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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
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Tesis Doctoral
Prospección biotecnológica deProspección biotecnológica decultivos de Euglena graciliscultivos de Euglena gracilis
(Euglenozoa)(Euglenozoa)
Tolivia, Analía Alejandra
2014
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:
Tolivia, Analía Alejandra. (2014). Prospección biotecnológica de cultivos de Euglena gracilis(Euglenozoa). Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Tolivia, Analía Alejandra. "Prospección biotecnológica de cultivos de Euglena gracilis(Euglenozoa)". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2014.
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental
Prospección biotecnológica de cultivos de Euglena gracilis (Euglenozoa)
Tesis presentada para optar al título de Doctora de la Universidad de Buenos Aires en el
área CIENCIAS BIOLOGICAS
Analía Alejandra Tolivia Directoras de tesis: Dra. Visitación Conforti
Dra. María del Carmen Ríos de Molina Consejero de Estudios: Dra. Visitación Conforti Buenos Aires, 2014.
Prospección biotecnológica de cultivos de Euglena gracilis (Euglenozoa)
En este estudio, extractos libres de paramilon, de dos cepas de Euglena gracilis (Klebs), se sometieron a un cribado químico para detectar metabolitos secundarios. Ambas cepas fueron estudiadas en sus formas fotosintéticas y blanqueadas, en sus fases de crecimiento exponencial y estacionaria. Se realizaron análisis cromatográficos y se estudiaron sus capacidades bioactivas mediante ensayos primarios. Se detectó así la presencia de esteroides, cardenólidos, triterpenos, taninos y flavonoides. En correlación con la presencia de polifenoles, los extractos polares mostraron actividad antioxidante frente al radical estable DPPH� e inhibición de crecimiento in vitro, incluso en ausencia de paramilon, sustancia con propiedades antioxidantes y antitumorales.
También se evaluó la producción de paramilon resultando las cepas blanqueadas cultivadas en medio mineral con exceso de acetato las más eficientes. Por derivatización de este polisacárido se obtuvo un producto con propiedades antivirales frente al Herpes virus tipo I, y su inclusión en la dieta de Cherax quadricarinatus, especie de importancia comercial, tuvo un efecto protector e inmunoestimulante de los efectores humorales sin afectar su crecimiento.
Finalmente, dado que estas microalgas poseen una película formada por bandas superpuestas que se asemeja a una red de difracción, se investigó desde el punto de vista electromagnético el papel que esta estructura desempeña en la protección frente a la radiación UV. Aplicando el método de Chandezón para resolver el problema de difracción de una red iluminada por una onda plana, se calculó la reflectancia de esta estructura, mostrando que el patrón periódico exhibido por la película podría proporcionar un método de protección frente a los rayos UV.
Palabras claves: Euglena gracilis, metabolitos bioactivos, paramilon, actividad antiviral, inmunoesimulante, respuesta electromagnética de la película.
Prospective biotechnological applications of Euglena gracilis (Euglenozoa) cultures
In this study, Euglena gracilis (Klebs) extracts from two strains were screened for the identification of secondary metabolites. Both strains were studied in their photosynthetic and bleached forms, on their exponential and stationary growth phases. Chromatographic analyses were performed and bioactive capabilities were studied using primary assays. Steroids, cardenolids, triterpenes, tannins, and flavonoids were found. In agreement with the presence of polyphenols, the polar fractions showed antioxidant activity against DPPH� and growth inhibition activity in vitro even in the absence of paramylon, which has been previously reported to have antioxidant and antitumoral properties.
The bleached strain grown in mineral medium with an excess of acetate was the most efficient at paramylon production. By derivatization of this polysaccharide, a product was obtained with antiviral properties against herpes virus type I. Its inclusion in the diet of Cherax quadricarinatus, a commercially important species, had a protective and immunostimulant effect of the humoral effectors without affecting their growth.
Finally, since these microalgae are covered by a typical surface pellicle formed by overlapping bands which resemble a diffraction grating, we investigated from an electromagnetic point of view the role this pellicle might play in the protection against UV radiation. The reflectance of the structure, calculated by applying the C‐method to solve the diffraction problem of a grating illuminated by a plane wave, showed that the periodic pattern exhibited by the pellicle has the potential to provide protection against UV damage.
Key words: Euglena gracilis, bioactive metabolites, paramylon, antiviral activity, immunostimulant, electromagnetic response of the pellicle.
AGRADECIMIENTOS
A la Agencia de Promoción Científica y Tecnológica, al CONICET y a la UBA, por su
financiamiento.
Al departamento de Biodiversidad y Biología Experimental y al departamento de
Química Biológica de la FCEN‐UBA, por permitirme usar instalaciones y equipamiento.
A mis directoras, Dras. Visitación Conforti y María del Carmen Ríos de Molina, por
abrirme sus puertas, por las oportunidades brindadas, por su apoyo, confianza y guía
constante, y por su compromiso con este trabajo, que no habría sido sin ellas.
A mis maestros, Ángela Juárez, Cecilia Rodríguez, Josefina Albergina, Carlos Velez, María
Teresa Wenzel y Nora Maidana, por haber compartido oportunamente sus saberes
conmigo.
A mis compañeros de laboratorio, Cristian Solari, Laura Ruiz, Paula Nannavecchia,
Vanina Galzenati, Maria Luz Padules, Jaun Pablo Basualdo, y Benjamín Basanta (que se
fue lejos), por su apoyo, sus infinitas colaboraciones, y por hacerme reír todos los días.
A la Dra. Iara Rocchetta, por su generosa ayuda, por sus consejos, por compartir su
conocimiento desinteresadamente y asesorarme aún en la distancia.
A las Dras. Julia Pettinari y Nancy López, por las cepas bacterianas.
A la gente de QB81, Dr. Sebastián Sabatini, Dra. Gabriela Chaufan, Lic. Mercedes Iumato,
Lic. Marisol Yusseppone, Lic. Anabella Fassiano, y Lic. Isis Coalova, por su buena
predisposición y ayuda, por hacerme sentir parte del grupo, y por los mates.
A los que de generosamente colaboraron con este trabajo: Dr. Daniel Medesani, Dra.
Verónica Viau, Dra. Cecilia Carmarán, Dra. Diana Skigin, Dra. Marina Inchaussandague,
Dra. Viviana Castilla, Dra. María Cecilia Rodríguez, Isabel Fuertes Vila, Dra. María Luján
Flores y Dr. Osvaldo Córdoba.
A mis compañeros del Colegio de la Ciudad, por mostrarme otras realidades y
enseñarme algo nuevo cada día.
A mis amigas, Cecilia y Marcia Lamela, María Laura Carrevedo, Verónica Viau, Silvina
Rosa, María Solange Vera, Daniela Echazú, Renata Menéndez, Liliana y Analía Martínez,
Laura Carignano, Natalia Benítez, Marina Carpano y Stella Molteni, por acompañarme
siempre en los caminos fáciles y en los difíciles.
A María, Carlos, Facu, Guada, Lucas, Luz, Carly, Laura, Juanita, Román, Marce, Juanita
(bis), Belén, Aída y Juana, por dejarme ser una más de ustedes.
A mi familia; Marta, Mario y Fer, por su apoyo constante e incondicional.
A Martín, por ser mi compañero, por hacer mi vida más linda y por planear conmigo el
futuro.
i
ÍNDICE
Abreviaturas utilizadas en el texto
Capitulo 1‐ Introducción general 1
Capitulo 2‐ Estudio farmacognóstico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Sección I‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Introducción 11
Objetivos e Hipótesis de trabajo 25
Materiales y Métodos 29
Resultados y Discusión 43
Conclusiones 69
Sección II‐Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Introducción 75
Objetivos e Hipótesis de trabajo 83
Materiales y Métodos 87
Resultados y Discusión 95
Conclusiones 111
Capítulo 3‐ Estudios sobre la producción y potencial bioactivo del paramilon obtenido de Euglena gracilis
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de Euglena gracilis y obtención de un derivado
Introducción 119
Objetivos e Hipótesis de trabajo 129
Materiales y Métodos 133
ii
Resultados y Discusión 143
Conclusiones 157
Sección II‐ Actividad Antiviral frente al virus Herpes simplex tipo 1
Introducción 163
Objetivos e Hipótesis de trabajo 175
Materiales y Métodos 179
Resultados y Discusión 187
Conclusiones 201
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
Introducción 207
Objetivos e Hipótesis de trabajo 223
Materiales y Métodos 227
Resultados y Discusión 241
Conclusiones 251
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis
Introducción 257
Objetivos e Hipótesis de trabajo 269
Materiales y Métodos 273
Resultados y Discusión 281
Conclusión 291
Capítulo 5‐ Conclusiones 295
Bibliografía
iii
Abreviaturas utilizadas en el texto:
ABAP‐ 2,2'‐azobis 2 dihidrocloruro metilpropionamidina
AG‐P‐ acilguanosina monofosfato
AMF‐ Microscopio de Fuerza atómica
BAW‐ fase móvil formada por n‐butanol:ácido acético:agua (4:1:5)
BBOT‐ bis(5‐tert‐butil‐2‐benzoxazolil)tiofeno
BUE‐ medio Buetow
βGBPs‐ porteínas de unión a β ‐glucanos
CC20‐ concentración citotóxica 20
CC50‐ concentración citotóxica 50
CE50‐ concentración efectiva 50
CEDFINI‐ ciclohexanona‐2,4‐dinitrofenilhidrazona
C&M‐ medio Cramer & Mayers
DCC‐ diciclohexilcarbamida
DCF‐ diclorofluoresceína
DCM‐ diclorometano
DMF‐ dimetiformamida
DMSO‐ dimetilsulfóxido
DOX‐ 1‐desoxi‐D‐xilulosa
DO600‐ densidad óptica medida a 600 nm
DPPH�‐ 1,1‐difenil‐2‐picril hidrazilo
dSRCI‐ receptor scavenger de Drosophila
EBV‐ virus de Epstein‐Barr
EGM ‐ Euglena gracilis medium
EROS‐ especies reactivas de oxígeno
vi
EtOAc‐ Acetato de etilo
EtOH‐ etanol
f‐ cepa fotosintética
Fexp‐ fase de crecimiento exponencial
Fest‐ fase de crecimiento estacionaria
Forestal‐ fase móvil formada por ácido acético:ácido clorhídrico:agua (30:3:10)
GC‐ células granulosas
GNBPs‐ proteínas de unión gram‐negativas
GPI‐ glicosilfosfatidilinositol
h‐ cepa heterotrófica
HC‐ células hialinas
HIV‐ virus de la inmunodeficiencia humana
HSPG‐ proteoglicanos heparán sulfato
HSV‐ virus herpes simplex
HSV‐1‐ herpes virus tipo 1
HSV‐2‐ herpes virus tipo 2
H2DCF‐DA‐ 2',7' diacetato de diclorofluoresceína
IAA‐ indol‐3‐acético
ICL‐ isocitrato liasa
IPP‐ isopirenoide
IS‐ índice de selectividad
LAT‐ latencia
L‐DOPA‐ L‐3,4 dihidroxifenilalanina
LGBP‐ proteínas de unión a lipopolisacáridos
LPS‐ lipopolisacáridos
MAT‐ cepa Matanza
v
MC‐ medio de crecimiento
MEM‐ medio mínimo esencial de Eagle
MEP‐ metileritritolfosfato
MeOH‐ metanol
m.i.‐ multiplicidad de infección
MM‐ medio de mantenimiento
MS‐ malato sintasa
MTT‐ bromuro de 3‐[4,5‐dimetilthiazol‐2yl]‐2,5‐difeniltetrazoilio
MVA‐ ácido mavelónico
PAMPs‐ patrones moleculares asociados a patógenos
PG‐ peptidoglicanos
PGRPs‐ proteínas receptoras de peptidoglicano
PMSF‐ fluoruro de fenilmetilsulfonilo
PO‐ fenoloxidasa
PRPs‐ proteínas de reconocimiento de patrones
proPO‐ sistema profenoloxidasa
RA‐ Resistente a aciclovir
RP‐HPLC‐DAD‐ cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa con arreglo de diodos
SAB‐ sero albúmina bovina
SC50‐ capacidad atrapante del 50% de radicales DPPH�
SDS‐ dodecilsulfato de sodio
SDS‐ PAGE‐ Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio
SGC‐ célula semigranulosas
SHL‐ sobrenadantes de homogenatos de hemocitos
SIDA‐ síndrome de inmunodeficiencia humana
vi
TGN‐ región trans de Golgi
TK‐ timidin quinasa
TLC‐ cromatografía en capa delgada
UF‐ unidades de fluorescencia
UFP‐ unidades formadoras de placas
UTEX‐ cepa UTEX 753
VZV‐ virus varicela‐zoster
CAPITULOI Introducción general
Capítulo 1: Introducción General ‐ 3 ‐
La producción de biomasa es, probablemente, la mejor alternativa viable frente
a los recursos fósiles para la producción de combustibles y productos químicos. En los
últimos años, el interés en la biomasa obtenida a partir de microalgas ha crecido tanto
en el campo de la investigación básica como aplicada. En cuanto a sus aplicaciones,
éstas van desde la producción de biomasa simple para alimento, hasta la obtención de
productos de alto valor, aunque para la mayoría de ellas el mercado aún está en
desarrollo. Actualmente se busca convertir la biomasa microalgal en productos
químicos de valor agregado y biocombustibles, en biorrefinerías que utilizan diferentes
tecnologías (Uggetti et al., 2014). Teniendo en cuenta la enorme biodiversidad de las
microalgas y el desarrollo de la ingeniería genética, este grupo de organismos
representa una de las fuentes más prometedoras de nuevos productos. Ellas presentan
características únicas, constituyendo un valioso material de estudio para alcanzar un
mayor conocimiento de la diversidad microalgal, a fin de contribuir a preservar el
recurso ficológico y posibilitar una explotación racional.
Los euglenoideos, en particular, son organismos flagelados y poseen por debajo
de la membrana plasmática una estructura proteica denominada película, a menudo
muy flexible, lo que permite que algunas especies presenten lo que se conoce como
movimiento metabólico. Todos ellos son unicelulares, de vida libre, con la excepción
de un único grupo que vive arraigado, el género Colacium. Una particularidad de los
euglenoideos es que pueden presentar desde un metabolismo exclusivamente
autotrófico hasta un metabolismo exclusivamente heterotrófico (quimiorganotrofos a
predadores), pasando por organismos que presentan una combinación de tipos
metabólicos (mixotrofos). Esta diversidad metabólica y morfoestructural, también se
manifiesta en su diversidad ecológica y distribución en la biósfera (Huber‐Pestalozzi,
1955; Tell y Conforti, 1986).
La mayoría de los euglenoideos requieren medios de crecimiento complejos y
son difíciles de cultivar en condiciones axénicas, por lo que si bien se conocen
diferentes aspectos de su biología, poco se sabe sobre su fisiología y requerimientos
ecológicos, como para poder caracterizarlos desde el punto de vista de la producción
de metabolitos y su posible utilidad. Una excepción es Euglena gracilis (figura 1), que
puede cultivarse en medio mineral con éxito y se ha utilizado en cultivos a gran escala
‐ 4 ‐ Capítulo 1: Introducción General
(Siegelman y Guillard, 1971, Friday et al., 2010), dado que puede mantenerse en un
ambiente controlado. Por esta razón, es el euglenoideo más usado en investigaciones
fisiológicas.
Figura 1: Fotografías de Euglena gracilis Klebs. Disponibles en http://botany.natur.cuni.cz
Euglena gracilis presenta cloroplastos particularmente sensibles a diversos
agentes químicos y factores físicos. Estos pueden inducir su pérdida irreversible junto
con el material genético que en ellos se encuentra, en un proceso llamado
blanqueamiento (Mego, 1968; Schiff y Epstein, 1968; Gillham, 1978; Ebringer, 1978;
Kempner, 1982; Ebringer y Krajčovič 1986). Este proceso se manifiesta por la pérdida
permanente de la capacidad de las células para formar cultivos o colonias de color
verde. Los llamados mutantes blanqueados carecen de clorofila y protoclorofila
fototransformable en cantidades detectables con los métodos tradicionales (Parthier y
Neumann, 1977; Bingham y Schiff, 1979; Osafune y Schiff, 1980, 1983). Algunas cepas
mutantes blanqueadas contienen carotenoides mientras que otras carecen de ellos,
hecho indicativo de las variaciones fenotípicas encontradas entre las cepas
blanqueadas (Parthier y Neumann, 1977; Bingham y Schiff, 1979; Fong y Schiff, 1979).
Además de los fármacos antibacterianos como la estreptomicina (Provasoli, 1948), hay
un amplio grupo de sustancias químicas que también son capaces de blanquear
irreversiblemente a E. gracilis por lo que, desde un punto de vista biotecnológico, se
Capítulo 1: Introducción General ‐ 5 ‐
trata de una especie interesante ya que presentan una serie de vías metabólicas únicas
(Ragan y Chapman, 1978).
Se conocen algunas aplicaciones para esta especie. Ha sido probada como
alimento en aves de corral (Mokady et al., 1980), indicando que puede reemplazar
exitosamente en un 25% las proteínas de soja utilizadas en este tipo de dietas. Se ha
testeado para la producción de biocombustibles acoplado al tratamiento de aguas
residuales (Mahapatra et al., 2013), se ha utilizado como sustrato para producir biogas
renovable (Mussgnug et al., 2010) y para remover el CO2 generado en centrales
eléctricas (Apel et al., 1994), lo que sugiere que es una especie interesante desde el
punto de vista de la biorremediación. En ella se ha logrado la síntesis intracelular de
nanopartículas de ferrihidrita, un material híbrido con un comportamiento
superparamagnético (Brayner et al., 2012); esta síntesis de partículas inorgánicas es
una ruta atractiva para obtener coloides funcionales de forma ambientalmente
amigable y con grandes implicancias, dado que además, posibilita la obtención de
células vivas magnéticas con aplicaciones en detección y terapia (Mandal et al., 2006).
Si bien no se le atribuyen propiedades medicinales a E. gracilis, se sabe que son
productoras de varias moléculas de importancia como vitaminas C y E (Takeyama et
al., 1997; Ogbona et al., 1998; 1999; Fujita et al., 2008), ácidos grasos poliinsaturados
(Barsanti et al., 2000), β –carotenos (Takeyama et al., 1997) y paramilon (un β‐1,3
glucano con propiedades inmunomoduladoras) (Fruehauf et al., 1983; Sugawara et al.,
1984; Skov et al., 2012).
Sobre la base de estos conocimientos previos y teniendo en cuenta la
versatilidad metabólica de E. gracilis, se decidió realizar esta investigación con la
finalidad de poder estudiar a esta especie como potencial productora de metabolitos
de interés y como fuente de bioinspiración. Para el desarrollo de este trabajo se
utilizaron dos cepas de E. gracilis. Una cepa nativa proveniente de un río altamente
contaminado del conurbano bonaerense (Río Matanza, Bs. As.), llamada cepa MAT y
otra proveniente del Centro de Cultivo Algal de la Universidad de Texas (USA), llamada
cepa UTEX 753. Ambas cepas fueron cultivadas en condiciones autotróficas y
heterotróficas, para comparar no sólo la cepa nativa con la proveniente del cepario
sino también para estudiar la influencia de las distintas condiciones de cultivo en la
‐ 6 ‐ Capítulo 1: Introducción General
producción de biomasa, paramilon (su polisacárido de reserva) y metabolitos
secundarios. Para complementar estos análisis se llevaron a cabo estudios sobre
bioactividad de diferentes extractos obtenidos de su biomasa y del paramilon aislado.
Además se realizaron observaciones ultraestructurales como complemento de los
estudios mencionados anteriormente y se utilizaron para analizar el perfil de la película
de E. gracilis y otros dos euglenoideos (P. trichophorum y M. megalopsis) con el fin de
predecir la respuesta de esa estructura ante la luz UV. Esto último tiene un particular
interés dado el potencial desarrollo de nuevas superficies con el fin de fabricar
estructuras similares a las halladas en la naturaleza con un objetivo específico.
CAPITULOIIEstudio farmacognóstico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
SecciónICribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 11 ‐
1. INTRODUCCIÓN
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 12 ‐
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 13 ‐
1.1 Los productos naturales
Se define como metabolismo al conjunto de reacciones químicas que tienen
lugar en un organismo. En aquellos que son fotosintéticos, la mayor parte del carbono,
y del nitrógeno con el aporte energético de la luz constituyen moléculas comunes a
todas las células, que son esenciales para su funcionamiento. A este tipo de
compuestos se los denomina metabolitos primarios ya que tienen una función
metabólica directa, son intermediarios esenciales en las vías catabólicas y anabólicas y
se encuentran en todas las células. Sin embargo, no todas las moléculas sintetizadas
por las células son metabolitos primarios. Los compuestos obtenidos a partir de
fuentes naturales, pueden ser agrupados en tres grupos (tabla 1):
1) los resultantes del metabolismo primario, también llamados principios inmediatos
por estar definidos por la fotosíntesis, la respiración y la síntesis proteica;
2) los resultantes del metabolismo intermedio, producidos directamente por los ciclos
metabólicos primarios;
3) los obtenidos como producto de un metabolismo secundario específico, los cuales
tienen distribución restringida y una función específica.
Numerosos productos químicos provenientes de fuentes naturales están
asociados con beneficios para la salud y son conocidos desde hace mucho tiempo
(Rouhi, 2003). Si bien muchos de ellos se clasifican como metabolitos secundarios
(también denominados productos naturales) esta terminología indica, a menudo
incorrectamente, que ellos no son esenciales para el crecimiento normal, el desarrollo
o la reproducción del organismo que los produce. Estos productos no presentan una
función definida en los procesos fotosintéticos, respiratorios, de asimilación de
nutrientes, de transporte o de síntesis. Además, muchos de ellos presentan una
distribución restringida, es decir, se sintetizan en pequeñas cantidades, no de forma
generalizada y en general por un determinado grupo taxonómico.
Hasta hace poco la principal fuente de medicamentos comerciales han sido los
productos naturales o bien sus fabricantes se han inspirado en ellos. Sin embargo, a
partir de la década de los 90, el descubrimiento de fármacos a partir de fuentes
naturales fue prácticamente eliminado de la industria farmacéutica. Este hecho se
basó principalmente en las nuevas propuestas del entonces emergente campo de la
química combinatoria (Cseke et al., 2004), donde bibliotecas enormes de pequeñas
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 14 ‐
moléculas diseñadas por el hombre podrían ser rápidamente sintetizadas y evaluadas
como posibles fármacos. Hasta el momento, este enfoque no ha dado los resultados
esperados. La gran mayoría de los compuestos combinatorios no se han convertido en
medicamentos aprobados, aunque algunos se encuentran en fase de ensayos clínicos.
Al mismo tiempo, el número de nuevos medicamentos que entran en el mercado se
han reducido y esto ha dado lugar a nuevas consideraciones sobre las estructuras
privilegiadas inherentes a los productos naturales (Desimone et al., 2004).
Productos del metabolismo Primario Intermedio Secundario
Carbohidratos Monosacáridos Glicósidos, Azúcares modificados, Ac. Urónicos, Heparina
Proteínas Aminoácidos Alcaloides, taninos, fenil propanos, cumarinas
Lípidos Ácidos grasos Policétidos, terpenos, esteroles, triterpenos Ácidos nucleicos Bases Tetrapirroles, alcaloides imperfectos
Tabla 1: Principales productos de los distintos tipos de metabolismo.
Un gran porcentaje de los principios bioactivos, comprendidos dentro de los
llamados metabolitos secundarios, han sido estudiados por su valor potencial y por sus
posibles aplicaciones como medicamentos, insecticidas, herbicidas, perfumes o
colorantes, entre otros. Sin embargo durante la última parte del siglo pasado ha
aumentado la atención sobre sus funciones biológicas y el rol ecológico que
desempeñan en la regulación entre organismos, en cuyo caso se los conoce como
compuestos alelopáticos. El metabolismo secundario tiene sus bases en moléculas
provenientes del metabolismo primario, por lo que su relación es inevitable (Bentley,
1999). La mayoría de los metabolitos secundarios derivan del acetil‐CoA, del ácido
shikimico o del ácido mevalónico que constituyen las tres principales rutas
biosintéticas (figura 1). El estudio de nuevos organismos como fuente de este tipo de
compuestos contribuye a su mejor aprovechamiento y se proponen como una
alternativa frente a los medicamentos de síntesis.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 15 ‐
Gliceraldehido 3-Fosfato Ruta del Metileritritol fosfato (MEP)
Figura 1: Principales rutas biosintéticas de metabolitos secundarios.
Dentro de los metabolitos secundarios, los principales grupos reconocidos son:
los compuestos terpénicos, los fenólicos y los nitrogenados, aunque no todos ellos se
ajustan a esta clasificación (por ejemplo las acetogeninas).
Compuestos terpénicos
Ellos forman una muy diversa familia de sustancias naturales producidas por
una gran variedad de organismos. Unos 30.000 terpenos han sido identificados
(Sacchetini y Poulter, 1997). La ruta biosintética de estos compuestos da lugar tanto a
metabolitos primarios como secundarios. Algunos terpenos son muy apreciados por
sus propiedades como aceites esenciales y su uso como fragancias data de más de dos
mil años (Turner, 1970). El grupo de los terpenos incluye hormonas (giberelinas y ácido
abscísico), pigmentos carotenoides (carotenos y xantofilas), esteroles (ergosterol,
colesterol), derivados de los esteroles (glicósidos cardíacos), látex y aceites esenciales.
Aunque las citoquininas y las clorofilas no pertenecen a este grupo, contienen en su
Terpenos CO2 Metabolismo Piruvato Ruta del ácido primario mevalónico Compuestos nitrogenados Acetil CoA Ruta del ácido Malónico Ciclo de Krebs Aminoácidos Alifáticos
s Fosfoenolpiruvato Aminoácido aromáticos Eritrosa-4-fosfato uta del ácido sikím R ico Compuestos
fenólicos
Gliceraldehido 3‐Fosfato Ruta del Metileritritol fosfato (MEP) Terpenos CO Metabolismo Piruvato Ruta del ácido 2
primario mevalónico Compuestos nitrogenados Acetil CoA Ruta del ácido Malónico Ciclo de Krebs Aminoácidos Alifáticos Fosfoenolpiruvato Aminoácidos aromáticos mpuestos Eritrosa‐4‐fosfato Ruta del ácido shikimico Co fenólicos
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 16 ‐
estructura una cadena lateral que es un terpeno. El término terpenoide hace
referencia a los terpenos modificados por oxidación o por reacomodamiento de su
esqueleto carbonado, como por ejemplo la vitamina A.
Afortunadamente, a pesar de su diversidad, los terpenos tienen una
característica simple y unificadora por la cual se definen y por la que se los puede
clasificar fácilmente. Todos ellos tienen unidades fundamentales (isopreno) de cinco
carbonos que se repiten (Croteau, 1998). Se definen como un grupo único de
productos basados en hidrocarburos naturales que poseen una estructura que deriva
hipotéticamente del isopreno, aunque éste nunca ha sido encontrado como producto
natural. La unidad isoprenoide, el isopentenil difosfato (IPP; Croteau y Loomis, 1975),
es producida por dos rutas biosintéticas diferentes. Se trata de una molécula de alta
capacidad reactiva que se polimeriza formando los distintos grupos de compuestos
terpénicos. La primera ruta biosintética es conocida como la ruta del MEP
(metileritritolfosfato) o vía DOX (1‐desoxi‐D‐xilulosa). En ella, el IPP se forma en el
cloroplasto, principalmente para los mono y diterpenos más volátiles. La segunda vía,
se conoce como la ruta del ácido mevalónico (MVA). Esta ocurre en el citoplasma y se
producen sesquiterpenos (Janses y De Groot, 2004). Los detalles de su biosínteis han
sido estudiados con anterioridad (Kuzuyama, 2002; Dubey et al., 2003; Eisenreich et
al., 2004). Un esquema simplificado de esta vía se muestra en la figura 2.
Figura 2: unidad isopirenoide (IPP) y biogenesis de los terpenos.
Terpenos
-P‐P
-P‐P
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 17 ‐
Los terpenos se clasifican por lo tanto según el número de unidades de cinco
carbonos (IPP) que contienen en:
C5: hemiterpenos
C10: monoterpenos (Aceites esenciales)
C15: sesquiterpenos (Acido abscísico)
C20: diterpenos (Giberelinas)
C30: triterpenos (Esteroides)
C40: tetraterpenos (Carotenoides)
Cn: politerpenos (Gomas y resinas)
La función de ellos en los organismos fotosintéticos, más precisamente en los
vegetales, se considera generalmente ecológica y fisiológica. Muchos inhiben el
crecimiento de otros vegetales disminuyendo así la competencia (alelopatía). Algunos
son conocidos por su acción insecticida, mientras que otros atraen a los insectos, por
ejemplo, polinizadores. Los ácidos abscísico y el giberélico, hormonas vegetales, son un
sesquiterpeno y un diterpeno respectivamente (Srivastava, 2002). Más de 130
giberelinas fueron identificadas, y nuevas estructuras terpénicas se siguen informando
en la actualidad (Silverstone y Sun, 2000; Al‐Jaberab et al., 2012; Ibrahim, 2012).
Desde el punto de vista de la aplicación farmacéutica, los principios activos más
interesantes de naturaleza terpénica son los monoterpenos y sesquiterpenos volátiles,
constituyentes de los aceites esenciales. En algas, por ejemplo, este tipo de sustancias
ha sido encontrada en el alga roja Laurencia obtusa (Topcu et al., 2003). Entre los 4
sesquiterpenos encontrados en esta especie, uno de ellos resultó tener actividad
frente a Plasmodium falciparum pudiendo considerarse como agente antimalárico.
También se hallaron en el alga Chlorodesmis fastigiata (Rasher et al., 2011) en la que
operan como potentes agentes alelopáticos.
Las giberelinas, reguladoras del crecimiento de las plantas, son un ejemplo de
diterpenos, en general tóxicos para los herbívoros.
Los triterpenos están formados por seis unidades de isopreno y son
biosintéticamente derivados del escualeno, una molécula de cadena lineal de 30 C de
la que todos los triterpenos cíclicos. Hay varios grupos importantes de estos
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 18 ‐
compuestos, incluyendo los triterpenos comunes, esteroides, saponinas, esteroles y
glucósidos cardíacos.
En el reino animal, los esteroides tienen gran importancia como hormonas,
coenzimas y provitaminas. En el reino vegetal prácticamente todos los esteroides se
encuentran hidroxilados en C‐3, se conocen como esteroles (fitosteroles) y su papel es
menos conocido. Hay evidencias de que algunos de los fitosteroles son eficaces contra
enfermedades cardiovasculares (Kris‐Etherton et al., 2002), probablemente porque
ellos colaboran en la disminución del colesterol en animales.
Entre los triterpenos se encuentran algunos esteroides en forma de glicósidos
con importantes funciones en medicina y en la industria. Entre estos se encuentran las
saponinas y los cardenólidos (glicósidos cardíacos). Las saponinas, ampliamente
distribuidas (Woitke et al., 1970) son glicósidos esteroidales o triterpénicos que tienen
la capacidad de romper las membranas de los glóbulos rojos y causar hemólisis. Tienen
la propiedad de hacer espuma con el agua, de ahí su nombre, y se pueden utilizar
como detergentes. Por otro lado, son tóxicos para peces y algunos poseen actividad
expectorante (Fenwick et al., 1990), bacteriostática (Bo et al., 2002), antiviral
(Utsunomiya et al., 1997) e inmunoestimulante (Naj et al., 2000).
Los cardenólidos son derivados del núcleo esteroideo general. Pertenecen a
este grupo los glicósidos cardíacos, sustancias que se emplean en casos de insuficiencia
cardiaca congestiva aumentando la fuerza de la contracción del corazón sin acrecentar
significativamente otros parámetros, que resultarían muy tóxicos en altas
concentraciones (Liu et al., 2010; Ho et al., 2011; Taheri et al., 2012). Su mecanismo de
acción generalmente implica la inhibición de las bombas de sodio‐potasio lo que
provoca múltiples efectos en la fisiología y patología cardíaca (Gheorghiade et al.,
2004).
Los carotenoides, estrechamente vinculados con el proceso de fotosíntesis,
pertenecen al grupo de los tetraterpenos y derivan generalmente del licopeno. Forman
dos grupos ampliamente distribuidos: carotenos y xantofilas. La ciclación en un
extremo da origen al γ‐caroteno y en ambos extremos al β‐caroteno, pigmento
prácticamente universal en los organismos fotosintéticos. Por tratarse de polienos,
variaciones en sus dobles enlaces dan lugar a numerosos isómeros, lo cual puede
proporcionar numerosos pigmentos responsables de diferentes colores, desde el
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 19 ‐
amarillo al rojo, necesarios en la fotosíntesis, donde actuarían protegiendo a los
organismos de la sobreoxidación catalizada por otros pigmentos que absorben la luz,
tales como las clorofilas.
Las gomas o resinas presentan moléculas de entre 1.500‐15.000 unidades
isoprenoides, los politerpenos. Ellos son pequeñas partículas que se encuentran
suspendidas en el látex, el cual solidifica al ponerse en contacto con el aire y constituye
un mecanismo de defensa frente a daños mecánicos.
Compuestos fenólicos.
Muchos organismos sintetizan una amplia variedad de metabolitos secundarios
que comparten la característica de poseer en su estructura varios grupos bencénicos
con sustituyentes hidroxilo. Estos reciben el nombre de compuestos fenólicos,
polifenoles o fenilpropanoides y todos ellos derivan del fenol, un anillo aromático con
un sustituyente hidroxilo. Desde el punto de vista de la estructura química, son un
grupo muy diverso que incluye desde moléculas sencillas, como los ácidos fenólicos,
hasta polímeros complejos, como los taninos.
Los colores vivos de muchos organismos fotosintéticos provienen generalmente
de tres fuentes: los tetrapirroles, principalmente la clorofila; los carotenos, de
naturaleza terpénica, como se mencionara anteriormente, y los compuestos
aromáticos. De estos últimos se conocen varios miles y continuamente se descubren
nuevas estructuras (Kawamura‐Konishi et al., 2012). En algunos casos, sus funciones
son bien conocidas, por ejemplo, las ligninas polifenólicas que son componentes
estructurales de paredes celulares. En otros casos, incluyendo los flavonoides, se han
propuesto una variedad de funciones, muchas de las cuales aún continúan en
investigación.
Los compuestos aromáticos se sintetizan por varias rutas biosintéticas. Estas
incluyen la vía del shikimato, que conduce por la síntesis de aminoácidos aromáticos
(fenilalanina, tirosina y triptófano), a los ácidos cinámicos y sus derivados (fenoles
sencillos, ácidos fenólicos y derivados, cumarinas, lignanos y derivados del
fenilpropano), la ruta de los poliacetatos que originan quinonas, xantona y orcinoles, y
las vías que generan los terpenoides. Algunos polifenoles se originan a través de rutas
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
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mixtas que combinan la vía del shikimato y del acetato, como el caso de los
flavonoides.
Debido a la acidez de la función hidroxílica (pKa de 8 a 11, dependiendo de los
sustituyentes), las sustancias fenólicas tienden a ser solubles en agua y con frecuencia
forman enlaces con residuos de carbohidratos. La mayoría de los fenoles simples son
componentes monoméricos de los polifenoles e incluyen, por ejemplo, al ácido
salicílico y gálico.
Los polifenoles son un grupo heterogéneo de moléculas. Dentro de esta gran
familia de compuestos se encuentran:
I‐ Los flavonoides: grupo ampliamente distribuido de pigmentos no
nitrogenados. Su esqueleto carbonado contiene 15 carbonos ordenados en dos anillos
aromáticos unidos por un puente de tres carbonos (figura 3). Por lo general son
solubles en agua y se encuentran como glucósidos, hecho que puede complicar su
determinación estructural. Generalmente están presentes en el citoplasma y vacuolas
de las células de los organismos que los producen. Se han reportado como sulfatos,
como dímeros (He et al., 1996; Barron et al., 1988) y como polímeros (Pan y Lubdgren,
1996).
Los flavonoides se clasifican en función del grado de oxidación del puente de
tres carbonos (figura 3) en: chalconas, flavonas, flavonoles, flavanonas, antocianinas e
isoflavonas. Otros grupos comunes incluyen auronas, xantonas y taninos condensados.
Son metabolitos secundarios de origen biosintético mixto, el anillo A proviene de la
ruta de la malonilcoenzima A y el anillo B y la cadena C3 derivan de la ruta del ácido
shikimico (figura 3).
Figura 3: Estructura básica de los flavonoides y sistema de numeración.
Entre las funciones de estos compuestos se encuentra la defensa y la
pigmentación. Las flavonas y flavonoles son los más ampliamente distribuidos de todos
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 21 ‐
los compuestos fenólicos. Desde el punto de vista de su potencial aplicación, se
conoce que muchos de ellos actúan a nivel circulatorio e inhiben la agregación
plaquetaria (Tzeng et al., 1991; Tsai et al., 1996; Mosa et al., 2011). Se han citado como
antiinflamatorios (Aquila et al., 2009; González Mosquera et al., 2011; Feng et al.,
2012) y antialérgicos (Kawai et al., 2007; Tewtrakul et al., 2008). También existen
estudios que demuestran su acción benéfica en el tratamiento de tumores prostáticos
(Wang et al., 2012; Ni et al., 2012; Khan et al., 2012) así como la relación entre su
estructura y actividad sobre el cáncer de mama (Zhang et al., 2005; Pick et al., 2011).
La galangina, un flavonoide aislado de la falsa acacia (Robinia pseudoacacia) ha
mostrado actividad antimicrobiana contra cepas resistentes a antibióticos de
Staphylococcus aureus (Cushnie et al., 2003). La quercetina, ampliamente distribuida
entre las plantas, posee actividad antioxidante. Actualmente este compuesto es muy
popular en las tiendas naturistas, aunque los beneficios son especulativos (Graefe et
al., 1999). Otros estudios los citan como compuestos con actividad anti HIV y en este
caso también se ha investigado la relación estructura‐actividad (Lameira et al., 2006).
Algunos isoflavonoides tienen acción antimicrobiana (Ortega et al., 1996), antifúngica y
leishmanicida (Cordell, 1995). A estos se les ha atribuido una cantidad de propiedades
farmacológicas incluyendo actividades inhibidoras de las enzimas hidrolasas,
ciclooxigenasas (Noreen et al., 1998; Selvam et al., 2004), fosfatasa alcalina, cAMP
fosfodiesterasa, ATP‐asas, liasas, hidroxilasas, transferasas, oxidoreductasas y quinasas
(Cordell, 1995).
Entre las algas, si bien hasta hace unos años los flavonoides no se habían
aislado ni caracterizado, hoy se conocen varios de ellos en distintas clases de Clorofitas
(Acetabularia ryukyuensis, Monostroma nitidium, y Caulerpa serrulata entre otras),
Feofitas (Undaria pinnatífida, Eisenia bicyclis y Laminaria religiosa entre otras) y
Rodofitas (Porphyra yezoensis, Gracilaria texorii y Chondrus ocellatus entre otras)
(Yoshie‐Stark et al., 2003).
II‐ Los taninos: constituyen otro grupo de compuestos fenólicos poliméricos,
solubles en agua, que al unirse a proteínas las desnaturalizan y las precipitan
(Hagerman y Butler, 1989). Se encuentran en grandes cantidades en alimentos que
tienen sabor muy amargo y resultan astringentes por unirse a las proteínas de la saliva,
por ejemplo el té. Existen dos subclases de estos compuestos; los taninos condensados
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 22 ‐
o catequínas y los hidrolizables o gálicos. Los taninos condensados (proantocianidinas)
se forman biosintéticamente por la condensación de flavanoles para formar redes
poliméricas. Estos no pueden ser hidrolizados pero sí oxidados por un ácido fuerte
para originar las antocianidinas. Los taninos hidrolizables son ésteres de un azúcar
(generalmente glucosa) con uno o más ácidos trihidroxibenzencarboxilico (ácido
gálico). Estos materiales dan precipitados insolubles con albúmina o gelatina. Esta
reacción con las proteínas se utiliza industrialmente para convertir las pieles animales
en cuero (durante el proceso de curtido), por su unión al colágeno aumentando su
resistencia al calor, al agua y a la acción de microorganismos. Los taninos hidrolizables
son más pequeños que los condensados y se hidrolizan más fácilmente. Son muy
sensibles a la oxidación, especialmente en medio ácido. Generalmente son toxinas
debido a su capacidad de unirse a proteínas y también actúan como protectores frente
a la herbivoría. Sin embargo, algunos tienen efecto beneficioso en la salud humana,
por ejemplo aquellos presentes en las uvas o el vino tinto, al bloquear la formación de
endotelina‐1, una molécula señal que provoca vasoconstricción (Andriantsitohaina et
al., 2012). Los taninos tienen diversos efectos sobre los sistemas biológicos dado que,
además de precipitar proteínas, son potenciales quelantes de metales y antioxidantes.
