCR (el gen de interés, tubo verde).- Tampón de la enzima ligasa.- Enzima ligasa.- Agua destilada.

3º.- Ve a tu poyata y en un tubo de PCR mezcla todos los componentes, tomando la pipeta.

4º.- Introduce el tubo con la mezcla en el termobloque, deja o/n (overnight) es decir, 8-10h a 16ºC.

Si los has hecho bien, ya tienes el gen dentro del plásmido para el siguiente paso, ahora debes introducir el plásmido en la bacteria.

5º.- Guarda el plásmido a -20ºC.

PROTOCOLO- FASE II: Transformación Bacteriana

1º.- Recoge el soporte con hielo y saca un tubo de bacterias de -80ºC y déjalo en hielo, las bacterias deben descongelarse lentamente para disminuir la tasa de mortalidad.

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

2º.- Toma del frigorífico a -20ºC el ADN plasmídico que contiene el gen y déjalo en hielo.3º.- Ve al aparato de electroporación que está dentro de tu cabina, toca la cubeta para depositar en ella una mezcla del plásmido y de la bacteria que acabas de descongelar, el choque eléctrico abre las paredes bacterianas y el plásmido entra en la bacteria.

4º.- Coloca el tubo en el horno a 37ºC para que las bacterias se recuperen durante 1hora (20 segundos virtuales), (después las bacterias del tubo se pasarían a una placa petri con medio de cultivo en presencia de antibiótico, sólo crecerían las bacterias que contienen tu gen con el plásmido que le confiere resistencia a dicho antibiótico, de la placa se toma una colonia que se crece en medio líquido en el horno a 37ºC, estos pasos se realizan virtualmente dentro del horno y no los realiza el avatar) del horno obtendrás finalmente un tubo falcon con la bacteria lista para transformar la planta.

Si el cultivo ha crecido, pasa a la siguiente fase!!!!

PROTOCOLO- FASE III

1º.- Recoge el Falcon con las bacterias del horno y llévalo a la cabina de flujo.

TRANSFORMACIÓN VEGETAL

2º.- Recoge los árboles de 3 meses de la cámara visitable y llévalas a la cabina.

3º.- Al tocar el material vegetal éste pasa a quedar cortado en trozos este material quedará dentro del medio con la bacteria la cual transforma el material.

4º.- Lleva las placas a la cámara visitable y espera a que se vayan generando callos, entra y sale de la cámara para observar los resultados, recuerda que la fase de desdiferenciación celular se salta en la práctica virtual.

5º.- Cuando observes explantos sobre el callo llévalos a la cámara y traslada los brotes a botes de plástico con medio, estos botes son de plástico, son más grandes y servirçan para inocular los árboles crecidos en su interior.

6º.- Lleva los botes a la cámara, espera a que crezcan y llévalos a la cabina de flujo para inocularlos con patógenos.

PROTOCOLO- FASE VI

1º.- Recoge las plantas de los botes de plástico, llévalos a la cabina.

INOCULACIÓN Y FENOTIPADO

2º.- Recoge el inóculo de hongo o de bacteria marcado como tal en el horno de incubación. (el paso de preparado del inóculo no se lleva a cabo en virtual).

3º.- Traslada el inóculo del erlenmeyer al bote de spray tocándolo.

4º.- Inocula con spray tomándolo y acercándolo al bote de plástico que contiene el árbol.

5º.- Cierra el bote y llévalo a la cámara, observa los síntomas al cabo de 1,2,3 y 4 semanas virtuales (recuerda que cada vez que entras y sales pasa una semana).

6º.- Anota los resultados del fenotipado y extrae conclusiones.

FUNDAMENTOS FASE V: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD IN VITRO DEL ANTIBIÓTICO VEGETAL

FUNDAMENTOS FASE VI: LOCALIZACIÓN SUBCELULAR Y TISULAR DEL ANTIBIÓTICO VEGETAL

ESTAS FASES SE ENCUENTRAN EN PROCESO……………..