Algunos de ellos han mostrado actividad antiviral frente al síndrome de
inmunodeficiencia humana (SIDA) por inhibición de la transcriptasa reversa (Notka et
al., 2004). Los registros de la presencia de taninos en algas son escasos pero más
antiguos que los de flavonoides. En las feofitas la acumulación de estos compuestos
fue asociada a la protección frente a la predación por herbivoría (Hunger, 1902).
Compuestos nitrogenados: aminas y alcaloides
Los compuestos que contienen nitrógeno (estructuralmente derivados del
amoníaco) como parte de su estructura general, se pueden clasificar como aminas o
alcaloides. En las aminas el nitrógeno generalmente, aunque no siempre, se incorpora
en una cadena y no en una estructura cíclica. En los alcaloides, en cambio, el nitrógeno
se incorpora a menudo a una estructura cíclica derivada de un aminoácido. La posición
del nitrógeno imparte la naturaleza química de la molécula, incluyendo cómo se
comporta en un sistema biológico. Los alcaloides son una gran familia de más de
15.000 metabolitos secundarios que tienen en común tres características: son solubles
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 23 ‐
en agua, contienen al menos un átomo de nitrógeno en la molécula y exhiben
actividad biológica. Muchos de los alcaloides derivan directamente de los aminoácidos
aromáticos fenilalanina, tirosina, y triptófano, aunque algunos como la nicotina y
compuestos relacionados lo hacen a partir de la ornitina. En los organismos que los
producen actúan como agentes antiherbivoría o como reguladores del crecimiento,
como por ejemplo, la hormona vegetal indol‐3‐acético (IAA, un derivado del indol
sintetizado a partir de triptófano, Buchanan et al., 2000).
A pesar de la diversidad estructural de los alcaloides, todos exhiben potentes
efectos fisiológicos y toxicológicos fundamentalmente sobre el sistema nervioso
central de los mamíferos. En humanos, las respuestas fisiológicas se deben en su gran
mayoría a su interacción con neurotransmisores (Mulac y Ulrich‐Humpf, 2011; Jursky y
Baliova, 2011). A dosis altas, casi todos los alcaloides son muy tóxicos. Sin embargo
tienen un gran valor terapéutico como relajantes musculares, tranquilizantes y
analgésicos cuando se utilizan dosis bajas, por lo que son de gran interés
farmacológico. Su diversidad estructural y amplio rango de bioactividades, hacen de
ellos uno de los grupos más importantes entre las sustancias naturales de interés
terapéutico. Por ejemplo, la morfina, un potente narcótico analgésico, se usa
extensivamente para el tratamiento del dolor moderado a severo (Bercovitch et al.,
1999). La colchicina se utiliza para tratar la inflamación asociada con la acumulación de
ácido úrico (gota) desde hace 2.000 años e incluso ha sido investigada como
componente activo para el tratamiento del cáncer (Jordan, 2002; Nakagawa‐Goto et
al., 2005) así como la vinblastina. La cocaína es un anestésico local y un potente
estimulante del sistema nervioso central (Flynn, 1991), y la estricnina es un
estimulante nervioso.
Algunos alcaloides se han encontrado en cianobacterias, como los hapalindoles
aislados de Hapalosiphon fontinalis (Moore et al., 1987) y en algas rojas, como el
martefragin A aislado de Martensia fragilis (Takahashi et al., 1998) y los lophocladines,
obtenidos de Lophocladia sp. (Gross et al., 2006).
1.2 El cribado químico
Se estima que alrededor del 80% de todos los medicamentos del mundo
derivan originalmente de fuentes vegetales. Sin embargo, muchas plantas a menudo
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
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situadas en regiones remotas del mundo, aún no han sido clasificadas
taxonómicamente, ni ha sido examinado su potencial medicinal. Por lo tanto, hay sin
duda, un gran número de posibles medicamentos y otros compuestos útiles derivados
de plantas por descubrir y caracterizar en todo el mundo. Gran parte del conocimiento
sobre las plantas con propiedades útiles, proviene de las poblaciones nativas que viven
en un área determinada. No es de extrañar entonces que las algas, sobre todo las
microalgas, no hayan sido hasta ahora consideradas.
La rama de la investigación, comúnmente conocida como fitoquímica, tiene
como objetivo el estudio de los productos del metabolismo secundario de plantas,
pero este tipo de análisis se puede llevar a cabo en cualquier tipo de organismos. Estos
estudios comprenden las etapas de extracción, aislamiento, purificación y
determinación estructural de esos metabolitos. El cribado químico es una de las etapas
iniciales de la investigación fitoquímica, que permite determinar cualitativamente los
principales grupos químicos presentes en un organismo, y a partir de allí, orientar la
extracción y/o fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de
mayor interés. Este proceso consiste en la extracción de dichos grupos desde la
biomasa, con solventes apropiados, y la aplicación de reacciones cromogénicas y de
precipitación, para su identificación. Estos procesos deben permitir una rápida
evaluación del producto, con reacciones sensibles, reproducibles y de bajo costo. Vale
resaltar que en los extractos crudos los constituyentes activos están normalmente
presentes en pequeñas concentraciones, por lo que los procesos de aislamiento y
purificación precisan además ser eficientes. Dentro de los medios de aislamiento, la
cromatografía es uno de los más útiles en la separación de mezclas y es aplicable tanto
como técnica para purificar como para identificar componentes. En trabajos previos
realizados con microalgas se ha demostrado que ellas pueden ser utilizadas como
fuente de compuestos con propiedades farmacológicas. Euglena gracilis es una
especie a la que hasta el momento no ha sido considerada como fuente de
medicamentos, pero dado su amplio rango metabólico, constituye un valioso material
de estudio para el desarrollo de diferentes investigaciones que permitan alcanzar un
mayor conocimiento de su diversidad funcional. Esto motivó a realizar un cribado
químico, cuyos resultados se presentan en esta sección.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 25 ‐
2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
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2.1 Hipótesis
La especie Euglena gracilis, por poseer una gran plasticidad metabólica y por su
capacidad de adaptarse a condiciones ambientales extremadamente variadas,
podría originar, a través de sus diversos patrones fisiológicos, una amplia gama de
metabolitos.
Mediante la caracterización de estos metabolitos se podrían encontrar algunos
que puedan tener interés farmacológico.
2.2 Objetivos Generales
Caracterizar químicamente a dos cepas de Euglena gracilis en dos de sus fases de
desarrollo en cultivo y bajo distintas condiciones nutricionales.
Caracterizar las cepas según su contenido de lípidos, proteínas, pigmentos y
flavonoides.
Comparar el perfil químico de las dos cepas, para establecer cuál de ellas resulta la
más apropiada como fuente de metabolitos de interés.
2.3 Objetivos específicos
Preparar y fraccionar extractos de distintas cepas de Euglena gracilis en dos de sus
fases de desarrollo en cultivo y bajo distintas condiciones nutricionales.
Identificar metabolitos primarios y secundarios a partir de las fracciones
generadas.
Analizar cromatográficamente lípidos, pigmentos, carbohidratos de bajo peso
molecular y flavonoides.
Analizar agregaciones macromoleculares por electroforesis en gel de
poliacrilamida con sodecilsulfato de sodio (SDS‐PAGE).
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
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3.1 Cepas microalgales y condiciones de cultivo
En esta primera etapa se trabajó con cultivos axénicos de 2 cepas de Euglena
gracilis. Una de ellas fue aislada del río Matanza (MAT) y la otra proviene de la
Colección de Cultivos de la Universidad de Texas ‐ UTEX 753 (UTEX). En todos los casos
se trabajó además con una variedad fotosintética (f) y otra blanqueada, heterotrófica
(h) que se obtuvo luego de tratar con estreptomicina a la cepa autotrófica (Ruiz et al.,
2004). Dado que las cepas blanqueadas no retomaron su capacidad fotosintética a
pesar de mantenerse sin agregados del antibiótico, pueden ser consideradas como
cultivos estables. Además, las cepas blanqueadas sólo se ensayaron en dos de los
medios (Buetow y EGM) dado su escaso crecimiento en medio mineral con escaso
contenido de una fuente de carbono (Cramer & Mayer).
Las cepas fueron mantenidas bajo luz continua, a 24 2 ºC, en tres medios de
cultivo, Cramer & Mayers, Buetow, EGM (CCPA, 2001). La composición de estos
medios de cultivo se detalla en la tabla 2.
Composición del medio de cultivo
Buetow (mg/l)
Cramer & Myers (mg/l)
EGM (mg/l)
Na Acetato 5000 ‐ 600 Na Citrato 645 800 ‐ (NH4)2SO4 ‐ 1000 KH2PO4 1000 ‐ (NH4)2HPO4 1000 1000 ‐ MgSO4 200 200 ‐ CaCl2 26,5 20 ‐ Fe(SO4)3 3 3 ‐ ZnSO4 0,4 0,4 ‐ MnCl2 1,8 1,8 ‐ Na2MoO4 0,2 0,2 ‐ CoCl2 1,3 1,3 ‐ CuSO4 0,02 0,02 ‐ Tiamina HCl 0,02 0,01 ‐ Vitamina B12 1µg/l 0,5 µg/l ‐ Extracto de carne ‐ ‐ 1000 Extracto de levadura ‐ ‐ 2000 Triptona ‐ ‐ 2000 Cl2Ca (10mg/l) ‐ ‐ 10 ml pH 7 7 7
Tabla 2: Composición de los distintos medios cultivo utilizados para el cultivo de E. gracilis.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 32 ‐
Los cultivos fueron repicados semanalmente en cada uno de los medios
empleados y se determinó en cada caso su curva de crecimiento celular en función del
tiempo. El recuento celular se realizó utilizando una cámara de Neubauer (Venrick,
1978). A partir de dichas curvas se seleccionó el medio que permitió la obtención de
mayores biomasas en lapsos de tiempo más cortos.
La biomasa se obtuvo por centrifugación a los 4 días de realizado el inóculo
(fase exponencial, Fexp) y a los 8 días (fase estacionaria, Fest), en una centrífuga
refrigerada a 4 ºC.
Una vez obtenida, ésta fue sometida a lavados exhaustivos con H2O destilada a
4 ºC para evitar contaminación con el medio de cultivo. Por último, fue secada por
liofilización y pesada (figura 4).
Cultivo de E. gracilis (‐f o ‐h)
Centrifugación a 4 ºC, 15 min, a 5000 x g (Fexp: 4 días; Fest: 8 días) Células Sobrenadante 5‐8 lavados exhaustivos Descarte con H2O destilada a 4 ºC ‐20 ºC Liofilización y almacenamiento en desecador a ºT ambiente
Figura 4. Obtención de la biomasa algal a partir de los cultivos en sus
distintas fases de crecimiento.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 33 ‐
3.2 Preparación de extractos y fraccionamiento
3.2.1 Fraccionamiento
El extracto crudo de un producto natural es, literalmente, un cóctel de
compuestos. Es difícil aplicar una técnica de separación única que permita aislar sus
componentes individuales. Por lo tanto, el extracto crudo debe ser dividido en varias
fracciones discretas que contengan, por ejemplo, compuestos de polaridades
similares, mediante una extracción líquido‐líquido.
Para el fraccionamiento inicial de cada extracto crudo, es aconsejable no
generar demasiadas fracciones (ya que un compuesto activo podría quedar distribuido
en cada una de ellas en baja concentración); sino que se trata de generar sólo algunas
fracciones grandes, relativamente crudas, en las que rápidamente se pueda detectar el
compuesto de interés.
Cuando se selecciona un procedimiento de extracción de metabolitos de
microorganismos, debe considerarse que éstos se producen a menudo en bajas
concentraciones y que una cepa puede producir una mezcla compleja de compuestos.
Además, éstos pueden ser completa o parcialmente excretados al medio o pueden
quedar dentro de las células. Si se espera aislar un metabolito de un cierto tipo, es
posible aplicar protocolos previamente publicados. El proceso a elegir se dificulta
cuando las cepas y/o los metabolitos son desconocidos, o cuando el objetivo es extraer
la mayor cantidad posible de metabolitos. Al igual que con los vegetales, se utilizan
solventes miscibles y no miscibles con agua y solventes orgánicos, por ejemplo, acetato
de etilo (EtOAc), diclorometano (DCM), n‐butanol, metanol (MeOH), etc.
Para llevar a cabo el fraccionamiento químico, se efectuó una extracción
general a partir del material cosechado de cada cepa, en sus dos fases de crecimiento.
Los extractos crudos se prepararon con etanol 96° y se fraccionaron por cambios de pH
y extracción con solventes de distinta polaridad (figura 5).
A partir de los residuos de las extracciones alcohólicas, se extrajeron los lípidos con
cloroformo‐metanol (2:1) (Folch et al., 1957).
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
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Liofilizado de E. gracilis (‐f o ‐h)
Maceración a 65°C por 3 horas con EtOH Filtración Extracto total Residuo I FRACCIÓN A Llevar a seco CHCl3:MeOH
(2:1)
HCl 1%
Filtración FRACCIÓN E
Acetona Residuo II Filtrado ácido FRACCIÓN F H2CCl2 NH3OH FRACCIÓN C (H2CCl2) Filtración H2CCl2 FRACCIÓN D (H2O) FRACCIÓN B
Figura 5. Extracción general realizada para el posterior análisis fitoquímico.
3.2.2 Extracción de pigmentos
Se hizo una segunda extracción exhaustiva de pigmentos utilizando acetona y
carbonato de magnesio a fin de evitar la formación accidental de metabolitos de la
clorofila. Dichos extractos fueron centrifugados a 6.700 x g para eliminar residuos y
poder llevar adelante un análisis mediante cromatografía líquida de alta resolución en
fase reversa con arreglo de diodos (RP‐HPLC‐DAD) (figura 6).
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 35 ‐
50 mg de material liofilizado
+
5 ml Acetona + Mg
Agitación en oscuridad a T ambiente por 30 minutos. X 3 Filtración en oscuridad
Residuo III Filtrado
Concentrar a presión reducida
Resuspender en 500 μl Acetona
Centrifugar 10 min a 6700 x g
Sobrenadante Sedimento
RP‐HPLC‐DAD
Figura 6. Extracción de pigmentos a partir del material liofilizado para su posterior análisis por HPLC.
3.2.3 Extracción de carbohidratos de bajo PM
Para obtener extractos enriquecidos en mono y oligosacáridos, la biomasa
liofilizada se extrajo con etanol 80% como se indica en la figura 7. Posteriormente,
cada muestra fue analizada mediante cromatografía planar y electroforesis
monodimensional.
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100 mg de material liofilizado +
20 ml EtOH 80%
Agitación a T ambiente por 6 hs Centrifugación Residuo IV Sobrenadante Reserva para Concentración a presión segunda extracción reducida a 40°C
Cromatografía Planar, y SDS‐PAGE
Figura 7. Extracción de mono y oligosacáridos a partir del material liofilizado.
3.3 Análisis Químico
Las 4 fracciones obtenidas mediante el fraccionamiento del material liofilizado
se analizaron mediante reacciones cualitativas usuales para la determinación de
grupos químicos (Rondina y Coussio, 1969; Domínguez, 1985; Harborne, 1991).
Sobre la fracción A se investigó la presencia de:
Flavonoides: estos se pueden reconocer experimentalmente mediante diferentes
ensayos de coloración. En nuestro trabajo se empleó la reacción de Shinoda,
(1928). Se secan 0,5 ml de la fracción A y el residuo se solubiliza con igual volumen
de agua destilada. Luego se agregan unas granallas de Mg y 0,2 ml de HCl
concentrado. Se deja reaccionar completamente y se observa la aparición de color.
Posteriormente se agregan 0,2 ml de alcohol amílico, se diluye con 2 ml de agua
destilada, y se observa el color que puede variar desde un rosa tenue hasta un tono
guinda en la fase orgánica.
Oxidrilos fenólicos (Reacción con FeCl3): para el reconocimiento preliminar de
polifenoles, se lleva a seco 1 ml de la fracción A. El residuo seco se disuelve en 1ml
de agua destilada y se agregan 3 gotas de FeCl3 1% acuoso. Una coloración amarilla
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 37 ‐
indica la presencia de 1 OH, el color verde grisáceo la presencia de 2 OH
adyacentes y el color azul a negro indica la presencia de 3 OH adyacentes.
Taninos (Reacción con Gelatina): para su reconocimiento preliminar se seca 1 ml de
la fracción A. El residuo seco se disuelve en 1 ml de agua destilada y se agregan 10
gotas de una solución acuosa de gelatina al 0,5% . La aparición de turbidez hasta un
precipitado abundante indica la presencia de taninos dada la capacidad de estas
sustancias de precipitar proteínas.
Lípidos (Reacción con I2): se siembran unas gotas de la fracción A en papel de filtro,
se deja secar y se expone a vapores de I2. Un resultado positivo se evidencia por la
presencia de manchas color marrón‐naranja.
Hidratos de Carbono (Reacción de Dubois, 1956): a 1 ml de la fracción A seca y
retomada con 0,25 ml de agua destilada se le adicionan 0,25 ml de una solución
acuosa de fenol al 5% y sobre la superficie se agregan 1,25 ml de H2SO4
concentrado. La aparición de color naranja a pardo indica la presencia de mono y
oligosacáridos de bajo peso molecular, dado que los polisacáridos de mayor peso
molecular precipitan en presencia de EtOH, quedando en el residuo de la primera
extracción (figura 5).
Sobre la fracción B se investigó la presencia de:
Esteroides y triterpenos (Reacción de Liebermann‐Burchard; Pinto Coelho y Alves,
1946): para su reconocimiento se mezclan 0,25 ml de anhídrido acético y 0,25 ml
cloroformo. Se enfría a 0°C en baño de hielo. A continuación 0,5 ml de la fracción
B se ponen en contacto con la mezcla de reactivos anterior y el tubo se coloca en
baño de hielo nuevamente. Entonces se agrega por las paredes 1 gota de H2SO4
previamente enfriado a 0°C. Se enfría nuevamente y se observa la coloración. El
desarrollo de un color verde‐azul indica la presencia de esteroides y el de una
coloración rojo‐naranja la de triterpenos.
Antraquinonas y naftoquinonas (Reacción de Bornträger; Auterhoff y Boehme,
1968).
Las antraquinonas, ampliamente distribuidas, se encuentran principalmente en
forma de glicósidos y en menor proporción como agliconas. También se han
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 38 ‐
encontrado compuestos sulfatados y diméricos (Alemayehu et al., 1998). Sin
embargo, existen todavía dudas acerca del verdadero estado natural de estas
sustancias, ya que hay evidencias experimentales que muestran que ellas no se
encuentran como tales en los organismos sino que son productos de la degradación
enzimática de las correspondientes formas reducidas (antronas y antranoles). Por esta
razón, debe considerarse esta posibilidad antes de afirmar la presencia de
antraquinonas en una muestra (Robinson, 1983). Las antraquinonas y demás
compuestos antracénicos pueden ser biosintetizadas por la ruta del malonil‐coenzima
A o bien, a partir del ácido shikímico y acido mavelónico. Tanto ellas como sus formas
reducidas pueden reconocerse a través del denominado ensayo de Borntranger
(Auterhoff y Boehme, 1968). Para ello se agitan 0,5 ml de la fracción B con 0,8 ml de
NaOH al 5% y se observa la coloración. Una fase acuosa roja o amarilla con
fluorescencia roja indica la presencia de estos metabolitos.
Sobre la fracción C se investigó la presencia de:
Alcaloides (Reacción de Dragendorff): para su reconocimiento se lleva a seco 0,2ml
de la fracción C, se retoma con 2 ml de HCl al 1% y se le agregan 2 gotas del
reactivo de Dragendorff. La formación de un precipitado pardo anaranjado indica
la presencia de alcaloides en la muestra.
Preparación del reactivo de Dragendorff: se disuelven 8 gr de subnitrato de
bismuto en 20 ml de HNO3 de densidad 1,8 unidades. Se vuelca esta solución
sobre otra que contiene 22,7 gr de ioduro de potasio en 20 ml de agua. Se deja
reposar y se separa el KNO3 decantado. Finalmente se diluye a 100 ml.
Cardenólidos (Reacción de Kedde): para su reconocimiento, a una gota de la
fracción C, llevada previamente a seco y retomada con alcohol, se le agregan 0,1
ml del reactivo de Kedde. Un resultado positivo está indicado por la persistencia
de una coloración púrpura o violeta. Además se realiza un blanco reemplazando el
reactivo de Kedde por una solución de KOH al 5,7 % (solución II) para descartar
colores producidos en medio alcalino por otras sustancias.
Preparación del reactivo de Kedde: se prepara mezclando volúmenes iguales de
las soluciones I y II.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 39 ‐
Solución I: Ácido 3,5 dinitrobenzoico al 2% en metanol.
Solución II: KOH al 5,7% en agua destilada.
Esteroides (Reacción de Liebermann‐Burchard): para su detección se procede de
igual manera que con la fracción B.
Leucoantocianinas (Reacción de Rosenheim): 0,5 ml de la fracción C se llevan a
seco y se retomaron con el mismo volumen de HCl al 1% en agua. Se le agregan
0,25 de HCl concentrando, se calienta a baño maría durante 10 minutos y se
observa la aparición de color. Si en la solución aparece una coloración desde
carmesí hasta rosa pálido, la mezcla se enfría y se agrega un pequeño volumen
de alcohol amílico agitando suavemente. La presencia de leucoantocianinas se
evidencia por el paso de la coloración a la fase alcohólica.
Sobre la fracción D se investigó la presencia de alcaloides mediante la reacción
de Dragendorff de la misma manera en que se procedió con la fracción C.
3.4 Análisis cromatográficos
Para cada grupo químico de interés detectado, se efectuaron análisis
cromatográficos en distintos sistemas. Se estudiaron los perfiles de los lípidos,
carbohidratos de bajo peso molecular, flavonoides y pigmentos constituyentes (Mabry
et al., 1970; Hellebust y Craigie, 1978; Wagner et al., 1984; Harborne, 1991; Jeffrey et
al., 1997).
3.4.1 Cromatografía en papel y en placa delgada (TLC).
3.4.1.1 Carbohidratos
En los extractos obtenidos a través del procedimiento mostrado en la figura 5,
se analizaron oligosacáridos mediante sistemas cromatográficos planares en papel
Whatman Nº 1. El primer revelado se hizo con luz UV para verificar la ausencia de
contaminantes. Luego las cromatografías fueron reveladas con AgNO3 40% (Hoton‐
Dorge, 1976). Una vez corridas las cromatografías, se analizaron bajo luz UV para
comprobar que no haya contaminación con otro tipo de metabolitos y una vez
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 40 ‐
reveladas con nitrato de plata se dejaron secar en oscuridad durante 36 horas antes de
su análisis.
3.4.1.2 Lípidos
Las fracciones E se analizaron utilizando un sistema monodimensional sobre
cromatoplaca de Sílica gel G60 saturada previamente con sulfato de amonio y
desarrollada con benceno‐acetona‐agua (30:91:8). Se reveló con luz natural, UV y
vapores de iodo.
3.4.1.3 Flavonoides
En la cepa que mostró una mayor coloración en la reacción de Shinoda, es decir
que evidenció mejor la presencia de estos metabolitos, se hizo un análisis mediante
una cromatografía bidimensional planar sobre papel Whatman Nº 1 de la fracción A,
utilizando dos fases móviles (BAW: n‐butanol:ácido acético:agua (4:1:5); Forestal:
ácido acético:ácido clorhídrico:agua (30:3:10)). Los revelados se efectuaron con luz
natural, luz UV a 365 nm, con y sin el agregado previo de vapores de amoníaco (Mabry
et al., 1970; Harborne, 1991).
3.4.1.4 Pigmentos
Mediante dos sistemas cromatográficos, se analizaron las fracciones solubles
en diclorometano (Fracciones B) y los residuos retomados con acetona (Fracción F).
Por un lado, para analizar clorofilas y carotenos se usó papel Whatman Nº 3MN con
éter de petróleo‐acetona‐n‐propanol (90:10:0,45) como fase móvil. Para las xantofilas
se trabajó sobre sílica gel G60‐carbonato de calcio (2:1) con éter de petróleo‐acetona‐
isopropanol (35,5:14:0.5) como fase móvil (Hellebust y Craigie, 1978; Harborne, 1991;
Jeffrey, 1997).
3.4.2 Análisis de pigmentos por RP‐HPLC‐DAD.
Si bien los pigmentos de E. gracilis se hallan descriptos en la bibliografía
(Wolken y Mellon, 1956; Krinsky y Goldsmith, 1960; Epstein y Weiss, 1960; Gross y
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 41 ‐
Stroz, 1975; Suetsugu y Wada, 2003), la cepa MAT no fue totalmente caracterizada. A
fin de comparar sus pigmentos con los de la cepa UTEX, se realizaron análisis para
ambas, bajo dos condiciones nutricionales y en dos de sus fases de desarrollo en
cultivo. Para esto, los extractos preparados según la sección 3.2.2 (figura 6) se
analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa con
detector de arreglo de diodo (RP‐HPLC‐DAD; Wright et al., 1991). De acuerdo con este
método los pigmentos fueron identificados por co‐cromatografía con estándares
apropiados provistos por la cátedra de Farmacognosia de la Facultad de Ciencias
Naturales San Juan Bosco mediante espectroscopía de diodos durante la elución y por
comparación de sus espectros de absorción con los estándares de referencia.
Estándares y extractos se pasaron a través de una columna C18, usando como eluyente
acetonitrilo:agua (90:10) a un flujo de 1ml/min y lecturas de absorbancia a 436 nm.
3.5 Análisis mediante SDS‐PAGE
El análisis de los glicoconjugados se hizo por electroforesis monodimensional
de los extractos obtenidos según la sección 3.2.3 (figura 7), en SDS‐PAGE, por
duplicado. Uno de los geles fue revelado para poder detectar proteínas con Coumassie
brillant blue y el otro con la base de Schiff, previa oxidación con ácido periódico (PA‐
Schiff), para poder localizar hidratos de carbono de bajo peso molecular. Por
superposición de ambos geles se puede detectar la presencia de ambas
macromoléculas, cuando éstas forman agregaciones macromoleculares.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 42 ‐
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 43 ‐
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 44 ‐
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 45 ‐
4.1 Microorganismos y condiciones de cultivo
Se establecieron las condiciones más adecuadas para alcanzar una biomasa
suficiente para efectuar los estudios químicos y de actividad biológica previstos. Según las
curvas de crecimiento realizadas, se determinó que la mayor biomasa en lapsos de
tiempo más cortos se obtuvo en el medio EGM (figuras 8 y 9). Partiendo de cultivos con
5.104 células/ml, la biomasa en fase exponencial se logró a los 4 días de crecimiento,
mientras que la de fase estacionaria se consiguió a los 8 días. Las cepas heterotróficas no
presentaron crecimiento en el medio Cramer & Mayers en el período de tiempo
analizado.
A)
0.000
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
7.000
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216
Tiempo (hs)
Den
sida
d ce
lula
r (10
5 cel
ulas
/ml)
B)
0.000
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
7.000
0 24 48 72 96
120 144 168 192 216
Tiempo (hs)
Den
sida
d ce
lula
r (1
05 c
elul
as/m
l)
EGM
Buetow
Cramer & Mayer
Figura 8. Curvas de crecimiento de E. gracilis fotosintética: A) cepa UTEX, B) cepa MAT, en distintos medios de cultivo
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 46 ‐
B)
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
4.000
4.500
0 24 48 72 96
A)
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
4.000
4.500
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216
Tiempo (hs)
Den
sida
d ce
lula
r (10
5 cel
ulas
/ml)
EGM
Buetow
120 144 168 192 216
Tiem (hs)
Den
sida
d ce
lula
r (10
5 cel
ulas
/ml)
po
Figura 9. Curvas de crecimiento de E. gracilis heterotrófica: A) cepa UTEX, B) cepa MAT, en distintos medios de cultivo.
Diferentes estudios fisiológicos, tecnológicos y diversos sistemas han sido
propuestos con el fin de maximizar la producción de biomasa en sistemas de cultivo de E.
gracilis (Chaumont 1993; Grobbelaar 2000; Lee 2001; Richmond 1996, 2000, Santek et al.
2012). Esta especie es comúnmente encontrada en cuerpos de agua con alto contenido
de materia orgánica, por lo que no resulta extraño que al comparar las curvas de
crecimiento en los tres medios de cultivo utilizados, tanto las cepas pigmentadas como
incoloras, hayan alcanzado las mayores biomasas en tiempos más cortos al crecer en un
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 47 ‐
medio rico en materia orgánica (EGM, CCAP 2001). Por este motivo, para la producción
de biomasa destinada a los análisis posteriores seleccionó el medio EGM. Probablemente
alguna forma de materia orgánica diferente al acetato y citrato presentes en los otros
medios sea la responsable de las tasas de crecimiento mayores en el medio EGM. Por
otro lado, la máxima eficiencia de producción de biomasa se registró en las cepas
autotróficas, seguramente debido a su capacidad de utilizar para su crecimiento tanto
compuestos orgánicos del medio como energía lumínica.
4.2 Fraccionamiento y análisis químico
La tabla 3 muestra los rendimientos de biomasas alcanzadas:
CEPA Condición nutricional FASE gr. de liofilizado/10
litros de cultivo Células x105/ml
Exponencial 1,34‐1,67 4,00‐4,97 UTEX Autotrófica
Estacionaria 1,92‐1,94 5,71‐5,77 Exponencial 0,89‐1,01 2,65‐3,01
Heterotrófica Estacionaria 1,19‐1,20 3,55‐3,58 Exponencial 1,37‐1,60 4,07‐4,75
Autotrófica Estacionaria 1,91‐1,97 5,84‐5,87 Exponencial 1,03‐1,16 3,08‐3,46
MAT Heterotrófica
Estacionaria 1,24‐1,26 3,70‐3,76
Tabla 3: Rendimiento de la obtención de biomasas liofilizadas.
Puede observarse que las mayores producciones de biomasa se dan en las
cepas autotróficas, lo cual es congruente con lo observado en las curvas de
crecimiento realizadas (figuras 8 y 9). Respecto a las cepas, las fotosintéticas presentan
rango similares en la producción de biomasa liofilizada. Por el contrario, pueden
observarse diferencias entre las cepas heterotróficas. La cepa MAT heterotrófica,
presenta mayores rendimientos respecto de la cepa UTEX en las mismas condiciones
nutricionales y fases de crecimiento (0,89‐1,01 y 1,19‐1,20 gr. de liofilizado/10 litros de
cultivo para la cepa UTEX en fase exponencial y estacionaria respectivamente, y 1,03‐
1,16 y 1,24‐1,26 gr. de liofilizado/10 litros de cultivo para la cepa MAT en fase
exponencial y estacionaria respectivamente). Estas diferencias entre cepas puede
deberse a que la cepa MAT es una cepa aislada de un cuerpo de agua natural rico en
materia orgánica (río Matanza, Buenos Aires) proveniente de la descarga de efluentes
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 48 ‐
de diversos frigoríficos ubicados en sus márgenes principalmente. Esta cepa es
mantenida en cultivo en el laboratorio de Biología Comparada de Protistas de la FCEN‐
UBA desde el año 2004 (Ruiz et al., 2004). En cambio la cepa UTEX que se mantiene en
colecciones de cultivos desde 1950, posiblemente presente una habilidad menor en el
uso de compuestos orgánicos que la cepa MAT.
La tabla 4 muestra los rendimientos de las 4 fracciones (A ‐ D) obtenidas
siguiendo el método explicado en la sección 3.2.1 (no se muestran los rendimientos de
la fracción D debido a que durante su obtención se formó una sal, que su cálculo:
Rendimientos (% ) Cepa Fase
Fracción A Fracción B Fracción C Fracción D Fexp 18,8‐21,6 10,9‐12,4 1,5‐1,52 ‐
UTEX‐f Fest 31,4‐31,5 7,2‐9,5 1,6‐2,3 ‐ Fexp 26,7‐30,8 5,8‐9,5 0,9‐1,4 ‐
MAT‐f Fest 26,4‐27,7 8,1‐11,3 1,1 ‐ Fexp 25,5‐26,8 9,5‐10,8 1,6‐1,9 ‐
UTEX‐h Fest 21,4‐26,6 10,2‐11 4,9‐5,2 ‐ Fexp 11,9‐12,9 4,1‐4,3 0,8‐2,6 ‐
MAT‐h Fest 20‐24 7,1‐8,3 0,5‐0,9 ‐
Tabla 4. Rendimientos obtenidos para las fracciones A ‐ D de cada cepa bajo diferentes condiciones nutricionales y en las dos fases de desarrollo analizadas.
Puede observarse que los mayores rendimientos corresponden a la fracción A,
es decir al extracto crudo. Los rendimientos bajan para las fracciones B y C debido a los
fraccionamientos realizados.
Las cuatro fracciones generadas se analizaron mediante reacciones cualitativas
usuales para la determinación de grupos químicos obteniendo los resultados generales
que se muestran en la tabla 5. Respecto a este tamizado, resulta interesante la
distribución de los grupos químicos encontrados. La presencia de polifenoles,
particularmente de taninos, podría indicar la existencia de un metabolismo activo
relacionado con los fenoles, sustancias comúnmente relacionadas con la defensa y la
protección frente a radicales libres (Céspedes et al., 2008; Rahim et al., 2008; Amorati y
Valgimigli, 2012; Baba et al., 2012). Por otro lado se detectó otro grupo de polifenoles,
los flavonoides, de los cuales hasta el momento había escasas referencias en algas. En
este punto se debe tener en cuenta que el ensayo empleado para la identificación de
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 49 ‐
polifenoles (FeCl3), es inespecífico ya que se basa en la capacidad del Fe de
complejarse con las estructuras fenólicas. Sin embargo, la identificación de flavonoides
se realizó con el reactivo de Shinoda, un ensayo más específico que involucra el anillo C
(figura 3) donde se encuentra el grupo carbonilo del flavonoide (Farnsworth, 1966) por
lo que una muestra podría presentar polifenoles que no sean del tipo flavonoides. En
este análisis las muestras que resultaron positivas para estructuras fenólicas también
lo fueron para flavonoides, con excepción de la cepa UTEX autotrófica en fase
estacionaria.
Los flavonoides también están fuertemente relacionados con la defensa y la
protección frente a radicales libres. Cuando los nutrientes se vuelven escasos, los
cultivos de E. gracilis entran en una fase de no crecimiento, conocida como
estacionaria, y desarrollan respuestas múltiples de resistencia a ese estrés. La
presencia de flavonoides en la fase estacionaria de crecimiento en cultivo podría estar
asociada a ese tipo de respuesta. La producción de estos compuestos en fase
exponencial sólo se registró en la cepa MAT fotosintética. Ello puede deberse a que,
como se explicó anteriormente, la cepa MAT aislada de un cuerpo de agua natural rico
en materia orgánica y mantenida en cultivo desde hace relativamente poco tiempo.
E. gracilis (cepa MAT) E. gracilis (cepa UTEX) Fotosintética Heterotrófica Fotosintética Heterotrófica Metabolitos Fracción Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest
Lípidos A + + + + + + + + Carbohidratos (Mono y Oligosacáridos de bajo PM) A + + + + + + + +
Flavonoides A +/‐ + ‐ ‐ ‐ + ‐ ‐ Taninos A ‐ ‐ + ‐ + ‐ + ‐ OH Fenólicos A + (1 OH) + (1 OH) ‐ ‐ + (2 OH) ‐ ‐ ‐ Esteroides B ++ +++ +/‐ ++ + ++ + ++ Triterpenos B ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ + ‐ Antraquinonas B ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Alcaloides C ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Cardenólidos C + ‐ + ‐ + ‐ + ‐ Leucoantocianinas C ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Esteroides C ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Triterpenos C ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Alcaloides NH4
+ D ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Tabla 5. Resultado de la evaluación fitoquímica sobre las 4 cepas de E. gracilis en sus dos fases
de crecimiento: + presencia, ‐ no detectado, +/‐ resultado dudoso.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 50 ‐
La metodología de cribado no incluye cuantificación, pero es un método
ampliamente utilizado como técnica cualitativa, cuando se estudia una nueva fuente de
productos naturales. Numerosos estudios han utilizado este tipo de técnicas mayormente
en plantas medicinales pero también en algas (Scholz y Liebezeit, 2006; Anbarasan et al.,
2010; Ganga Rao et al., 2012; Vetriselvan 2012).
4.3 Análisis Cromatográficos
Los metabolitos secundarios son actualmente objeto de interés e investigación,
pero su extracción como parte de las investigaciones fitoquímicas o biológicas plantea
retos específicos que deben abordarse a partir de los procesos de extracción. Una
extracción exitosa comienza con una cuidadosa selección y preparación de las muestras.
En este trabajo se presentan, tanto metodologías de extracción generalizadas (para la
detección de metabolitos mediante el cribado químico), así como otras de extracción más
específicas, adecuadas para determinados tipos de compuestos.
4.3.1 Cromatografía en papel y en placa delgada (TLC).
4.3.1.1 Carbohidratos
Los extractos obtenidos como se explica en la sección 3.2.3 tuvieron los
rendimientos mostrados en la tabla 6. Todos ellos se analizaron mediante cromatografía
en papel para identificar carbohidratos de bajo peso molecular, como se explica en la
sección 3.4.1.2. Los mono y oligosacáridos detectados se muestran en la figura 10 y en la
tabla 7.
Rendimiento (% ) E. gracilis (cepa UTEX) E. gracilis (cepa MAT)
Fotosintética Heterotrófica Fotosintética Heterotrófica Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest 39,8 43 53 67 31,6 31,2 52.6 61
Tabla 6. Rendimientos de las extracciones de carbohidratos de bajo peso molecular.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 51 ‐
Figura 10. Perfil cromatográfico de carbohidratos de bajo peso molecular. U: Cepa UTEX, M: Cepa MAT, Glu.: glucosa, Gal.: Galactosa, Sac.: Sacarosa, Lac.: Lactosa.
E. gracilis (cepa UTEX) E. gracilis (cepa MAT) Fotosintética Heterotrófica Fotosintética Heterotrófica
Carbohidrato
Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest Sacarosa ‐ ‐ + + + + ‐ ‐ Trehalosa ‐ + ‐ ‐ ‐ + ‐ ‐ Glucosa ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + ‐ Fructosa ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + Trisacárido ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
Tabla 7. Carbohidratos de bajo peso molecular detectados por cromatografía en papel.
Los hidratos de carbono producidos por E. gracilis comprenden
fundamentalmente un polisacárido de reserva denominado paramilon (‐1,3 glucano),
sacarosa y trehalosa. En particular los disacáridos no reductores, como la sacarosa y la
trehalosa, son los principales hidratos de carbono involucrados en las funciones
fisiológicas, de reserva y transporte cuya producción depende de la composición del
medio de cultivo utilizado y de las fases de desarrollo. Estos dos disacáridos son los únicos
sintetizados de forma natural como tales y es poco frecuente que coexistan en la
naturaleza. Su distribución en la naturaleza es notoriamente diferente: mientras que la
trehalosa está presente en un rango muy amplio de organismos (bacterias, hongos, algas,
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 52 ‐
invertebrados y algunas plantas vasculares), la sacarosa está mayormente restringida a
las plantas, algas verdes y cianobacterias (Elbein, 1974; Avigad, 1982; Avigad y Dey, 1997;
Cumino et al., 2002; Salerno y Curatti, 2003). En E. gracilis se ha descripto la producción
de sacarosa y trehalosa, indicando que la producción de este último es mayor durante la
fase estacionaria, momento en el cual hay estrés nutricional (Porchia et al., 1999). En
nuestro estudio se obtuvieron resultados similares, la trehalosa sólo pudo ser detectada
por cromatografía en las cepas UTEX (cepa a la que hace referencia el trabajo de Porchia
et al., 1999) y MAT fotosintéticas en fase estacionaria, lo que sugiere que la trehalosa
constituye en este alga un metabolito que se acumula en las células ante la limitación de
nutrientes. Por otro lado, la producción de sacarosa, fue detectada tanto en las fases
exponenciales como estacionarias, en cepas fotosintéticas y heterotróficas.
Anteriormente se propuso que la producción de sacarosa parece ser importante en las
etapas de crecimiento activo (Porchia et al., 1999), sin embargo en nuestro estudio
también se detectó este disacárido en las fases estacionarias. Esto sugiere que la sacarosa
también podría estar involucrada en otras funciones, posiblemente de protección celular,
como ocurre con la trehalosa. Existen antecedentes sobre estas funciones para la
sacarosa frente a condiciones de alta salinidad, frio, y sequía en plantas, algas y ciertas
cianobacterias (Levitt, 1980; Salerno y Pontis, 1989; Reed et al., 1984), por lo que es
posible que la protección también se produzca frente a un estrés nutricional.
4.3.1.2 Lípidos
Los lípidos analizados como se indica en la sección 3.4.1.3 se muestran en la figura
11 y en la tabla 8. Puede observarse que predominaron mono‐ y di‐
galactosildiacilglicéridos, sulfolípidos (excepto en las verdes durante las fases
estacionarias), fosfatidiletanolamina y fosfatidilcolina.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 53 ‐
Figura 11. Perfil cromatográfico monodimensional de lípidos de E. gracilis.
Los lípidos han sido estudiados en E. gracilis (Rosenberg y Pecker, 1964; Rocchetta
et al., 2006) si bien aún no se ha avanzado en sus posibles aplicaciones. Cabe destacar
que la presencia de galactolípidos en las condiciones de cultivo utilizadas en este trabajo,
coincide con lo descripto por Matson et al. (1970).
E. gracilis (cepa UTEX) E. gracilis (cepa MAT)
Fotosintética Heterotrófica Fotosintética Heterotrófica Lípido
Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest Fexp Fest
Acido fosfatídico + ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐
Fosfatidilcolina ‐ ‐ + + + + ‐ ‐
Fosfatidiletanolamina + + + + + + + +
Sulfolípido + ‐ + + + ‐ + +
Digalactosil‐ diglicérido ‐ ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐
Glicósido de esterol ‐ + ‐ ‐ + + ‐ ‐
Monogalactosil‐diglicérido + + ‐ + + + ‐ ‐
Pigmentos y lípidos neutros + + + + + + + +
Tabla 8. Grupos de lípidos detectados en las cepas de E. gracilis fotosintéticas y heterotróficas.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 54 ‐
4.3.1.3 Flavonoides
Los flavonóides analizados, como se indica en la sección 3.4.1.4, se
muestran en la figura 12. Sólo un tipo de flavonoide, la quercetina, pudo identificarse de
acuerdo con los rf en los dos sistemas de solventes utilizados. Posiblemente el resto de
los compuestos que se observan en el perfil cromatográfico sean derivados glicosilados
de la quercetina.
Q
Figura 12: Glicosidos flavonoides detectados cromatográficamente en la cepa UTEX‐
fotosintética en fase estacionaria. Q: Quercetina.
Existen algunos reportes en la bibliografía sobre presencia de flavonoles, entre los
que se incluye a la quercetina, en algas (Nagai y Yukimoto 2003; Goud et al., 2007; García‐
Casal et al., 2009; Vijayavel et al., 2010; Yang et al., 2012) pero sería la primera vez que
este compuesto se registra en euglenoideos. Cabe destacar que sustancias relacionadas
con este tipo de flavonoides son ampliamente descriptas como antioxidantes,
antiinflamatorias, antitumorales, antisépticas, antivirales, entre otras (Saija et al., 1994;
Choi et al., 2002; Heim et al., 2002; Crespo et al., 2008).
4.3.1.1 Pigmentos
Si bien la técnica cromatográfica en papel ya no se utiliza actualmente, sigue
resultando práctica para una exploración preliminar. En este caso nos permitió
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 55 ‐
asegurar total extracción de los pigmentos, dado que en los residuos obtenidos
(Residuo II, figura 5) no quedaron pigmentos. Los pigmentos identificados por
cromatografía en placa de sílica se muestran en la figuras 14 y la tabla 10. Estos
análisis permitieron comprobar la presencia de aquellos descriptos para los Euglenofitos,
tales como clorofilas a y b, β‐carotenos, diadinoxantinas y neoxantina.
Figura 14. Esquema del perfil cromatográfico de xantofilas.
E. gracilis (cepa UTEX) Fotosintética
E. gracilis (cepa MAT) Fotosintética Pigmento
Fexp Fest Fexp Fest Β‐carotenos + + + + Clorofila a + + + + Clorofila b + + + + Diadinoxantina ‐ ‐ + + Neoxantina ‐ ‐ + +
Tabla 10. Xantofilas presentes en las 4 cepas de E. gracilis en sus dos fases de crecimiento.
4.3.2 HPLC
4.3.2.1 Pigmentos
Los resultados de los análisis mediante HPLC se muestran en las figuras 15 a 19
y las tablas 11 a 14. La extracción realizada para el análisis de pigmentos mediante HPLC
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 56 ‐
permitió obtener rendimientos entre un 33,0% (UTEX‐h‐Fest) y un 68,8% (MAT‐f‐Fest). A
continuación se presentan los espectros obtenidos para todas las cepas, destacándose los
tiempos de retención (Tr) y los máximos de absorción en el solvente de elusión, para cada
caso. Además se muestra el rendimiento de la extracción obtenido para cada cepa en sus
distintas fases de crecimiento y bajo las distintas condiciones nutricionales.
Muestra Rendimiento
de la extracción (% )
Pico Tr (min)
λ Máxima absorción
(nm) Pigmento Porcentaje
1 15,00 410, 508, 538, 608,
664
Compuesto no identificado.
31,12
2 33,50 467, 603, 648 Clorofila b' 8,40
3 39,00 431, 619, 664 Clorofila a 40,53
4 40,00 390, 415, 430, 619,
664 Clorofila a´ 10,72
UTEX‐f‐Fexp
(436 nm)
60,2
5 49,50 408, 504, 535, 606,
664
Compuesto no identificado.
9,24
Tabla 11: Porcentaje de cada uno de los compuestos detectados por HPLC, para la cepa UTEX fotosintética en fase exponencial (UTEX‐f‐ Fexp‐436 nm).
Figura 15: A) Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa UTEX fotosintética en fase exponencial (UTEX‐f‐Fexp‐ 436 nm). B) Espectro de absorción de cada compuesto detectado. Columna C18, eluyente Acetonitrilo:Agua (90:10) flujo
1ml/min, lecturas de absorbancia a 436 nm.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 57 ‐
A)
B)
Pico 1: Tr 15,00 min; Máximos de absorción: 410, 508, 538, 608, 664 nm. Compuesto no identificado.
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
Abs
orba
ncia
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Pico 2: Tr 33,50 min; Máximos de absorción: 467, 603, 648 nm. Clorofila b'.
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
Abs
orba
ncia
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
Pico 3: Tr 39,00 min; Máximos de absorción: 431, 619, 664 nm. Clorofila a.
38,896 Extracted
430,9
619,0
664,2
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
nm
400,00 450,00 500,00 550,00 600,00 650,00 Pico 4: Tr 40,00 min; Máximos de absorción: 390, 415, 430, 619, 664 nm. Clorofila a’. 300 400 500 600 700 800
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
Pico 5: Tr 49,50 min; Máximos de absorción: 408, 504, 535, 606, 664 nm. Compuesto no identificado.
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
Abs
orba
ncia
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 58 ‐
Figura 16: A) Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa UTEX fotosintética en fase estacionaria (UTEX‐f‐Fest‐ 436 nm). B) Espectro de absorción de cada compuesto detectado.
Columna C18, eluyente Acetonitrilo:Agua (90:10) flujo 1ml/min lecturas de absorbancia a 436 nm.
A)
B) Pico 1: Tr 5,30 min; Máximos de absorción: 402, 498, 516, 615, 665 nm. Compuesto no identificado. 300 400 500 600 700 800
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
Pico 2: Tr 6,10 min; Máximos de absorción: 410, 467, 502, 535, 608, 666 nm. Compuesto no identificado.
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
300 400 500 600 700 800
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
Pico 3: Tr 7,10 min; Máximos de absorción: 409, 464, 504, 535, 608, 665 nm. Neoxantina impura. 300 400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
Pico 4: Tr 8,80 min; Máximos de absorción: 421, 445, 474, 663 nm. Violoxantina impura.
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
300 400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Pico 5: Tr 10,00 min; Máximos de absorción: 410, 456, 507, 538, 609, 665 nm. Compuesto no identificado.
300 400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Pico 6: Tr 10,50 min; Máximos de absorción: 428, 456 nm. Microxantina.
300 400 500 600 700 800-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 59 ‐
Pico 7 : Tr 12.00 min; Máximos de absorción: 452, 479 nm. ‐criptoxantina impura. 300 400 500 600 700 800
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
Pico 8 : Tr 23.10 min; Máximos de absorción: 455, 583, 632 nm. Compuesto no identificado.
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
300 400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Pico 9 : Tr 24.50 min; Máximos de absorción: 465, 598, 648 nm. Compuesto no identificado.
300 400 500 600 700 800
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Pico 10: Tr 30.00 min; Máximos de absorción: 420, 614, 649 nm. Clorofila b impura.
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Pico 11: Tr 33.00 min; Máximos de absorción: 337, 386, 415, 432, 616, 663 nm. Compuesto no identificado.
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Pico 12: Tr 34.90 min; Máximos de absorción: 390, 415, 430, 617, 664 nm. Clorofila a.
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
300 400 500 600 700 800
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
Pico 13: Tr 36.50 min; Máximos de absorción: 433, 626, 666 nm. Clorofila a impura.
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
300 400 500 600 700 800-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Pico 14: Tr 46.30 min; Máximos de absorción: 412, 451, 476, 527, 604, 663 nm. Clorofila a' impura. Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
300 400 500 600 700 800-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Pico 15: Tr 54.80 min; Máximos de absorción: 409, 507, 537, 606, 665 nm. Compuesto no identificado.
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
300 400 500 600 700 800
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 60 ‐
Muestra Rendimiento
de la extracción (% )
Pico Tr (min)
λ Máxima absorción
(nm) Pigmento Porcentaje
1 5,30 402, 498, 516, 615, 665
Compuesto no identificado.
7,80
2 6,10 4.10, 467, 502, 535, 608, 666
Compuesto no identificado.
4,79
3 7,10 409, 464, 504, 535, 608, 665
Neoxantina impura. 5,03
4 8,80 421, 445, 474, 663
Violoxantina impura. 8,10
5 10,00 410, 456, 507, 538, 609, 665
Compuesto no identificado.
5,68
6 10,50 428, 456 Microxantina 3,72
7 12,00 452, 479 α‐
criptoxantina impura
3,96
8 23,10 455, 583, 632 Compuesto no identificado.
6,98
9 24,50 465, 598, 648 Compuesto no identificado.
1,83
10 30,00 420, 614, 649 Clorofila b impura 23,48
11 33,00 337, 386, 415, 432, 616, 663
Compuesto no identificado.
18,39
12 34,90 390, 415, 430, 617, 664 Clorofila a 5,14
13 36,50 433, 626, 666 Clorofila a impura 1,24
14 46,30 412, 451, 476, 527, 604, 663
Clorofila a’ impura 2,31
UTEX‐f‐Fest (436 nm)
57
15 54,80 409, 507, 537, 606, 665
Compuesto no identificado.
1,54
Tabla 12: Porcentaje de cada uno de los compuestos detectados por HPLC para la cepa UTEX
fotosintética en fase estacionaria (UTEX‐Ph‐ Fest‐436 nm).
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 61 ‐
Figura 17: A) Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa MAT fotosintética en fase exponencial (MAT‐f‐Fexp‐ 436 nm). B) Espectro de absorción de cada compuesto detectado.
Columna C18, eluyente Acetonitrilo:Agua (90:10) flujo de 1ml/min lecturas de absorbancia a 436 nm
A)
B) Pico 1: Tr 14,80 min; Máximos de absorción: 410, 476, 508, 537, 602, 665 nm. Compuesto no identificado.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Pico 2:Tr 16,00 min; Máximos de absorción: 445, 475 nm. Anteraxantina y micronona‐like.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Pico 3: Tr 18,50 min; Máximos de absorción: 428, 456 nm. ‐criptoxantina.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Pico 4 : Tr 33,00 min; Máximos de absorción: 467, 600, 649 nm. Clorofila b'. A
bsor
banc
ia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
Pico 5 : Tr 39,00 min; Máximos de absorción: 386, 415, 430, 617, 664 nm. Clorofila a.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Pico 6: Tr 41,00 min; Máximos de absorción: 385, 411, 430, 619, 664 nm. Clorofila a'.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 62 ‐
Pico 7: Tr 50,00 min; Máximos de absorción: 409, 536, 606, 661 nm. Compuesto no identificado. A
bsor
banc
ia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Pico 8: Tr 52,50 min; Máximos de absorción: 409, 507, 536, 606, 664 nm. Compuesto no identificado.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Pico 9: Tr 58,50 min; Máximos de absorción: 409, 505, 537, 606, 664 nm. Compuesto no identificado.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Muestra Rendimiento
de la extracción (% )
Pico Tr (min)
λ Máxima absorción
(nm)
Pigmento Porcentaje
1 14,80 410, 476, 508, 537, 602, 665
Compuesto no identificado.
9,84
2 16,00 445, 475 Anteraxantina y micronona‐like.
5,62
3 18,50 428, 456 ‐criptoxantina. 6,47
4 33,00 467, 600, 649 Clorofila b´ 9,56
5 39,00
386, 415, 430, 617, 664 Clorofila a 46,49
6 41,00 385, 411, 430, 619, 664 Clorofila a’ 11,72
7 50,00 409, 536, 606, 661
Compuesto no identificado. 3,84
8 52,50
409, 507, 536, 606, 664
Compuesto no identificado 3,19
MAT‐f‐ Fexp (436 nm)
68,4
9 58,50 409, 505, 537, 606, 664
Compuesto no identificado. 3,28
Tabla 13: Porcentaje de cada uno de los compuestos detectados por HPLC para la cepa MAT fotosintética en fase exponencial (MAT‐f‐Fexp‐436 nm).
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 63 ‐
Figura 18: A) Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa MAT fotosintética en fase estacionaria (MAT‐f‐Fest‐ 436 nm). B) Espectro de absorción de cada compuesto detectado. Columna C18, eluyente Acetonitrilo:Agua (90:10) flujo de 1ml/min lecturas de absorbancia a
436 nm.
A)
B) Pico 1: Tr 7,50 min; Máximos de absorción: 409, 465, 507, 536, 608, 665. Compuesto no identificado.
300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm) Pico 2: Tr 10,00 min; Máximos de absorción: 414, 445, 475, 537, 609, 665 nm. Violoxantina impura.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Pico 3: Tr 10,50 min; Máximos de absorción: 410, 508, 538, 609, 665 nm.
Compuesto no identificado.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Pico 4: Tr 12,50 min; Máximos de absorción: 428, 456 nm. Fucoxantol impuro.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
Pico 5: Tr 14,10 min; Máximos de absorción: 428, 451, 478 nm.
‐criptoxantina‐like.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 64 ‐
Pico 6: Tr 29,00 min; Máximos de absorción: 467, 602, 649 nm. Clorofila b impura.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Pico 7: Tr 30,00 min; Máximos de absorción: 467, 602, 649 nm. Clorofila b impura. A
bsor
banc
ia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Pico 8: Tr 32,00 min; Máximos de absorción: 420, 614, 660 nm. Compuesto no identificado. A
bsor
banc
ia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
Pico 9: Tr 34,50 min; Máximos de absorción: 337, 385, 414, 430, 617, 664 nm. Compuesto no identificado.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Pico 10: Tr 36,00 min; Máximos de absorción: 381, 415, 430, 617, 664 nm. Clorofila a.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Pico 11: Tr 47,00 min; Máximos de absorción: 408, 504, 535, 606, 664 nm. Clorofila a' impura.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Pico 12: Tr 54,50 min; Máximos de absorción: 409, 507, 537, 606, 665 nm. Clorofila a' impura.
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 65 ‐
Muestra
Rendimiento de la
extracción (% )
Pico Tr (min)
λ Máxima absorción
(nm) Pigmento Porcentaje
1 7,50 409, 465, 507, 536, 608, 665
Compuesto no identificado. 12,50
2 10,00 414, 445, 475, 537, 609, 665
Violoxantina impura. 8,12
3 10,50 410, 508, 538, 609, 665
Compuesto no identificado. 7,80
4 12,50 428, 456 Fucoxantol impuro. 4,59
5 14,10 428, 451, 478 ‐
criptoxantina‐like.
2,99
6 29,00 467, 602, 649 Clorofila b impura. 5,88
7 30,00 467, 602, 649 Clorofila b impura. 1,17
8 32,00 420, 614, 660 Compuesto no identificado. 1,60
9 34,50 337, 385, 414, 430, 617, 664
Compuesto no identificado. 40,81
10 36,00 381, 415, 430, 617, 664 Clorofila a 11,22
11 47,00 408, 504, 535, 606, 664
Clorofila a' impura.
2,35
MAT‐f‐ Fest (436 nm)
68,8
12 54,50 409, 507, 537, 606, 665
Clorofila a' impura. 0,96
Tabla 14: Porcentaje de cada uno de los compuestos detectados por HPLC para la cepa MAT
fotosintética en fase estacionaria (MAT‐f‐Fest‐436 nm).
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 66 ‐
A) B)
Pico 1: Tr 4,00 min Solo se detectó un pico en la zona UV que podría corresponder a proteínas
Abs
orba
ncia
Longitud de onda (nm)
300 400 500 600 700 800-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Figura 19: A) Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa MAT heterotrófica en fase exponencial (MAT‐h‐Fexp‐436 nm). B) Espectro de absorción del pico detectado en el
cromatograma. Columna C18, eluyente Acetonitrilo:Agua (90:10) flujo de 1ml/min lecturas de absorbancia a 436 nm
Las cepas heterotróficas MAT en fase estacionaria y UTEX en sus dos fases de
crecimiento también fueron analizadas mediante esta metodología pero no
presentaron picos en el rango visible, los cromatogramas fueron similares al obtenido
para la cepa MAT heterotrófica en fase exponencial, motivo por el cual no se
muestran.
Un análisis exhaustivo de los pigmentos mediante RP‐HPLC‐DAD, permitió
detectar una mayor cantidad de pigmentos que los detectados por TLC. Varios autores
han descripto los pigmentos de Euglena (Krinsky y Goldsmith, 1960; Suetsugu y Wada,
2003) indicando variaciones según las fases de desarrollo, de la intensidad de luz (Gross y
Stroz, 1975) y de algunos nutrientes del medio de cultivo (Epstein & Weiss, 1960). En
nuestro estudio, en ambas cepas se pudo observar, durante la fase estacionaria de
crecimiento, una disminución en el contenido de clorofila que se acompaña de un
aumento de los carotenoides. La situación inversa puede observarse en la fase de
crecimiento exponencial. Esta relación entre los carotenos, que parecen disminuir con el
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 67 ‐
aumento de la clorofila sintetizada, sugiere que ellos están implicados en la formación de
clorofilas. Wolken y Mellon (1956) indican que un mismo tipo de porfirinas puede
participar en la síntesis de ambos pigmentos, operando simultáneamente hacia la síntesis
de carotenoides o hacia su eliminación y síntesis de clorofila. También se han descripto
complejos clorofila‐proteínas en cepas normales y blanqueadas de E. gracilis
(Cunningham y Schiff, 1986). Si bien la neoxantina fue descripta hace varios años, no se
ha profundizado en el estudio de sus posibles aplicaciones (Krinsky et al., 1964).
4.4 Análisis de glicoconjugados mediante SDS‐PAGE
Dado que las extracciones de carbohidratos (sección 3.2.3) mostraron altos
rendimientos (tabla 6) y sus cromatografías mostraron poco contenido de carbohidratos
de bajo peso molecular, esto sugiere que en las extracciones se está obteniendo algún
otro metabolito, entre los que se descarta el polisacárido de reserva que precipita en el
proceso de extracción. Ya que las extracciones se llevaron a cabo con etanol 80% es
posible que estos rendimientos tan altos se deban a la presencia de proteínas, por lo que
se realizaron geles para detectar glicoconjugados. Por superposición de los geles
realizados como se describe en la sección 3.5 se detectó su presencia (figuras 20 y 21).
Estos agregados sólo fueron detectados en las cepas UTEX y MAT heterotróficas en sus
dos fases de crecimiento. Estas mismas cepas son las que presentaron los mayores
rendimientos de las extracciones, por lo que puede asociarse tan altos rendimientos a la
presencia de estos glicoconjugados.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 68 ‐
Figura 20: Gel revelado con Coumassie brillant blue para la detección de proteínas.
Figura 21: Gel revelado PA‐Schiff para la detección de carbohidratos.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 69 ‐
5. CONCLUSIONES
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 70 ‐
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon. ‐ 71 ‐
En este trabajo de tesis, hemos realizado un cribado químico exploratorio de los
metabolitos primarios y secundarios de E. gracilis. Los resultados muestran que esta
especie puede considerarse una fuente importante de metabolitos con potencial valor
biotecnológico. Este análisis nos brinda además, una base para futuros estudios,
posibilitando una mejor caracterización de los compuestos químicos de interés a partir de
extracciones exhaustivas y específicas, información necesaria para su cuantificación y la
elaboración de planes de desarrollo.
Al analizar los resultados obtenidos con distintas cepas de E. gracilis, hemos
podido comprobar que las cepas pigmentadas son las que mostraron un mayor
rendimiento en cuanto a la producción de biomasa. El estudio de la producción de
metabolitos secundarios nos permite afirmar que estas cepas, crecidas en un medio rico
en materia orgánica, serían potenciales productoras de compuestos polifenólicos como
los flavonoides y taninos, asociados principalmente a actividades antioxidantes, pero
también mencionados como responsables de otras bioactividades que les otorgan valor
farmacológico. Por este motivo las cepas fotosintéticas serían las más apropiadas para
estudios biotecnológicos. Por otra parte este tipo de compuesto sólo se detectó en fase
estacionaria de crecimiento.
Por último, no se puede descartar otras posibles aplicaciones de otros
compuestos detectados en la biomasa de E gracilis como los triterpenos y cardenólidos,
conocidos por ser eficaces en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.
Sección II‐ Cribado químico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon.
‐ 72 ‐
SecciónIICribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 75 –
INTRODUCCIÓN
‐ 76 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 77 – 1.1 El Cribado Farmacológico
El verdadero objetivo de la investigación farmacognóstica es poder descubrir
nuevos compuestos para usos medicinales o agrícolas. Por esta razón, uno de los
primeros pasos en la investigación de productos naturales es determinar si los
extractos de las especies en estudio son activos (cribado biológico o farmacológico).
Los ensayos biológicos se vuelven entonces ineludibles y se realizan con el fin de
identificar extractos de organismos para determinar si poseen efectos bioquímicos o
celulares, así como también para guiar la separación, aislamiento y la evaluación de los
componentes principales de los extractos analizados. La actividad de los extractos o
compuestos aislados se evalúa mediante ensayos biológicos, que consisten en la
medición de la potencia relativa o la actividad de compuestos. Esto se logra
determinando la cantidad necesaria de ese compuesto o mezcla para producir bajo
condiciones estándares, un efecto en un animal de prueba u órgano apropiado. Sin
embargo, en su sentido más amplio, un ensayo biológico puede implicar observaciones
o mediciones de los efectos obtenidos en cualquier sistema biológico, para la
detección de propiedades de un extracto crudo, fracción cromatográfica, mezcla o
compuesto puro.
La mayoría de los agentes terapéuticos disponibles son sustancias de
composición química conocida que se pueden ensayar mediante análisis químicos o
físicos cuantitativos. Sin embargo, algunas drogas, principalmente las de origen
natural, no pueden ser ensayadas mediante estas técnicas por lo que se usan métodos
biológicos. Los procesos de estandarización biológica son en general menos precisos,
más costosos e insumen más tiempo (Snitkoff, 2000), por lo que se los reserva para
casos en los que:
1. La identidad química del principio activo no ha sido establecida por completo,
2. No se ha desarrollado un ensayo químico adecuado para medir el principio activo,
aunque su estructura química haya sido dilucidada,
3. El principio activo es una mezcla compleja de sustancias de estructura y actividad
variada,
‐ 78 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
4. La purificación de la droga cruda necesaria para un ensayo químico no es posible o
no es práctica,
5. El ensayo químico no es una indicación válida de la actividad biológica debido a, por
ejemplo, la falta de diferenciación entre isómeros activos e inactivos.
Los bioensayos pueden implicar el uso de sistemas in vivo (ensayos clínicos,
experimentos usando un determinado organismo), sistemas ex vivo (usando tejidos
aislados y órganos) o en sistemas in vitro (utilizando por ejemplo cultivos celulares).
Los estudios in vivo son más relevantes para las condiciones clínicas y a su vez puede
proporcionar datos sobre la toxicidad. Las desventajas de estos estudios son los altos
costos, la necesidad de contar con una gran cantidad de compuesto o fracción a
probar, la complejidad de su diseño y la dificultad para determinar sus mecanismos de
acción. Los bioensayos in vitro son más rápidos y requieren pequeñas cantidades de
compuestos, pero puede que no sean pertinentes a las condiciones clínicas. Pese a
esto, la tendencia actual es la utilización de ensayos in vitro en reemplazo de los in
vivo. Ambos tipos deben procurar una metodología rápida, sencilla, en general
económica, poca cantidad de muestra, y deben tener la capacidad de detectar una
amplia gama de actividades. Los bioensayos disponibles en la actualidad son robustos,
específicos y sensibles incluso utilizando picogramos del compuestos de prueba
(Meyer et al., 1982, McLaughlin, 1991; McLaughlin et al., 1993, Desmarchelier, et al.,
1995).
Para este tipo de ensayos hay que tener en cuenta los siguientes puntos básicos
(Cannell, 1998):
1. Las muestras disueltas o en suspensión, en un solvente distinto al solvente de
extracción original, deben ser filtradas o centrifugadas para eliminar cualquier material
insoluble.
2. Las muestras acidificadas o basificadas se deben reajustar a su pH, para evitar que
interfieran con el ensayo.
3. En todos los análisis, deben ser incorporados controles positivos y negativos.
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 79 – 4. Idealmente, la prueba debe ser al menos semicuantitativa y/o las muestras deben
ser analizadas usando una serie de diluciones, para determinar dónde reside la
mayoría de los compuestos diana.
5. El ensayo debe ser lo suficientemente sensible para detectar componentes activos
en baja concentración.
Las etapas fundamentales son dos: un cribado primario (general o preliminar) y
uno secundario (específico o de orden superior). En cada una de ellas se realizan uno o
más bioensayos, utilizando los extractos y/o los productos purificados.
1.2 Cribado primario
En particular, el cribado biológico primario puede involucrar ensayos de
actividad antibiótica, test de inhibición in vitro, ensayos con invertebrados como
Artemia sp. o insectos y algunos ensayos bioquímicos. No se incluyen en esta etapa los
ensayos biológicos que utilicen animales vertebrados o clínicos humanos.
Actividad antibiótica: El término ensayo microbiano o microbiológico puede
implicar observaciones o mediciones en microorganismos como bacterias, levaduras u
hongos. En general, los principios involucrados en los ensayos microbiológicos son
iguales a los empleados para organismos superiores, sin embargo, una diferencia
destacable es el tamaño poblacional, por lo que los resultados obtenidos en un cultivo
conforman la respuesta promedio de una población extremadamente grande de
microorganismos de prueba. En el caso de los ensayos antimicrobianos se evalúa la
potencia de las sustancias antibióticas. El efecto se mide por la inhibición del
crecimiento de una cepa apropiada de microorganismos, es decir, la prevención de la
multiplicación de los microorganismos de prueba. Los procedimientos empleados en
los ensayos antimicrobianos pueden ser en placa o turbidimétricos. Con los ensayos en
placa se cuantifica la potencia del antibiótico midiendo el halo de inhibición del
crecimiento microbiano que rodea un disco de papel embebido en la sustancia de
prueba. Para ello se usan distintas diluciones de la sustancia a probar, colocándolas
sobre la superficie de un medio nutritivo sólido, inoculado previamente con el
microorganismo de prueba. La inhibición lograda se compara con la producida por
‐ 80 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
concentraciones conocidas de un estándar de referencia. En cambio, en los ensayos
turbidimétricos la inhibición del crecimiento microbiano se estima por medición de la
turbidez de la suspensión de microorganismos, en un medio líquido al cual se le ha
agregado diferentes cantidades del compuesto a ensayar.
Test de inhibición in vitro: En este tipo de bioensayo se utilizan semillas
(generalmente de trigo -Trit icum sat ivum - de una variedad ident ificada) que se
germinan en condiciones naturales con agua corriente (control negativo), en presencia
de un antitumoral conocido (Vinblastina SO42‐, control positivo) y de distintas
concentraciones de los extractos y/o productos a analizar. Al cabo de 72 horas, se
calcula el porcentaje de inhibición, en base a la longitud de la raíz de mayor longitud
del control negativo (100 % de crecimiento). Se trata de un ensayo muy preciso, fiel,
económico y que además permite inferir la posibilidad de que la muestra contenga un
producto antitumoral (Mongelli et al., 1995). También puede ocurrir que la muestra en
lugar de inhibición del crecimiento provoque estimulación, lo cual permite evaluar la
presencia de sustancias fitoestimulantes.
Test de Artemia sp: las larvas del crustáceo Artemia salina (nauplii) o de otras
especies de igual género fueron sugeridas como una sonda conveniente para evaluar
las actividades farmacológicas de los extractos de productos naturales, ya que ellos
pueden manifestar cierta toxicidad hacia los nauplios recién eclosionados. Este ensayo
tiene la ventaja de ser rápido (24 horas), bajo costo y sencillo ya que no se requieren
técnicas asépticas. Se pueden utilizar fácilmente un gran número de organismos que
pueden estar continuamente disponibles, lo que resulta ventajoso para las
consideraciones estadísticas. Además no requiere ningún equipo o formación especial
y se puede utilizar una cantidad relativamente pequeña de muestra. Los compuestos
activos obtenidos de este modo podrían entonces ser sometido a bioensayos más
específicos (McLaughlin et al., 1998).
Ensayos bioquímicos: Algunos ensayos pueden realizarse sin usar material
biológico, es el caso de la estimación de la capacidad antioxidante por el método del
radical 2,2'‐difenil‐1‐picrilhidrazilo o DPPH�. Un radical libre es cualquier especie
química ya sea atómica o molecular, capaz de existir independientemente y que
contiene un electrón desapareado en el orbital más externo. Este electrón genera un
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 81 – campo eléctrico que no es anulado, lo que ocasiona que la especie química sea
paramagnética y por ende altamente reactiva, capaz de actuar en los sistemas
biológicos dañándolos irreversiblemente (Venereo, 2002).
El estrés oxidativo se produce cuando, por exposición de materia viva a diversas
fuentes, se desencadena una ruptura del equilibrio que debe existir entre las
sustancias o factores prooxidantes y los mecanismos antioxidantes encargados de
eliminar dichas especies químicas. Dicho desequilibrio se puede producir por un déficit
de estas defensas o por un incremento exagerado de la producción de especies
reactivas. El estrés oxidativo trae como consecuencia alteraciones en la relación
estructura‐función de biomoléculas de vital importancia, en cualquier órgano, sistema
o grupo celular especializado, ocasionando un daño oxidativo que puede llevar a un
estado patológico y a la muerte celular (Amic et al., 2003).
El radical libre 1,1‐difenil‐2‐picrilhidrazilo (DPPH), es un indicador para medir la
capacidad de secuestro de cualquier compuesto con actividad antioxidante,
especialmente de los compuestos fenólicos.
El fundamento de esta técnica consiste en la medición a 517 nm de la reducción
del radical estable 1,1‐difenil‐2‐picril hidrazilo (DPPH�). Su mecanismo de reacción
consiste en la sustracción de un átomo de hidrógeno proveniente de un donor (AH)
para generar difenilpicrilhidrazina y una especie radicalaria (R�) según la siguiente
reacción:
DPPH� + AH DPPH + A�
DPPH� + R� DPPH‐R
La reacción produce un cambio de color violeta a amarillo, lo que lleva a una
disminución de la absorbancia a 517 nm, de las soluciones alcohólicas de DPPH en
presencia de agentes antioxidantes (ej. compuestos fenólicos). Es un método sensible
y rápido, que no es afectado por la polaridad de la muestra, y además se aplica en
‐ 82 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
general a todos los fenoles porque sus oxidrilos son muy reactivos y se oxidan
fácilmente.
1.3 Cribado secundario
Los extractos que posean actividad biológica marcada en el cribado primario
pasan a ser analizados en un cribado secundario, en el que se emplean bioensayos más
específicos, que generalmente son de respuesta más lenta y tienen mayor complejidad
y costo que los primarios. En el cribado secundario, suelen estimarse las actividades
antiviral, citotóxica, antitumoral, antineoplásica, inmunosupresora, antimalárica,
amebicida y antimicobacterias, entre otras.
Este cribado farmacológico, ya sea general o específico, produce sólo
probabilidades sobre la actividad que la muestra tendría en, por ejemplo, un ser
humano enfermo.
Cuando la investigación está asociada a ensayos específicos de actividad
biológica, el análisis fitoquímico permite identificar, analizar y caracterizar fracciones o
sustancias bioactivas presentes en una determinada especie. Como se mencionó en la
sección anterior, E. gracilis es una especie a la que no se le atribuyen propiedades
medicinales, pero que sin embargo ha mostrado resultados interesantes en el cribado
químico así como diversos patrones entre cepas y fases de crecimiento en cultivo. Por
este motivo se desarrolló un cribado biológico preliminar (primario) que permitiera
interpretar los resultados del cribado químico. En esta sección se presentan los
resultados del cribado farmacológico de los extractos de dos cepas de E. gracilis libres
de paramilon, en diferentes condiciones nutricionales (heterotrófica y autotrófica) y en
dos de sus fases de desarrollo en cultivo.
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 83 –
2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
‐ 84 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 85 – 2.1 Hipótesis
Sobre la base de los resultados del que cribado químico, se espera que los
extractos alcohólicos de algunas de las cepas de Euglena gracilis en estudio
posean actividad antioxidante frente a radicales libres por ser potencial
productora de polifenoles.
Dado que además de la actividad antioxidante, los polifenoles son compuestos
con propiedades farmacológicas, los extractos alcohólicos de algunas de las cepas
en estudio podrían resultar bioactivos.
Dado que en el cribado químico, las fracciones no alcoholicas mostraron la
presencia de esteroides, triterpenos y cardenólidos (resultados mostrados en la
sección 1 de este capítulo), estas fracciones también podrían resultar bioactivas.
2.2 Objetivos Generales
Realizar ensayos biológicos primarios in vitro con los extractos de 2 cepas de
Euglena gracilis, obtenidos bajo distintas condiciones nutricionales y en diferente
etapa de desarrollo en cultivo, para poder evaluar distintos tipos de actividades.
2.3 Objetivos específicos
Evaluar la actividad antioxidante total de los extractos metanólicos de E. gracilis.
Evaluar la actividad tóxica en dos sistemas biológicos, un modelo animal (Artemia
salina) y un modelo vegetal (Triticum sativum).
Evaluar la actividad antibacteriana frente a cepas Gram negativas (Escherichia coli
y Pseudomonas putida) y Gram positiva (Bacillus subtilis).
Evaluar la actividad antifúngica frente a cepas fitopatógenas (Oxyporus
latemarginatus, Bjerkandera adusta, Coriolus villosus y Fusarium oxysporum sp.
medicaginis).
‐ 86 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 87 –
3. MATERIALES Y MÉTODOS
‐ 88 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 89 – 3.1 Microorganismos, condiciones de cultivo, obtención de la biomasa y
fraccionamiento
Se trabajó con cultivos axénicos de 2 cepas de Euglena gracilis (MAT y UTEX). En
todos los casos se trabajó además, con una variedad fotosintética (‐f) y otra blanqueada,
heterotrófica (‐h) obtenida por tratamiento con estreptomicina (Ebringer et al., 1970). Las
cepas fueron mantenidas bajo luz continua, a 24±2 °C, en medio EGM (CCPA, 2001). La
biomasa se obtuvo por centrifugación, a 4 °C, a los 4 días de realizado el inóculo (fase
exponencial, Fexp) y a los 8 días (fase estacionaria, Fest). Una vez obtenida, la biomasa
fue sometida a lavados exhaustivos con agua destilada a 4 °C, para evitar la
contaminación con el medio de cultivo. Por último, se secó por liofilización y pesada.
Para llevar a cabo el cribado farmacológico, se efectuó una extracción general y
fraccionamiento de igual modo al utilizado en el cribado fitoquímico (sección 1, 3.2.1).
3.2 Actividad Antioxidante por el método de actividad secuestradora del radical 1,1‐
difenil‐2‐picrilhidrazilo.
Las fracciones A y B, generadas en el fraccionamiento, se ensayaron para
determinar si poseen actividad antioxidante mediante el método de 2,2'‐difenil‐1‐
picrilhidrazilo (DPPH), utilizando como control positivo t‐butil‐hidroxitolueno (BHT, Koleva
et al., 2002). Para ello las fracciones se evaporaron bajo presión reducida y se registró el
peso del residuo generado. Para la cuantificación de la actividad se prepararon las
siguientes soluciones:
a) Blanco de reactivo: muestra la absorbancia del reactivo como tal cuando no se
reduce. Consiste en una mezcla DPPH� y etanol.
b) Blanco de muestra: se realiza para determinar la absorbancia de la muestra sola
y de sus pigmentos en caso de tenerlos. Está compuesto por la muestra y etanol como
diluyente a distintas concentraciones.
c) Muestras: se realiza para determinar la absorbancia del reactivo (DPPH�)
cuando está en contacto con diferentes concentraciones de un agente reductor. Está
compuesta por la muestra, etanol como diluyente a distintas concentraciones y el
reactivo (DPPH�).
Las soluciones alcoholicas de DPPH� 0,3 mM se prepararon de manera diaria y se
reservaron a 4 °C entre mediciones, se mezclaron con diferentes diluciones de cada una
‐ 90 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
de las fracciones (5 diluciones de cada una) o con una solución de BHT 0,18 mM (control
positivo). Las muestras se incubaron por 30 minutos, en oscuridad, a temperatura
ambiente, y se midió la absorbancia a 517 nm, utilizando etanol como línea de base para
el espectrofotómetro. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. La
capacidad atrapante, es decir la capacidad de remoción de radicales de las muestras
ensayadas se expresó como porcentaje de inhibición del radical DPPH� (% SC) para cada
dilución, de cada muestra, de acuerdo con lo establecido por Yen and Duh (1994), según
la siguiente ecuación:
% SC= 100 ‐ [(Abs517 Muestra‐ Abs517 blanco) x 100]/Abs517 control
La capacidad atrapante del 50% de los radicales DPPH� (SC50) fue calculada
mediante regresión lineal, donde la abscisa representa la concentración del extracto
ensayado y la ordenada al origen el porcentaje de inhibición del radical DPPH�, promedio
de las tres réplicas (% SC, Choi et al., 2002b).
3.3 Toxicidad
3.3.1 Inhibición del crecimiento en raíces de trigo
Todas las fracciones (A a D) generadas en el fraccionamiento se ensayaron para
determinar si poseen actividad inhibitoria del crecimiento radicular en Triticum sativum.
Las fracciones no polares se solubilizaron en DMSO 2% . Para llevar a cabo el ensayo se
seleccionaron semillas de T. sativum, que se colocaron sobre papel de filtro en placas de
petri de 14 cm de diámetro y se les adicionaron 10 ml de agua corriente. Las placas se
colocaron en oscuridad durante 48 horas, a fin de que se produzca la germinación de las
semillas. Una vez germinadas, se tomaron fotografías de las raíces, que luego se midieron
utilizando el software ImageJ (National Institute of Health). Las semillas germinadas se
pasaron a nuevas placas de petri con papel de filtro, en cada una se colocaron 5 semillas y
se trabajó por duplicado. Las placas de petri de 5 cm fueron entonces regadas con 1,5 ml
de las soluciones a ensayar, agua corriente o vinblastina SO42 (0,02% ) en el caso de los
controles negativo y positivo, respectivamente. Las placas fueron selladas con parafilm e
incubadas en oscuridad a 24 °C por 72 horas. Luego se registró la longitud promedio de
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 91 – las raíces y se estimó el porcentaje de inhibición del crecimiento radicular, tomando
como 100% las semillas tratadas con agua de red.
3.3.2 Toxicidad frente a Artemia salina
Se desinfectaron quistes de Artemia salina, colocándolos en una solución de
hipoclorito de sodio al 2% por 45 minutos. Luego se colocaron los quistes sobre un filtro y
se lavaron exhaustivamente, con agua destilada estéril, para la eliminación del cloro.
Los quistes se pasaron entonces a un dispositivo de eclosión, con medio salino 15
‰, previo lavado y enjuague del recipiente con la solución de hipoclorito de sodio al 2% y
agua destilada estéril. Los quistes se mantuvieron en el dispositivo, bajo aireación
constante desde el fondo, para permitir una hidratación pareja, a temperatura ambiente
y bajo iluminación constante por 48 horas. El medio salino fue preparado por disolución
de sal marina comercial “Marinemix professional” en agua destilada. El medio fue filtrado
al vacío y se ajustó el pH a 8,5‐9,0 con buffer Na2CO3 0,5 M (2 ml/l de medio salino).
Luego de la eclosión de los nauplii, estos se recolectaron mediante iluminación
puntual intensa con pipeta Pasteur y se pasaron a placas de petri de 5 cm de diámetro,
con medio salino limpio 28 ‰. Se tomaron al azar los nauplii que se utilizaron en el test,
colocando 20 de ellos en cada placa, con las diferentes fracciones solubilizadas en medio
salino 28 ‰ (las fracciones a ensayar no polares se prepararon con DMSO al 2% ). Las
placas fueron incubadas por 24 horas a 24± 2 °C, con iluminación constante. Al cabo de la
incubación se contaron los naupliis sobrevivientes (Meyer et al., 1982).