Se trata de una fitohormona reguladoradel crecimiento vegetal del grupo de lasauxinas. Estas hormonas desempeñan unpapel fundamental en el desarrollovegetal ya que promueven la elongacióncelular, el desarrollo radicular, elcrecimiento del fruto y son responsablesde la dominancia apical.Se sintetizan en la yemas, en los tejidosjóvenes, frutos y embrión.Todas las auxinas son compuestos queposeen un anillo aromático y un grupocarboxílico. El miembro más importante ypotente de las auxinas es el ácidoindolacético. Existen análogos sintéticosde las auxinas como el 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), el ácido indolbutírico (IBA) y el ácido naftalen acético(ANA).

Ácido indolacético

ADN (ácido desoxirribonucleico) o DNA (deoxyribonucleic acid). Tipo de ácido nucleico, macromolécula que forma parte de todas las células. Contiene la información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria.Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es decir, un polinucleótido. Cada nucleótido, a su vez, está formado por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser adenina→A, timina→T, citosina→C o guanina→G) y un grupo fosfato que actúa de enlace entre nucleótidos.

http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/basics/dna

Para más información:

ADN

ADN molde

Secuencia de ADN que sirve de referencia para la ADN polimerasa.

Agar

Polisacárido sulfatado complejo compuesto principalmente por galactosa y ácido glucurónico. Se extrae normalmente de algas rojas y se usa como agente solidificante en medios de cultivo.

Tiene dos propiedades importantes:-No es asimilable por los microorganismos, sólo es un sustrato o matriz, esto hace que el medio de cultivo no se altere por el crecimiento.

-Se funde por encima de 100 C pero no solidifica hasta temperaturas por debajo de 45 C, esto permite ser utilizado en el laboratorio a temperaturas toleradas por las manos humanas, y cultivar los microorganismos en un amplio rango de temperaturas.

Su utilización en medios de cultivo data del siglo XIX cuando la esposa de W. Hesse (colaborador de R. Koch) se enteró de las dificultades de su esposo para cultivar microorganismos en medios sólidos, y le aconsejó utilizar el espesante de sus mermeladas (el agar).

Agitador de laboratorio

Instrumento de laboratorio diseñado para mezclar líquidos, o líquidos y sólidos. Existe una variedad de agitadores basados en la aplicación:

- Agitador de bandeja: se trata de una superficie que gira en el plano accionada por un motor . Se suele utilizar para mezclar cosas delicadas, como geles para tinción. Los agitadores orbitales poseen balanceo, lo que contribuye a una mezcla mas eficiente.

- Agitador magnético: se basa en un motor eléctrico regulable en velocidad de giro que crea un campo electromágnetico que hace girar un imán colocado en el recipiente de mezcla (matráz, vaso de precipitados, etc). Este tipo de mezcladores suelen presentar una superficie calefactora que facilita la disolución de solutos. Estos agitadores son muy populares para la elaboración de soluciones, medios, etc, en volúmenes que van desde los pocos ml a varios litros.

- Agitador de noria: los recipientes estancos giran en el plano vertical, como una noria.

- Agitador de vórtice (vortex), se trata de agitadores para mezclar volúmenes relativamente pequeños (desde pocos microlitros hasta ml) en una amplia variedad de tubos de laboratorio (eppendorf, falcon, tubos de ensayo, etc). El movimiento excéntrico del eje orbital crea un vórtice o vortex que facilita una mezcla rápida y eficiente.

Agrobacterium tumefaciens

Bacteria que origina una enfermedad denominada tumor de cuello en algunas plantas. La bacteria infecta heridas de la planta e incorpora un fragmento de ADN llamado ADN-T de su plásmido Ti (inductor de tumores) en el genoma de la planta hospedadora. Este ADN-T contiene genes de virulencia que inducen el tumor . Este mecanismo puede utilizarse para transferir ADN foráneo a una célula vegetal, para ello se modifica el plásmido Ti sustituyendo parte del ADN-T por el ADN (gen) de interés y eliminando los genes de virulencia.

Cámara diseñada para mantener el ambiente estéril requerido para trabajar con cultivos de células o tejidos. Se consigue mediante el paso de un flujo continuo no turbulento de aire esterilizado por filtración a través de la zona de trabajo.

El flujo de aire puede ser horizontal o vertical.En las cabinas de flujo horizontal, el aire filtrado mediante filtros de alta eficiencia HEPA, atraviesa la cámara central en una corriente laminar horizontal que se expulsa por la abertura frontal de la cabina.En las campanas de flujo vertical, el aire filtrado fluye a modo de cortina y evita que las micropartículas y aerosoles que se puedan crear en la manipulación contaminen al manipulador y al ambiente. Mediante un sistema de aspiración se recoge el aire contaminado y después de pasarlo por unos filtros, se expulsa al exterior.