3.4 Actividad antibacteriana
Se ensayó la actividad antibacteriana de los extractos sobre tres cepas de
bacterias, provistas por el laboratorio de Microbiología del Departamento de Química
Biológica de la FCEN:
‐Pseudomonas putida (cepa KT2440)
‐Bacillus subtilis (cepa 168)
‐Escherichia coli (cepa JM109)
Las cepas se mantuvieron en agar nutritivo (extracto de carne 3gr; peptona 5gr;
agar 15gr; agua destilada c.s.p. 1000 ml) hasta el momento del ensayo. Una colonia de
‐ 92 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
cada cepa fue transferida a medio líquido (caldo nutritivo de igual composición al agar
nutritivo, a excepción del agar) e incubada 24 horas a 36 °C. Posteriormente se realizaron
diluciones de los cultivos, bajo flujo laminar, hasta obtener una suspensión bacteriana
equivalente a 0,5 de la escala de Mc Farland (DO600= 0,05 para todas las cepas).
Se prepararon placas de petri estériles con agar Mueller Hinton (MH) y bajo flujo
laminar se embebieron discos para antibiogramas, con 20 μl de cada extracto (Fracciones
A‐D), a diferentes concentraciones y antibiótico según correspondiera. Las fracciones a
ensayar no polares se resuspendieron con DMSO al 2,5% .
Bajo flujo laminar, se inocularon las placas MH con 0,1 ml de una suspensión
bacteriana equivalente a 0,5 de la escala de Mc Farland y se formó un césped usando un
rastrillo.
Sobre las placas inoculadas se apoyaron los discos con los extractos y antibióticos,
sin usar más de 5 discos en la misma placa (NCCL, 2000). Se cerraron las placas, se
sellaron con parafilm y se incubaron por 24 horas a 36 °C. Al cabo de la incubación se
retiraron las placas y se observó la formación de halos de inhibición.
Estos ensayos se repitieron a fin de analizar dicha actividad, pero utilizando los
compuestos extracelulares de Euglena gracilis. Para esto se embebieron discos para
antibiogramas con una suspensión de células de Euglena gracilis. Esta suspensión se
tomó a diferentes tiempos de desarrollo en cultivo, bajo distintas condiciones
nutricionales. Por un lado se analizó el exudado de las células crecidas en un medio
orgánico (EGM; CCPA, 2001) y por otro el de las células crecidas en un medio mineral, con
agregado de una fuente de carbono (Buetow, CCPA, 2001). Como controles se utilizaron
los medios frescos y antibióticos.
3.5 Actividad antifúngica
Bajo flujo laminar, se embebieron discos para antibiogramas con 20 μl de cada
extracto (fracciones A a D). Las fracciones a ensayar no polares se resuspendieron con
DMSO al 6,5% . Los controles fueron DMSO 6,5 al % y discos sin embeber.
Se prepararon placas de petri estériles con medio Agar‐Malta (extracto de malta
20 g, agar 15 g, agua destilada 1000 ml). Para estos estudios se trabajó con hongos
fitopatógenos y degradadores de madera, provistos por el laboratorio de Micología,
Fitopatología y Liquenología (PRHIDEB – CONICET): Fusarium oxysporum sp.medicaginis
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 93 – (cepa 126), Oxyporus latemarginatus (cepa 444) Bjerkandera adusta (cepa 2197) y
Coriolus villosus (cepa 145).
Bajo flujo laminar, se embebieron discos para antibiogramas con 20 μl de cada
extracto, a diferentes concentraciones.
Luego se inocularon placas con agar‐malta con un fragmento de cada uno de los
hongos mencionados y se apoyaron sobre estas placas los discos embebidos en los
extractos. Las placas se cerraron, se sellaron con parafilm y se incubaron una semana a
25°C. Se midieron los radios formados por los hongos cada 24 horas durante esa semana.
Dado que se detectó la formación de una sal, durante la obtención de la fracción
D, se decidió proceder a hacer los procesos de extracción pero sin el agregado de
biomasa algal. También se ensayó la actividad antifúngica de esta sal.
‐ 94 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 95 –
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
‐ 96 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 97 – 4.1 Actividad Antioxidante por el método de DPPH
Para determinar la actividad antioxidante se aplicó el método del DPPH. Muchas
especies de radicales de diferente reactividad están implicadas en la propagación de la
oxidación y pueden ser utilizadas en la evaluación de la de eliminación de radicales libres.
Sin embargo, se prefiere a menudo el uso de radicales relativamente estables como lo
son el DPPH● o el ABTS●+ (Miller et al., 1993; Brand‐Williams et al., 1995; Fogliano et al.,
1999). El radical estable DPPH● ha sido ampliamente uピlizado en estudios de acピvidad
antioxidante de diversos compuestos aislados (Brand‐Williams et al., 1995; Sánchez‐
Moreno et al., 1998), extractos de plantas (Imai et al., 1994; Yen y Duh, 1994; Duh y Yen,
1997) e incluso en alimentos (Yamaguchi et al., 1998). Esto se debe a que es muy rápido,
no requiere instrumentación especial, es reproducible y sensible. Esto lo hace
particularmente conveniente para el cribado de un gran número de muestras que
además pueden presentar diferente polaridad. El método no discrimina las diferentes
especies de radicales, pero da una idea general acerca de la capacidad de inactivación de
radicales.
En las figuras 1 y 2 pueden observarse las regresiones lineales que permitieron
calcular la capacidad atrapante 50 (SC50), de cada una de las fracciones (A y B), de las
cepas de E. gracilis, obtenidas bajo las condiciones nutricionales analizadas. La tabla 1
muestra las dosis que logran remover el 50% de los radicales DPPH● (SC50) en cada caso.
En nuestro estudio, el método se aplicó a un antioxidante conocido (BHT) y a una serie de
extractos de las diferentes cepas de E. gracilis (tabla 1). Considerando que una muestra
posee buena actividad antioxidante cuando la SC50 es menor a 250 µg/ml de extracto,
puede afirmarse que se detectó actividad antioxidante en las fracciones de mayor
polaridad (fracciones A) de las cepas UTEX‐f‐ Fexp (SC50 = 157,25 µg/ml), UTEX‐f‐ Fest (SC50
= 240,06 µg/ml) y MAT‐f‐ Fest (147,7 µg/ml), todas ellas positivas en el cribado químico
para polifenoles, sugiriendo la presencia de taninos, flavonoides y oxidrilos fenólicos,
quienes podrían ser los responsables de la alta actividad frente al radical DPPH●.
Dado que el método del DPPH no se ve afectado por la polaridad de la muestra,
ello nos permitió estudiar las fracciones poco polares (fracciones B), que también
resultaron ser antioxidantes, es el caso de las cepas UTEX‐h‐Fest (SC50 = 123,4 µg/ml),
UTEX‐f ‐ Fest (SC50 = 91 µg/ml), UTEX‐f ‐ Fexp (SC50= 195,4 µg/ml), MAT‐f‐Fest (SC50 = 179,3
µg/ml) y MAT‐f‐Fexp (SC50 = 233,6 µg/ml).
‐ 98 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
FRACCIÓN A FRACCIÓN B
MAT‐f‐Fexp
MAT‐f‐Fest
0 50 100 150 200 2500
20
40
60
80
100R2 = 0,9943SC50= 233,61
Concentración (g/ml)
%SC
0 200 400 6000
20
40
60
80
100R2 = 0,9879SC50= 654,35
Concentración (g/ml)
%SC
0 100 200 300 400 5000
20
40
60
80
100
R2 = 0,9891SC50= 147,71
Concentración (g/ml)
%SC
0 100 200 300 400 5000
20
40
60
80
100R2 = 0,8361SC50= 179,31
Concentración (g/ml)
%SC
MAT‐h‐Fexp
Figura 1: Regresiones lineales para el cálculo de la capacidad atrapante 50 (SC50) de las fracciones A y B de las cepas MAT fotosintética y heterotrófica en fases de crecimiento exponencial y
estacionaria.
MAT‐h‐Fest
0 200 400 6000
20
40
60
80
100R2 = 0,877
SC50= 1453,69
Concentración (g/ml)
%SC
100
80
60
40
20
00 200 400 600
R2 = 0,9208SC50= 746,88
Concentración (g/ml)
%SC
0 200 400 6000
20
40
60
80
100R2 = 0,9711
SC50= 1117,26
Concentración (g/ml)
%SC
100
80
60
0 200 400 6000
40
20
R2 = 0,934SC50= 555,86
Concentración (g/ml)
%SC
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 99 –
FRACCIÓN A FRACCIÓN B
UTEX‐f‐Fexp
UTEX‐f‐Fest
UTEX‐h‐Fexp
UTEX‐h‐Fest
0 50 1000
20
40
60
80
100 R² = 0,998SC50=195,37
Concentración (g/ml)
%SC
0 100 200 3000
20
40
60
80
100 R2 = 0,876SC50= 157,25
Concentración (g/ml)
%SC
0 100 200 3000
20
40
60
80
100R2 = 0,9995SC50= 240,06
Concentración (g/ml)
%SC
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
100 R² = 0,986SC50= 90,97
Concentración (g/ml)
%SC
0 200 400 6000
20
40
60
80
100R2 = 0,9751SC50= 454,51
Concentración (g/ml)
%SC
0 200 400 6000
20
40
60
80
100R2 = 0,8735SC50= 754,23
Concentración (g/ml)
%SC
0 200 400 6000
20
40
60
80
100
R2 = 0,9895SC50= 123,41
Concentración (g/ml)
%SC
0 200 400 6000
20
40
60
80
100R2 = 0,8566SC50= 2150,68
Concentración (g/ml)
%SC
Figura 2: Regresiones lineales para el cálculo de la capacidad atrapante 50 (SC50) de las fracciones A y B de las cepas UTEX fotosintética y heterotrófica en fases de crecimiento exponencial y
estacionaria.
‐ 100 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
MAT UTEX Fracción Fase
fotosintética heterotrófica fotosintética Heterotrófica
Fexp 654,4 1453,7 157,3 454,5 A
Fest 147,7 1117,3 240,1 2150,7
Fexp 233,6 746,9 195,4 754,2 B
Fest 179,3 555,9 91 123,4
Tabla 1: Resultados de la cuantificación de actividad antioxidante expresados como SC50 (µg/ml) de los extractos A y B de las cepas de E. gracilis fotosintéticas y heterotróficas.
La actividad antioxidante en Euglena gracilis siempre ha sido vinculada a la
presencia de vitamina E y C y ß‐Carotenos (Takeyama et al., 1997), dado que estas
sustancias son poco polares, podrían ser las responsables de esta actividad en la fracción
B. En tanto que los polifenoles y otros compuestos polares estarían relacionados a la
capacidad antioxidante de la fracción A. Hasta el momento no había sido citada esta
asociación en E. gracilis.
4.2 Análisis de toxicidad
4.2.1 Inhibición del crecimiento en raíces de trigo
En las Figuras 3 y 4 se muestran los efectos sobre las longitudes alcanzadas por las
raíces de trigo, de la fracción A obtenida a partir de las diferentes cepas algales testeadas,
en sus diferentes condiciones nutricionales y fases de crecimiento en cultivo, agua de red
y vinblastina como controles negativo y positivo respectivamente.
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 101 –
Figura 3: Longitud de las raíces de T. sativum en presencia del extracto A de la cepa UTEX fotosintética (A) y heterotrófica (B) en fase exponencial y estacionaria de crecimiento. (* P˂0,05).
A partir de la figura 3 puede observarse que la fracción A de las cepas UTEX
fotosintética y heterotrófica en fase estacionaria, mostraron una disminución en la
elongación de las raíces de T. sativum, la cual resultó dependiente de la concentración.
Con la fracción obtenida de las cepas UTEX en fase exponencial, si bien con la menor
concentración ensayada se produjo una disminución en la elongación de las raíces, a la
mayor concentración se revirtió el efecto.
Un comportamiento inverso pudo observarse en las raíces tratadas con las
fracciones A de las cepas MAT (figura 4). Esta fracción obtenida de las cepas MAT en fase
exponencial, mostraron una disminución dependiente de la concentración en la
elongación de las raíces de T. sativum. Al tratar las raíces con la fracción obtenida de las
cepas MAT en fase estacionaria, se observó que con la mayor concentración de extracto
hubo longitudes mayores, similares al control.
A B
0
1
2
3
4
UTEX‐f‐Fexp UTEX‐f‐Fest
*
*
*
Vimblastina0,02 mg/ml
Aguade red
0,05 mg/ml 0,1mg/ml
Longitud
de raices
deT. sativum
(mm)
0
1
2
3
4
UTEX‐h‐Fexp UTEX‐h‐Fes t
*
Vimblastina0,02 mg/ml
Aguade red
0,05 mg/ml 0,1mg/ml
Longitud
de raices
deT. sativum
(mm)
‐ 102 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Figura 4: Longitud de las raíces de T. sativum en presencia del extracto A de las cepas MAT fotosintética (A) y heterotrófica (B) en fase exponencial y estacionaria de crecimiento. (* P˂0,05).
En la tabla 2 se muestra los porcentajes de inhibición del crecimiento de las raíces
de T. sativum tratadas con los extractos A. Se puede ver que las fracciones A produjeron
variaciones en el crecimiento de la raíz, dependiente de la concentración. En las cepas
UTEX fotosintética y heterotrófica, en fase estacionaria, y en las cepas MAT fotosintética
y heterotrófica en fases exponenciales hubo inhibición del crecimiento. En cambio,
algunas de las concentraciones de las fracciones A de las cepas UTEX fotosintética y
heterotrófica en fases exponenciales, estimularon el crecimiento de las raíces. Idénticos
resultados se obtuvieron con los extractos de las cepas MAT fotosintética y heterotrófica
en fases estacionarias de crecimiento.
0
1
2
3
4
MAT‐f‐Fexp MAT‐f‐Fest Vimblastina0,02 mg/ml
Aguade red
0,05 mg/ml 0,1mg/ml
A
* *
Longitud
de raices
deT. sativum
(mm)
B
0
1
2
3
4
MAT‐h‐Fexp MAT‐h‐Fest
*
*
Vimblastina0,02 mg/ml
Aguade red
0,05 mg/ml 0,1mg/ml
Longitud
de raices
deT. sativum
(mm)
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 103 –
Cepa Fase Concentración (mg/ml) Inhibición (% ±SD)
0,05 33,9±10,7 Est
0,1 70,9±2,4 0,05 60,7±1,8
UTEX‐f Exp
0,1 (17,9±7,8) 0,05 48,7±13,6
Est 0,1 (16,9±3,4) 0,05 29,1±3,4
MAT‐f Exp
0,1 45,3±0,6 0,05 17,9±8,8
Est 0,1 41,9±7,7 0,05 20,2±6,1
UTEX‐b Exp
0,1 (17,85) 0,05 95,5±1,5
Est 0,1 (11,4±4,4) 0,05 28,2±2
MAT‐b Exp
0,1 57,3±4,9 Agua de red ‐ 0 Vinblastina 0,02 57,6±2,9
Tabla 2: Porcentaje de inhibición de las raíces de T. sativum.
Los datos entre paréntesis representan % de crecimiento de las raíces por estimulación al ser tratados con las fracciones respectivas.
En una etapa inicial del cribado farmacológico, la actividad antitumoral puede ser
inferida por bioensayos simples, tales como la inhibición del crecimiento de semillas de
trigo (Desmarchelier et al., 1995). Anteriormente el paramilon de Euglena gracilis fue
reportado como agente antitumoral, al ensayarse su efecto sobre ratones balb‐c
(Quesada et al., 1976). En este estudio se muestran evidencias de actividad inhibitoria del
crecimiento con la fracción A que carece de paramilon, ya que éste permanece en el
residuo de la primera extracción. Los resultados del ensayo de inhibición del crecimiento
de las raíces de trigo sugieren que los fenoles, presentes en este extracto, pueden ser los
responsables de la inhibición del crecimiento, pero no son datos concluyentes, ya que
algunas de las concentraciones ensayadas estimularon el crecimiento de las raíces y las
diferencias sólo resultaron significativas en el caso de la cepa UTEX‐f‐Fexp, a una
concentración de 0,1 mg/ml. Posiblemente, a pesar de aplicar el mismo procedimiento de
extracción, haya heterogeneidad en la composición de los distintos extractos obtenidos y
a ello se deba la variabilidad de los resultados.
Existen numerosas citas sobre los efectos biológicos de los compuestos fenólicos.
Ellos pueden desempeñar un doble papel como antioxidantes o prooxidantes
‐ 104 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon dependiendo de la concentración y pH del medio (Yoshino et al., 1999; Yamashita et al.,
1999). Además algunos de ellos como la quercetina, luteonina, kaempferon, apigenina y
genisteína, entre otros, tienen actividad inhibitoria sobre varias quinasas relacionadas con
el ciclo celular (Zi et al., 1998; Choi et al., 2001). En este tipo de acción se podría
fundamentar la inhibición causada en el crecimiento de las raíces de trigo, que
potencialmente, les permitiría también tener efectos antitumorales.
Cepa Fracción Fase Concentración
(mg/ml)
Inhibición
(% ±SD) Cepa Fracción Fase
Concentración
(mg/ml)
Inhibición
(% ±SD)
0,05 93,8±4,5 0,05 99,9±0,8 Est
0,1 92,7±6,6 Est
0,1 95,5±3,5
0,05 97,2±1,8 0,05 92,2±1,6 B
Exp 0,1 98,6±1,3
B
Exp 0,1 80,8±1,8
0,05 90,3±9,3 0,05 91,6±12 Est
0,1 87,4±3,6 Est
0,1 94,4±4
0,05 88,9±2,6 0,05 96,2±2,4 C
Exp 0,1 98,3±13
C
Exp 0,1 88,4±10,2
0,05 98,9±6,2 0,05 96,1±4,6 Est
0,1 97,8±0,1 Est
0,1 97,7±0,1
0,05 99,1±1,3 0,05 97,9±1
UTEX
f
D
Exp 0,1 94,4±1
MAT
f
D
Exp 0,1 94,1±7,9
0,05 93,4±0,1 0,05 94,7±2 Est
0,1 92,6±4,1 Est
0,1 78,2±1,8
0,05 95,9±1,1 0,05 74,7±7,3 B
Exp 0,1 93,5±1,5
B
Exp 0,1 88,7±2,3
0,05 86±0,8 0,05 96,4±4,7 Est
0,1 94,6±1 Est
0,1 96,2±2,5
0,05 90,9±18,4 0,05 93,4±4,6 C
Exp 0,1 89,7±5,1
C
Exp 0,1 88,9±9
0,05 70,3±46 0,05 62,3±34,6 Est
0,1 56,1±13 Est
0,1 79,9±49,3
0,05 69,6±24 0,05 99,7±5,6
UTEX
b
D
Exp 0,1 71±38
MAT
b
D
Exp 0,1 93,4±4,2
Agua de red ‐ 0
Agua de red + DMSO ‐ 95,5±4,5 Vinblastina 0,02 57,6±2,9
Tabla 3: Porcentaje de inhibición de las raíces de T. sativum de las fracciones B, C y D obtenidas.
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 105 –
La tabla 3 muestra las inhibiciones observadas con el resto de las fracciones. Dado
que todas estas fracciones se solubilizaron utilizando DMSO 2% , se incluyó además un
control con este compuesto. Este control presentó inhibiciones similares a las fracciones
en las concentraciones ensayadas, por este motivo puede asumirse que la inhibición se
debió al DMSO y no a las fracciones en sí. De hecho, el control positivo (vinblastina)
presentó inhibiciones menores a las fracciones y al control de DMSO.
4.2.2 Ensayo de toxicidad en Artemia salina
Como se observa en las tablas 4 y 5 ninguno de los extractos ensayados
resultaron tóxicos para A. salina a las concentraciones ensayadas.
Cepa Fracción Fase µg/ml Supervivencia (% ) Cepa Fracción Fase µg/ml Supervivencia
(% ) 1 92,6±10,5 1 87±3,4 5 96,4±0,6 5 91,3±7,9 Est 10 93,7±4,3
Est 10 92,5±4,4
1 100 1 86,9±1,6 5 93,1±0,3 5 95,5±6,4
A
Exp 10 97,8±3
A
Exp 10 92,8±10,1
1 95 1 100 5 91,2±12,5 5 100 Est 10 96,7±4,7
Est 10 100
1 97,6±3,4 1 100 5 97,5±3,5 5 100
B
Exp 10 100
B
Exp 10 100
1 100 1 97,5±3,5 5 100 5 100 Est 10 94,7
Est 10 97,5±3,5
1 97,6±3,4 1 97,5±3,5 5 97,5±3,5 5 100
C
Exp 10 97,5±3,5
C
Exp 10 100
1 95,2±0,2 1 100 5 100 5 97,4±3,8 Est 10 100
Est 10 100
1 100 1 100 5 100 5 100
UTEX f
D
Exp 10 100
MAT f
D
Exp 10 100
Control Agua de Mar 97,5±3,5 Control Agua de Mar + DMSO 96,3±5,2
Tabla 4: Porcentaje de supervivencia de Artemia salina en presencia de los extractos A a D de las cepas UTEX y MAT fotosintéticas en fases exponenciales y estacionarias.
‐ 106 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Cepa Fracción Fase µg/ml Supervivencia
(% ) Cepa Fracción Fase µg/ml
Supervivencia (% )
1 91±3,6 1 100 5 96,8±1,9 5 94,3±1,7 Est 10 97,5±3,4
Est 10 96,2±1,1
1 95,3±0,5 1 94±3,4 5 97,7±3,2 5 95,2±0,3
A
Exp 10 97,5±3,5
A
Exp 10 97±4,3
1 97,5±3,5 1 100 5 100 5 97,7±3,2 Est 10 100
Est 10 100
1 100 1 97,6±3,4 5 97,5±3,5 5 94,7±0,4
B
Exp 10 95,7±0,4
B
Exp 10 100
1 100 1 97,5±3,5 5 97,4±3,8 5 95±0,4 Est 10 100
Est 10 100
1 97,5±3,5 1 100 5 97,6±3,4 5 92,1±11,2
C
Exp 10 97,7±3,2
C
Exp 10 100
1 100 1 100 5 100 5 94,3±0,2 Est 10 89,7±0,4
Est 10 100
1 100 1 95 5 100 5 94,4±7,9
UTEX‐h
D
Exp 10 100
MAT‐h
D
Exp 10 100
Control Agua de Mar 97,5±3,5 Control Agua de Mar + DMSO 96,3±5,2
Tabla 5: Porcentaje de supervivencia de Artemia salina en presencia de los extractos A a D de las cepas UTEX y MAT heterotróficas en fases exponenciales y estacionarias.
4.3 Actividad antibacteriana
Las diferentes fracciones ensayadas no mostraron actividad antibacteriana frente
a ninguna de las cepas bacterianas testeadas. Sin embargo, los ensayos realizados con los
productos extracelulares evidenciaron algo de actividad frente a la única cepa Gram +
empleada. Estos resultados se muestran en la Tabla 6 y se indican mediante el diámetro
de los halos de crecimiento. En particular, los productos extracelulares de las cepas
blanqueadas por tratamiento con estreptomicina mostraron mayor actividad frente a
Bacillus subtilis. La cepa MAT fue la única que sostuvo esta actividad hasta las 168 horas
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 107 – de crecimiento al ser cultivada en medio EGM. En medio mineral (Buetow), tampoco se
observó actividad antibacteriana.
Diámetro del halo de inhibición (cm)
Medio de
Cultivo
Cepa Condición Nutricional
Tiempo (horas)
Células/ml
B. subtilis 168
P. putida KT
2440
E. coli 169
24 4,29x105 < 7 mm ‐ ‐ 72 ‐ ‐ ‐ ‐ 120 ‐ ‐ ‐ ‐
Fotosintética
168 ‐ ‐ ‐ ‐ 24 2,67x105 < 8 mm ‐ ‐ 72 3,99x105 11 mm ‐ ‐ 120 ‐ ‐ ‐ ‐
Utex Heterotrófica
168 ‐ ‐ ‐ ‐ 24 2,8x105 < 7 mm ‐ ‐ 72 ‐ ‐ ‐ ‐ 120 ‐ ‐ ‐ ‐
Fotosintética
168 ‐ ‐ ‐ ‐ 24 1,12x105 27 mm ‐ ‐ 72 1,94x105 14 mm ‐ ‐ 120 2,55x105 14 mm ‐ ‐
EGM
Mat Heterotrófica
168 3,15x105 11 mm ‐ ‐ Estreptomicina (2 µg) 35 mm 40 mm 56 mm Ampicilina (2 µg) 40 mm 20 mm 50 mm
Tabla 6: Actividad antimicrobiana de los productos extracelulares de dos cepas de E. gracilis (MAT y UTEX) en dos condiciones nutricionales heterotrófica y fotosintética. Los recuentos celulares
sólo se llevaron a cabo cuando fue detectado inhibición del crecimiento bacteriano.
Hasta las actualidad, se creyó que E. gracilis no era productora de compuestos
alelopáticos (Rice, 1984), posiblemente debido a que la amplia mayoría de los estudios se
realizaron con las cepas naturales, es decir, fotosintéticas. Sin embargo los resultados
obtenidos en este trabajo indicarían que las cepas blanqueadas si son capaces de
producir sustancias alelopáticas.
4.4 Actividad Antifúngica
Las fracciones A, B y C no mostraron actividad antifúngica frente a ninguna de las
cepas ensayadas. La fracción D, tampoco mostró actividad frente a Oxyporus
latemarginatus (444), Bjerkandera adusta (2197) y Coriolus villosus (145), pero, como se
muestra en las figuras 5 y 6, los resultados parecían indicar que poseía actividad contra
Fusarium oxysporum sp. medicaginis (cepa 126 M). Sin embargo, como, durante la
‐ 108 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon obtención de la fracción D se detectó la formación de una sal (capítulo 1 sección 1), ésta
también fue ensayada frente a F. oxysporum sp. medicaginis. Así se pudo comprobar que
la actividad antifúngica se debía a la presencia de estas sales y no a algún metabolito en la
fracción D proveniente de las cepas de E. gracilis ensayadas.
0 24 48 72 96 120
144
168
192
216
240
0
2
4
6
8
10MAT‐f‐FexpMAT‐f‐FestMAT‐b‐Fex
p
MAT‐b‐FestUTEX‐f‐Fex
p
UTEX‐f‐Fex p
UTEX‐b‐Fes
t
DMSO
Disco
Sal
Horas
Rad
io de crecim
iento
deFusarium
oxysporum
sp.m
edicaginis
(cm)
Figura 5: Actividad antifúngica de los distintos extractos D provenientes de las diferentes cepas de
E. gracilis en distintas condiciones de estudio (concentraciones entre 4,08 y 6,4 mg/ml). Los controles fueron el solvente en el que se resolubilizó la fracción D, discos sin ningún contenido y la
sal formada durante el proceso de obtención de la fracción.
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 109 –
Figura 6: Imágenes de Fusarium oxysporum en presencia de los controles (disco sin contenido y DMSO 6.5% ) y en presencia de la fracción D de una de las cepas a modo de ejemplo y de la sal
formada durante el fraccionamiento sin haber incluido biomasa algal.
La recuperación del hongo al inocular la biomasa fúngica en medio fresco luego de
la exposición a la sal fue completa al cabo de 10 días (figura 7).
Figura 7: crecimiento de Fusarium oxysporum a los 10 días de inoculado en medio fresco y post‐tratamiento con la sal formada durante el fraccionamiento sin haber incluido biomasa algal.
‐ 110 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 111 –
5. CONCLUSIONES
‐ 112 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon ‐ 113 –
Nuestro estudio mostró que las fracciones polares (etanólicas) son las que tienen
la mayor actividad atrapante de radicales libres, lo cual podría estar asociado con la
presencia de polifenoles. Éstas también resultaron activas inhibiendo el crecimiento de
las raíces de T. sativum para la mayoría de los casos. Los resultados de estos dos ensayos
sugieren que los fenoles serían los responsables del efecto antioxidante y de la inhibición
del crecimiento detectada en raíces de trigo. Los compuestos fenólicos pueden
desempeñar un doble papel como antioxidantes o prooxidantes y algunos tienen
actividad inhibitoria sobre varias quinasas relacionadas con el ciclo celular. La inhibición
sobre el crecimiento de las raíces de trigo observada en este trabajo, podría
fundamentarse en este tipo de acción y les permitiría tener potencialmente efectos
antitumorales.
Por otro lado, la eliminación de cloroplastos por tratamiento con estreptomicina
parece estimular la producción de sustancias extracelulares (posiblemente
exopolisacáridos) que resultaron ser levemente bioactivos frente a B. subtilis.
Las pruebas primarias de actividad biológica llevadas a cabo complementan la
caracterización química y permite una primera evaluación del potencial de E. gracilis
como una fuente de productos bioactivos.
‐ 114 ‐ Sección II: Cribado farmacológico de extractos de Euglena gracilis libres de paramilon
CAPITULOIIIEstudios sobre la producción y el potencial bioactivo del paramilon obtenido de Euglena gracilis
SecciónIEstudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 119 ‐
1. INTRODUCCIÓN
‐ 120 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 121 ‐ 1.1 Mixotrofia en Euglena gracilis.
La plasticidad nutricional de Euglena gracilis le permite crecer en condiciones
fototróficas, heterotróficas o fotoheterotróficas dependiendo del medio de cultivo y
las condiciones de luz (Barsanti et al., 2000). Esto hace que la especie sea un modelo
interesante para el estudio de diferentes vías metabólicas. Cuando E. gracilis crece
heterotróficamente, en la oscuridad constante, las células pierden sus cloroplastos
quedando sólo los proplástidos indiferenciados (Epstein & Schiff, 1961). Esta condición
puede ser revertida (Schiff & Schwartzbach, 1982) dado que si las células se exponen
nuevamente a la luz, los proplástidos comienzan a diferenciarse en cloroplastos y
después de 1 a 3 días pueden verse células fotosintéticamente activas con cloroplastos
maduros (Vannini, 1983). Los cloroplastos de Euglena gracilis (Figura 1a) poseen tres
membranas que los delimitan (Gibbs, 1981). Los euglenoideos adquirieron sus
cloroplastos por endosimbiosis con algas clorofílicas y de estas tres membranas, las
dos más internas corresponderían a la envoltura propia del cloroplasto, mientras que
la más externa, que carece de ribosomas, se relacionaría con la membrana fagocítica
del euglenoideo incoloro ancestral (Leedale, 1968). En algunos cloroplastos de los
pigmentados se puede diferenciar el pirenoide, que es la región de la matriz plastidial
que posee material más denso e incoloro. Esta estructura está compuesta
principalmente por proteínas, puede ser atravesado por uno o más tilacoides (Zakrys &
Walne, 1998) y en algunas especies puede estar recubierto de paramilon
extraplastidial (Figura 1b). En E. gracilis los cloroplastos poseen diplopirenoides
ubicados a ambos lados del cloroplasto y comúnmente pueden encontrarse rodeando
al pirenoide y por fuera de la membrana plastidial dos calotas del polisacárido de
reserva del grupo.
La estreptomicina es un antibiótico que no inhibe la división celular o la
viabilidad de E. gracilis, pero actúa como "blanqueador" de las células, dado que
provoca la pérdida permanente de los cloroplastos, junto con su ADN, en las células
fotosintéticas en activa división y a la vez bloquea el desarrollo de los cloroplastos en
las células que no se dividen (Schiff y Schwartzbach, 1982). Mientras que los
cloroplastos son muy susceptibles a la estreptomicina, las células no. Una posible
explicación a este fenómeno es que los cloroplastos de Euglena gracilis poseen
‐ 122 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ribosomas diferentes a los citoplasmáticos, lo que implica independencia en la síntesis
de alguna de sus proteínas (Drown y Galloway, 1969). Por otra parte, la síntesis de las
clorofilas a y b y de los carotenoides se inhibe por altas concentraciones de
estreptomicina. Se cree que este antibiótico tiene un efecto quelante del magnesio
que compone a la clorofila; de hecho, su acción se vuelve parcialmente reversible con
la adición de cationes divalentes (Kirk, 1962).
Tanto en cultivos fotoheterotróficos como heterótroficos, de E. gracilis, el
acetato puede ser usado como única fuente de carbono. Este puede seguir dos vías
metabólicas (Wiessner y French, 1979) y se incorporará sólo en lípidos e hidratos de
carbono, pero no en proteínas, ya que en éstas el carbono proviene casi enteramente
del que es fijado por la fotosíntesis (Cook, 1965). La adición de acetato en cultivos
expuestos a la luz inhibe la síntesis de clorofila y el desarrollo de cloroplastos y reduce
la actividad fotosintética respecto de los medios de minerales (Ternetz, 1912; App &
Jagendorf, 1963; Buetow, 1967). Tanto en condiciones de luz como de oscuridad, la
estreptomicina inhibe la incorporación de carbono a partir del acetato a las proteínas y
ácidos nucleicos. En cambio, este antibiótico estimula notablemente su incorporación
en polisacáridos en condiciones autotróficas (Kirk, 1961).
Euglena gracilis puede asimilar acetato y etanol a través del ciclo del glioxilato y
por lo tanto presumiblemente deben metabolizar acetato derivado por β‐oxidación de
ácidos grasos y alcoholes en una forma similar (Haigh y Beevers 1964; Danforth, 1968).
La asimilación de acetato se puede llevar a cabo por el ciclo del glioxilato, una
derivación de las reacciones de descarboxilación del ciclo del ácido cítrico, que permite
a los organismos sintetizar carbohidratos a partir de compuestos de dos átomos de
carbono, como fue propuesto por primera vez por Kornberg y Krebs (1957). La
ubicación de este ciclo en E. gracilis difiere según los distintos autores. Estaría presente
o bien en unos corpúsculos llamados glioxisomas (Graves et al., 1972) o bien en las
mitocondrias (Ono et al., 2003). El sistema mitocondrial de Euglena gracilis consiste en
un único retículo (Leedale & Buetow, 1970) que se ramifica a lo largo de toda la célula
(Figura 1c y d), formando una especie de malla que constituye aproximadamente un
6% del volumen celular (Pellegrini, 1980). Pringsheim y Hovasse (1948) encontraron
que el desarrollo de las mitocondrias de numerosas especies depende de la fase de
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 123 ‐ crecimiento o de la privación de fuentes de carbono, lo que se correspondería con la
plasticidad nutricional del género.
Figura 1. Micrografías obtenida por MET de Euglena gracilis de: A‐ Cloroplasto (cl), modificado de Leedale (1968), escala: 1µm. B‐ diplopirenoide (pi) con dos calotas de paramilon (p), fuente: Roccheta et al., 2006 Escala: 1µm. C‐ Modelo tridimensional de la red mitocondrial de Euglena gracilis, D‐ Sección de una mitocondria mostrando
las crestas mitocondriales (X 50.000). C y D‐ fuente: Buetow (1982).
La asimilación del acetato requiere de dos enzimas claves: la isocitrato liasa
(ICL; EC 4.1.3.1) y la malato sintasa (MS; EC 2.3.3.9), específicas del ciclo del glioxilato.
Se ha informado de que Euglena gracilis tiene tanto actividades ICL como MS (Reeves
et al., 1962; Heinrich y Cook, 1967) y que estas actividades enzimáticas se incrementan
considerablemente cuando se utiliza etanol como una única fuente de carbono (Inui et
al., 1992). La isocitrato liasa cataliza la escisión de d‐isocitrato en glioxilato y succinato.
El glioxilato liberado se condensa con acetil‐CoA para producir L‐malato por acción de
la malato sintasa. Estas dos enzimas aseguran una alternativa a dos de los pasos de
descarboxilación del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (figura 2) en la síntesis de
D
A B
cl
p
ppi
C
‐ 124 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis succinato. Así, el ciclo del glioxilato es especialmente importante bajo condiciones
limitantes de carbono. En ciertas plantas superiores y en las algas, el ciclo del glioxilato
se ha informado que desempeña un papel fundamental en la síntesis de hidratos de
carbono a partir de lípidos de almacenamiento, en los primeros estadíos de desarrollo
(Eastmond y Graham, 2001; Bedhomme et al., 2009).
A glucosa
ácidos grasos Gluconeogénesis
β‐oxidación fosfoenolpirubato
2 acetil‐CoA oxalacetato
2 CoA
Ciclo del Ciclo
Glioxilato succinato de Krebs
NADH + H+
B
Figura 2: A‐ Esquema simplificado del ciclo del glioxilato y su relación con el ciclo de Krebs. B‐ Ciclo del glioxilato. Fuente: A) Modificado de Nelson y Cox, 2008; B) Berg et al., 2008.
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 125 ‐ En E. gracilis, las actividades de las enzimas clave del ciclo del glioxilato, ICL y
MS, son conferidas por una sola proteína bifuncional llamada enzima del ciclo del
glioxilato de Euglena gracilis (EgGCE). Esta enzima consiste en una única cadena
polipeptídica con un dominio N‐terminal con actividad MS y un dominio C‐terminal con
actividad ICL (Nakazawa et al., 2005; 2011).
El acetato como única fuente de carbono en un medio mineral tiende a
estimular la respiración en E. gracilis. El consumo de O2 en este tipo de medios con
acetato es 4 veces mayor que el consumo endógeno de las células. Además, las células
que crecen en un medio con acetato como fuente de carbono, tienen un 50% más de
ARN que las células que crecen en cultivos con glucosa (Cook y Heinrich, 1965). Por
otro lado, en cultivos fotosintéticos de E. gracilis y sincronizados expuestos a períodos
de luz/oscuridad puede inducirse la actividad ICL después de la adición de acetato,
Woodward y Merret (1975).
1.2 Producción de paramilon de Euglena gracilis y antecedentes sobre sus
aplicaciones.
Los β‐glucanos son homopolímeros de glucosa de estructura compleja que
pueden aislarse de las paredes celulares de bacterias, hongos, algas, cereales y
levaduras (Stone y Clarke, 1992; Zekovic y Kwiatowski, 2005). El número de β‐glucanos
es casi tan grande como el número de fuentes utilizadas para su aislamiento (Vetvicka
y Sima, 2004). Mientras que muchos β‐glucanos tienen uniones del tipo β‐(1 6), dos
son las fuentes más conocidas por producir β‐glucanos lineales con uniones β‐(1 3),
las bacterias del género Alcaligenes, que sintetizan este polisacárido extracelular,
conocido como curdlan, y los euglenoideos entre los que se encuentra E. gracilis, que
sintetiza el polisacárido con ubicación siempre extraplastidial, en forma de gránulos
citoplasmáticos o sobre los pirenoides (Figura 1b) y que es conocido como paramilon.
Los β‐glucanos han tenido hasta la actualidad variadas aplicaciones. Cuando se
incorporó en la dieta de algunos animales y humanos, se detectó un efecto de
descenso del colesterol, una moderación de la glucosa sanguínea postprandial y
respuesta insulínica en humanos (Kogan, 2000). Activa el sistema inmune, la
producción de plaquetas y modifica procesos sépticos (Czop, 2008; Bacic, 2009). Se usa
‐ 126 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis en el tratamiento de queratosis solar y protege contra las irradiaciones (Donzis, 1995 y
1998). Tiene propiedades antitumorales (Quesada et al., 1976; DiLuzio, 1983; Ohno et
al., 2001; Hong et al., 2003, Gu et al., 2005) e inhibe la producción de peróxido de
hidrógeno por macrófagos in vitro (Adachi et al., 1993). Derivados sulfatados del
paramilon de Euglena gracilis, han mostrado actividad anti‐HIV (Koizumi et al. 1993) y
se encontró tanto actividad antibacteriana como estimulación de macrófagos de
derivados de este polisacárido mediante la introducción de cargas positivas en la
molécula (Sakagami et al., 1989; Sakagami et al., 1991). Este tipo de compuestos
también ha sido utilizado como inmunoestimulante para reforzar los sistemas de
defensa no específicos de especies de importancia comercial (López et al., 2003;
Vismara et al., 2004; Skov et al., 2012; Yogeeswaran et al., 2012; Chang et al. 2013).
Existen otros organismos que producen este polisacárido, entre ellos se
encuentra Saccharomyces cerevisiae quien posee de un 85 a un 90% de polisacáridos
en su pared celular, uno de los cuales es un β‐glucano. A escala estructural la pared
celular de Saccharomyces cerevisiae está constituida por 3 grupos de polisacáridos:
manano‐proteínas, polímeros de glucosa o β‐glucanos y en menor proporción
polímeros de N‐acetil glucosamina o quitina (Klis et al., 2002; Aguilar‐Uscanga y
François, 2003; Jouany et al., 2005). En estas células los β‐(1,3)‐D‐glucanos se
encuentran unidos a polisacáridos con uniones de tipo β‐(1,6). A diferencia de las
levaduras, los euglenoideos acumulan grandes cantidades de paramilon intracelular,
pudiendo llegar a producir hasta más del 50% de su peso seco (Barsanti et al., 2001;
Rodríguez Zabala et al., 2010). Se conoce además, tanto por observaciones de especies
en la naturaleza como por ensayos in vitro, que la producción de éste polisacárido es
sumamente variable con las condiciones ambientales (Conforti, 1998). La alta
producción así como su relativa pureza facilitan extracción del polisacárido,
pudiéndose obtener un producto libre de contaminantes celulares.
Como se mencionara anteriormente, en ciertas plantas superiores y las algas, el
ciclo del glioxilato desempeña un papel fundamental en la síntesis de hidratos de
carbono. Esto llevó a estudiar de qué modo se relaciona la cantidad de acetato
presente en el medio, la actividad isocitrato liasa, la producción de paramilon y las
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 127 ‐ variaciones ultraestructurales que los diferentes metabolismos expresados provocan
en las células de E. gracilis. En esta sección se presentan los resultados de este estudio.