Cabina de flujo laminar

Callo

Los tejidos dañados que crecen de forma desorganizada se conocen, en las plantas, comocallos.En las técnicas del cultivo in vitro, se denomina callo al tejido desdiferenciado formadopor células vegetales totipotentes (células capaces de regenerar un organismo completosi las condiciones ambientales y los estímulos son los adecuados) que crecen en medioscon nutrientes.Los callos se pueden obtener al introducir explantes o pequeñas porciones de tejidoscomo hojas, cotiledones o raíces , en medios de inducción de callo.También se pueden obtener callos al pasar protoplastos aislados a medios de inducciónde callo, donde se regeneran de nuevo las paredes celulares y se induce su divisióncelular.Para regenerar con éxito una planta a partir de una célula individual indiferenciada esnecesario cultivar los callos en un medio que posea nutrientes y hormonas decrecimiento (fitohormonas) . Éstas controlan el crecimiento y la diferenciación de lascélulas vegetales: las auxinas regulan el crecimiento de la raíz, y las citoquininas inducenel crecimiento de los brotes e inhiben de este modo el crecimiento de la raíz. Laproporción entre citoquininas y auxinas es decisiva.

Clonación En sentido general es obtener copias idénticas de un organismo, célula o molécula. Clonación génica es la inserción de un fragmento de ADN en un vector o en un cromosoma hospedador para diferentes propósitos como su multiplicación o su expresión entre otros.

Codificar

Según la Real Academia de la Lengua Española, codificar es “transformar mediante las reglas de un código la formulación de un mensaje”.

En genética molecular se dice que los genes codifican proteínas. Esto quiere decir que los genes contienen un mensaje (la información necesaria para la síntesis de una proteína) que sigue las reglas de un código (el código genético). Para entender el mensaje codificado de un gen, éste tiene que ser traducido (traducción genética).

Código genético El código genético es el conjunto de normas por las que la información codificada en el material genético (secuencias de ADN o ARN) se traduce en proteínas (secuencias de aminoácidos) en las células vivas. El código define la relación entre secuencias de tres nucleótidos, llamadas codones, y aminoácidos. Un codón se corresponde con un aminoácido específico.El número de codones posibles es 64, de los cuales 61 codifican aminoácidos (siendo además uno de ellos el codón de inicio, AUG) y los tres restantes son sitios de parada (UAA, llamado ocre; UAG, llamado ámbar; UGA, llamado ópalo). La secuencia de codones determina la secuencia aminoacídica de una proteína en concreto, que tendrá una estructura y una función específicas.

El código genético es universal, específico, continuo y degenerado.

Para más información:· Los códigos genéticos (tablas):

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/index.cgi?chapter=tgencodes#SG1

Cultivo de bacterias (líquido y en placa).

Los microorganismos que se utilizan en el laboratorio son cultivos puros, proceden de una sola célula. Las bacterias se cultivan en el laboratorio en condiciones asépticas, todo el material utilizado debe ser estéril. Se utilizan incubadores donde se controla que la temperatura y las necesidades de oxígeno sean las óptimas para cada bacteria.

Dependiendo de las necesidades el medio de cultivo puede ser líquido o sólido.

-los medios líquidos se utilizan para obtener gran cantidad de células de un microorganismo concreto, se utilizan matraces o tubos que se incuban en agitación.

-los medios de cultivo sólido se consiguen añadiendo antes de la esterilización agar como agente solidificante. El medio, estéril, fundido a Tª>45ºC, se reparte en placas de Petri (circulares con tapa no hermética). Esto permite inmovilizar las células permitiéndoles crecer y formar masas visibles, las colonias. Generalmente se utiliza para conseguir aislar colonias.

El cultivo in vitro se define como el cultivo en un medio nutritivo, en condiciones estériles, de semillas, órganos, explantos, tejidos, células y protoplastos de plantas.

En el cultivo in vitro se controlan y optimizan los factores físicos (luz, Tª y humedad), nutricionales y hormonales, y se excluyen todos los microorganismos y plagas que puedan afectar a la planta.