‐ 128 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 129 ‐
2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
‐ 130 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 131 ‐ 2.1 Hipótesis
Debido a su capacidad de incorporar acetato como fuente de carbono, Euglena
gracilis es capaz de producir cantidades variable de su polisacárido de reserva en
función de la cantidad de acetato presente en el medio de cultivo. Esta variabilidad
en la producción de paramilon implicaría una mayor actividad de la enzima isocitrato
liasa y una variabilidad morfológica asociada al tipo de metabolismo expresado.
2.2 Objetivo General
Evaluar la producción de paramilon en distintas cepas de E. gracilis bajo distintas
condiciones nutricionales en los medios típicamente utilizados para su cultivo, los
cuales poseen diferentes fuentes de carbono.
Relacionar la actividad isocitrato liasa con la producción de paramilon, lípidos,
pigmentos y la ultraestructura de las organelas de dos cepas de E. gracilis,
cultivadas bajo distintas condiciones nutricionales por variación de fuentes de
carbono.
2.3 Objetivos específicos
Cuantificar la producción de paramilon de dos cepas de Euglena gracilis, en
condiciones heterotróficas y autotróficas, en los medios típicamente utilizados en su
cultivo, los cuales poseen diferentes fuentes de carbono.
Evaluar la pureza del paramilon extraído.
Cuantificar las reservas metabólicas en dos cepas de Euglena gracilis, en condiciones
heterotróficas y autotróficas, en los medios típicamente utilizados en su cultivo.
Cuantificar la actividad isocitrato liasa en dos cepas de Euglena gracilis, en
condiciones heterotróficas y autotróficas, en los medios típicamente utilizados en su
cultivo.
Evaluar cambios ultraestructurales en dos cepas de Euglena gracilis, en condiciones
heterotróficas y autotróficas, crecidas en los medios típicamente utilizados para su
cultivo, los cuales poseen diferentes fuentes de carbono.
‐ 132 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 133 ‐
3. MATERIALES Y MÉTODOS
‐ 134 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 135 ‐ 3.1 Microorganismos y condiciones de cultivo.
Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en cultivos axénicos de dos
cepas de Euglena gracilis, UTEX 753 (Colección de Cultivos de Algas de la Universidad de
Texas, EE.UU.) y MAT (aislada del río Matanza, Buenos Aires, Argentina, Ruiz et al., 2004).
Se trabajó con ambas cepas fotosintéticas (MAT‐f y UTEX‐f) y sus variantes, blanqueadas
con estreptomicina, heterotróficas, (MAT‐h y UTEX‐h). Los cultivos se desarrollaron en
tres medios de cultivo: dos medios minerales con pH 7, uno con citrato y el otro con
citrato y exceso de acetato de sodio como fuentes de carbono. Se ensayó además un
tercer medio con exceso de materia orgánica (EGM, tabla 1). Las cepas blanqueadas sólo
se ensayaron en dos de los medios (Buetow y EGM), dado su escaso crecimiento en
medio mineral con bajo contenido de una fuente de carbono (Cramer y Mayer). Las algas
se cultivaron en erlenmeyers de vidrio de 250 ml a 24 ± 1 °C y la irradiación fue
proporcionada por tubos fluorescentes blancos de luz diurna (20 mmol m‐2 s‐1) con un
fotoperíodo de luz‐oscuridad 12:12.
Se inocularon alícuotas de cultivos en crecimiento exponencial conteniendo 5 x
104 células/ml en cada erlenmeyer, para los ensayos enzimáticos, siguiendo las
condiciones de cultivo mencionadas anteriormente. La densidad celular se determinó por
recuento en cámara de Neubauer, con menos del 10% de error, 0,05 (Venrick, 1978).
Las muestras para las diferentes mediciones se recogieron a las 96 horas de haber
realizado el inóculo.
‐ 136 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis
Composición del medio de cultivo
Buetow (mg/l)
Cramer y Myers (mg/l)
EGM (mg/l)
Na Acetato 5000 ‐ 600 Na Citrato 645 800 ‐ (NH4)2SO4 ‐ 1000 KH2PO4 1000 ‐ (NH4)2HPO4 1000 1000 ‐ MgSO4 200 200 ‐ CaCl2 26,5 20 ‐ Fe(SO4)3 3 3 ‐ ZnSO4 0,4 0,4 ‐ MnCl2 1,8 1,8 ‐ Na2MoO4 0,2 0,2 ‐ CoCl2 1,3 1,3 ‐ CuSO4 0,02 0,02 ‐ Tiamina HCl 0,02 0,01 ‐ Vitamina B12 1µg/l 1µg/l ‐ Extracto de carne ‐ ‐ 1000 Extracto de levadura ‐ ‐ 2000 Triptona ‐ ‐ 2000 Cl2Ca (10mg/l) ‐ ‐ 10 ml pH 7 7 7
Tabla 1: Composición de los medios de cultivo utilizados típicamente en el cultivo de E. gracilis y durante los ensayos.
3.2 Cuantificación de paramilon.
Para la extracción de paramilon se modificó el protocolo de Kiss et al. (1988). Se
centrifugaron 100 ml de cultivo, se lavaron las células tres veces con solución
fisiológica y se mantuvieron a ‐20°C durante toda la noche. Luego se agregó una
solución de SDS al 2% (p/v) y buffer Tris‐HCl 0,125 M, la suspensión se sonicó por 15
segundos utilizando un sonicador de vastago. Los granos de paramilon se
sedimentaron por centrifugación, durante 20 minutos a 1.000 x g. Este tratamiento se
realizó repetidas veces hasta obtener una solución translúcida. Luego los granos se
lavaron tres veces con agua destilada a 70°C y se filtraron, utilizando filtros tipo APFC
millippore que se secaron en estufa a 60°C para su cuantificación. Esta determinación
se llevo a cabo por triplicado y los resultados se expresan como µg/105 células.
La calidad de los cuerpos de paramilon se analizó mediante la observación bajo
un microscopio óptico Olympus BX 50.
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 137 ‐ 3.3 Cuantificación de proteínas totales.
Se evaluó el contenido de proteínas totales, a las 96 horas, mediante la técnica
de Bradford (1976), utilizando sero albúmina bovina (SAB) como estándar.
3.4 Cuantificación de lípidos totales.
Los lípidos se cuantificaron de acuerdo al método de Bligh y Dyer (1959). Para
esto se tomó 1 ml de cultivo, se cosecharon las células por centrifugación y se lavaron
3 veces con agua destilada. A continuación se agregaron 4 ml de una mezcla de
cloroformo:metanol (2:1 v/v), luego otros 2 ml de la misma mezcla y finalmente 2 ml
de H2O agitando en vortex después de cada adición. Posteriormente se centrifugó a
300 x g durante 15 minutos, a temperatura ambiente, para acelerar la separación de
las fases y se retiró la fase inferior con pipeta Pasteur de vidrio. Esta fase se colocó en
cristalizadores limpios, secos y tarados, que se llevaron a estufa hasta evaporación
total del solvente. El contenido de lípidos se calculó como la diferencia entre el peso
del recipiente con y sin la muestra seca.
3.5 Cuantificación del contenido de clorofila
El contenido de clorofila se determinó siguiendo el procedimiento descripto por
Wellburn (1994). Se recogieron las células de 5 ml de cultivo por centrifugación a 1.500
x g durante 15 minutos a 4 °C. Las células se congelaron a ‐22 °C y los pigmentos se
extrajeron con una solución de acetona al 80% (v/v). Los extractos se generaron
colocando las muestras en la solución de acetona durante 1 hora a 4 °C y luego fueron
sonicados, manteniéndolos en baño de hielo. Los pigmentos se separaron de los restos
celulares por centrifugación a 1.500 x g durante 15 minutos a 4 °C y las absorbancias
de los sobrenadantes se midieron en un espectrofotómetro UV/Vis (T80 Spectrometer
PG Instruments) a 646 y 663 nm. Para la cuantificación de las clorofilas se utilizaron las
siguientes fórmulas:
Clorofila a = 12,21 x A663 ‐ 2,81 x A646
Clorofila b = 20,13 x A646 ‐ 5,03 x A663
‐ 138 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis 3.6 Determinación de los azucares componentes y microanalisis elemental del
paramilon obtenido.
3.6.1 Hidrólisis ácida
El paramilon, extraído como se indica en el punto 3.2, fue sometido a una
hidrólisis ácida (Albersheim et al., 1967). Para esto 3,8 mg del polisacárido se
sometieron a hidrólisis con 1 ml de ácido tricloroacético 1N, en un vial con tapa de
teflón, a 120 °C, durante 3 hs. Luego los hidrolizados se llevaron a sequedad con
agregados sucesivos de agua destilada bajo corriente de nitrógeno hasta la eliminación
total del ácido.
3.6.2 Obtención de derivados acetilados para cromatografía gaseosa
La reducción a alcohol se llevó a cabo agregando 1 ml de agua destilada y una
punta de espátula de borohidruro de sodio como agente reductor. Se dejó reaccionar
durante 3 horas y luego se eliminó el agente reductor agregando ácido acético glacial,
gota a gota, hasta la desaparición de efervescencia. La mezcla se llevó a seco y se lavó
5 veces con metanol anhidro. Luego se incorporaron 0,5 ml de anhídrido acético y 0,5
ml de piridina (catalizador) y se llevó a 80‐100 °C, en estufa, durante 30 minutos, para
lograr la acetilación. Los alcoholes acetilados se extrajeron con cloroformo y se lavaron
2 veces son bicarbonato de sodio y 3 veces con agua destilada. La fase clorofórmica se
filtró sobre sulfato de sodio anhidro, se evaporó el cloroformo y el residuo se congeló a
‐22 °C, para evitar su degradación, hasta el momento de su análisis por cromatógrafía
gaseosa en columna capilar SP‐2330 (Supelco).
3.6.4 Microanálisis elemental
Por otro lado el paramilon extraído se sometió a un microanálisis elemental de
C, H y N, en un equipo Carlo Erba EA 1108 (CHNS‐O), a fin de verificar la pureza y
calidad del producto. Para dicho análisis se llevó a cabo la combustión de la muestra
en un tubo reactor donde fue transformada a CO2, H2O, N2 y SO2. La separación de los
gases se realizó en un cromatógrafo gaseoso, con detector de conductividad térmica y
una columna de porapac. El método requiere la calibración con sustancias patrón de
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 139 ‐ composición conocida, en este caso se utilizó Sulfamida como patrón para la
determinación de C, H y N (datos experimentales) y 2,5 bis(5‐tert‐butil‐2‐
benzoxazolil)tiofeno (BBOT) y ciclohexanona‐2,4‐dinitrofenilhidrazona (CEDFINI) como
sustancias patrones para el ensayo de control de C, H y N (datos teóricos). El análisis se
llevó a cabo por corrida simple.
3.7 Cuantificación de la actividad isocitrato liasa.
3.7.1 Preparación del homogenato celular.
Las células se cosecharon por centrifugación a 3.000 x g durante 15 minutos, a
4 °C, y el pellet se resuspendió en 1 ml de buffer fosfato 50 mM, pH 7, conteniendo
inhibidores de proteasas (PMSF 0,5 mM y benzamidina 10 mM) y se mantuvieron en
baño de hielo. La ruptura de las células se llevó a cabo por ultrasonicación, en baño de
hielo, mediante 3 ciclos de 10 segundos, a una frecuencia de 20 KHz y con intervalos
de 15 segundos, con el fin de evitar el sobrecalentamiento.
El homogenato celular se centrifugó a 15.000 x g durante 20 minutos, a 4°C , y
se mantuvo a esa temperatura, para su inmediata utilización. El resto del
sobrenadante, se guardó a ‐20ºC, para la posterior determinación de proteínas como
se indicó en la sección 3.3).
3.7.2 Actividad isocitrato liasa.
La medición de la actividad isocitrato liasa (EC 4.1.3.1) se basa en el aumento
de la densidad óptica medida a 324 nm como consecuencia de la formación de un
compuesto coloreado, fenilhidrazona del glioxilato, a partir de fenilhidrazina (Cooper &
Beevers, 1969; Martínez Rivas & Vega, 1993; Sabatini et al., 2011; Sztrum et al., 2012).
La actividad ICL se midió usando ácido treo‐DSLS‐isocítrico como sustrato
(Cooper y Beevers, 1969). Para ello en una cubeta de cuarzo se colocó la mezcla de
reacción (1 ml) conteniendo 860 µl de buffer fosfato de potasio 100 mM, pH 6,8; 9 µl
de mercaptoetanol 4,6 mM y 44 µl de MgCl2 87 mM. Se agregaron 40 µl de
fenilhidracina 10 mM y 35 µl de homogenato celular. Se tomó la lectura del blanco a
‐ 140 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis 324 nm. La reacción se inició con el agregado de 13 µl de sustrato (ácido treo‐DSLS‐
isocítrico 13 mM, Sigma), como se muestra en el siguiente esquema:
Succinato
ICL
fenilhidrazina
Glioxilato Fenilhidrazona del glioxilato (324)
Se registró el aumento de absorbancia entre los 240 y los 360 segundos (tiempo
en el que la pendiente es estable) tomando lecturas cada 30 segundos a 30 °C.
Para la cuantificación de la actividad enzimática se utilizaron las siguientes
ecuaciones:
K= 2,3
Isocitrato
x log A inicial (A) Δt A final
Donde:
A: densidad óptica a 324 nm
Δt: 120 segundos
La unidad enzimática cataliza la formación de 1 µmol de glioxilato por minuto a
pH 6,9 y 30°C. La actividad específica se expresó por miligramos de proteínas totales
según:
Unidades enzimáticas/mg de proteína= K*x fd.
ɛ x proteínas totales
Donde:
K*: valor calculado experimentalmente por (A)
ɛ: coeficiente de extinción= 17 x 10 ‐3 M‐1 s‐1
fd: factor de dilución (volumen de homogenato/volumen total de mezcla de reacción).
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 141 ‐ 3.8 Microscopía electrónica de transmisión (MET).
Se compararon distintas organelas a nivel ultraestructural en ambas cepas, en
las diferentes condiciones nutricionales ensayadas. Para ello, las células fueron
recolectadas mediante centrifugación durante 20 minutos a 3.500 x g. Se descartó el
sobrenadante y las células se fijaron con glutaraldehído al 2,5% preparado en buffer
cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,4; durante toda la noche a 4°C. Luego fueron post‐
fijadas en tetróxido de Osmio 1% preparado en buffer fosfato 0,1M; pH 7,4 durante 2
horas, se centrifugó a baja velocidad, se descartó el sobrenadante y las células se
lavaron durante 10 minutos con buffer fosfato 0,1M; pH 7,4 tres veces. Se cosecharon
las células fijadas por centrifugación durante 5 minutos y se deshidrataron las
muestras utilizando una serie de concentraciones crecientes de acetona. Luego de la
deshidratación se realizaron inclusiones en resina Spurr de baja densidad (Reymond y
Pickett‐Heaps, 1983). Los preparados se seccionaron con un ultramicrótomo con
cuchilla de diamante (1 µm de espesor) y se tiñeron con acetato de uranilo 2% por 5
minutos y citrato de plomo 5% durante 5 minutos (Reynolds, 1963). Las secciones
fueron examinadas utilizando un microscopio electrónico de transmisión de alta
resolución, Zeiss EM 10 A/B, en el centro de microscopía avanzada de la Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales (CMA‐FCEN).
3.9 Análisis estadístico.
Cada tratamiento se realizó por triplicado y los datos se expresaron como
promedio ± error estándar. Para los gráficos y el análisis estadístico de los datos se
utilizó el programa GraphPad Prism 5. Se calcularon las medias, los desvíos y los
errores estándares de las réplicas. La significación estadística de la diferencia entre los
resultados obtenidos en los medios de cultivo (Cramer y Mayer, EGM y Buetow), las
condiciones nutricionales (fotosintética y heterotrófica) y las cepas (MAT y UTEX) se
determinaron mediante un análisis de varianza de un factor (ANOVA). En todos los
casos se consideraron significativas las diferencias con p<0,05.
‐ 142 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 143 ‐
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
‐ 144 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 145 ‐ 4.1 Microorganismos, condiciones de cultivo y cuantificación de la producción de
paramilon.
La mayor producción de paramilon se produjo en los cultivos de las cepas
blanqueadas, en particular cuando fueron cultivadas en medio mineral con exceso de
acetato (figura 3). De las dos cepas blanqueadas cultivadas en estas condiciones, la cepa
UTEX es el que tuvo mayor contenido del polisacárido (12,6 ± 0,8 mg/105 células y 10,0 ±
0,5 mg/105 células para las cepas UTEX y MAT respectivamente). Estas dos cepas
disminuyeron significativamente la producción de paramilon cuando se cultivaron en
medio con exceso de materia orgánica (5,7 ± 0,3 mg/105 células y 7,4 ± 0,3 mg/105 células
para las cepas UTEX y MAT respectivamente). Como se puede ver en la figura 3, las
diferencias en la producción de paramilon son mayores en la cepa UTEX que las
observadas en la cepa MAT (55% y 26% respectivamente).
Las cepas fotosintéticas muestran un comportamiento similar, el mayor contenido
de polisacáridos de reserva se produjo en los cultivos crecidos en exceso de acetato (7,5 ±
0,8 mg/105 células y 7,6 ± 0,3 mg/105 células para las cepas UTEX y MAT
respectivamente, figura 3) y la producción de paramilon disminuyó significativamente
tanto al crecer en medio orgánico (4,4 ± 0,3 mg/105 células y 4,9 ± 0,5 mg/105 células
para las cepas UTEX y MAT respectivamente) como en medio mineral sin exceso de
acetato (4,9 ± 0,4 mg/105 células y 4,8 ± 0,4 mg/105 células para las cepas UTEX y MAT
Figura 3: Producción de paramilon de las diferentes cepas en las dos condiciones nutricionales analizadas (* p˂0,05).
respectivamente).
UTEX f UTEX h MAT f MAT h0
5
10
15
EGM BUE
**
*
*
Cepa y Condición nutricional
Param
ilon
( g/105
células)
C&M
‐ 146 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis Estos resultados concuerdan con observaciones previas realizadas en la cepa
UTEX sobre la estimulación de la producción de polisacáridos de reserva tanto en las
cepas fotosintéticas como blanqueadas en presencia de altas concentraciones de acetato
en el medio de cultivo (Barsanti et al., 2001). Particularmente estos autores indican que E.
gracilis puede acumular paramilon en más del 90% del peso seco celular, bajo
condiciones de oscuridad (heterotrofia) y en presencia de glucosa como única fuente de
carbono. En nuestro estudio no se analizó el comportamiento de las cepas en presencia
de glucosa, pero si se analizó el comportamiento de una cepa autóctona (MAT) que no
presentó diferencias en su comportamiento con respecto a la cepa UTEX.
4.2 Contenidos de proteínas y lípidos bajo distintas condiciones de cultivo.
En las cepas fotosintéticas el contenido de proteínas fue significativamente mayor
en los cultivos crecidos en medio mineral con fuente adicional de carbono (Buetow,
figura 4). Sin embargo no se observaron diferencias en el contenido proteico en los otros
cepas en las dos condiciones nutricionales analizadas (* p˂0,05).
Como se mencionara anteriormente, el acetato del medio puede ser
incorporado sólo en lípidos e hidratos de carbono, pero no en proteínas, que
contienen, casi enteramente, carbono fijado por fotosíntesis. En nuestro caso se
observa que los mayores contenidos proteicos ocurrieron en las cepas fotosintéticas
cuando crecieron en un medio con exceso de acetato. Esto podría explicarse porque,
medios de cultivos ni en las cepas blanqueadas.
Figura 4: Producción de proteínas totales de las diferentes
UTEX f UTEX h MAT f MAT h0
2
4
6
8
EGM BUE
*
C&M
*
Cepa y Condición nutriciona
Proteínas
(mg/106 células)
l
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 147 ‐ en presencia de una fuente externa de carbono (acetato), todo el carbono obtenido
por fotosíntesis sería utilizado para la síntesis proteica, incrementando sus niveles
respecto de los obtenidos en otros medios empleados.
Por otro lado, la estreptomicina también inhibe la incorporación de acetato en
proteínas y ácidos nucleicos de las células (Cook, 1965), esto explicaría los bajos
contenidos proteicos observados en las cepas blanqueadas, cultivadas tanto en medio
orgánico como en medio mineral con exceso de acetato.
Respecto a los lípidos, se observa un incremento en su contenido cuando las
cepas fotosintéticas y heterotróficas crecen en medio con exceso de acetato respecto del
medio orgánico (figura 5). En el caso de las cepas fotosintéticas los niveles intermedios
de lípidos ocurrieron en medio mineral sin fuente adicional de carbono (Cramer y Mayer: 5 s cepas UTEX y MAT
Figura 5: Producción de lípidos totales de las diferentes cepas en las
dos condiciones nutricionales analizadas (* p˂0,05).
Cuando hay lípidos de reserva y no hay una fuente de carbono en el medio, E.
gracilis puede utilizar esos lípidos para la síntesis de carbohidratos gracias a la presencia
del ciclo del glioxilato (Schnarrenberger y Martin, 2002). Esto concuerda con nuestras
observaciones (menores contenidos de lípidos en medios sin acetato), lo que indicaría
que estas reservas lipídicas pueden estar siendo utilizadas en la síntesis de carbohidratos.
23,7 ± 1,8 y 24,3 ± 6,4 µg lípidos/1.10 células para la
respectivamente).
UTEX f UTEx h MAT f MAT h0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
EGM BUE C&M
*
*
*
*
Cepa y Condición nutricional
Lípidos ( g
/105
células)
*
‐ 148 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis Por el contrario, en medios con acetato los lípidos parecen no utilizarse por lo que los
contenidos son mayores.
4.3 Contenido de pigmentos en las cepas fotosintéticas
La cepa UTEX mostró los mayores contenidos de clorofila en los tres medios
ensayados (3,2 ± 0,2 mg/105 células, 2,5 ± 0,3 mg/105 células y ± 4,6 ± 0,5 mg/105 células,
para los medios con exceso de materia orgánica, minerales con y sin exceso de acetato
respectivamente, figura 7). La cepa MAT mostró un comportamiento similar a la cepa
UTEX pero sus contenidos de pigmentos fueron inferiores (1,9 ± 0,3 mg/105, 1,2 ± 0,1
mg/105 y 3,8 ± 0,2 mg/105 para los medios con exceso de materia orgánica, minerales con
y sin exceso de acetato respectivamente). En las dos cepas el contenido de pigmentos fue
significativamente mayor en medio mineral sin fuente adicional de acetato (Cramer y
las diferentes cepas en las dos condiciones nutricionales analizadas (* p˂0,05).
Como se mencionara anteriormente, en presencia de una fuente de carbono
externa, como el acetato, la fotosíntesis puede verse afectada debido a la inhibición en la
síntesis de clorofila y por lo tanto en el desarrollo de cloroplastos (App & Jagendorf,
1963; Buetow, 1967). Esto concuerda con nuestras observaciones, ya que los mayores
contenidos de pigmentos (clorofilas a+b) se encontraron en los cultivos crecido en
medio mineral sin fuente adicional de acetato.
Mayer) en relación a los otros dos medios de cultivo ensayados.
Figura 7: Contenido de pigmentos (Clorofila a+b) de
UTEX f MAT f0
1
2
3
4
5
6
EGM BUE
*
C&M
*
Cepa
Chl a
+ Chl b
( g/105
células)
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 149 ‐ 4.4 Actividad Isocitrato liasa
Ambas cepas blanqueadas, cuando se cultivan en un medio mineral con la adición
de acetato, presentan los mayores niveles de actividad ICL (figura 8). En líneas generales
puede observarse que frente al aumento de acetato hay mayor actividad ICL, pero este
aumento es mayor en las cepas blanqueadas que en las cepas autotróficas. Este
comportamiento se debería a que las células que son heterotróficas sólo pueden crecer a
expensas de alguna fuente de carbono externo (como el acetato), en cambio las células
fotosintéticas pueden o no usar esta fuente de carbono, ya que cuentan con el proceso
fotosintético para la asimilación del carbono. En particular la actividad ICL de la cepa
UTEX‐h es significativamente mayor (0,82 ± 0,1 nmol/mg prot) cuando se cultiva en un
medio mineral con exceso de acetato. Si bien la cepa MAT heterotrófica muestra un
comportamiento similar, en este caso las diferencias no resultaron significativas.
Figura 8: Actividad ICL de las diferentes cepas en las diferentes condiciones nutricionales analizadas (* p˂0,05).
Las dos cepas fotosintéticas tienen un comportamiento similar, presentan mayor
actividad ICL en medio orgánico (0,5 ± 0,1 nmol/mg prot para las cepas UTEX y MAT) que
en medio mineral con exceso de acetato (0,5 ± 0,1 nmol/mg prot y 0,4 ± 0,1 nmol/mg
prot para las cepas UTEX y MAT respectivamente) y en medio mineral sin exceso de
acetato (0,4 ± 0,1 nmol/mg prot y 0,3 ± 0,1 nmol/mg prot para las cepas UTEX y MAT
respectivamente), sin embargo estas diferencias no resultaron significativas. Por otro lado
no hay diferencias entre las cepas fotosintéticas.
UTEX f UTEX h MAT f MAT h0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
EGM BUE C&M
*
Cepa y Condición nutriciona
Actividad
(nmol/mg prot)
l
‐ 150 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis La enzima isocitrato liasa cataliza las escisión de isocitrato en glioxilato y
succinato. Esto permite que las células que poseen el ciclo del glioxilato, en el que
participa ésta entre otras enzimas, puedan vivir a expensas del acetato. Por este motivo
es de esperar que en presencia de acetato la actividad de esta enzima aumente. En
concordancia con esto último, nuestros resultados muestran un aumento de la actividad
ICL en presencia de acetato (medios EGM y Buetow). Sin embargo, para las cepas
fotosintéticas parece que el exceso de materia orgánica por si sola también aumenta la
actividad ICL. Posiblemente alguno de los componentes de los hidrolizados utilizados para
la preparación del medio enriquecido en materia orgánica (EGM) sea el responsable del
aumento en la actividad de esta enzima en condiciones autotróficas.
4.5 Diferencias ultraestructurales (Análisis mediante MET)
En las figuras 9 a 12 se muestra la ultraestructura de cloroplastos y
mitocondrias observadas en las cepas fotosintéticas y heterotróficas en las diferentes
condiciones de cultivo analizadas.
Figura 9: Cepas fotosintéticas crecidas en medio orgánico (EGM). A) Cepa MAT, B) Cepa UTEX, detalle de los cloroplastos (Cl) y nucleo (Nu). Escalas: A= 10 µm; B= 5 µm; C= 1 µm.
A B
Cl
Cl
Nu Nu
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 151 ‐
Cl
Nu
Mi
B
Cl
C
Mi
A
Las cepas fotosintéticas cultivadas en medio con exceso de acetato
mostraron cloroplastos menos desarrollados (figura 10 a) que los observados en
las células cultivadas en medios orgánico (figura 9 b) o mineral (figura 11 a y b),
algunos de ellos incluso se vieron desorganizados (figura 10 b). Como se
mencionara anteriormente esto se debe a que a en presencia de acetato hay una
inhibición en la síntesis de clorofila y en el desarrollo de cloroplastos (App &
Jagendorf, 1963; Buetow, 1967).
Figura 10: E. gracilis fotosintética cultivadas en medio mineral con un exceso de acetato (BUE). A) Cepa MAT‐f, B) Detalle de un cloroplasto (Cl) de la cepa UTEX, C) Detalle de la
red mitocondrial (Mi) de la cepa UTEX‐h. Escalas: A= 10 µm; B= 1 µm; C= 0,1 µm.
Tanto en condiciones autotróficas como heterotróficas, se puede observar que
bajo condiciones de exceso de acetato (figura 10 A y C) y en medio orgánico (figura 12
A y B) hubo un gran desarrollo mitocondrial. Esto responde a un metabolismo
heterotrófico producto de la asimilación del acetato del medio en el primer caso y en
el segundo a la asimilación de alguna fuente de carbono presente en el medio que
además podría ser responsable de las altas actividades ICL observadas en las cepas
‐ 152 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis fotosintéticas cultivadas en medio orgánico. Además se observó que las mitocondrias
presentaron una ultraestructura inusual (figuras 10 C y 12 B) para lo que no se ha
encontrado explicación en la bibiografía conocida.
Figura 11: Detalles de los cloroplastos (Cl) de E. gracilis crecidas en medio mineral sin exceso de acetato (C&M). A) Cepa UTEX, B) Cepa MAT. Escala= 10 µm.
Figura 12: Detalles de las mitocondrias (Mi) en las cepas UTEX‐h (A) y MAT‐h (B) crecidas en medio orgánico (EGM). Escala = 1 µm.
También puede observarse el alto contenido de gránulos de paramilon que se
producen en las células blanqueadas cuando crecen en medio mineral con exceso de
acetato (figura 13) en relación al contenido del polisacárido de reserva de la misma
cepa cultivada en un medio rico en materia orgánica.
A B
Cl Cl
Nu
Nu
Mi
A
Mi
B
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 153 ‐
A B
Figura 13: Cepa UTEX‐h cultiva en medio A) Buetow, B) EGM. Escala = 10 µm.
4.6 Composición general y microanalisis elemental del paramilon obtenido.
El análisis de los monosacáridos componentes reveló que la totalidad de la
muestra está compuesta por el monosacárido glucosa.
La tabla 3 muestra los resultados obtenidos mediante el microanálisis elemental
del glucano obtenido (figuras 14 y 15) por el método de extracción descripto en el ítem
3.2. Puede apreciarse que no hubo contenido de nitrógeno por lo que se puede decir que
el producto obtenido estuvo libre de otros compuestos celulares (como por ejemplo
proteínas) que en este caso actuarían como contaminantes del producto final.
Muestra N (% ) C (% ) H (% )
Paramilon ‐ 39,1 5,8
Patrón de BBOT 6,51 72,53 6,09
Ensayo de control de BBOT 6,47 72,49 6,03
Patrón de CEDFNI 20,14 51,79 5,07
Ensayo de control de CEDFNI 20,19 51,74 5,03
Tabla 3: Análisis elemental orgánico del paramilon obtenido.
‐ 154 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis La caracterización química de los compuestos orgánicos de carbono, hidrógeno
y nitrógeno juega un papel muy importante en todos los procesos de síntesis,
separación, purificación e identificación estructural, tanto con fines de investigación y
control de calidad, en el ámbito de los productos farmacéuticos, la química orgánica y
muchos otros. En este caso, la caracterización química llevada a cabo sobre muestras
de paramilon, obtenidas por este método, mostró el grado de pureza del polisacárido
(0% de N) indicando que se trata de un método eficiente para su separación y
purificación de otros componentes celulares. Por otro lado, el examen microscópico
del material obtenido de esta manera no mostró células intactas o restos celulares
(figura 14).
Figura 14: Aspecto del paramilon paramilon extraído de Euglena gracilis al
microscopio óptico (X 400). Se pueden apreciar los gránulos de paramilon y la ausencia de restos celulares.
Pese a esto, la formula molecular del paramilon (C6H10O5)n requiere los valores
teóricos C: 44,4% , O: 49,3% e H: 6,2% de lo que se desprende que el método degradó
en parte al polisacárido, por lo que dismiuye la cantidad relativa de C. Clarke y Stone
(1960), mediante una separación previa de los pigmentos y una degradación de
proteínas, logran extraer los gránulos utilizando urea. Estos autores obtienen mejores
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 155 ‐ resultados que los presentados aquí respecto de los porcentajes de C, H y O, sin
embargo ellos registran una pequeña pérdida de C (42,4 % ) y un contenido, aunque
mínimo, de N y P (0,5 y 0,05 % respectivamente). En el método original de extracción
de Kiss et al. (1988) no se presentan resultados sobre microanálisis elemental ni se
reportan los niveles de producción de este polisacárido.
Figura 15: Aspecto del paramilon de Euglena gracilis obtenido por el
método de Kiss et al. (1998)
‐ 156 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 157 ‐
CONCLUSIONES
‐ 158 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis
Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis ‐ 159 ‐
En este trabajo de tesis, hemos analizado la producción de paramilon en distintas
cepas de E. gracilis bajo diferentes condiciones nutricionales, utilizando los medios de
cultivo más populares para la especie.
Del análisis de la actividad ICL, hemos podido comprobar que la mayor actividad de
esta enzima se obtiene en condiciones heterotróficas, cuando las células crecen en un
medio mineral con exceso de acetato. Esta actividad le permite a las células
incrementar sus niveles de paramilon, manteniendo altos los niveles lipídicos y
protéicos. En el caso de las cepas fotosintéticas, cuando crecen en estas condiciones, el
acetato se incorpora en los carbohidratos (lo que se observa como un aumento en el
paramilon) y lípidos, mientras que la fotosíntesis se aprovecharía para la síntesis de
proteínas, que en las condiciones mencionadas presenta los mayores niveles. En estas
cepas además hay una disminución del contenido de pigmentos, lo que indicaría un
desplazamiento hacia el metabolismo heterotrófico.
Los estudios ultraestructurales nos han permitido verificar que, en un medio
mineral con exceso de acetato, las cepas heterotróficas acumulan gran cantidad de
paramilon a la vez que presentan mitocondrias muy desarrolladas. En estas
condiciones las cepas fotosintéticas presentan una disminución en el tamaño de sus
cloroplastos, incluso algunos pueden presentarse desorganizados, y también muestran
mitocondrias muy desarrolladas, lo cual se condice con ese desplazamiento hacia un
metabolismo heterotrófico. Cuando las células crecen en un medio sin exceso de
acetato (Cramer y Mayer) sólo pueden valerse de la fotosíntesis por lo que
ultraestructuralmente se observan cloroplastos muy desarrollados y mitocondrias
pequeñas, a la vez que los contenidos de pigmentos son los más elevados.
En base al análisis aquí presentado, se concluye que las mejores condiciones para
la producción del polisacárido de reserva de esta especie, corresponde a cultivos con
una fuente adicional de carbono en exceso (acetato en este caso). Esta condición es
válida para la obtención de los mejores rendimientos en la producción de paramilon,
tanto en las cepas blanqueadas como fotosintéticas, aunque las blanqueadas
resultaron ser las que producen mayor cantidad de este polisacárido de reserva. Al
analizar los resultados obtenidos con las distintas cepas de E. gracilis, hemos podido
comprobar que la cepa con mejores rendimientos, en la producción de paramilon, es la
‐ 160 ‐ Sección I‐ Estudios sobre la producción de paramilon de E. gracilis UTEX‐h en las condiciones anteriormente citadas, por lo que sería la cepa de elección
para la producción de este polisacárido.
SecciónIIActividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 163 ‐
1. INTRODUCCIÓN
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 164 ‐
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 165 ‐
1.1 Antivirales
Las infecciones virales son causa de daño, muerte y pérdidas en la población.
Para combatirlas, las vacunas cumplen un rol esencial ya que pueden prevenir distintas
enfermedades virales, aunque esto no siempre es posible. En esos casos surge la
necesidad del uso de drogas con actividad antiviral, es decir, utilizar compuestos con la
capacidad de inhibir una o varias etapas del ciclo de multiplicación de un virus.
Para que un antiviral resulte efectivo, debe ser selectivo, es decir, se debe
procurar que la droga inhiba la replicación viral a concentraciones que no resulten
tóxicas para la célula huésped. En este contexto, el hecho de que los virus utilicen la
maquinaria intracelular para su replicación representa una dificultad, por lo que una
quimioterapia exitosa se logra cuando la inhibición de la replicación viral no afecta el
funcionamiento celular, minimizando así la aparición de efectos adversos. A pesar de
que existe una gran cantidad de compuestos ensayados, la mayoría resultan tóxicos
para las células y a este inconveniente se le suma el surgimiento de cepas resistentes
debido a tratamientos prolongados (Damonte, 1996; Field y Biswas, 2011). Una
alternativa frente a este problema es la aplicación de terapias combinadas, así como
una búsqueda activa y diversificada de nuevos compuestos bioactivos que eliminen o
atenúen la enfermedad viral evitando la aparición de resistencias. Esta última es una
opción que cobra mayor relevancia si se tiene en cuenta que el número de antibióticos
disponibles en el mercado supera ampliamente a la cantidad de drogas antivirales de
las que se dispone (Andrei y De Clerq, 1996).
Entre los productos naturales, los polisacáridos sulfatados obtenidos a partir de
fuentes naturales resultan promisorios. Existe variada bibliografía que describe la
actividad antiviral de este tipo de compuestos frente al virus dengue (Talarico et al.,
2005; Pujol et al., 2012), herpes virus (Lee et al., 2004; López et al., 2013), virus
influenza (Makarenkova et al., 2010; Kim et al., 2013), virus de la hepatitis A (Girond et
al., 1991) y virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Hayashi et al., 1996). En
cuanto a los β‐glucanos, derivados sulfatados de este tipo de compuestos, obtenidos
de diversas fuentes, han mostrado actividad frente a varios virus (Zhang et al., 2004;
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 166 ‐
de Souza Cardozo et al., 2011) y en el caso particular de Euglena gracilis, derivados
sulfatados del paramilon han mostrado actividad anti‐HIV (Koizumi et al. 1993).
1.1.1 Mecanismo de acción de los antivirales
Muchos antivirales interfieren con alguna de las etapas de la replicación viral,
pero otros provocan respuestas en la célula huésped de tipo antiproliferativa e
inmunomoduladora, éste es el caso de los interferones y citoquinas. De acuerdo a su
perfil específico de actividad, un compuesto antiviral puede interactuar de forma
directa con su blanco de acción (como la amantadina, la rimantadina y el foscarnet) o
puede necesitar primero una activación intracelular (como el aciclovir, un análogo de
nucleósido que debe ser fosforilado por quinasas celulares o virales) (tabla 1).
Tabla 1: Mecanismo de acción y actividad de algunos antivirales sobre la infección vírica. (RA): Resistente a aciclovir.
Antiviral Activación Mecanismo de acción Virus afectado Cita
Aciclovir Fosforilado Metabolizado a aciclovir trifosfato que inhibe a la ADN polimerasa viral.
herpes simplex, varicella zoster, citomegalovirus
Elion et al., 1977 Elion, 1983
Foscarnet Ninguna Inhibición de la ADN polimerasa viral
citomegalovirus, herpes simplex (RA), varicela zoster (RA)
Safrin et al., 1990 Crumpacker, 1992
Rimantadina Amantadina
Ninguna
Obstrucción de una proteína de membrana y su habilidad para variar el
pH intracelular.
influenza A Hoffman et al., 1965 Pfau et al., 1972
Ribavirina Fosforilada Interferencia con ARNm
viral.
Lassa, hantavirus, hepatitis C
Browne, 1979 McCormick et al., 1986
Interferón alfa
Ninguna Inducción de enzimas
celulares que interfieren en la síntesis proteica.
hepatitis D Issacs y Lindermann, 1957
Farci et al., 1994
Oseltamivir Ninguna inhibe actividad de la
enzima viral neuroaminidasa
influenza A y B Jackson et al., 2011
Nevirapina Ninguna inhibe a la transcriptasa
reversa viral HIV Arribas y Eron, 2013
Saquinavir Ninguna inhibe la actividad de la
proteasa viral HIV Arribas y Eron, 2013
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 167 ‐
Como se mencionó anteriormente, el mecanismo de acción de un antiviral
tiene como blanco la inhibición de alguna etapa de la replicación viral sin alterar el
metabolismo celular. Tanto la adsorción de la partícula viral a la superficie celular,
como la penetración y el desnudamiento viral (liberación del genoma viral en el
interior de la célula) son eventos que sólo ocurren en células infectadas, por lo que son
los principales blancos de acción de los antivirales. Otros posibles blancos son la
transcripción y traducción de los ARNm virales, la replicación del genoma viral y el
clivaje de proteínas precursoras mediadas por enzimas virales.
1.2 Virus Herpes Simplex.
1.2.1 Características.
El virus herpes simplex (HSV) pertenece a la familia Herpesviridae, subfamilia
Alphaherpesvirinae. Numerosos virus patógenos para el hombre pertenecen a esta
familia. Entre ellos se encuentran HSV, tipo 1 y 2, responsables de las lesiones
herpéticas orofaciales y genitales respectivamente; el virus varicela‐zoster (VZV) que
produce la varicela y la enfermedad conocida como culebrilla; el virus de Epstein‐Barr
(EBV, subfamilia Gammaherpesvirinae) que provoca la mononucleosis infecciosa, el
linfoma de Burkitt y puede ser el agente causal de carcinoma nasofaríngeo; y el
citomegalovirus (subfamilia Betaherpesvirinae) que también provoca mononucleosis,
retinitis, hepatitis y otras enfermedades sobre todo en inmunodeprimidos (De
Cristófano et al., 1996).
El virión del HSV, de unos 150nm de diámetro, es esférico y cubierto por una
envoltura con espículas en su superficie. En su interior contiene una cápside
icosaédrica con 162 capsómeros, rodeados por un tegumento amorfo. Dentro de la
cápside se encuentra un core electrodenso que contiene al genoma viral constituido
por ADN bicatenario y que codifica para más de 70 proteínas en la célula infectada
(Landy, 1989; McGeoch, 1989; figura 1).
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 168 ‐
Figura 1: A) esquema del herpes virus (sec. Bleasdale, 2013), B) Micrografía del Herpes virus (por J.C. Brown, Univ. de Virginia). C) Cápside del Herpes virus tipo
1. Fuente: Rochat et al., 2011. Escala: 200 Å.
El huésped natural del HSV es el hombre, la infección primaria en seres
humanos por lo general se produce en la mucosa orofacial durante la infancia. Allí, el
virus se replica dentro de las células epiteliales y sufre su ciclo de vida lítico que
termina con la producción de viriones infecciosos y la lisis de la célula huésped. Existen
dos tipos de HSV, 1 y 2. El HSV‐1 está asociado mayormente con lesiones orales y
oculares y se transmite a través de secreciones orales y respiratorias. En cambio, el
HSV‐2 está mayormente asociado a lesiones genitales y su transmisión es
fundamentalmente sexual. Hoy se conoce que el HSV‐1 también puede causar
infección de los genitales debido a prácticas sexuales, aun cuando una úlcera bucal no
es evidente. El HSV‐1 genital está aumentando su prevalencia en la población (Mertz et
al., 2003; Celum et al., 2010), sin embargo, la mayoría de los casos de herpes genitales
son aún causados por el HSV‐2.
En ambos casos la infección se produce a través de una mucosa erosionada
(labios, boca, ojos, genitales) o de la piel, donde comienza la multiplicación del virus,
quien luego difunde a los ganglios linfáticos donde se produce una multiplicación
secundaria. El HSV es un ejemplo de una interesante propiedad de ciertos virus ya que
puede presentarse en una forma activa y otra latente. Durante la fase activa, el virus
interfiere con el metabolismo normal de la célula, causando los síntomas asociados
con la enfermedad. En la fase latente, si bien la célula huésped permanece infectada,
el hospedador es un portador asintomático de la enfermedad (Schiffer et al., 2009).
CA
ADN viral
Tegumento
Envoltura viral
Glicoproteína
Cápside
B
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 169 ‐
Las lesiones recurrentes que presenta esta enfermedad se deben a esa latencia viral
que se produce, en el caso del HSV‐1, en los ganglios del nervio trigémino que
comunica la cara con el sistema nervioso central, y en los ganglios del nervio sacro que
se encuentra cerca de la base de la médula espinal en el caso del HSV‐2. Dado que el
virus alcanza otras células epiteliales, o bien por fusión de membranas de dos células
contiguas o bien por transmisión célula a célula, a través de las uniones estrechas
entre células vecinas, no entra en contacto con el medio extracelular evitando así a los
anticuerpos. A su vez, el hecho de que haya anticuerpos evita la diseminación viral, por
lo que las reincidencias de las lesiones se llevan a cabo en el lugar de la infección
original (Garcia‐Blanco y Cullen, 1991; De Cristófano et al., 1996). Estas recurrencias en
las lesiones están generalmente relacionadas a factores tanto emocionales (por
ejemplo estrés), como a factores físicos (por ejemplo irradiación solar). Comúnmente
estas recurrencias suelen ser de evolución corta y sintomatología moderada, con
completa regeneración del epitelio. La prevalencia de la infección por virus HSV es
aproximadamente del 100% en la edad adulta. Esto se debe a que existe liberación de
virus infeccioso en mucosas y/o epitelios sin lesiones evidentes, por lo que el virus se
transmitiría entre personas aparentemente sanas (Celum et al., 2010).
Desafortunadamente, todavía no existe ninguna vacuna aprobada para la
prevención de HSV, aunque algunas se encuentran en fases de desarrollo (Senzer et
al., 2009; Bernstein 2010; Belshe et al. 2012; Skoverne et al., 2013). Por este motivo, el
aciclovir (9‐(2‐hidroxietoximetil) guanina), un derivado de guanina con una cadena
lateral acíclica (White y Fenner, 1994) es el tratamiento de elección para esta viremia.
Este derivado requiere de la enzima viral, timidin quinasa (TK) para su fosforilación
intracelular a acilguanosina monofosfato (AG‐P). Luego, la AG‐P necesita de una
quinasa celular dependiente de GMP para ser activada completamente a acilguanosina
trifosfato (AG‐PPP). Este último, inhibe a la ADN polimerasa viral competitivamente y
es incorporado al ADN. Dado que este derivado carece del grupo hidroxilo en el
extremo 3´ causa la interrupción en la elongación de la cadena de ADN. Debido a que
la pro‐droga requiere de la activación de una enzima viral, el aciclovir no es tóxico para
las células no infectadas por lo que además puede ser administrado tópicamente o por
vía oral o intravenosa. Dada la prevalencia de la infección y el hecho de que se han
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 170 ‐
registrado mutantes resistentes al aciclovir in vivo y en cultivos celulares se torna
importante la búsqueda de nuevos compuestos antiherpéticos.
1.2.2 Ciclo de multiplicación viral.
La entrada del HSV en la célula huésped requiere de la interacción secuencial
de glicoproteínas de membrana específicas virales (gB, gC, gD, gH y gL) con los
receptores celulares. Se ha descripto una primera interacción con proteoglicanos
heparán sulfato (HSPG), y una segunda interacción que implica la unión a diferentes
moléculas (nectina1, el mediador de la entrada del herpes virus (HVEM) o el 3‐O
heparán sulfato sulfatados, 3‐OS HS) en diferentes tipos celulares (O’Donnell et al.,
2008). Durante el ciclo de multiplicación de HSV (Figura 2), una glicoproteína de la
envoltura (gC) se une a los residuos heparán sulfato que se encuentran en la superficie
celular, quien además es mediador de la unión a otros receptores celulares, por lo que
promueve la penetración viral por fusión de la envoltura viral con la membrana
plasmática. Durante este proceso además estarían involucradas otras dos
glicoproteínas (gB y gH). Luego, las proteínas del tegumento se liberan y una de ellas
suprime la síntesis de proteínas celulares. La cápside, que también es liberada al
citoplasma, se transporta hacia un poro nuclear donde el ADN viral es liberado y
circularizado (Belshe, 1991; Eisenberg et al., 2011).
Otra proteína del tegumento se libera y activa la transcripción de los 5 genes α.
Esta proteína viral se asocia a otras dos proteínas celulares para formar un complejo
multiproteico, que reconoce la secuencia en la región promotora del ADN viral,
disparando la transcripción mediante la polimerasa celular. Los ARNm son
transportados al citoplasma donde son traducidos a proteínas regulatorias de la
expresión de los genes tardíos. Una proteína inicia la transcripción de los genes , que codifican para enzimas requeridas para incrementar la reserva de nucleótidos y de
otras proteínas necesarias para la replicación viral. El genoma viral se replica
circularmente. Siguiendo el ciclo de replicación, algunas proteínas β inducen la
transcripción de genes llamados , que codifican para las proteínas requeridas para la
formación de nuevos viriones (Belshe, 1991). Durante el ensamblaje se forma una
cápside vacía donde luego se empaqueta el ADN viral en el núcleo celular (Metteleiter,
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 171 ‐
2002, Hollinshead et al., 2012). Algunas evidencias experimentales señalan que la
cápside dejaría el núcleo recubierto con la membrana nuclear interna, y dicha cubierta
se perdería por fusión con la envoltura nuclear externa, dejando las cápsides rodeadas
únicamente por el tegumento, libres en el citoplasma. La nueva adquisición de una
envoltura se produciría a partir de membranas tubulares citoplasmáticas (Hollinshead
et al., 2012). Esta adquisición puede explicarse de dos formas (Bleasdale, 2013; figura
3):
a‐La cápside y tegumento se unen a la región trans de Golgi (TGN) adquiriendo una
nueva envoltura en su lumen. El virión envuelto pasa entonces a la vía secretora hasta
la fusión de la vesícula con la membrana plasmática liberando el virión.
b‐ Por endocitosis de la membrana plasmática se forman vesículas tubulares que se
unen y envuelven las cápsides y sus tegumentos. Los viriones envueltos son luego
llevados a la superficie donde ocurre la fusión de la vesícula con la membrana
plasmática liberando el virión.
Figura 2: Ciclo de multiplicación de HSV (de Chiara et al., 2012).
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 172 ‐
Figura 3: Modelo para la adquisición de la envoltura viral (Hollinshead et al., 2012): (1)
Glicoproteínas virales se procesan en el aparato de Golgi (TGN) y se exportan a la
superficie celular. (2) La membrana plasmática con glicoproteínas se invagina y es
transportada a través del endosoma temprano para producir envolturas tubulares. (3)
Los túbulos con las glicoproteínas envuelven las cápsides en el citoplasma celular
formando viriones con una doble membrana. La fusión de las membranas produce la
liberación de un virión rodeado de tegumento. (EE) endosoma temprano; (ER) retículo
endoplásmico; (GA) el aparato de Golgi; (PM) membrana plasmática; (TGN) región
trans de Golgi.
El HSV‐1 es capaz de establecer una infección latente durante toda la vida del
huésped en los cuerpos celulares de las neuronas que alimentan el sitio de la infección
primaria (Baringer y Swoveland, 1973). Esta latencia se caracteriza por la presencia de un
genoma viral funcional sin la producción de virus infeccioso. Durante este tiempo, las
transcripciones asociadas a latencia (LAT) son las únicas transcripciones prominentes
(Stevens et al., 1987), cuyo papel en la generación de péptidos funcionales o proteínas es
todavía una cuestión de debate (Henderson et al., 2009). La reactivación de la latencia
puede ser desencadenada por varios estímulos externos (estrés, inmunosupresión, etc.)
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 173 ‐
que activan la expresión de los genes virales. Los viriones recién producidos son
transportados a los sitios de infección primaria donde causan lesiones herpéticas
recurrentes (figura 4).
Figura 4: Ciclo de mantenimiento (latencia) del HSV y su reactivación
(sec. Penkert y Kalejta, 2012).
En los últimos años, se han encontrado numerosos compuestos procedentes de
fuentes naturales que han mostrado actividad antiherpética al interferir con los
primeros eventos del ciclo viral, incluida la unión del virus a y/o la entrada a la célula
huésped (Ghosh et al., 2009). Se han encontrado varios polisacáridos con
características antivirales tales como los ramnanos sulfatados obtenidos del alga verde
Monostroma nitidum (Lee at al., 2010), fucoidanos de alga parda Undaria pinnatifida
(Lee et al., 2004; Hayashi et al., 2008), polisacáridos ácidos sin grupos sulfato aislados
de las cianobacterias Nostoc flagelliforme (Kanekiyo et al., 2007) y polisacáridos
neutros aislados de Basella rubra (Dong et al., 2012), una planta popular en varios
países por sus hojas comestibles, extensamente usada en la cocina asiática. Con
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 174 ‐
respecto a los polisacáridos sulfatados, su mecanismo de acción es incierto, aunque
algunos autores han atribuido su acción a la inhibición de la adsorción del virus a la
célula huésped y su internalización (Baba et al., 1988; Eo et al., 2000; Talarico et al.,
2005). Esto se debería a que los polisacáridos sulfatados presentan una estructura
química muy similar al heparán sulfato, por lo cual podrían bloquear la infección viral
al competir con el heparán sulfato por la interacción con el virus.
Eliminado: í
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2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
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2.1 Hipótesis
Dado los efectos antivirales de muchos polisacáridos sulfatados, si se modifica
mediante sulfatación el paramilon, polisacárido de reserva de Euglena gracilis, éste
podría ser capaz de inhibir al virus herpes simplex tipo 1 (HSV‐1) in vitro.
2.2 Objetivos Generales
Evaluar la actividad antiviral frente a HSV‐1 de un derivado obtenido mediante un
proceso de sulfatación del paramilon de E. gracilis.
2.3 Objetivos específicos
Someter al paramilon obtenido de E. gracilis a un proceso de derivatización con el
objetivo de producir un derivado sulfatado.
Evaluar la actividad citotóxica en células Vero del paramilon y del derivado
obtenido de E. gracilis.
Evaluar la actividad antiviral frente a HSV‐1 del derivadoobtenido de E. gracilis.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
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3.1 Preparación de un derivado sulfatado del paramilon.
El paramilon obtenido como se describe en el punto 3.2 del capítulo 3 sección 1
se sometió a un proceso de sulfatación de acuerdo con la técnica descripta por Takano
et al. (1996). Para esto se tomaron 100 mg de paramilon y se homogeneizaron en 9,5
ml de dimetiformamida (DMF) durante 3 horas con agitación y calor, sin superar los
40°C. Una vez homogeneizado, se añadieron 640 mg de diciclohexilcarbamida (DCC)
disuelta en 8,2 ml de DMF. La mezcla se llevó a 0°C con baño de hielo y agua y se
añadió una solución 0,30 M de H2SO4 en DMF. La mezcla se agitó durante 15 minutos a
0°C, bajo corriente de nitrógeno, luego se volcó sobre 50 gr de hielo molido y se
neutralizó con una solución de NaOH. Una vez neutralizada, la mezcla se dializó
durante 5 días con agua corriente y 2 días con agua destilada. Una vez dializada, la
mezcla se filtró utilizando papel de filtro, a fin de remover la diciclohexilurea derivada
de la DCC. La muestra se mantuvo durante 3 días en heladera y, tras la formación de
un precipitado color blanco, se volvió a repetir el proceso de filtrado, esta vez
utilizando un papel más grueso. El filtrado se concentró a presión reducida, se congeló
a ‐24°C, se liofilizó y se mantuvo en desecador hasta su posterior utilización.
3.2 Actividad citotóxica y antiviral del paramilon y su derivado. 3.2.1 Medios de cultivo. Medio de crecimiento (MC): Medio mínimo esencial de Eagle (MEM), carbonato de
sodio 26 mM suplementado con 5% de suero fetal bobino inactivado y gentamicina
(50g/ml).
Medio de mantenimiento (MM): Medio mínimo esencial de Eagle (MEM), carbonato de
sodio 26 mM suplementado con 1,5% de suero fetal bobino inactivado y gentamicina
(50g/ml).
Medio de plaqueo: Medio mínimo esencial de Eagle doblemente concentrado (MEM
2X) suplementado con 4% de suero de ternera inactivado y 100 g/ml de gentamicina.
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 182 ‐
En el momento de utilizarse se mezcla con igual volumen de metilcelulosa 1,4% para
obtener un medio semisólido.
3.2.2 Células.
Se utilizó la línea celular Vero (figura 5). Esta línea celular fue obtenida en 1952
a partir de un riñón de un mono verde africano (Cercopithecus aethiops) adulto normal
(ATCC‐CCL, 1992). Las células fueron crecidas en monocapa en MC a 37°C y
mantenidas en MM. Los cultivos que se incubaron en estufa con 4% de CO2, se
suplementaron con buffer ácido N‐[2‐hidroxietil] piperazin‐N´‐[2‐etansulfónico]
(HEPES) 20mM y bicarbonato de sodio 26 mM.
Figura5: Línea celular Vero utilizada en los ensayos antivirales. Fuente: American Type Culture Collection (ATCC), www.atcc.org
3.2.3 Virus.
Se utilizó la cepa F de HSV‐1 obtenida de la American Type Culture Collection
(ATCC, Rockville, USA). Los stocks virales provistos por el laboratorio de Virología del
Departamento de Química Biológica se conservaron a ‐70°C y se titularon por el
método de formación de placas de lisis (UFP).
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
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3.2.4 Ensayo de viabilidad celular.
Previamente al estudio de la actividad antiviral de un compuesto, se debe
evaluar el efecto tóxico de éste sobre las células en ausencia del virus. Con el fin de
determinar si el derivado, obtenido según la metodología descripta en la sección 3.3,
tiene algún grado de citotoxicidad, se evaluó la viabilidad de células Vero mediante el
método de MTT en presencia del derivado y en presencia del paramilon sin derivatizar.
El MTT, bromuro de (3‐[4,5‐dimetilthiazol‐2yl]‐2,5‐difeniltetrazoilio, Sigma
Chemical Co. St. Louis), es un compuesto que se reduce por acción de la enzima
mitocondrial succinato deshidrogenasa, generando un producto de color azul
(formazan) (Denizot y Lang, 1986). La medida de la absorbancia a 595 nm permite
detectar alteraciones en el metabolismo oxidativo celular, en los cultivos tratados con
droga respecto a los no tratados.
Monocapas de células Vero crecidas en microplacas de 96 pocillos durante 48
horas se incubaron con 100 µl de MM, conteniendo diferentes concentraciones de los
dos compuestos a analizar, el polisacárido derivatizado y el polisacárido sin derivatizar,
durante 48 horas a 37 ºC y en atmósfera de CO2. Luego se retiró el medio y se
colocaron en cada pocillo 100 µl de una solución de MTT a una concentración final de
0,5 mg/ml en el medio. Las placas se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37 °C, en
atmósfera de CO2. Luego se les retiró el medio y se agregaron 200 µl de etanol 96°,
homogeneizando bien la mezcla en cada cavidad. Se leyeron las absorbancias a 595 nm
en un lector de placa. El porcentaje de viabilidad celular se calculó como:
% de viabilidad celular = 100 x densidad óptica 595nm tratado
densidad óptica 595nm control
A partir de los gráficos de regresión lineal, del porcentaje de viabilidad celular
en función de la concentración del compuesto, se determinó la concentración del
polisacárido derivatizado y sin derivatizar, que provoca una reducción del 50% en la
viabilidad celular (CC50).
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
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3.2.5 Ensayos antivirales del derivado obtenido.
Luego de realizados los estudios de toxicidad, se llevó a cabo la evaluación de la
actividad antiviral frente a HSV‐1 del derivado obtenido (sección 3.1), en la línea
celular Vero. Está reportado que esta línea es sensible a poliovirus tipo 3, virus
SemlikiForest, paramarixovirus, herpesvirus y adenovirus tipo 3 y 7 entre muchos otros
(Horwitz, 1990).
3.2.5.1 Ensayo de inhibición del rendimiento viral.
La actividad antiviral fue evaluada mediante el ensayo de inhibición del
rendimiento viral. Para esto, monocapas de células Vero crecidas en microplacas de 24
cavidades se inocularon con 0,2 ml de una suspensión de virus a una multiplicidad de
infección (m.i.) de 1, a fin de infectar la mayoría de las células del cultivo. Luego de una
hora de adsorción a 37°C, en atmósfera de CO2, se retiró el inóculo viral y las células se
cubrieron con 0,5 ml de MM, conteniendo diluciones seriadas del compuesto. Los
cultivos controles se cubrieron con MM, pero sin el compuesto. Posteriormente, los
sobrenadantes se cosecharon manteniéndolos en baño de hielo, a fin de que no
perdiesen infectividad y se titularon por el método de UFP (ver la sección 3.2.5.2). La
actividad antiviral se calculó como el porcentaje de inhibición del título viral en los
cultivos tratados respecto al control, utilizando la siguiente fórmula:
% inhibición = 100 – título de la muestra x 100
título del control de virus
La concentración efectiva 50 (CE50) se estimó como la concentración del
compuesto que redujo el título viral en un 50% respecto al control sin tratamiento.
Este valor se calculó a partir de la recta de regresión lineal obtenida del gráfico del
título en función de la concentración.
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 185 ‐
3.2.5.2 Titulación de la infectividad viral
La titulación de la infectividad viral se determinó por recuento de UFP,
utilizando células Vero. Para esto, las células se inocularon con diluciones seriadas al
décimo (por duplicado) de las suspensiones a testear y luego de 1 hora de adsorción a
37°C se retiró el inóculo y se cubrió cada cavidad con 0,5 ml de medio de plaqueo. Las
placas se incubaron nuevamente por 96 horas en las mismas condiciones, luego se
fijaron las células con formol al 10% durante 15 minutos y se revelaron las placas por
tinción con cristal violeta al 1% durante 20 minutos. El título viral se determinó según
la siguiente ecuación:
Titulo viral = promedio del número de placas de lisis
(UFP/ml) vol. de inóculo X dilución
3.2.5.3 Ensayo de reducción del número de placas.
Las monocapas de células Vero, crecidas en microplacas de 24 pocillos, se
infectaron con una dilución del stock viral de manera tal de contar con un inóculo de
0,2 ml conteniendo 50 UFP. Luego de 1 hora de adsorción a 37°C, se retiró el inoculo,
se cubrió cada cavidad con 0,5 ml de medio de plaqueo y las microplacas se incubaron
a 37°C en estufa de CO2. Al cabo de 4 días las células se fijaron y se tiñeron para poder
revelar la presencia de placas lisis (descripto en 3.2.5.2). El tratamiento con el derivado
de paramilon se realizó incubando en etapas diferentes:
1) únicamente durante la adsorción viral,
2) durante la adsorción y se mantuvo en el medio de plaqueo,
3) el polisacárido se agregó luego de la adsorción y se mantuvo en el plaqueo.
La CE50 se estimó como la concentración del compuesto que redujo el número
de placas en un 50% respecto al control sin tratamiento. Este valor se calculó a partir
de la recta de regresión lineal obtenida del gráfico del número de placas en función de
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 186 ‐
la concentración. En todos los casos se calculó el índice de selectividad (IS) como el
cociente CC50/CE50 y se calculó el porcentaje de inhibición del número de placas como:
% inhibición = 100 – número de placas de la muestra x 100
número de placas del control de virus
3.3 Análisis estadístico.
Cada tratamiento se realizó por triplicado y los datos se expresaron como
promedio ± desvío estándar. Para los gráficos y el análisis estadístico de los datos se
utilizó el programa GraphPad Prism 5. Se calcularon las medias y los desvíos
estándares de las réplicas. Para comparar los controles con las distintas
concentraciones del polisacárido en estudio se realizaron análisis de varianza (ANOVA)
de un factor considerando a las concentraciones como variables independientes. En
todos los casos se consideraron significativas las diferencias con p<0,05.
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
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4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
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Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
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4.1 Actividad citotóxica y antiviral del paramilon y su derivado.
4.1.1 Efecto del paramilon y su derivado sobre la viabilidad de las células Vero.
La figura 6 muestra la reacción de las células Vero tratadas con el derivado
obtenido frente al MTT. La observación mediante microscopía óptica de las cavidades
tratadas con el compuesto a concentraciones que resultaron tóxicas para las células,
nos permitió detectar el redondeamiento de su contorno y el desprendimiento de
algunas células al sobrenadante de los cultivos (datos no mostrados).
Figura 6: Reacción de las células Vero tratadas con diferentes concentraciones del derivado obtenido frente al MTT.
En este estudio se pudo observar una marcada disminución de la viabilidad
celular con el aumento de las concentraciones del derivado obtenido (figura 7A). Este
comportamiento no se detectó cuando se trató a las células con concentraciones
crecientes de polisacárido sin derivatizar (figura 7B). El polisacárido sin activar no sólo
no presentó efectos citotóxicos, sino que por el contrario, parece haber estimulado
significativamente la actividad enzimática de las células al ser tratadas con altas
concentraciones del compuesto.
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 190 ‐
Por otro lado, se observó que a muy bajas concentraciones del derivado
obtenido (7 a 14 µg/ml, figura 7A), parece haber una estimulación de la actividad
enzimática celular, sin embardo esta estimulación no resultó significativa.
Figura 7: Efecto citotóxico del paramilon derivatizado (A) y sin derivatizar (B)
sobre células Vero (pг0,05).
A partir de los datos de viabilidad obtenidos por tratamiento de las células Vero
con el derivado obtenido, y mediante regresión lineal (figura 8) surge que la
concentración citotóxica 50 (CC50) para este derivado es de 400 µg/ml. También se
estimó la concentración que permitió una supervivencia del 80% o superior de las
células Vero. La concentración citotóxica 20 (CC20) fue de 108 µg/ml. Para este análisis
0,000 3,7 7,5 15 30 60 120 230 4600
100
200
300
400
500 *
B
Concentración (g/ml)
% Viabilidad
0 7 14 29 58 115 230 460 9200
50
100
150
*
A
Concentración (g/ml)
% V
iabi
lidad
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 191 ‐
no se consideraron los valores en los que hubo estimulación de las células ya que no
resultaron significativos (datos no incluidos en la regresión lineal).
Figura 8: Regresión lineal de la viabilidad de las células Vero en función de las
diferentes concentraciones del derivado obtenido.
Considerando los valores de citotoxicidad obtenidos, se procedió a valorar el
efecto de uno de estos compuestos, el paramilon derivatizado, sobre la multiplicación
viral, utilizando un rango de concentraciones similar o menor a la CC20 para asegurar
por lo menos un 80% de viabilidad celular.
4.1.2 Evaluación de la actividad antiviral del derivado obtenido.
4.1.2.1 Ensayo de inhibición del rendimiento viral.
En este ensayo se infectaron células Vero con HSV‐1 y luego de una hora de
adsorción del inóculo viral, los cultivos se cubrieron con medio de cultivo conteniendo
distintas concentraciones del derivado. A las 72 horas post‐infección se cuantificó el
rendimiento viral. Los títulos infecciosos obtenidos por recuento de placas de lisis de
los sobrenadantesse muestran en la figura 9.
0 200 400 600 800 10000
25
50
75
100
125
y = ‐0,103 x + 91,17R2 = 0,906
Concentración (g/ml)
% Viabilidad
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 192 ‐
Figura 9: Respuesta del rendimiento viral a diferentes dosis del derivado obtenido. Los resultados se expresan como título del virus liberado al sobrenadante (* significancia respecto del control,
** significancia respecto de 7 µg/ml de paramilon derivatizado, en ambos casos pг0,05).
La figura 10 muestra el porcentaje de inhibición del rendimiento viral, tomando
como un 100 % de rendimiento, al título obtenido de los controles. Si bien se
observaron diferencias estadísticamente significativas a partir de los 7 µg/ml del
compuesto respecto de los controles, los resultados obtenidos indicarían que el HSV‐1
muestra una moderada susceptibilidad al compuesto si se lo adiciona luego de la
adsorción del virus a las células. Si bien con una concentración de 7 µg/ml se observó
un 70% de inhibición, con concentraciones mayores se detectó un menor grado de
inhibición (figura 10).
Figura 10: Porcentaje de inhibición del rendimiento viral respecto de los controles (0% de inhibición). (* significancia respecto del control, ** significancia respecto de 7 µg/ml del
derivado obtenido, en ambos casos pг0,05).
0 3,5 7 14 29 580
500000
1000000
1500000
2000000
*
**
Concentración (g/ml)
Titu
lo v
iral
(U
FP
/ml)
0 3,5 7 14 29 580
20
40
60
80
100 **
*
Concentración (g/ml)
% I
nhib
ició
n
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 193 ‐
4.1.2.2 Ensayo de reducción del número de placas
En la figura 11 se muestran las placas de lisis obtenidas cuando se incubó en
forma conjunta el virus con diferentes concentraciones del derivado durante la adsorción
como se indica en la sección 3.2.5.3.
Figura 11: Placas de lisis reveladas por tinción con cristal violeta al 1% .
El número de placas de lisis obtenido en función de la concentración del
compuesto en estudio se muestra en la figura 12 A. En ella puede observarse que a bajas
dosis de compuesto la efectividad de la infección descendió pero no significativamente.
En cambio el número de placas se redujo significativamente cuando se utilizaron
concentraciones superiores a los 14 µg/ml. En la figura 12 B se muestra la regresión lineal
del número de placas en función de la concentración del derivado obtenido, mediante
esta regresión se calculó la concentración efectiva 50 (CE50), que es la concentración de
compuesto que puede reducir en un 50% el número de placas respecto de los controles.
La concentración correspondiente a la CE50 fue de 27µg/ml.
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 194 ‐
Figura 12: A) Número de placas en función de la dosis del derivado obtenido cuando se incorporó en forma conjunta a las partículas virales durante la etapa
de adsorción (pг0,05). B) regresión lineal.
En la figura 13 se puede observar el efecto dosis‐dependiente del compuesto en
estudio sobre la inhibición del número de placas de lisis. Las diferencias sólo resultaron
significativas respecto de los controles en dosis superiores a los 14 µg/ml.
Figura 13: Porcentaje de inhibición del número de placas virales respecto de los controles (0% de inhibición) cuando se incorporó el derivado obtenido en forma conjunta a las partículas virales (pг0,05).
A B
0 3,5 7 14 29 580
10
20
30
40
*
Concentración (g/ml)
Núm
ero
de p
laca
s
0 20 40 600
10
20
30
40
y = ‐0,4x + 25,68R2 = 0,879
Concentración (g/ml)
Núm
ero
de p
laca
s
0 3,5 7 14 29 580
20
40
60
80
100 *
Concentración (g/ml)
% I
nhib
ició
n
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 195 ‐
En la figura 14 A se muestran los resultados obtenidos en función de la
concentración del compuesto en estudio, cuando estuvo presente tanto durante la
adsorción como durante la etapa de internalización y replicación (en el medio de
plaqueo). En esta figura puede observarse que a bajas dosis la efectividad de la infección
descendió aunque no resultó significativo. Las diferencias significativas respecto de los
controles se observan a partir de la incubación con 14 µg/ml o concentraciones de
compuesto superiores, de manera similar a lo que ocurrió cuando se incubó a las células
con el compuesto en estudio sólo durante la adsorción viral. En la figura 14 B se muestra
la regresión lineal del número de placas en función de la concentración del derivado
obtenido. Con esta regresión se calculó la concentración efectiva 50 (CE50) que fue de 34
µg/ml.
Figura 14: A) Número de placas de lisis en función de la dosis del derivado obtenido cuando se incorporó en forma conjunta a las partículas virales durante la etapa de
adsorción y en el medio de plaqueo (pг0,05). B) regresión lineal.
A B
0 3,5 7 14 29 580
10
20
30
*
Concentración (g/ml)
Núm
ero
de p
laca
s
0 20 40 600
5
10
15
20
25
y = ‐0,196x + 16,68R2 = 0,799
Concentración (g/ml)
Núm
ero
de p
laca
s
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 196 ‐
En la figura 15 se puede observar el efecto dosis‐dependiente del compuesto en
estudio sobre la inhibición del número de placas de lisis. Nuevamente se observa un
efecto dosis dependiente con diferencias significativas respecto a los controles a partir de
la incubación con 14 µg/ml o superiores.
Figura 15: Porcentaje de inhibición del número de placas respecto de los controles (0% de inhibición) cuando se incorporó el derivado obtenido en forma conjunta a las partículas virales y en el medio de plaqueo (pг0,05).
En la figura 16 se muestran los resultados obtenidos en función de la
concentración del compuesto en estudio cuando éste se incorporó sólo en el medio de
plaqueo. En este caso no se observó una reducción significativa en el número de placas
dentro del rango de concentraciones de compuesto ensayadas. En la figura 17 se
muestra la regresión lineal del número de placas en función de la concentración del
derivado. En todos los casos se detectó una reducción del número de placas inferior a
50% respecto a los controles.
Figura 16: Número de placas en función de la dosis del derivado obtenido cuando se incorporó en el medio de plaqueo (pг0,05).
0 3,5 7 14 29 580
20
40
60
80
100
*
Concentración (g/ml)
% I
nhib
ició
n
0 3,5 7 14 29 580
10
20
30
Concentración (g/ml)
Núm
ero
de p
laca
s
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 197 ‐
Figura 17: Regresión lineal del número de placas en función de la dosis de derivado cuando se incorporó en el medio de plaqueo.
En los resultados mostrados en la figura 18 no se evidencia un efecto inhibitorio
dosis‐dependiente sobre el número de placas de lisis, a diferencia de los ensayos en los
cuales el compuesto en estudio se incorporó en la etapa de adsorción.
Figura 18: Porcentaje de inhibición del número de placas respecto de los controles (0% de inhibición) cuando se incorporó el derivado sólo en el medio de plaqueo (pг0,05).
A continuación se resumen los resultados obtenidos en los ensayos de reducción
del número de placas. La tabla 2 muestra los valores de la CC50, de la CE50 y del índice de
selectividad (IS) para cada ensayo (CC50/CE50). El mayor índice de selectividad se obtuvo
cuando se incubó el polisacárido derivarizado junto con las partículas virales durante la
0 3,5 7 14 29 580
20
40
60
80
100
Concentración (g/ml)
% I
nhib
ició
n
0 20 40 600
10
20
30y = ‐0,091x + 17,78
R2 = 0,56
Concentración (g/ml)
Núm
ero
de p
laca
s
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 198 ‐
etapa de adsorción. La presencia del compuesto luego de la adsorción no afectó la
multiplicación viral.
+/‐ +/+ ‐/+
CC50 400µg/ml
CE50 27µg/ml 34µg/ml >58 µg/ml
IS 14,8 11,7 inactivo
Tabla 2: Concentraciones citotóxica 50 (CC50) y efectiva 50 (CE50) del derivado obtenido e índices de selectividad (IS) cuando se adicionó el derivado en forma conjunta a las partículas virales
durante la etapa de adsorción solamente (+/‐), cuando se lo adicionó durante la adsorción y en el medio de plaqueo (+/+) y cuando se lo adicionó sólo en el medio de plaqueo (‐/+).
Dados los valores de CE50 e IS observados se puede afirmar que el producto
obtenido en este trabajo es capaz de inhibir la adsorción de HSV‐1 de manera
competitiva in vitro. Esta inhibición suponemos que podría lograrse por dos posibles
mecanismos.
1. Dado que durante el ciclo de multiplicación de HSV‐1, una glicoproteína de la
envoltura viral se une a residuos heparán sulfato de la superficie celular
promoviendo la penetración viral por fusión de esta envoltura con la
membrana plasmática, es posible que si nuestro derivado incorporó grupos
sulfatos, compita con esos residuos de la superficie celular. Sin embargo, al no
haber analizado si efectivamente el derivado obtenido incorporó el sulfato, no
podemos afirmar nada al respecto.
2. También podría ocurrir que durante el proceso de derivatización se haya
reducido el peso molecular del polisacárido de 270000 (Tamura et al., 2009) a
valores mucho menores y que éstos posean actividad antiherpética. Existen
citas en la bibliografía sobre polisacáridos neutros de pesos moleculares entre
140 y 23700 con actividad antiherpética (HSV‐2) con índices de selectividad
entre 3 y 42 (Dong et al., 2012).
Tabla con formato
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 199 ‐
Queda claro que se necesitaría una mayor cantidad de estudios para definir el
mecanismo de acción de este compuesto y una vez que se conozca, se podrían
hacer combinaciones con otros antivirales aprobados en clínica, a fin de establecer
la existencia o no de sinergismo.
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 200 ‐
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 201 ‐
5. CONCLUSIONES
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 202 ‐
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 203 ‐
En este estudio se realizó una descripción de la actividad antiviral frente al virus
Herpes simplex tipo 1 del paramilon, compuesto aislado de una fuente natural, con
reportes previos de este tipo de actividad frente al HIV. A partir de los ensayos
realizados se propone que el derivado obtenido es capaz de inhibir la adsorción del
Herpes virus in vitro, dado que su IS fue mayor de 10, condición necesaria para ser
considerada con potencial antiviral.
Mediante la derivatización se obtuvo un producto bioactivo, pero con una pérdida
del 80% de la masa inicial por lo que resultaría útil también, que se lleven a cabo
estudios de relación estructura‐actividad para producir compuestos que además de
tener los parámetros deseados (CC50, CE50 e IS), muestren una interesante razón costo‐
beneficio. Por otro lado, logrado esto último, será importante también estudiar el
mecanismo de acción de este compuesto, con potencial valor biotecnológico.
Sección II‐ Actividad Antiviral de un derivado del paramilon de E. gracilis frente al virus Herpes simplex tipo 1
‐ 204 ‐
SecciónIIISuplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 207 ‐
1. INTRODUCCIÓN
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 208 ‐
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 209 ‐
1.1 Cherax quadricarinatus y su cultivo.
Cherax quadricarinatus (VON MARTENS) (Artropoda: Crustacea: Decapoda:
Parastacidae, Brusca & Brusca, 1990) es una langosta de agua dulce nativa del norte de
Australia conocida popularmente como “red claw” debido a la presencia de una
mancha roja (red patch) en la cara externa de las quelas de los machos (Figura 1). Se
trata de una especie que presenta características que la hacen propicia para el cultivo.
Presenta un rápido crecimiento, tolera altas temperaturas y bajas concentraciones de
oxigeno disuelto y se la puede cultivar a densidades relativamente altas en
comparación con otras especies del mismo género (Morrissy, 1990). Actualmente el
cultivo de esta especie se ha extendido hacia varios países de Sudamérica (Ecuador,
Argentina y Uruguay, entre otros, García‐Guerrero et al., 2003). En Argentina, su
cultivo ha sido introducido con explotaciones a baja y mediana escala en las provincias
con clima cálido (como Corrientes, Misiones, Chaco, Formosa, Salta, Tucumán y
Santiago del Estero), mientras que en aquellas de clima templado (como Santa Fe,
Córdoba, Entre Ríos y Buenos Aires) no ha prosperado debido a las bajas temperaturas
de otoño e invierno, resultando desfavorables para el cultivo de la especie
(Luchini, 2004).
Figura 1: Ejemplar macho de C. quadricarinatus en el que se puede observar la mancha roja o “red patch” en sus quelas. Disponible en http://www.ittiofauna.org
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 210 ‐
Entre las características más importantes que hacen de C. quadricarinatus una
especie cultivable (Jones, 1990) se destaca su rápido crecimiento anual que le permite
alcanzar la talla comercial (50 a 100 g) en aproximadamente 6 a 8 meses. Presenta un
alto rendimiento de carne útil, con un elevado porcentaje del cuerpo comestible,
concentrado en la cola (abdomen) y quelas (Thompson et al., 2004). En condiciones
favorables de cultivo, alcanza la madurez sexual en el primer año de vida. Su capacidad
reproductiva es relativamente alta dado que una hembra puede presentar múltiples
desoves durante los meses más cálidos del año, consiguiendo una producción de hasta
tres ó cuatro camadas por hembra por año. La fecundación es elevada comparada con
otros crustáceos de la misma familia; cada hembra produce entre 100 a 1000 huevos
por desove, dependiendo de su talla, edad y estado sanitario (Sagi et al., 1996, Tropea
et al., 2012). En general, los primeros desoves en las hembras jóvenes son de unas
pocas decenas de huevos, incrementándose el tamaño del desove con el tamaño de la
hembra, aunque la frecuencia de desoves tiende a disminuir con la edad (Tropea et
al., 2012). La incubación de los huevos puede comprender de 4 a 8 semanas,
dependiendo de la temperatura del agua de cultivo (a menor temperatura mayor
tiempo de incubación).
Otra ventaja de la especie es su desarrollo directo, donde el estadio larval
ocurre enteramente dentro del huevo. Al eclosionar nace el primer juvenil (semejante
morfológicamente al adulto, pero sin madurez sexual). Posteriormente a la eclosión,
los juveniles reciben cuidado parental durante los primeros 10 a 15 días por parte de la
hembra, hecho que minimiza las pérdidas por predación durante este período.
Comparada con otras especies del mismo género, C. quadricarinatus posee baja
agresividad, aunque puede observarse canibalismo desde sus primeras fases de vida,
particularmente si hay superpoblación o escasez de recursos (Masser & Rouse, 1997;
Jones & Ruscoe, 2001; Barki et al., 2006; Viau & Rodríguez, 2010, entre otros).
Presenta un hábito alimentario omnívoro‐detritívoro, esto hace que, bajo condiciones
de cultivo, la especie acepte rápidamente una amplia variedad de alimentos (Loya‐
Javellana et al., 1994; Jones, 1995; Campaña‐Torres et al., 2006). Existe una tendencia
hacia el suministro de alimentos formulados de alta calidad nutricional (Cortés‐Jacinto
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 211 ‐
et al., 2003; Thompson et al., 2005; Campaña‐Torres et al., 2006; Gutiérrez &
Rodríguez, 2010, entre otros), que llevan al productor a incluir dietas generalmente
diseñadas para peces o camarones. Actualmente, algunos investigadores se
encuentran analizando el potencial de los biofilms naturales como fuente alternativa
de alimentación, y agente regulador de la calidad del agua de cultivo, con el fin de
disminuir los costos operacionales generados por las costosas dietas balanceadas
(Jones & Thanuthong, 2002; Viau et al., 2012).
No se han encontrado enfermedades potencialmente serias para el cultivo de
la especie, al menos en nuestro país (Luchini, 2004). Los agentes causantes de
enfermedad que se han encontrado para C. quadricarinatus se muestran en la tabla 1.
Estos organismos han sido implicados en algún momento en episodios de mortalidad o
de escasa producción del cultivo de la especie. Sin embargo, se ha demostrado que no
tienen impacto sobre el ser humano.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 212 ‐
Agente de enfermedad Tipo Síntomas Medidas Cita
Rickettsia sp. Bacteria
Letargo, alimentación escasa y baja tasa de
crecimiento. Mortalidad significativa.
Descarte del stock y
esterilización de los
estanques.
Tan y Owens, 2000; Romero et al., 2000
Coxiella cheraxi Bacteria
Afecta principalmente branquias, aunque el
hepatopáncreas también se ve afectado.
Sin medidas concretas.
Tan y Owens,
2000
Psorospermium sp.