Cultivo in vitro

Planta de chopo de 3 meses de edad cultivada in vitro

Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs)

Unidades fundamentales del ADN formadas por tres fosfatos unidos al grupo hidroxilo 5º de un azúcar desoxirribosa y una base nitrógenada (adenina (A), tionina (T), citosina (C) y guanina (G)).

Electroforesis de ADN

Técnica separativa utilizada para resolver fragmentos de ADN de distinto tamaño enfunción de la carga eléctrica.

La separación electroforética se lleva a cabo sobre matrices semisólidas, generalmentede agarosa o de poliacrilamida (sólo para moléculas de ADN de tamaño menor a100,000 pb).

El ADN tiene una carga eléctrica neta negativa debido fundamentalmente a los gruposfosfato que contiene, de manera que, al someterlo un campo eléctrico, se desplazaráhacia el polo positivo (ánodo). En principio las moléculas de una mezcla de ADN semoverán a una velocidad proporcional a su tamaño. Las moléculas de ADN maspequeñas se mueven mas rápido a través de los poros de la matriz y son las que migranmas lejos.

Enzimas de restricción

Fueron descubiertas en los años 60 por Werner Arber y Hamilton D. Smith como mecanismo de protección de las bacterias contra los virus bacterianos (bacteriófagos). Las bacterias cortan el ADN (digestión del ADN) del virus exógeno con enzimas, las denominadas endonucleasas de restricción (enzimas de restricción). El ADN propio de las bacterias, en cambio, está protegido por grupos metilo (-CH3) adicionales, que bloquean su acción. En 1970 Herbert W. Boyer, descubrió que estas enzimas no cortan arbitrariamente el ADN, sino sólo exactamente en determinadas pares de bases. Cada tipo de enzima es capaz de reconocer y cortar una secuencia especifica de ADN, generando extremos de ADN romos (p. ej.: SmaI) o cohesivos (p. ej.: EcoRI). Hoy se conocen más de 1200 enzimas de restricción. Sin embargo, sólo algunas de ellas son interesantes para la ingeniería genética. Los fragmentos de ADN obtenidos por una de estas enzimas pueden ser unidos entre si por enzimas de ligación.

5 … G A A T T C … 3

3 … C T T A A G … 5

EcoRI

5 … C C C G G G … 3

3 … G G G C C C … 5

SmaI

Extremos complementarios de ADN

Extremos escalonados o cohesivos de una molécula de ADN que son producidos por una enzima de restricción, y que presentan afinidad específica entre sí.

Fenotipado:

Definir el fenotipo de un organismo

Fenotipo:

Apariencia externa de un organismo; características visibles de un organismo debidas a la interacción de su genotipo y el medio ambiente.

Cámara en la que se puede realizar el cultivo de plantas en condiciones ambientales (luz, Tª y humedad) estrictamente controladas.

El crecimiento de plantas en un fitotrón minimiza el impacto de las variaciones ambientales en el crecimiento de las plantas, reduce la incidencia de contaminaciones por patógenos o plagas, y permite unas condiciones de confinamiento ideales para el crecimiento de plantas en fase de experimentación.

Fitotrón

Duración de la luz del día o período de iluminación diaria que se suministra durante el crecimiento de las plantas.

La duración de los periodos de iluminación o de oscuridad regula actividades de las plantas asociadas al crecimiento, desarrollo, formación de órganos de reserva, floración y letargo.

Las plantas se clasifican según su respuesta fotoperiódica en:• Plantas de día corto: aquellas que florecen con periodos de luz inferiores a un cierto

valor crítico.• Plantas de día largo: aquellas que florecen con periodos de luz superiores a un cierto

valor crítico.• Plantas neutras: aquellas que florecen con independencia del fotoperiodo.

Fotoperiodo

Gel de agarosa

Matriz semisólida formada por polímeros derivados de carbohidratos que se utiliza como soporte para la separación mediante electroforesis de fragmentos de ácidos nucleicos o proteínas. La agarosa es un compuesto soluble en agua a temperaturas superiores a los 60ºC y solidifica posteriormente por debajo de los 45ºC.

GenUn gen es una secuencia ordenada de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN en el caso de algunos virus), que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular, que puede ser una proteína (a partir de ARN mensajero), ARN ribosómico o ARN de transferencia.