Ictiofonida (Opistokonta)
Afecta las branquias, tejido conectivo y neural;
membranas de ovario, músculo cardíaco y
esquelético. Sin patología.
Sin medidas concretas.
Herbert, 1987; Edgerton y Owens, 1999
Thelohania sp. Microsporidia Músculo abdominal opaco, de baja prevalencia, pero
alta mortalidad.
Poco común, sin medidas concretas.
Herbert, 1987 y 1988
Virus baciliforme de Cherax
quadricarinatus (CqBV)
Virus
Prevalencia alta, pero baja patogenicidad; asociado a animales aletargados y
moribundos.
Sin medidas concretas.
Anderson y Prior, 1992;
Edgerton, 1996
Cherax quadricarinatus
parvovirus Virus
Animales moribundos, exoesqueletos suaves. De baja prevalencia pero alta
mortalidad.
Sin medidas concretas.
Bowater et al., 2002
Cherax quadricarinatus reovirus‐like
(CqRV)
Virus Baja mortalidad.
Infecciones relativamente benignas.
Sin medidas concretas.
Edgerton et al., 2000
Cherax quadricarinatus
Totivirus‐like (CGV)
Virus Más prevalente en juveniles, con baja
mortalidad.
Sin medidas concretas.
Edgerton et al., 1994; Poulos et
al., 2006
Virus del síndrome de
mancha blanca (WSSV)
Virus
Depósitos anormales de calcio en la epidermis cuticular (manchas
blancas)
Sin medidas concretas
Shi et al., 2000; Wang et al.,
2012
Tabla 1: Organismos identificados causantes de enfermedades en C. quadricarinatus. (www.fao.org; Longshaw 2011)
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 213 ‐
En todos los casos, los riesgos de transmisión de estas enfermedades se
minimizan mediante la vigilancia de la salud de las langostas por parte de los
productores, así como la eventual puesta en cuarentena de los animales afectados.
1.2 Los polisacáridos como fuente de inmunoestimulación.
Una amplia variedad de polisacáridos obtenidos a partir de una gran variedad
de fuentes, tienen la capacidad de estimular el sistema inmunológico, por lo que se
comportan como inmunomoduladores. El interés en los glucanos se ha incrementado
después de los experimentos llevados a cabo con Zymosan, un glucano con repetición
de unidades de glucosa unidas por enlaces β‐1,3 que se prepara a partir de la pared
celular de levaduras y que estimula los macrófagos a través de la activación del sistema
del complemento (Fitzpatrick y & Di Carlo, 1964). Farmacológicamente, este tipo de
compuestos se clasifican como modificadores de la respuesta biológica y diferentes
parámetros físico‐químicos, como la solubilidad, la estructura primaria, el peso
molecular, las ramificaciones y la carga del polímero influyen en su actividad (Bohn y
Be Miller, 1995).
Los estudios originales sobre los efectos de los β‐1,3‐glucanos sobre el
sistema inmunológico se han centrado en ratones (Suzuki et al., 1990; Kournikakis et
al., 2003; Vetvicka y Sima, 2004). Pero estudios posteriores demostraron que los β‐1,3‐
glucanos tienen una fuerte actividad inmunoestimulante en una amplia variedad de
otros organismos, incluyendo las lombrices de tierra (Beschin et al., 1998), camarones
(Duvic y Söderhäll, 1990), peces (Anderson,1992), ratas (Feletti et al., 1992), conejos
(Kennedy et al., 1995), coballos (Drandarska et al., 2005), ovinos (Waller y Colditz,
1999), cerdos (Hiss et al., 2003) y humanos (Kougias et al., 2001). En base a estos
resultados Soltanian et al. (2009) propone que los β‐1,3‐glucanos representan un tipo
de inmunoestimulante que es activo a través del espectro evolutivo y, probablemente,
esto represente una respuesta inmune innata altamente conservada contra patógenos
fúngicos.
Los crustáceos no poseen un sistema inmunitario específico ni con capacidad
de memoria (Berger, 2000), lo que impide el uso de vacunas en cultivo. Por este
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 214 ‐
motivo, el empleo de inmunoestimulantes como agentes preventivos es en la
actualidad materia de investigación y tiene como fin determinar los mecanismos de
acción involucrados así como cuantificar sus efectos.
1.4 El sistema inmune de los crustáceos.
En la respuesta inmune de los crustáceos se distinguen efectores celulares y
humorales, que actúan en conjunto para eliminar los agentes extraños. A pesar de la
ausencia de un sistema inmune adaptativo basado en linfocitos y anticuerpos, los
invertebrados han desarrollado una amplia variedad de mecanismos de defensa que
les permite utilizar sus vías innatas, cruciales como primera línea de defensa y
altamente eficaces para protegerse de patógenos invasores (Vetvika et al., 2004).
Recientemente, datos experimentales sobre estos mecanismos en invertebrados
indicarían que la experiencia pasada con patógenos puede proporcionar individuos o
descendientes con una inmunidad mejorada (Kurtz, 2005). Esto proporcionaría
evidencia de que la especificidad y la memoria podrían existir en algunos
invertebrados, aunque faltan estudios que lo confirmen.
La inmunidad innata se creía que producía respuestas inmunes no específicas
caracterizadas por eventos de fagocitosis, pero luego se demostró que tiene una
especificidad considerable y que es capaz de distinguir lo propio de los extraño. El
sistema inmune innato reconoce lo extraño a través de una serie de proteínas de
reconocimiento de patrones (PRPs), altamente conservados a lo largo de la evolución
(Janeway, 1992; Hoffmann et al., 1999; Janeway y Medzhitov, 2002). Estos receptores
reconocen moléculas conservadas del metabolismo microbiano producidas por
microorganismos patógenos y que el anfitrión no produce. Este reconocimiento
permite que el sistema inmunológico pueda distinguir células infecciosas no propias de
las células propias. Las estructuras moleculares reconocidas por estos receptores son
llamados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). Estos patrones no se
encuentran en los metazoos y se cree que son esenciales para la supervivencia de los
patógenos microbianos. Los ejemplos más conocidos de PAMPs son los
lipopolisacáridos bacterianos (LPS), los peptidoglicanos (PG), los ácidos lipoteicoicos,
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 215 ‐
los mananos, el ADN bacteriano, el ARN de doble cadena y los β‐glucano de hongos
(Medzhitov y Janeway, 2000). El reconocimiento de estas estructuras provoca
respuestas diseñadas para proteger al huésped del patógeno invasor, y forman parte
del sistema inmune innato en todos los organismos superiores (Brown y Gordon,
2003). En los vertebrados, el reconocimiento y la respuesta a estas estructuras tienen
lugar en receptores de la superficie celular, mientras que en los invertebrados tiene
lugar principalmente en la hemolinfa (Brown y Gordon, 2005).
1.4.1 Proteínas de reconocimiento de β‐glucanos y vías de activación.
En los vertebrados, aunque la opsonización contribuye al reconocimiento de las
partículas de β‐glucanos, no se han identificado moléculas en el plasma involucradas
en su reconocimiento (Brown y Gordon, 2005). Por el contrario, en los invertebrados el
reconocimiento de estos carbohidratos parece ocurrir principalmente en la hemolinfa
gracias a una serie de proteínas. Sólo un receptor celular se ha demostrado que
reconoce los β‐glucanos en los invertebrados, el receptor scavenger de Drosophila
(dSRCI) (Soltanian et al., 2009). A pesar de estas diferencias, el reconocimiento de los
β‐glucanos en ambos sistemas tiene por resultado el desencadenamiento de la
respuesta inmune, actuando principalmente en el control de hongos patógenos.
Las dos familias de proteínas de reconocimiento mejor caracterizadas en
invertebrados son las de unión a peptidoglicanos (PGBPs) y las de unión a β‐glucanos
(βGBPs) (Chen et al., 2004; Goncalves et al., 2012). Éstas contienen un dominio similar
a las β‐glucanasas bacterianas, pero carecen de actividad enzimática, debido a una
serie de sustituciones de aminoácidos en el sitio activo (Royet, 2004). La mayoría de
ellas se segregan en la hemolinfa, pero al menos una puede estar unida a membranas
a través de un anclaje vía glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Kim et al., 2000). La expresión
de algunas de estas proteínas puede ser inducida tras la infección con bacterias o
levaduras (Jiang et al., 2004). A pesar de que estas proteínas fueron relacionadas con
una variedad de respuestas inmunes en invertebrados, incluyendo la activación de las
cascadas de profenoloxidasas (proPO) y la producción de péptidos anti‐microbianos
(Ferrandon et al., 2004; Royet, 2004), el mecanismo por el cual la unión de los β‐
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 216 ‐
glucano provoca tales respuestas es aún desconocido. Las proteínas receptoras de
peptidoglicanos son las principales implicadas en su reconocimiento, pero dos PGBPs
del plasma de Holotrichia diomphalia (Hd‐PGRP‐1 y Hd‐PGRP‐2) han demostrado ser
capaces también de reconocer a los β‐glucano (Brown et al., 2005). Hd‐PGRP‐1 es
capaz de inducir la cascada profenoloxidasa en presencia de β‐glucano, lo que sugiere
que puede jugar un papel directo en la respuesta inmune frente a una infección con
hongos (Lee et al., 2004). Otra proteína de reconocimiento presente en la hemolinfa
de los cangrejos cacerola es el factor G, un heterodímero compuesto de dos
subunidades, que responde específicamente a β‐glucano (Muta et al., 1995). La
subunidad α contiene dominios similares a glucanasas bacterianas y proteínas de
unión a carbohidratos e interviene en el reconocimiento de los β‐glucanos; mientras
que la subunidad β es un zimógeno de proteasa (Takaki et al., 2002). En respuesta a los
β‐glucano, el factor G se activa al someterse a proteolisis autocatalítica y se inicia la
activación de la cascada de coagulación (Muta et al., 1995).
Varias proteínas de unión a glucanos han sido identificadas en los artrópodos, y
su actividad usualmente es la activación de la cascada ProPO. Algunas de las βGBPs
aisladas son capaces de unir tanto glucanos lineales como ramificados (Lee et al.,
2000); mientras que otras sólo unen glucanos ramificados con enlaces 1,6 (Fabrick et
al., 2004). Estas βGBPs se encuentran comúnmente en los crustáceos; por lo general
tienen tamaños de aproximadamente 100 kDa, y además unen glucanos, bacterias y
hemocitos actuando como opsoninas (Cerenius et al., 1994).
Los β‐glucanos pueden inducir todos los mecanismos inmunes anti‐microbianos
de los invertebrados, incluyendo la fagocitosis, la nodulación y encapsulación y la
síntesis de péptidos antimicrobianos (AMPs) (Brennan y Anderson, 2004; Brown y
Gordon, 2005). La mayoría de estas respuestas se basan en cascadas proteolíticas que
conducen a la melanización, la coagulación de la sangre, la liberación de péptidos
antimicrobianos y proteínas responsables de estrés que se cree que participan en la
opsonización y en el secuestro de hierro (Jiravanichpaisal et al., 2006).
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 217 ‐
1.4.2 Hemocitos: efectores de la respuesta.
Las células circulantes de los invertebrados se llaman hemocitos y su rol más
importante es la protección de los animales contra los microorganismos
potencialmente infecciosos. Ellos participan en el reconocimiento, la fagocitosis, la
citotoxicidad y la melanización (Söderhäll y Cerenius, 1992; Tzou et al., 2002; Cerenius
y Söderhäll, 2004). Las células implicadas en la respuesta inmune derivan de células
hematopoyéticas indiferenciadas (HPC) y se cree que se diferencian en los diversos
linajes celulares bajo la influencia de diferentes factores (Jiravanichpaisal et al., 2006).
En los crustáceos las reacciones inmunes celulares involucran tres tipos de hemocitos
circulantes: las células hialinas (HC), las semigranulosas (SGC) y las granulosas (GC)
(Johansson et al., 2000). Esta clasificación se basa principalmente en la morfología. Los
hemocitos hialinos son pequeños, esféricos y no contienen gránulos o tienen pocos y
son capaces de fagocitar (Smith y Söderhäll, 1983; Raa, 1996). Los hemocitos
semigranulosos tienen número variable de pequeños gránulos eosinófilos que
encierran el sistema de activación de ProPO, una serie de enzimas que se activan
mediante proteólisis (Vázquez et al., 1998). Ellos son responsables de la encapsulación
y tienen participación limitada en la fagocitosis. Los hemocitos granulosos poseen
grandes gránulos eosinófilos en gran cantidad, son las células que tienen la principal
reserva del sistema ProPO y carecen de función fagocítica (Smith y Söderhäll, 1983;
Persson et al., 1987). Ambos, GC y SGC, pueden participar de eventos de degranulación
frente a moléculas extrañas tales como lipopolisacáridos o β‐glucanos. Los SGC son el
primer tipo de hemocitos que reacciona ante partículas extrañas in vivo y responden
mediante degranulación liberando el sistema ProPO al plasma (Johansson et al., 2000).
El número de hemocitos circulantes puede ser afectado por diversos factores.
En los crustáceos y otros invertebrados, los hemocitos se reducen durante la infección
por microorganismos. En cambio no disminuyen durante una infección por virus
(Jiravanichpaisal et al., 2001). En los cangrejos de río la inyección de β‐1,3‐glucanos
reduce rápidamente el número de hemocitos, pero este evento es seguido por una
lenta recuperación hasta alcanzar su nivel normal luego de 4‐6 hs (Smith y Sörderhäll,
1983). La pérdida de hemocitos circulantes después de la inyección con β‐1,3‐glucanos
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 218 ‐
podría deberse a la agregación de células, indicando un papel importante en la defensa
del organismo.
Las respuestas principales de defensa, con la participación de hemocitos frente
a PAMPs son: la fagocitosis, la nodulación y la encapsulación, aunque los hemocitos
también responden frente a lesiones externas participando en la reacción de
coagulación.
a‐ Fagocitosis: Se trata de una respuesta celular primaria frente a pequeñas
partículas como bacterias, levaduras y células apoptóticas, que está ampliamente
conservada (Sörderhäll y Sörderhäll, 2001). Constituye la primera línea de defensa
inmunitaria cuando una partícula atraviesa la primera barrera de defensa que
constituye la cutícula (Söderhäll y Cerenius, 1992). La fagocitosis se inicia mediante el
reconocimiento y unión de una partícula a la célula fagocítica, seguido por la absorción
a través de la modificación del citoesqueleto y el transporte vesicular intracelular hacia
los fagosomas donde se destruye aquello que se envolvió. El reconocimiento de la
partícula diana puede ser directo, por la unión de receptores a la superficie del
objetivo o por opsonización mediada a través de factores que marcan a la partícula
para la ulterior fagocitosis (Bayne, 1990).
La fagocitosis ha sido poco estudiada en los crustáceos decápodos. Sin
embargo, dos proteínas multi‐funcionales han sido aisladas, purificadas y
caracterizadas a partir de hemocitos del cangrejo de agua dulce Pacifastacus.
leniusculus (Johansson et al., 1999; Huang et al., 2000). Ambas desempeñan un papel
como proteínas inmunes innatas y poseen actividades de adhesión celular y
opsonización. En otros crustáceos decápodos, como los camarones peneidos, la
eliminación de material extraño del hemocele involucra a células fagocíticas fijas. Se
sabe que proteínas y posiblemente virus menores a 30 nm de diámetro, pueden ser
retirados por los podocitos branquiales, que son células especializadas situadas en las
branquias (Rodríguez, 1996). Los hemocitos, es decir, las células libres en suspensión
en la hemolinfa son los más abundantes y comunes entre las células fagocíticas. Sin
embargo, los fagocitos fijos son muy importantes en la eliminación de algunas
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
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sustancias. Estas células se encuentran en las superficies de arteriolas y en los espacios
hemales del hepatopáncreas (Johnson, 1987).
b‐ Nodulación y encapsulación: La encapsulación o nodulación es una
respuesta inmune celular que se limita a la defensa contra cuerpos extraños
demasiado grandes como para ser fagocitados por los hemocitos de manera individual
(Vázquez et al., 1998). El término nodulación se refiere a la formación de agregados
multicelulares hemocíticos, que atrapan, por ejemplo, un gran número de bacterias en
un determinado espacio extracelular. Como los agregados pueden adherirse a los
tejidos o a nódulos más grandes pueden eventualmente ser encapsulados (Lackie,
1988). A diferencia de la fagocitosis, la nodulación y la encapsulación tienen por
resultado la formación de multicapas de hemocitos alrededor del organismo invasor.
Estos procesos se acompañan de la melanización a través de la actividad fenoloxidasa
(Söderhäll y Cerenius, 1992), que le confiere colores oscuros a las cápsulas y dentro de
las cuales finalmente el parásito muere. Se han sugerido varios factores como agentes
responsables de la muerte de los parásitos dentro de estas cápsulas incluyendo la
asfixia, la producción local de quinonas citotóxicas a través de la cascada de activación
del sistema ProPO, la producción local de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno y
la producción de péptidos antibacterianos (Gillespie et al., 1997; Nappi et al., 1995;
2000).
1.4.3 Sistema de activación profenoloxidasa (ProPO).
En los invertebrados, las lesiones mecánicas o la presencia de objetos extraños
como parásitos y microorganismos tienen como resultado la deposición de melanina
en el tejido dañado o en el organismo intruso. La melanina físicamente aísla al
organismo extraño y por lo tanto previene la infección por retardar su crecimiento.
Pero quizás aún más importante es que, durante la formación de melanina, se originan
quinonas intermediarias altamente reactivas y tóxicas. La forma activa de la enzima
fenoloxidasa (PO) es la responsable de estas actividades. La activación de esta enzima
está cuidadosamente regulada y es provocada por el sistema de activación ProPO que
se compone de proteínas capaces de unirse a polisacáridos y a otros compuestos
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
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asociados con microorganismos. El sistema ProPO está presente en muchos grupos de
invertebrados y consta de varias proteínas que están implicadas en la melanización, las
reacciones citotóxicas, la encapsulación y adhesión celular y la fagocitosis (Söderhäll et
al., 1994; Vázquez et al., 1998; Cannon et al., 2004).
La activación y la regulación del sistema ProPO han sido parcialmente
elucidados en crustáceos (principalmente en cangrejos de agua dulce y en camarones)
así como en varios insectos, mediante estudios bioquímicos y el uso de proteínas
recombinantes (Sung et al., 1994, 1996; Kwon et al., 2000; Wang et al., 2001 (a); Lee et
al., 2002; Kim et al., 2002; Jiang et al., 2003; Ji et al., 2003; Yu et al., 2003). Este
sistema se desencadena por la presencia de pequeñas cantidades de los componentes
de las paredes celulares microbianas (figura 2), lo que asegura que el sistema se active
en presencia de agentes potencialmente patógenos. El sistema ProPO se compone de
proteínas de reconocimiento de patrones (PRPs) incluyendo proteínas de unión a LPS
(LPSBPs), proteínas de unión a peptidoglicanos (PGBPs), proteínas de unión de β‐1,3
glucano (βGBP), varias serinproteasas y sus zimógenos (Söderhäll y Cerenius, 1992;
Vargas et al., 1996; Vargas y Yepiz, 2000).
Los inhibidores de proteasas, son importantes factores de regulación del
sistema ProPO ya que evitan la activación del sistema si éste no es apropiado (Cerenius
y Söderhäll, 2004).
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
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Lipopolisacáridos LPSBP
Homologos de serinproteasas
Peptidoglicanos β‐1,3 glucanos
Quinonas Melanina
Cascada Serinproteasa
PGBP βGBP
Proforma de la enzima activadora de profenoloxidasa (pro‐PPA)
Enzima activadora de profenoloxidasa (PPA)
Fenoloxidasa (PO)
Profenoloxidasa (ProPO)
O Fenoles2
Figura 2: Vista general del sistema de activación ProPO de artrópodos (Cerenius y Söderhäll, 2004). El sistema es activado por PRPs que se unen a β‐1,3 glucanos, LPS y PGN (es decir por βGBPs, LPSBPs o PGBPs que pueden ser proteínas separadas o proteínas con varios sitios de unión, dependiendo de la especie y de la proteína) o por factores endógenos producidos después de un daño tisular. Una cascada de serinproteasas, aún no caracterizadas, da como resultado la escisión de una proforma de la enzima activadora de profenoloxidasa (pro‐PPA) en PPA activa (Vargas y Yepiz, 1998). Algunas PPAs requieren homólogos de serinproteasas y algunas PPAs son capaces de escindir ProPO directamente en PO. Finalmente la PO activa oxida compuestos fenólicos y se produce la melanina que protege físicamente al animal del agente extraño. Durante su formación se producen productos intermediarios (quinonas) altamente reactivos y tóxicos.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
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1.4.4 El sistema de coagulación.
Una de las principales diferencias entre vertebrados e invertebrados es el
hecho de que los fluidos corporales de los vertebrados se limitan principalmente a los
vasos sanguíneos y linfáticos, mientras que los invertebrados poseen un sistema
circulatorio abierto en el cual la hemolinfa baña los tejidos, denominándose hemocele
a los sitios donde ésta circula. Por lo tanto, luego de una lesión, los invertebrados
(particularmente los crustáceos) se valen de mecanismos eficientes que permiten el
rápido sellado de las heridas de la cutícula previniendo rápidamente la pérdida de
hemolinfa y el ingreso de microorganismos al hemocele (Söderhäll y Cerenius, 1992).
La coagulación de la hemolinfa es una parte importante del sistema inmune innato,
implicando una combinación de factores solubles y derivados celulares (Johansson et
al., 1999; Theopold et al., 2002). En los cangrejos cacerola, el proceso está regulado
por una cascada proteolítica que se activa por elicitores bacterianos a través de
proteínas específicas de reconocimiento. En cambio, en cangrejos de río, la
coagulación se produce a través de la polimerización de una proteína de coagulación
plasmática y es catalizada por una transglutaminasa (TGasa) calcio dependiente (Hall
et al., 1999; Yeh et al., 1999; Wang et al., 2001 (b)).
Actualmente las enfermedades causadas por virus y bacterias siguen siendo un
problema mundial en acuicultura causando pérdidas significativas en la producción,
por lo que su control se vuelve un problema a resolver. En años recientes se han
utilizado diversos inmunoestimulantes para aumentar la resistencia de los camarones
Penaeus monodon y Penaeus vannamei contra bacterias e infecciones virales (Sung et
al., 1994, 1996; Otero et al., 2000; Chang et al., 2003; Cornejo, 2001). Dado que la
especie Cherax quadricarinatus es otra especie de importancia comercial en nuestro
país, en esta sección se presentan los resultados de la evaluación del paramilon como
suplemento alimenticio con potenciales propiedades inmunomoduladoras en este
crustáceo.
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2. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
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2.1 Hipótesis
El paramilon producido por Euglena gracilis, por ser un β‐(1→3) glucano, podría
tener efectos sobre los sistemas de defensa en los juveniles tempranos de la
especie con importancia comercial Cherax quadricarinatus, actuando como un
inmunomodulador al ser administrado como suplemento dietario.
2.2 Objetivo General
Evaluar al paramilon como suplemento alimenticio inmunoestimulante en una
especie de importancia comercial, Cherax quadricarinatus.
2.3 Objetivos específicos
Analizar las variaciones en el crecimiento de animales alimentados con y sin
paramilon como suplemento inmunoestimulante.
Cuantificar la producción de radicales peróxidos en hemocitos obtenidos de
animales alimentados con y sin paramilon como suplemento inmunoestimulante.
Cuantificar la capacidad antioxidante de los hemocitos obtenidos de animales
alimentados con y sin paramilon como suplemento inmunoestimulante.
Cuantificar las actividades fenoloxidasas libre y en hemocitos obtenidos de
animales alimentados con y sin paramilon como suplemento inmunoestimulante.
Cuantificar el sistema profenoloxidasa en animales alimentados con y sin
paramilon como suplemento inmunoestimulante.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
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3.1 Mantenimiento y condiciones de experimentación. Hasta que los juveniles alcanzaron la talla requerida y durante los 30 días de
experimentación se establecieron las siguientes condiciones:
El fotoperiodo se mantuvo en 14:10 (luz:oscuridad) y la temperatura en
27±1 ºC en laboratorio climatizado.
A fin de evitar el canibalismo, durante el periodo de mantenimiento los
estanques se suplementaron con refugios, mientras que durante el
periodo de experimentación los animales se aislaron en recipientes
plásticos pequeños de 500 ml perforados para permitir la libre
circulación de agua.
Los recambios totales de agua (dulce y sin cloro) se realizaron una vez a
la semana durante el periodo de mantenimiento y 3 veces por semana
durante el periodo de experimentación. Para quitarle el cloro al agua se
utilizo un filtro de carbón activado.
Durante el periodo de mantenimiento a los animales se les suministró
alimento balanceado en forma diaria. Durante la experimentación los
juveniles se alimentaron ad limitum con una cantidad equivalente al 5%
de su peso aproximadamente.
3.2 Grupos experimentales
Se utilizaron 10 juveniles tempranos en cada grupo experimental con un peso
promedio de 8 ± 2 g. Los grupos experimentales definidos fueron:
Juveniles alimentados con balanceado no comercial cuyo aporte
proteico se debe principalmente a harina de pescado.
Juveniles alimentados con balanceado no comercial cuyo aporte
proteico se debe principalmente a harina de pescado suplementado con
un 5% de paramilon obtenido de E. gracilis.
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Los ingredientes que componen cada una de las dietas utilizadas en el ensayo
se muestran en la tabla 2, su análisis proximal se muestra en la tabla 3 y en la tabla 4
se expone la composición del suplemento vitamínico mencionado en la tabla 1.
Balanceado Balanceado + Paramilon 5%
Harina de pescado 280 280
Exp. de soja 390 390
Paramilon ‐ 50
Aceite de soja* 60 60
Glutagel 190 140
Bentonita 60 60
Vitafac Super Aqua 20 20
Astaxantina 15 15
Tabla 2: Composición (g/Kg de alimento balanceado) de las dietas utilizadas durante el ensayo (* ml/kg de alimento balanceado).
Balanceado Balanceado + Paramilon 5%
Proteinas 35,19 35,19
Lipidos 11,12 11,12
Carbohidratos 20,84 20,91
Tabla 3: Análisis aproximado de las dietas utilizadas durante el ensayo. Cada componente se indica como porcentaje del total.
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Vitamínico
Liposolubles
Vit A 3000 µI/Kg
Vit D 600 µI/Kg
Vit E (alfa‐tocoferol/antioxidante) 60 mg/Kg
Vit K 5 mg/Kg
Hidrosolubles
Vit C (acido ascorbico) 150 mg/Kg
Vit B1 (tiamina) 10 mg/Kg
Vit B2 (rivoflavina) 10 mg/Kg
Vit B6 (piridoxina) 7 mg/Kg
Vit B12 0,02 mg/Kg
Biotina 0,4 mg/Kg
Acido Pantoténico 35 mg/Kg
Acido Fólico 6 mg/Kg
Niacina 80 mg/Kg
Colina 500 mg/Kg
Inositol 100 mg/Kg
Mineral
Zinc 50 mg/Kg
Magnesio 35 mg/Kg
Manganeso 15 mg/Kg
Hierro 12 mg/Kg
Yodo 3 mg/Kg
Tabla 4: Composición del Vitafac Super Aqua (Roche®) mencionados en la tabla 1.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 232 ‐
3.3 Parametros medidos durante el ensayo
A lo largo del ensayo se midieron las siguientes variables:
Supervivencia, como porcentaje acumulado de individuos muertos en cada grupo
experimental, retirando diariamente a los organismos muertos.
Crecimiento, se determinó el peso de los animales en todos los grupos
experimentales cada semana en una balanza de precisión (± 0,1 mg). A partir del dato
del peso corporal, se calcularon los siguientes parámetros de crecimiento:
Ganancia de peso (GP):
GP (% )= (peso final‐peso inicial) x 100 peso inicial
Tasa especifica de crecimiento diario (TECD):
TECD (% )= ((Ln peso final‐Ln peso inicial)) x 100 tiempo de ensayo
3.3 Parámetros cuantificados al finalizar el ensayo.
3.3.1 Determinación de los efectores de la respuesta inmune
3.3.1.1 Obtención de la hemolinfa
Se colocaron los animales con la cara ventral hacia arriba dejando expuesta la
zona de unión entre cefalotórax y abdomen (seno hemolinfático ventral), luego se
extrajeron en esterilidad 600 µl de hemolinfa de cada animal con una jeringa de
insulina (1 ml) con una aguja hipodérminca de grosor 27G. Para las sucesivas
determinaciones la hemolinfa fue dividida en 5 alícuotas (Figura 3):
Una fracción de 4 µl se utilizó para realizar extendidos.
Otra fracción de 200 µl se suplementó con una solución de oxalacetato al 10%
en proporción 1:10. Se separaron los hemocitos del plasma por centrifugación a
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
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500 x g durante 20 minutos y a 4 ºC. El plasma fue reservado para la realización
de ensayos de actividad antibacteriana y los hemocitos se resuspendieron en
Buffer Hepes (Composición: Hepes, 30 mM; KCl, 200 mM; MgCl2, 1 mM)
suplementado con una solución de oxalacetato al 10% en proporción 1:10 para
la determinación de la capacidad antioxidante total (TOSC) y la cuantificación
de radicales peróxidos (EROS).
Una tercera fracción de 300 µl se suplementó con una solución de oxalacetato
al 10% y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM en proporción 1:10 para
la cuantificación de las actividades ProPO y PO.
En todos los casos en los que la hemolinfa se suplementó con anticoagulante
(oxalacetato), la mezcla se homogeneizó inmediatamente para evitar la
coagulación de la hemolinfa. Las muestras se mantuvieron a 4°C hasta el momento
de las determinaciones a excepción de los 3 µl de los extendidos.
3.3.1.2 Cuantificación de hemocitos
Para llevar a cabo la cuantificación de los diferentes tipos de hemocitos se
utilizó la coloración de Wright‐Giemsa. A partir de 4µl de hemolinfa fresca sin
anticoagulante se realizaron extendidos sobre porta objetos limpios. Estos se dejaron
secar y se fijaron en metanol. Posteriormente se cubrieron con la solución de Wright‐
Giemsa dejando actuar por 2 minutos y se agregó buffer Giordano (fosfato 8,3 mM; pH
7,2) durante otros 2 minutos. Luego los extendidos se aclararon con agua de red y se
lavaron con ácido acético al 5% hasta obtener preparados rosados. Finalmente los
extendidos se cubrieron con medio de montaje anhidro para microscopía (DPX‐Merck)
y se analizaron bajo microscopio óptico con contraste de fase, a 1000X de
magnificación, clasificando a los hemocitos en hialinos, semigranulosos y granulosos.
Las frecuencias relativas de cada uno se estimó sobre un total de 300 células contadas.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
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300 µl 600 µl de hemolinfa 200 µl
+ oxalacetato 10% + oxalacetato 10%
+ PMSF 0,1 mM 4 µl
Centrifugación 800 x g Cuantificación de Centrifugación 800 x g
15 min., 4 ºC Hemocitos 15 min., 4 ºC
Hemocitos* Plasma* Hemocitos* Plasma
Lisis Actividad EROS/TOSC Actividad
+ elicitor (SHL) fenoloxidasa antibacteriana
libre
Actividad
Actividad Profenoloxidasa
fenoloxidasa
total
* 20 µl Determinación de proteínas
Figura 3: Marcha general de toma y preparación de las muestras de hemolinfa para las sucesivas determinaciones.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 235 ‐
3.3.1.3 Determinación de Especies reactivas de Oxígeno (EROS).
Para cuantificar las EROS se realizó una curva de calibración con H2O2 en buffer
de reacción. Las muestras se adicionaron con la sonda fluorescente H2DCF‐DA y se
incubaron una hora en oscuridad. Posteriormente se procedió a la lectura con un
lector de fluorescencia a 488 nm de emisión y 525 nm de excitación.
3.3.1.4 Determinación de la capacidad antioxidante frente a radicales
peróxidos.
La capacidad antioxidante total contra radicales peróxidos (TOSC) se evaluó
mediante la determinación de EROS en muestras de hemolinfa de animales tratados y
controles usando un generador de radicales peróxido (modificado de Amado et al.,
2009). Para estas determinaciones, en 6 pocillos de una microplaca de 96 pocillos
blanca se colocaron 30 µl de la suspensión de hemocitos (preparado como se describe
en la Sección 3.3.1.1) y 152 µl de buffer de reacción conteniendo 30 mM de HEPES (pH
7,2), 200 mM KCl y 1 mM MgCl2. En tres de los seis pocillos de cada muestra se
agregaron 10 µl de 2,2'‐azobis 2 dihidrocloruro metilpropionamidina (ABAP; 4 mM). En
los otros tres pocillos se agregó igual volumen de agua mili Q. La placa se incubó en
oscuridad por 5 minutos a 35 °C. A esta temperatura, los radicales peróxidos se
producen por descomposición térmica de ABAP (Winston et al., 1998).
Inmediatamente antes de la lectura de las microplacas, se añadió en todos los pocillos
8 µl de la sonda fluorescente 2',7' diacetato de diclorofluoresceína (H2DCF‐DA) a una
concentración final de 4 mM. La H2DCF‐DA, un compuesto no fluorescente, se escinde
por las esterasas presentes en la muestra y se oxida por las especies reactivas de
oxígeno (EROS) generadas por el ABAP a diclorofluoresceína (DCF), un compuesto
fluorescente que puede ser detectado a 488 nm de emisión y 525 nm de excitación
con un lector de fluorescencia (Figura 4). La descomposición térmica del ABAP y la
formación de EROS y se monitoreó durante 60 minutos, realizando lecturas cada 5
min.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 236 ‐
A) H2DCF‐DA
ABAP
Termólisis (д35°C)
DCF
Acetato (DA) ERO
Fluorescencia
H2DCF DCF‐
B)
Figura 4: A) Diagrama de flujo de la metodología empleada para la medición de la capacidad antioxidante total frente a radicales peróxido, mediante la determinación de esta ERO en ausencia y en presencia de ABAP (2,2'‐azobis 2 dihidrocloruro metilpropionamidina). H2DCF‐DA: 2 ', 7'‐ diacetato de diclorofluoresceína. H2DCF: 2 ', 7'‐diclorofluoresceína. DCF: H2DCF oxidada. B) Resultados de una corrida típica que muestra los registros de fluorescencia con y sin ABAP en función del tiempo.
De acuerdo con los trabajos de Regoli y Winston (1999) y Regoli (2000) los
antioxidantes no enzimáticos de bajo peso molecular (como GSH, ácido ascórbico,
ácido úrico y vitamina E) en general son responsables del 70% de la capacidad
Sin ABAP
Unidades
de Fluorescen
cia
Con ABAP
Tiempo
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 237 ‐
antioxidante total frente a radicales peróxidos, por lo que de existir inhibición
enzimática debido a la alta temperatura requerida para la descomposición ABAP en
radicales peróxidos (35 °C), la reducción de la capacidad antioxidante debería ser un
problema menor.
La producción total de fluorescencia se calculó integrando las unidades de
fluorescencia (UF) a lo largo del tiempo de medición, ajustando los datos a una función
polinómica de segundo orden. Los resultados se expresaron como diferencia de área
UF × minuto en la misma muestra, con y sin adición ABAP y normalizados a la zona de
EROS sin ABAP. La diferencia relativa entre las áreas de EROS con y sin ABAP se
consideró como una medida de la capacidad antioxidante. Los cálculos de la capacidad
antioxidante se determinaron como:
Capacidad antioxidante= Área EROS con ABAP‐ Área EROS sin ABAP
Área EROS sin ABAP
3.3.1.4 Obtención de homogenatos de hemocitos.
Los hemocitos separados por centrifugación se sometieron a disrupción celular
mediante 4 pulsos de 5 segundos a 20 Hz de frecuencia, con un sonicador de vástago.
El procedimiento se llevó a cabo en baño de hielo con períodos de 10 segundos entre
pulsos. El homogenato se centrifugó a 4 °C por 20 minutos, a 800 x g.
3.3.1.5 Cuantificación de la actividad Fenoloxidasa (PO) y Profenoloxidasa
(ProPO).
La actividad PO se midió sobre las muestras de hemolinfa de animales tratados
y controles, tanto en plasma (enzima libre), como en los sobrenadantes de los
homogenatos de hemocitos (SHL, preparados como se indica en la sección 3.3.1.5 y
elicitados con tripsina, modificado de Asokan et al., 1997). Las mediciones se
realizaron espectrofotométricamente mediante la detección de la formación de
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 238 ‐
dopacromo, detectable a 490 nm, a partir de L‐3,4 dihidroxifenilalanina (L‐DOPA),
usando un lector de placas. La reacción se monitoreó cada 5 minutos durante 15
minutos. Para estas determinaciones, realizadas por triplicado, 50 µl de plasma o SHL
se colocaron en placas de 96 pocillos transparentes. A las muestras de SHL se les
agregaron 50 µl de tripsina (1 mg/ml, elicitor) y todas se llevaron a volumen con Buffer
Hepes (30 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM KCl y 1 mM MgCl2). Las muestras se
incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente y luego se adicionaron 75 µl de L‐
DOPA 5 mM. Para asegurar que la oxidación del reactivo (L‐DOPA) se deba a las
enzimas (PO) plasmáticas y del SHL de C. quadricarinatus, y no a peroxidasas, se
realizaron mediciones de PO en presencia 16 mM de un inhibidor de esta enzima, el 2‐
hidroxi‐2,4,6‐cicloheptatrien‐1‐uno (tropolone).
3.3.1.6 Ensayo de actividad antibactariana del plasma.
La actividad antibacteriana se ensayó utilizando el plasma de muestras de
hemolinfa, de animales tratados y controles, frente a 3 cepas bacterinas: E. coli
(JM109), P. putida (KT2440) y B. subtilis (168). Las cepas bacterianas se mantuvieron
en agar nutritivo (Composición: Extracto de carne, 3gr, peptona 5gr, agar 15 gr, agua
destilada c.s.p. 1000 ml) hasta el momento del ensayo.
Una colonia de cada cepa fue transferida a un medio líquido (caldo nutritivo,
composición: extracto de carne 3gr, peptona 5gr, agua destilada c.s.p. 1000 ml) y se
incubó a 36 °C durante 24 hs. A partir de estos cultivos se realizaron diluciones de los
cultivos en PBS bajo flujo laminar, hasta obtener suspensiones bacterianas equivalente
a 0,5 de la escala de Mc Farland (DO600 para las 3 cepas: 0,05). Se sembraron 10 µl de
cada suspensión en placas con agar Mueller‐Hinton formando un césped bacteriano,
estas siembras se realizaron por triplicado.
Se embebieron discos para antibiogramas estériles con 10 µl de plasma o PBS
(control positivo). Cuando la superficie del agar se secó, se apoyaron sobre ella discos
de antibiograma usando una pinza estéril. Todas las placas se incubaron a 36 °C
durante 24 hs al término de las cuales se observó la formación de halos de inhibición.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 239 ‐
3.3.1.7 Cuantificación de proteínas.
La determinación del contenido proteico tanto en plasma como en hemocitos
de muestras de hemolinfa de animales tratados y controles se realizó por el método de
Bradford (1976) usando seroalbúmina bovina como estándar. Para ello, de cada
muestra u homogenato se utilizaron 3 µl para la determinación espectrofotométrica,
llevándolo a un volumen de 100 µl con agua destilada, agregando 1 ml de reactivo de
Bradford y leyendo la absorbancia a 595nm.
3.4 Análisis estadístico.
Los datos se expresaron como promedio ± error estándar. Para los gráficos y el
análisis estadístico de los datos se utilizó el programa GraphPad Prism 5. Para
comparar las muestras de hemolinfa, de los animales controles con las de los
alimentados con suplemento de paramilon, se realizó un ANOVA de un factor. En
todos los casos se consideraron significativas las diferencias con p<0,05.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 240 ‐
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 241 ‐
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 242 ‐
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 243 ‐
4.1 Supervivencia y crecimiento
Al cabo del ensayo, sólo se detectó un individuo control muerto, por lo que no
puede afirmarse que hubo diferencias entre la mortalidad de animales tratados y
controles. Respecto del crecimiento de los animales, no se observaron diferencias
entre tratamientos (figura 5). La figura 6 muestra la ganancia de peso evaluada
periódicamente, en ella puede observarse una tendencia no significativa (p出0,05) a
una mayor ganancia de peso en los animales alimentados con el balanceado sin
suplementar. El suplemento con paramilon en el alimento tampoco produjo
diferencias significativas (p出0,05) en cuanto a la ganancia de peso al final del
tratamiento.
Figura 5: Curvas de crecimiento estimadas como peso de animales controles y en los alimentados con 5% de paramilon como suplemento. Los datos están
expresados como media ± SE (n= 10).
Figura 6: Curvas de ganancia de peso en animales controles y en los alimentados con 5% de paramilon como suplemento. Los datos están
expresados como media ± SE (n= 10).