El gen es considerado como la unidad de almacenamiento de información genética y unidad de herencia al transmitir esa información a la descendencia. El conjunto de genes de una especie se denomina genoma.

Genoma

Material genético correspondiente a la dotación cromosómica completa de una especie.

Hospedador

Organismo que alberga a otro organismo o a un vector de clonación.

Inocular:

Introducir un patógeno o sus partes en una planta huésped o un órgano de la planta.

Inóculo:

Un patógeno o sus partes capaces que pueden causar infección cuando son transferidos a un sitio favorable.

Ligación y clonajeProceso de Ligación.- Se inserta o “pega” el gen (fragmento obtenido en la PCR dentro del vector (normalmente un plásmido) el gen se inserta en un cassete de secuencia conocida que generalmente, concede resistencia a un antibiótico . (enzima ligasa)

Tras el proceso de polimerización ó amplificación la ligasa establece puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias formando enlaces covalentes entre las mismas. Los extremos de ADN podrán ser romos ó cohesivos.

Reacción de ligación: Contiene la enzima de ligación (ligasa), el tampón adecuado para la actividad enzimática, el ADN plasmídico obtenido mediante midiprep y el inserto amplificado por PCR. La relación de cantidades entre ADN plasmídico e inserto en la reacción depende de sus tamaños. La reacción suele llevarse a cabo durante una noche en un baño a 16ºC de temperatura.

Medidor de pH (también denominado pH-metro)

Instrumento para medir la acidez o basicidad de una solución acuosa. El pH-metro típico consta de una sonda sensor o electrodo conectado a un medidor electrónico que procesa y muestra la lectura de pH.

La mayoría de las sondas de pH se fabrican en vidrio. El diseño de la sonda se basa en un tubo hueco a modo de celda en cuyo interior hay un electrodo inmerso en una solución tampón referencia (0.1 mol/L KCl a pH 7). La parte exterior de la sonda también llamada bulbo esta hecha en un sílice poroso muy fino (SiO2) donde se aloja un segundo electrodo expuesto a la solución a valorar. Cuando los dos electrodos están conectados con un medidor de pH, la diferencia de voltaje se amplifica permitiendo la lectura el pH de la muestra.

La precisión de un pH-metro depende en gran medida de la calibración previa al uso, es por ello que se recomienda que se calibre diariamente usando al menos tres soluciones tampón de referencia (pH 4, pH 7 y pH 10 suelen ser los recomendados). El proceso de calibrado corrobora el voltaje producido por la sonda (aproximadamente 0.06 voltios por unidad pH) con la escala pH de la solución tampón standard.

Medio de cultivo

Son soluciones estériles con todos los nutrientes necesarios para cultivar microorganismos en el laboratorio. A menudo los medios están tamponados para que el pH sea el óptimo.

Lo medios de cultivos se clasifican según su composición en:-medios de cultivo definido- se conoce la composición exacta de todos su nutrientes.-medios de cultivo complejos- incluye en su composición un hidrolizado del que se desconoce su composición química exacta como peptonas (hidrolizado de carne), extracto de levaduras…etc.

Además se pueden diseñar medios de cultivos específicos para seleccionar o enriquecer un microorganismo concreto.

Es un medio que promueve la desdiferenciación es decir, la pérdida de las característicasde especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático.Los medios de inducción de callo se encontrarían dentro de este tipo de medios.

Medio de des-diferenciación de células

Medio de inducción de callo

Medio que se emplea para la inducción de la formación de callos a partir de explantes.Se trata de un medio nutritivo al que además se añaden citoquininas y auxinas, comoreguladores del crecimiento, con el fin de promover la división celular y obtener célulascon elevada capacidad regenerativa.

Micropropagación es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente de forma rápida, eficiente y en grandes cantidades.

La micropropagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas idénticas a una planta madre, que puede haber sido obtenida por transformación, mutagénesis o mejora genética. La micropropagacion se utiliza también para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.

En la micropropagación, a partir de un fragmento (explanto) de una planta seleccionada (llamada planta madre), se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. El explanto más usado para los procesos de propagación in vitro son las yemas vegetativas de las plantas.

Dentro del proceso de micropropagación se pueden diferenciar varias fases o etapas:1. Preparación de la planta madre.2. Desinfección de explantos.3. Cultivo in vitro del material seleccionado.4. Multiplicación de brotes 5. Enraizamiento 6. Aclimatación

Micropropagación

Miniprep

Consiste en el proceso de extracción y purificación de ADN plasmídico (plásmido). Muchos métodos han sido desarrollados para purificar los plásmidos de bacterias, pero en todos ellos se pueden diferenciar tres pasos comunes:

1.- Crecimiento en medio selectivo (p. ej.: en presencia del antibiótico adecuado) del cultivo bacteriano. Las condiciones de crecimiento pueden variar dependiendo de la capacidad de replicación del plásmido.

2.- Concentración y lisado de las bacterias. Las bacterias son recogidas y concentradas por centrifugación. Para poder lisarlas se usan múltiples métodos, incluyendo tratamientos con detergentes, disolventes orgánicos, choque osmótico o térmico.

3.- Purificación del plásmido. Son muy variados los métodos empleados en el laboratorio. Lo que se pretende es poder obtener una gran cantidad de alta calidad de la estructura intacta del plásmido.

Patógeno

Que produce enfermedad, del griego πάθος (pathos), "enfermedad“, y γενής (genēs) , "productor de". Es un agente infeccioso que produce un daño, la enfermedad, en el huésped (planta o animal).

PCR

Reacción en cadena de la polimerasa: Método para amplificar in vitro un segmento específico de ADN que utiliza dos cebadores que hibridan en los dos extremos del segmento con polaridad opuesta, y que sirven como punto de inicio para la replicación exponencial mediante ciclos sucesivos de la secuencia que se encuentra entre ellos.

http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

pHForma de expresar la acidez y basicidad de disoluciones acuosas. Se define como el logaritmo negativo de la concentración (moles/L) de ion H+ (H3O+):

• pH=log1/H3O+ o pH=-log[H3O+]

El agua destilada presenta un pH 7 o neutro a 25ºC. Soluciones con pH menores de 7 se denominan ácidas, y soluciones con pH mayores a 7 se denominan básicas.

Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y más diversas, realizando una enorme cantidad de funciones diferentes.Las proteínas de todos los seres vivos están determinadas mayoritariamente por su genética (con excepción de algunos péptidos antimicrobianos de síntesis no ribosomal).

Las proteínas son largas cadenas de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos entre el grupo carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminoácido adyacentes. La secuencia de aminoácidos en una proteína está codificada en su gen mediante el código genético. Los residuos en una proteína sufren a veces modificaciones químicas en la modificación postraduccional: antes de que la proteína sea funcional en la célula, o como parte de mecanismos de control. Las proteínas pueden también asociarse para formar complejos proteicos estables.Las proteínas se sintetizan dependiendo de cómo se encuentren regulados los genes que las codifican. Por lo tanto, son susceptibles a señales o factores externos. El conjunto de las proteínas expresadas en una circunstancia determinada es denominado proteoma.

Proteína

Regulación transcripcional de un gen

Las células necesitan regular los tipos y cantidades de macromoléculas que generan, el primer nivel de regulación es en la expresión génica, es decir el control de la transcripción o la cantidad de ARNm que se produce de ciertos genes.

Hay proteínas y moléculas que siempre son necesarias en la célula (expresión constitutiva) sin embargo, la mayoría sólo se requieren en momentos puntuales de su desarrollo.

El control de la transcripción se hace a través de proteínas que se unen al DNA. El control negativo se hace a través de proteínas represoras que impiden la unión de la RNA-polimerasa. Por el contrario, el control positivo lo llevarán a cabo proteínas que se unen al DNA y activan la transcripción

Resistente (frente a patógenos)

Es el organismo que expresa resistencia, que es capaz de evitar o reducir el ataque de agentes infecciosos causantes de enfermedad. En contraposición con el organismo susceptible, el resistente presenta menor acumulación del patógeno en su organismo que se manifiesta con frecuencia en una apariencia sana sin síntomas de enfermedad. Así mismo, el término tolerante describe al organismo que muestra una apariencia normal o con menores síntomas de enfermedad, aún presentando una acumulación elevada del patógeno.

La resistencia puede deberse a la existencia de barreras preexistentes o a mecanismos inducibles. Entre los mecanismos inducibles se distinguen:

•Defensa inducible por PAMPS (PTI, PAMP triggered immunity), debido al reconocimiento por parte de un receptor presente en la membrana del hospedador de un patrón molecular asociado al patógeneno (PAMP).•Defensa inducible por efectores (ETI, effector triggered immunity), debido al reconocimiento por parte de una proteína de resistencia del hospedador de un efector, una factor producido por el patógeno para alterar el metabolismo de la célula hospedadora.

Síntomas de enfermedad

Los síntomas de la enfermedad son el conjunto de manifestaciones externas o internas delhuésped diferentes del estado normal que están asociadas generalmente al desarrollo deuna enfermedad.

La palabra síntoma proviene del griego σύμπτωμα, "accidente, infortunio, aquello queocurre”.Suelen ser característicos de cada tipo de agente patógeno. Se utilizan con frecuencia parala identificación del agente responsable de la enfermedad <1 >. Tienen la contrapartida deque la percepción de un síntoma es frecuentemente es subjetiva y difícilmente mesurable.

Ejemplos de síntomas asociados a enfermedades de plantas son:

Clorosis o amarilleamiento de partes de la planta por destrucción de la clorofilaMarchitez o falta de frescura y/o inclinación de las hojas por carencia de agua.Necrosis o muerte del tejido de la plantaPodredumbre o destrucción húmeda del tejido vegetal

<1> http://extension.oregonstate.edu/catalog/pdf/ec/ec1562-s-e.pdf

Susceptible (frente a patógenos).

Es el organismo que está en riesgo de ser infectado por un agente infeccioso. En contraposición con el organismo resistente, el susceptible cuando es infectado presenta una mayor acumulación del patógeno en su organismo, que se manifiesta habitualmente con la presencia de unos síntomas asociados a la enfermedad.

La susceptibilidad puede ser debida a que el hospedador no dispone de barreras o mecanismos de resistencia contra el agente patógeno o a que el agente patógeno produce una serie de factores (efectores) que alteran el metabolismo de la célula hospedadora suprimiendo la resistencia.

Tampón

Solución que previene el cambio de pH tras la adición de pequeñas cantidades de ácidos o bases. Está compuesto por un ácido débil y su correspondiente sal con una base fuerte, o por una base débil y su correspondiente sal con un ácido fuerte.

Traducción genética

La traducción es el segundo proceso de la síntesis proteica (el primer proceso es la expresión génica). La traducción ocurre en el citoplasma de la célula, donde se encuentran los ribosomas. Los ribosomas están formados por una subunidad pequeña y una grande que rodean al ARNm. En la traducción, el ARN mensajero se decodifica para producir un polipéptido específico de acuerdo con las reglas especificadas por el código genético. Es el proceso que convierte una secuencia de ARNm en una cadena de aminoácidos para formar una proteína. Es necesario que la traducción venga precedida de un proceso de transcripción. El proceso de traducción tiene cuatro fases: activación, iniciación, elongación y terminación (entre todos describen el crecimiento de la cadena de aminoácidos, o polipéptido, que es el producto de la traducción).

Programas on-line para la traducción de secuencias:

http://web.expasy.org/translate/

La transformación refiere a un cambio genético estable producido al transferir ADN exógeno a una célula.

Un cierto número de mecanismos están disponibles para transferir ADN a células vegetales:1. La transformación mediada por Agrobacterium, es la más simple transformación vegetal. El tejido vegetal (generalmente hojas) es cortado en pequeños pedazos, ej. 10x10 mm, y sumergidos por 10 minutos en una solución que contiene Agrobacterium. Algunas células adyacentes al corte serán transformadas por la bacteria, que transfiere su ADN a la célula. Estas células son regeneradas in vitro en medio selectivo. Algunas especies pueden ser transformadas tan sólo al sumergir las flores en la suspensión de Agrobacterium, y luego sembrar las semillas en un medio selectivo. 2. Biobalística: Pequeñas partículas de oro o tungsteno cubiertas de ADN, que se disparan a células vegetales jóvenes o embriones vegetales. La eficiencia de transformación es más baja que utilizando Agrobacterium, pero la mayoría de las plantas pueden ser transformadas con este método. 3. Electroporación: Crea agujeros momentáneos en la membrana celular utilizando golpes eléctricos, lo que permite que el ADN entre a la célula.

Transformación