0 10 20 306
7
8
9
10
11
12
Control 5% paramilon
Dias
Pes
o (g
)
0 10 20 300
10
20
30
40
Control 5% paramilon
*
Dias
Gan
anci
a de
pes
o (%
)
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 244 ‐
Las tasas de crecimiento específico tampoco muestran diferencias significativas
entre animales controles y tratados, aunque todos parecen presentar un incremento
hacia la mitad del tratamiento y luego un descenso (figura 7). Esto también se evidencia
en la ganancia en peso que resultó significativa (p˂0,05) a partir de la segunda semana de
tratamiento respecto de la primera tanto en animales tratados como en los controles
(figura 6).
Figura 7: Tasa de crecimiento específico en animales controles y en los alimentados con parmilon como suplemento. Los datos están expresados
como media ± SE (n= 10).
0 10 20 300.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Control 5% paramilon
Dias
Tas
a de
cre
cim
ient
oesp
ecífi
co (
%)
Estos resultados ponen en evidencia que la formulación de un alimento
suplementado con paramilon, sin modificar los porcentajes de carbohidratos, lípidos y
proteínas totales de la dieta, no altera el crecimiento de los animales por lo que se puede
asumir que cubre los requerimientos nutricionales de la especie en el estadio de
desarrollo ensayado.
4.2 Efectores de la respuesta inmune.
Puede observarse que en ambos grupos experimentales no hubo diferencias en las
frecuencias relativas de los tipos de hemocitos (Tabla 5).
Tipo de hemocitos Control (% ± DE) Tratados (% ± DE)
Hialinos 29,3 ± 14,5 29,8 ± 13,3 Granulosos 66,5 ± 15,1 66,6 ± 12,4
Semigranulosos 4,2 ± 1,9 6,6 ± 3,3
Tabla 5: Frecuencia de tipos de hemocitos presentes en animales tratados y controles (n=10).
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 245 ‐
En la hemolinfa del cangrejo de río, las células hialinas están involucradas
principalmente en la fagocitosis. Las células semigranulares son las activas en la
encapsulación ya que reconocen y responden a partículas extrañas (Johansson y
Söderhäll, 1985). Junto con las células granulosas, las semigranulosas también participan
en la citotoxicidad, el almacenamiento y la liberación del sistema de activación ProPO
(Jackson, 1994; Johansson et al., 2000). En los crustáceos, el número de hemocitos o la
proporción de los diferentes tipos de células se ve afectada por factores tales como el
sexo, el crecimiento, la etapa de la vida, ciclo de muda, el estado nutricional, factores de
estrés y la infección por bacterias (Fotedar et al., 2001). En este estudio se observa que la
adición de glucano no altera el número de hemocitos circulantes, ni su proporción en C.
quadricarinatus.
4.3 Determinación de EROS y actividad antioxidante.
Contro
l
5% p
arami lo
n0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
M H
2O2
Figura 9: Niveles basales de EROS en hemocitos de Cherax quadricarinatus alimentados con paramilon como suplemento. Los datos se expresan como media ± SE (n = 10).
Control
5% p
aram
ilon
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 *
Are
a re
lativ
a
Figura 10: Capacidad antioxidante total contra los radicales peróxidos en hemocitos de Cherax quadricarinatus alimentados con paramilon como suplemento. Los datos se expresan como media ± SE (n = 10). Las áreas relativas fueron calculadas como el cociente entre la diferencia de áreas (con y sin ABAP) normalizado al área sin ABAP (área
basal).
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 246 ‐
Los niveles basales de EROS no mostraron diferencias significativas entre
tratamientos (figura 9). Sin embargo, el alimento suplementado con un 5% del β‐1,3
glucano provocó una mejora significativa en la capacidad antioxidante de los hemocitos
frente a los radicales peróxidos generados por el ABAP (figura 10).
Se conoce que los β‐glucanos mejoran la actividad de fagocitosis mediante el
aumento de la actividad de una serie de sustancias microbicidas, incluyendo
fenoloxidasas, aniones superóxido, peróxido de hidrógeno, oxígeno singulete y diversas
enzimas lisosomales (Ma et al., 1999; Misra et al., 2004). Sin embargo, en este estudio se
observó que la presencia de este tipo de polisacáridos en la dieta mejora la respuesta
antioxidante de la hemolinfa.
4.4 Sistema profenoloxidasa.
Al analizar las actividades PO libre, total y ProPO, puede verse que, mientras que la
actividad PO en plasma aumentó significativamente (p˂0,05) en los animales alimentados
con paramilon como suplemento (figura 11), la actividad PO total y ProPO parecen
disminuir con el tratamiento (figuras 12 y 13) aunque estas diferencias resultaron no
significativas (p出0,05).
Contro
l
5% pa
ramilo
n
0.0000
0.0005
0.0010
0.0015
0.0020
0.0025 *
DO
490/
mg
prot
eina
s
Figura 11: Actividad PO libre en plasma de Cherax quadricarinatus alimentados con paramilon como suplemento (p<0.05). Los datos están expresados como media ± SE (n= 10). La actividad fue calculada por diferencia en las pendientes durante la oxidación del L‐DOPA en presencia y ausencia de un inhibidor (TROPOLONE) por mg de proteína.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 247 ‐
Cont ro
l
5% pa
rami lo
n
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
DO
490/
mg
prot
eina
s
Figura 12: Actividad PO total en SHL de Cherax quadricarinatus alimentados con
paramilon como suplemento (p<0.05). Los datos están expresados como media ± SE (n= 10). La actividad fue calculada por diferencia en las pendientes durante la
oxidación del L‐DOPA en presencia de un elicitor (TRIPSINA), en presencia y ausencia de un inhibidor (TROPOLONE) por mg de proteína.
Cont ro
l
5% pa
rami lo
n
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
DO
490/
mg
prot
eina
s
Figura 13: Actividad ProPO en SHL de Cherax quadricarinatus alimentados con paramilon como suplemento. Los datos están expresados como media ± SE (n= 10). La actividad fue
calculada por diferencia entre la actividad PO total y la actividad PO libre.
Los β‐glucanos están involucrados directamente en la activación de la respuesta
inmune. Una serinproteasa está implicada en la activación del sistema ProPO (Söderhäll,
1983), el cual puede conducir a la producción de melanina, adhesión celular,
encapsulación y fagocitosis cuando es activado por β‐glucanos (Söderhäll, 1983). Las
células granulosas, previamente activadas por este tipo de polisacárido, pueden sufrir una
exocitosis liberando el sistema ProPO a partir de los gránulos, mediante dos proteínas
endógenas que están asociadas a dicho sistema, conocidas como factor de 76 kD y las
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 248 ‐
proteínas de unión a β‐1,3‐glucano. Así, los β‐glucanos contribuyen a activar el sistema
ProPO que conduce a la formación de las enzimas PO (Söderhäll y Cerenius 1992). En
nuestro estudio se observó un aumento significativo de la actividad PO libre (en plasma)
mientras que las actividades PO y ProPO de hemocitos disminuye. Este resultado estaría
indicando que el paramilon provocaría la liberación y activación del sistema ProPO. Sin
embargo, los recuentos de hemocitos no reflejan este accionar, dado que no se detectó
una disminución en el número de células granulosas y semigranulosas. Posiblemente, por
hematopoyesis, nuevos hemocitos compensen las pérdidas por degranulación. Esto se
opone a lo sugerido por Smith et al. (2003), quienes sugieren posibles consecuencias
negativas de la inmunoestimulación por reducción en el número de hemocitos
circulantes. Estudios realizados en los cangrejos de río que involucran la inyección de β‐
1,3‐glucanos, mostraron que el número de hemocitos se reduce rápidamente, pero luego
hay una lenta recuperación hasta alcanzar los niveles normales tras 4‐6 hs (Smith y
Sörderhäll, 1983). Zhu et al. (2010) han informado que ejemplares de Procambarus clarkii
alimentados con quitosan mostraron un aumento significativo en el número de hemocitos
totales. Estos estudios apoyarían que la administración de PAMPs no produce una
reducción en los hemocitos circulantes sino todo lo contrario. En nuestro caso, más
estudios deberán realizarse para terminar de dilucidar el mecanismo de la respuesta
total.
4.5 Actividad antibacteriana y contenido proteico plasmático.
No se observó actividad antibacteriana del plasma en ninguno de los dos grupos
experimentales, así como no se vieron diferencias (p出0.05) en el contenido proteico del
plasma (figura 14) ni de los hemocitos (figura 15). Esto indicaría que el tratamiento
aplicado no tuvo efectos sobre la síntesis de péptidos antimicrobianos.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 249 ‐
Contro
l
5% pa
ramilo
n
0
20
40
60
80m
g pr
otei
na/m
l pla
sma
Figura 14: Contenido proteico del plasma de Cherax quadricarinatus alimentado con paramilon como suplemento. Los datos están expresados como media ± SE (n= 10).
Contro
l
5% p
aram
ilon
0
2
4
6
8
10
mg
prot
eina
/ml S
HL
d ax
Figura 15: Contenido proteico del SLH e Cher quadricarinatus alimentado con paramilon como suplemento. Los datos están expresados como media ± SE (n= 10).
Numerosos estudios han focalizado sus esfuerzos en comprender las vías de
activación de los sistemas de defensa en animales invertebrados (Asokan et al., 1997;
Medzhitov y Janeway, 2000; Cerenius y Söderhäll, 2004). Algunos de estos estudios se
han centrado en la administración oral de PAMPs (patrones moleculares asociados a
patógenos) como paredes de levaduras (Devaraja et al., 1998; Suphantharika et al., 2003),
hongos (Chang et al., 2003), o microorganismos probióticos (Rengpipat et al., 2000). En C.
quadricarinatus, no hay suficientes antecedentes sobre este tipo de técnicas, aunque se
ha reportado que la inyección de amilosa aumenta la supervivencia de ejemplares
infectados con el virus del síndrome de mancha blanca (WSSV) uno de los patógenos más
importantes que afecta a crustáceos (Wang et al., 2012). Esta técnica resulta poco
conveniente cuando se piensa en estos animales como un recurso con producciones a
mediana y gran escala, por lo que la incorporación de este moléculas como el paramilon
en el alimento parece ser una forma de administración viable para los productores.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 250 ‐
Considerando los resultados de crecimiento y actividades PO y antioxidante, el paramilon
puede ser incorporado en las dietas de estos animales, dado que ha mejorado los niveles
de PO libres (en plasma) y ha aumentado la capacidad antioxidante de los hemocitos sin
pérdidas de biomasa animal.
Por otro lado, el polisacárido de reserva de E. gracilis nunca se había probado en
esta especie de importancia comercial. Dada la capacidad de esta cepa de producir
grandes cantidades de este polisacárido, sería interesante probarla de manera directa
como alimento para éste u otros crustáceos cultivables, dado que se trata de una
microalga con alto contenido proteico en comparación con otras microalgas comúnmente
utilizadas en el cultivo de especies de interés comercial (Nannavecchia, 2006). Además es
una especie productora de ácidos grasos poliinsaturados (Regnault 1995, Barsanti et al.
2000, Meyer et al. 2003, Rocchetta et al. 2006), lo que la hace potencialmente
interesante para la alimentación de hembras pre adultas y ovígeras (Li et al., 2010; 2011).
Otros objetivos para futuros estudios podrían focalizarse en el tiempo que duran los
efectos de la inmuestimulación, así como los efectos de estos parámetros indicadores del
estado inmunológico en tratamientos más prolongados.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 251 ‐
5. CONCLUSIONES
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 252 ‐
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus.
‐ 253 ‐
Este estudio es el primero en evaluar los efectos del polisacárido de reserva de E.
gracilis sobre la especie de importancia comercial C. quadricarinatus. Los resultados de
esta investigación indican que la inclusión de paramilon en la dieta puede mejorar la
respuesta inmune de la especie. La diferencia significativa en la capacidad antioxidante
total de la hemolinfa, así como en la actividad PO libre, muestran que el polisacárido tuvo
un efecto protector e inmunoestimulante de los efectores humorales (sistema ProPO) en
los animales que recibieron el polisacárido como suplemento durante 30 días. A su vez, el
agregado de glucano en el alimento no afectó su crecimiento, por lo que el paramilon
podría resultar un potencial suplemento para ser incorporado en dietas de alta calidad,
como agente preventivo en los sistemas de cultivos comerciales de Cherax
quadricarinatus y otros crustáceos.
Sección III‐ Suplemento alimenticio con propiedades inmunoestimulantes en Cherax quadricarinatus
‐ 254 ‐
CAPITULOIVEstudios sobre la respuesta electromagnética de la película de Euglena gracilis
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 257 ‐
1.INTRODUCCIÓN
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 258 ‐
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 259 ‐
1.1 Bioinspiración, biomimética y biorreplicación
La bioinspiración, la biomimética y la bioreplicación constituyen una progresión
de los enfoques de la ingeniería biomimética, que incorpora la idea de que podemos
pensar en las funciones que exhiben los seres vivos para el diseño de nuevas
estructuras y dispositivos (Pulsifer y Lakhtakia, 2011). De estos tres enfoques, la
bioinspiración es el más antiguo y el más frecuentemente aplicado. La inspiración se
basa en una estructura biológica que cumple una función específica y luego se fabrica
un dispositivo con una funcionalidad similar sin tener necesariamente la misma
geometría. Un ejemplo de esto, es el uso de sensores de gas para la prevención de
incendios forestales durante el secado de madera y sus productos, inspirados en los
sistemas de detección altamente diferenciados de los escarabajos de fuego (Merimna
atrata) para distinguir diferentes compuestos liberados durante las diversas etapas de
un incendio (Paczkowski et al., 2011). La biomimética constituye el paso siguiente en
la progresión. Se intenta replicar la funcionalidad de una estructura biológica
reproduciendo aproximadamente una de sus características estructurales esenciales.
Un excelente ejemplo es la estructura de Velcro que emula las púas en forma de
gancho de una semilla de bardana (Arctium sp.). Un ejemplo más reciente es el diseño
de sistemas de corte y limpieza por acción del agua imitando las características
estructurales de los canales del veneno de las cobras (Balmert et al., 2011). La tercera
forma en que los ingenieros son capaces de extraer ideas a partir de los seres vivos
para producir nuevos dispositivos, es la biorreplicación. Esta implica la replicación
directa de una estructura presente en un organismo. Si bien hasta la fecha no existen
dispositivos bioreplicados comerciales, diferentes grupos de trabajo han sido capaces
de replicar estructuras tales como el ala de la mariposa (Pulsifer et al., 2010; Figura 1),
la capa córnea del ojo de un insecto (Pulsifer et al., 2011) o el frústulo de una diatomea
(Losic et al., 2007).
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 260 ‐
Figura 1: (a) Fotografía del ala de una mariposa (Danaus plexippus). (b) Una réplica negativa del ala. (c) Detalle de la microestructura del ala. (d) Micrografía de una réplica positiva de las microestructuras del ala hechas de níquel.
A lo largo de la evolución, en la naturaleza se han desarrollado una notable
variedad de estructuras muy complejas. Algunas de ellas poseen detalles
sorprendentes y exhiben propiedades electromagnéticas singulares. La interacción de
la luz con estas microestructuras puede producir diferentes efectos, como los colores
iridiscentes o la apariencia metálica, dependiendo de los mecanismos ópticos
involucrados (Srinivasarao, 1999; Parker, 2000; Vukusic y Sambles, 2003; Berthier,
2007; Kinoshita, 2008). Estas estructuras no sólo generan efectos visuales,
dependiendo del tamaño que posean y de los materiales que las compongan se
pueden obtener características interesantes también en otras regiones del espectro,
tales como las regiones ultravioleta e infrarroja. Las especies que poseen este tipo de
microestructuras pueden hacer uso de ellas para diferentes funciones biológicas como
la regulación térmica y la protección frente a diferentes radiaciones como el UV. Por
ejemplo, la flor de las nieves (Leontopodium alpinum) que crece en las praderas
alpinas, tiene un mecanismo de protección frente a la radiación UV. Éste se basa en el
uso de nodos a lo largo de fibras que contienen material absorbente de la radiación UV
perjudicial, constituido por estructuras fotónicas nanométricas que actúan como
acopladores selectivos de longitud de onda (Kertész, 2006). Estos mecanismos
estructurales son la base de sistemas artificiales biomiméticos que actualmente se
diseñan y desarrollan con diversas aplicaciones (Saito, 2011). Además, este tipo de
estructuras se pueden combinar con pigmentos adecuados para cumplir con una
función prediseñada. Por ejemplo, diferentes tipos de telas tejidas con fibras de
celulosa se han estudiado estructuralmente con el fin de lograr con ellas, protección
frente a la radiación UV (Riva y Algaba, 2006).
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 261 ‐
1.2 Periplasto y metabolia en euglenoideos
Todos los euglenoideos presentan inmediatamente por debajo de la membrana
plasmática un periplasto (figura 2) también llamado película o complejo pelicular
(Preisig et al., 1994).
e
dc
b
a
Figura 2: Micrografías obtenidas mediante MET de secciones transversales celulares mostrando el complejo pelicular. a. Las flechas indican los microtúbulos de la película. Se observan los cuerpos mucíferos (m), el mucílago (mc) y el plasmalema (Pl) de una especie metabólica. Escala = 1µm. b. Las flechas indican la zona de articulación de una especie muy metabólica sin presentar proyecciones articulares en la película. Escala: 1µm. c. La punta de flecha muestra el marco aplanado en forma de “S” de cada banda de una especie metabólica. Escala: 0,5 µm. d. La punta de flecha muestra el marco en forma de “S”, zona de enganche con la próxima banda (ho) y la zona de solapamineto (O). Escala: 0,5 µm. e. Las flechas indican los microtúbulos de la película de una especie rígida. Se observa el canal mucífero (c), el surco de una banda (g), cresta de la próxima banda (r), cuerpos mucíferos (m), plasmalema (Pl). Escala = 1 µm. Fuentes: b, c, d Leander et al. (2001); a, e Buetow (1982).
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 262 ‐
El complejo pelicular está formado por una superposición de un número
invariable, según la especie, de unidades corticales o bandas, por ejemplo 40 para
Euglena gracilis. Estas bandas son acintadas, más o menos helicoidales o longitudinales
y de disposición anteroposterior. Cada una de estas unidades corticales está a su vez
constituida por un pliegue y un surco anexo. El área donde estas bandas se articulan
puede observarse al microscopio óptico como una estría que será más o menos visible
dependiendo de la especie (figura 3).
Figura 3: Euglena helicoideus fotografiada al microcopio óptico. Pueden observarse las estrías características del grupo. Fuente: Leander (2004).
Las bandas peliculares están compuestas por al menos dos glicoproteínas unidas
por puentes disulfuros formando el epiplasma o esqueleto celular (Bricheux y
Brugerolle, 1986). La figura 4 muestra un esquema generalizado de la estructura de la
película con sus componentes básicos. Este complejo pelicular comprende la
membrana plasmática y el glicocalix o epiplasma; un estrato subyacente a la
membrana. A nivel de cada interbanda presenta fibrilllas o microtúbulos que se
disponen alineados longitudinalmente en el área de solapamiento.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 263 ‐
a
b c d
ef g
Figura 4: Esquema generalizado de la estructura de la película con sus componentes básicos (a) e ilustraciones de la serie de transformación asociado a la evolución de las proyecciones de la banda pelicular desde especies más metabólicas a especies más rígidas (b a g). a. configuración de tres bandas con sus zonas de articulación y los microtúbulos asociados posicionados debajo de la membrana plasmática y subtendido por cisternas tubulares del retículo endoplásmico. b. Una banda pelicular que carece de proyecciones articulares presente en algunos euglenoideos bacterivoros, eucarivoros y osmotroficos primarios. c. Una banda pelicular con proyecciones prearticulares filamentosas y proyecciones postarticulares en forma de peine presente por ejemplo en Eutreptiales y muchas especies del género Euglena. d. Una banda pelicular con proyecciones prearticulares lineales y proyecciones postarticulares en forma de peine presente por ejemplo en Discoplastis y algunas especies del género Euglena. e. Una banda pelicular con proyecciones robustas en forma de dientes y proyecciones postarticulares en forma de peine presente por ejemplo en los géneros Phacus y Lepocinclis. f‐g. Una banda pelicular con proyecciones prearticulares en forma de placa y proyecciones postarticulares robustas presentes por ejemplo en algunas especies del género Lepocinclis. (Fuente: Leander et al., 2007)
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 264 ‐
En la zona de articulación suelen observarse además un conjunto de fibras
transversales de unión; vesículas del retículo endoplasmático y de la red mitocondrial;
y cuerpos mucíferos que conectan con el exterior mediante poros (figura 5). Hacia
cada uno de los extremos de la célula las bandas se fusionan reduciendo su número
(Buetow, 1968) y el patrón de reducción de las estrías también es característico de
taxones vinculados evolutivamente (Leander y Farmer, 2000; Leander et al., 2001;
Esson y Leander, 2008)
a b
Figura 5: Microfotografías mediante SEM (a) y TEM (b) de Euglena cantabrica mostrando los cuerpos muciferos (flechas). Escalas: a. 4 µm, b. 2 µm. Fuente:
Leander y Farmer, 2000.
El grado de movimiento de la célula es el resultado de la organización de la
película, pudiendo ser lo suficientemente flexible como para variar la forma
deformándose rápidamente, como sucede en el caso de Euglena gracilis (figura 6 a y
b) o Peranema trichophorum (figura 6 c). En aquellas especies con bandas más anchas
y gruesas se ve minimizado dicho movimiento metabólico (Leedale, 1968). Como
resultado, las especies pueden ser ligeramente flexibles o bien, rígidas, como es el caso
del género Monomorphyna (figura 7). El movimiento metabólico no está siempre
relacionado con la locomoción, provoca además que las células se redondeen en una
reacción rápida o se contorsionen en una variedad de formas de tipo ameboide. Esto
suele ocurrir cuando se somete a la célula a situaciones de estrés pudiendo ser el
comienzo del enquistamiento.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 265 ‐
Figura 6: Micrografías obtenida por SEM de la región anterior de E. gracilis (a) y de Peranema trichophorum (c). Micrografías obtenida por AFM de E. gracilis. Fuente: a.
Vismara et al., 2000. b. Gruenberguer et al., 2007. c. Leander 2004.
Figura 7: Micrografías obtenidas por SEM (a) y TEM (b) de Monomorphyna ovata. Las flechas señalan las zonas de articulación, Escalas: 10 µm (a) y 1 µm (b). Fuente: Leander y Farmer,
2001.
a
b
c
a b
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 266 ‐
1.3 Radiación ultravioleta
Entre los principales acontecimientos de la evolución biológica, la oxigenación de
la atmósfera fue un proceso gradual producido a lo largo de un período aproximado de
mil quinientos millones años, con la consiguiente formación de la capa de ozono. Esta
capa impide que la radiación UV‐C, altamente perjudicial para cualquier molécula
biológica, llegue a la Tierra. Sin embargo, todos los organismos terrestres, así como
aquellos acuáticos que viven en la superficie de los cuerpos de agua, están expuestos a
la radiación UV‐A y UV‐B. Esta radiación es potencialmente dañina para la vida y, como
penetra hasta 12 metros en el agua, puede reducir la supervivencia, el crecimiento y la
producción del fitoplancton (Skerratt et al., 1998; Bischof et al., 2011). En las especies
fotosintéticas, las condiciones ambientales altamente estresantes limitan su capacidad
para utilizar la energía de la luz absorbida, produciéndose sobreexcitación de los
fotosistemas (Demmig‐Adams y Winter, 1988). Las alteraciones en su normal
desarrollo, crecimiento y supervivencia debido al estrés provocado por altas
temperaturas o irradiancias se deben al desbalance entre los procesos de fotosíntesis y
respiración (Mohanty, 2003). Sin embargo, estos organismos han desarrollado
numerosos mecanismos de protección con tendencia a evitar o disminuir estos daños.
En particular, la recuperación de la exposición a la radiación UV no sólo depende de la
duración y el grado de radiación recibida, sino también de la capacidad de los
organismos para protegerse de la radiación UV. Los mecanismos de protección más
estudiados son por un lado, aquel basado en la cantidad de los pigmentos sintetizados
y por el otro los de reparación (Franklin & Forster, 1997; Ekelund, 2000). Hasta el
momento nunca se ha tenido en cuenta la posible protección que podría ejercer la
superficie celular. Por esta razón resulta de gran importancia evaluar si la película
junto con la membrana plasmática que lo recubre, se comportan como protectores
estructurales frente a la radiación UV.
1.3 Método de Chandezón
Las variaciones en la velocidad de propagación de la luz en diferentes medios,
dependen del índice de refracción del material y hacen que, para frecuencias
diferentes, la luz se refracte de manera diferente.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 267 ‐
En el caso de los euglenoideos, su película se asemeja a una red de difracción,
por lo que para calcular la respuesta óptica de la película, el método diferencial
desarrollado por Chandezon et al. (1982), generalmente denominado método C, es
apropiado. Éste se basa en un cambio de coordenadas que transforma un perfil
corrugado en una superficie plana. Es un método que ha demostrado ser muy versátil y
eficaz para resolver el problema de la difracción de la luz en redes de difracción (Li,
1999; Li et al., 1999; Inchaussandague y Depine, 1996; Inchaussandague y Depine,
1997). El método C reduce la solución numérica al problema matricial de encontrar los
autovalores y autovectores de una matriz en cada medio, simplificando el manejo de
las condiciones de contorno.
En este capítulo se investiga el rol de la película como protectora de la célula
frente a la radiación UV. Se presentan aquí los resultados obtenidos del análisis de la
respuesta electromagnética de la película de Euglena gracilis en comparación con
otras dos especies de euglenoideos, Peranema trichophorum y Monomorphyna
megalopsis frente a la radiación UV, al comparar la respuesta electromagnética de una
superficie rugosa periódica (E. gracilis y P. trichophorum) con una superficie lisa (M.
megalopsis) en especies que difieren en su susceptibilidad frente a la radiación, entre
otras cosas, por ser organismos fotosintéticos (E. gracilis y M. megalopsis) y
heterotrófico (P. trichophorum).
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 268 ‐
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 269 ‐
2.OBJETIVOS E HIPÓTESIS
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 270 ‐
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 271 ‐
2.1 Hipótesis
E. gracilis presenta una superficie incolora conformada por bandas
proteicas. De acuerdo con esta característica, esta estructura podría actuar
como una red de difracción reflejando la luz UV y disminuyendo su entrada
a la célula.
Dada la semejanza de la película a una red de difracción, ella podría servir
como modelo para construir una estructura con propiedades
electromagnéticas capaz de actuar como protección frente a la radiación
UV.
2.2 Objetivo general
Analizar mediante el método de Chandezón si la estructura periódica de la
película influye en la respuesta electromagnética a la radiación UV.
2.3 Objetivos específicos
Someter cultivos de E. gracilis, M. megalopsis y P. trichoforum a radiación
UV.
Verificar la viabilidad de estas especies sometidas a la radiación.
Analizar mediante microscopía electrónica de transmisión la ultraestructura
de las células y medir parámetros geométricos relevantes, como espesor,
ancho de banda, ancho de interbanda y profundidad del surco.
Aplicar el método de Chandezón para simplificar las condiciones de
contorno y predecir la respuesta reflejada de la película ante la luz UV.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 272 ‐
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 273 ‐
3.MATERIALES Y MÉTODOS
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 274 ‐
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 275 ‐
1.1 Microorganismos y Condiciones de cultivo
Se utilizaron tres especies de euglenoideos: Euglena gracilis (UTEX 753),
Peranema trichophorum y Monomorphyna megalopsis. E. gracilis fue obtenida de la
colección de cultivo de la Universidad de Texas (USA), P. trichophorum proviene de la
colección de cultivos de Carollina suplies (USA) y M. megalopsis fue aislada del río
Matanza, Buenos Aires, Argentina a partir de una muestra extraída utilizando una red
de fitoplancton de 20 µm de poro. Los cultivos de E. gracilis y P. trichophorum eran
cultivos axénicos y estables, en el caso de M. megalopsis, los cultivos unialgales se
obtuvieron a partir de células aisladas y lavadas dos veces con solución fisiológica
(0,9% NaCl, pH 7) que fueron sembradas en extracto de suelo (SWM, Pringsheim,
1946) estabilizado con CaCO3. Todos ellos fueron mantenidos bajo fotoperíodo 12:12,
con una irradiancia de 25‐35 µE/ m2 seg, provista por tubos de 40 watt de potencia, a
24 ± 1 ºC en SWM. Los cultivos fueron repicados cada 10 días. En el caso de P.
trichophorum además se agregó al medio Chlamydomonas reinhardtii como alimento
dado que se trata de una especie heterótrofica. Esta especie de euglenoideo se utilizó
en los ensayos de radiación luego de haber ingerido la totalidad del alimento.
1.2 Ensayo de radiación
Cuando se verificó el crecimiento de algas, se prepararon 18 placas de Petri con
5 ml de medio SWM estabilizado con CaCO3. Seis placas se inocularon con 104cell/mL
de Euglena gracilis, 6 con P. trichophorum sin alimento y 6 con M. megalopsis. Tres
réplicas de cada especie fueron cubiertas con las correspondientes tapas de las placas
de Petri como control. Todas las muestras fueron irradiadas durante 8 horas con tubos
fluorescentes (ReptiSun 5.0) cuyo espectro de emisión se muestra en la figura 8. En las
placas irradiadas, el volumen se mantuvo por adición de medio de cultivo.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis
‐ 276 ‐
Figura 8: Espectro de emisión de la lámpara ReptiSun 5.0 (20‐watt) utilizada durante los ensayos.
1.3 Viabilidad
La viabilidad celular se analizó mediante el ensayo de exclusión de trypan blue
(Freshney, 1987). Una alícuota (1 ml) de la suspensión celular se mezcló con 0,1 ml de
0,4% de trypan blue preparado en buffer fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,4). Se
realizaron recuentos de células teñidas utilizando cámaras Neubahuer en un
microscopio Olympus BX50. Las células se examinaron dentro de 5 minutos posteriores
al agregado del trypan blue con el fin de evitar una posible citotoxicidad fotodinámica
(Hathaway et al., 1964). Otra alícuota (1 ml) de la suspensión de células se fijó con una
solución de formaldehído al 3% y las células totales se determinaron utilizando
cámaras Neubahuer. El porcentaje de células no teñidas (células viables) se determinó
en los cultivos tratados y controles. Se contaron suficientes células para tener un error
inferior al 10% (Venrick, 1978).
1.4 Microscopía electrónica de transmisión
Se comparó la ultraestructura de la película de los organismos tratados y
controles utilizando MET. Para ello, las células fueron recolectadas mediante
centrifugación durante 20 minutos a 3.500 x g. Se descartó el sobrenadante y el
“pellet” se fijó con glutaraldehído al 2,5 % preparado en buffer cacodilato de sodio 0,1
M (pH 7,4) durante toda la noche a 4°C. Luego fueron post‐fijadas en de tetróxido de
Osmio 1% preparado en buffer fosfato durante 2 horas, se centrifugó a baja velocidad,
se descartó el sobrenadante y el “pellet” se lavó durante 10 minutos con buffer fosfato
tres veces. Se cosecharon las células fijadas por centrifugación durante 5 minutos y se
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 277 ‐
deshidrataron las muestras utilizando una serie de concentraciones crecientes de
acetona (30% , 50% , 70% , 95% , y 2 x 100% ). Luego de la deshidratación se realizaron
inclusiones en resina Spurr de baja densidad (Reymond y Pickett‐Heaps, 1983). Los
preparados se seccionaron con un ultramicrótomo con cuchilla de diamante (1 µm de
espesor) y se tiñeron con acetato de uranilo 2% por 5 min y citrato de plomo 5%
durante 5 min (Reynolds, 1963). Las secciones fueron examinadas utilizando un
microscopio electrónico de transmisión de alta resolución Zeiss EM 10 A/B en el centro
de microscopía avanzada de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (CMA‐FCEN).
1.4 Parámetros determinados
Para cada una de las especies analizadas se midieron parámetros de la película
en organismos tratados y controles. Para esto se utilizó el software Imagen. Los
parámetros medidos fueron espesor, ancho de banda, ancho de interbanda,
profundidad del surco. Con esos valores se determinaron el período y altura de la
película para cada muestra. Se hicieron al menos 200 mediciones de cada parámetro
para cada tratamiento y especie.
1.5 Análisis teórico‐numérico
Dado que la película de estos organismos es una estructura periódica que
asemeja una red de difracción, para evaluar su respuesta electromagnética se realizó
un análisis teórico‐numérico. Este análisis fue realizado por el grupo de
electromagnetismo aplicado del departamento de Física de la FCEyN‐UBA. Los
períodos y alturas determinados como se indica en la sección 1.4 se utilizaron para
predecir la respuesta reflejada de película ante la luz UV utilizando el método
electromagnético de Chandezon (Chandezon et al., 1980) para el cálculo de la
respuesta electromagnética de redes de difracción.
En la figura 9 se puede observar la geometría del problema de difracción donde
se muestra una interfaz periódica corrugada, invariante en la dirección z, que se
describe como una función continua y = a (x) y por ser periódica, se cumple que:
a (x ± d) = a (x) donde d es el período.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 278 ‐
h
Figura 9: Perfil de forma sinusoidal que simula la película de E. gracilis y P. trichophorum
El límite corrugado periódicamente divide el espacio en dos regiones con
materiales con permitividades diferentes Ɛ1 (región y>a(x)) y Ɛ2 (y<a(x)),
respectivamente. Ambos medios son isótropos, homogéneos, y no magnéticos. Se
considera que una onda electromagnética plana, linealmente polarizada y de
frecuencia angular ω incide desde la región y>a(x) con un ángulo Ɵ0 con respecto al eje
y, cuyo plano de incidencia es el plano xy. El campo electromagnético se describe
clásicamente en términos de dos campos vectoriales: el campo eléctrico y el campo
magnético. La onda puede incidir con el vector campo eléctrico perpendicular al eje z
(modo TE), o con el vector campo magnético perpendicular al eje z (modo TM).
Para resolver el problema electromagnético se utilizó un código computacional
basado en el método C, cuyos detalles están disponibles en varios trabajos (Chandezon
et al., 1982; Li, 1999; Li et al., 1999). La idea principal del método C es simplificar las
condiciones de contorno usando una transformación muy simple de coordenadas
curvilíneas no ortogonales, que convierte la interfaz corrugada de la red, en un plano.
El método C permitió obtener las eficiencias de los órdenes de difracción reflejados y
transmitidos. Si bien el método es adecuado para redes de forma arbitraria, para el
propósito de este trabajo en las simulaciones numéricas se consideró un perfil de
forma sinusoidal, es decir:
a (x)=0,5 h cos (2πx/d), donde h es la profundidad de la red.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 279 ‐
Así el perfil real de la película de E. gracilis y P. trichophorum se asemeja a una
interfaz sinusoidal que separa los medios dentro y fuera de la célula. Dado que el
hábitat de estas especies es el agua, se tomó el índice de refracción del medio externo
(incidente) como 1,33. De acuerdo con Nakano et al. (1987), los principales
componentes químicos de la membrana plasmática y la película de E. gracilis son
proteínas, lípidos polares como la fosfatidiletanolamina, e hidratos de carbono como
xilosa, fucosa, y ramnosa. Estos componentes tienen índices de refracción entre 1,46 y
1,6. Por otro lado, dado que la película es un carácter altamente conservado en
euglenoideos, se puede considerar que M. megalopsis y P. trichophorum poseen una
película con una composición similar, por lo que para los cálculos se consideró el
interior de la célula como un medio homogéneo con un índice de refracción promedio
de 1,5.
También se analizó si los pigmentos presentes en E. gracilis contribuyen a su
protección contra la radiación UV ya que en este caso, el grado de absorción de la
célula también podría ser un mecanismo de protección. Para explorar este aspecto, se
introdujo una pequeña parte imaginaria del índice de refracción de la célula, que
representa las pérdidas por absorción.
A partir de los datos hallados con el método de Chandezon, con el programa
Origin se graficaron las curvas de potencia total reflejada normalizada al plano y
absorbida normalizada al plano en función de la radiación incidente.
1.6 Análisis estadístico
La significación estadística de las diferencias entre los controles y los cultivos
tratados y entre las especies se determinó por análisis de varianza (ANOVA) de dos
factores, con el fin de evaluar las diferencias entre los tratamientos y la viabilidad de
las especies. Las comparaciones se realizaron utilizando GraphPad Prism 5 y los valores
p<0,05 se consideraron significativos.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 280 ‐
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 281 ‐
4.RESULTADOS Y DISCUCIÓN
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 282 ‐
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 283 ‐
4.1 Viabilidad de las algas y observaciones ultraestructurales
El tratamiento con radiación UV mostró diferencias significativas en la
viabilidad de las especies M. megalopsis y P. trichophorum respecto a sus respectivos
controles (Figura 10). Sin embargo, E. gracilis no evidenció diferencias significativas
entre tratamientos. Al comparar la viabilidad de las células irradiadas no se observaron
diferencias significativas entre E. gracilis y P. trichophorum, mientras que la viabilidad
de M. megalopsis irradiada resultó significativamente menor a la de las otras dos
especies en iguales condiciones.
E. gracilis
P. trichophorum
M. megalopsis
0
20
40
60
80
100
Control
Irradiadas
*
*
Células viab
les (%
)
Figure 10: Porcentaje de células viables en cultivos control e irradiados de E. gracilis, P. trichophorum y M. megalopsis. Los resultados se expresan como media ± desvío estándar de
tres experimentos diferentes. (* pг0,05).
La radiación aplicada no afectó la ultraestructura de la película en E. gracilis y P.
trichophorum (figuras 11 y 12), pero al comparar las micrografías de M. megalopsis,
observamos diferencias ultraestructurales entre el control (Figura 13 A y B) y las
células expuestas (Figura 13 C). Se pudo observar un aumento en el contenido de
paramilon en M. megalopsis, el cual produjo cambios en la película. Si bien no se
observó replicación de bandas, algunas mostraron un ligero ensanchamiento (Figura
13 C). Tampoco hubo cambios en los cloroplastos de M. megalopsis y E. gracilis, los
cuales mantuvieron su estructura (figuras 11 C y 13 C).
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 284 ‐
De acuerdo a las figuras 11 y 12, la película de E. gracilis y P. trichophorum se
asemeja a una red de difracción con períodos que varían entre 0,155 y 0,384 µm para
E. gracilis y entre 0,256 y 0,521 µm para P. trichophorum. Por otro lado, la película de
M. megalopsis no presenta un patrón tan regular, esta muestra regiones casi planas,
con longitudes que varían entre 1,6 y 4 µm (figura 13). Por este motivo y dadas las
longitudes de onda de la radiación UV, puede considerarse como una superficie plana.
Por este motivo se analizó la respuesta electromagnética de las estructuras corrugadas
en comparación con la de una interfaz plana, que representa la respuesta de M.
megalopsis.
Pa Cl Cl Nu Pe
Figura 11: micrografías de E. gracilis. A) Célula del grupo control. B) Detalle de la película (Pe) y C) de cloroplasto (Cl) del grupo irradiado. Pa: paramilon, Nu: núcleo. Escalas: A) 5
µm; B) 0.5 µm; C) 1 µm.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 285 ‐
Nu Pe
Figura 12: micrografías de P. trichophorum. A) Célula del grupo control B) detalle de la película (Pe) del grupo irradiado. Nu: núcleo. Escalas: A) 4 µm; B) 1 µm.
Pe Cl Nu Cl Nu Nu Pa Pa
Figura 13: micrografías de M. megalopsis. Célula del grupo control (A) e irradiado (C). B) Detalle de la película (Pe) del grupo control. Nu: núcleo, Pa: paramilon, Cl: cloroplasto.
Escalas: A) 5 µm; B) 1 µm; C) 5 µm.
4.2 Respuesta electromagnética
En esta sección se muestra los resultados de la reflectancia total normalizada
como una función de la longitud de onda incidente y de la relación entre la
profundidad y el período (h/d), para diferentes valores de período. Se define R
(reflectancia total normalizada) como la reflectancia total de la red periódica
normalizada a la reflectancia de una interfaz plana entre los mismos medios, y se
calcula como:
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 286 ‐
R = Σn (enTE + en
TM)/(ǀrTEǀ2 + ǀrTMǀ2)
donde enTE (en
TM) es la eficiencia del enésimo orden de difracción reflejado cuando el
campo eléctrico es perpendicular al eje z (TE) o lo es el campo magnético (TM) y rTE
(rTM) es el coeficiente de reflexión de Fresnel en iguales condiciones (TE y TM) (Jackson,
1999).
En todos los casos se observó la reflectancia de la superficie corrugada
(películas de E. gracilis y P. trychophorum) normalizada a la reflectancia del plano
(películas de M. megalopsis) entre los mismos materiales. Esto puso de manifiesto las
diferencia entre E. gracilis y P. trychophorum (ambas resistentes a la radiación UV) y
M. megalopsis (sensible). Para los resultados mostrados en la figura 14 se consideró
una interfaz sinusoidal que separa dos medios con índices de refracción de 1,33 (n1) y
1,5 (n2) con incidencia normal. En esta figura se muestran los gráficos de la reflectancia
total normalizada (R) para redes de diferentes periodos. Se consideraron ciertos
valores de períodos que se encuentran en los rangos típicos de las películas de estas
microalgas: 0,256 μm; 0,276 μm; 0,315 μm y 0,495 μm. Los tres primeros valores son
característicos de E. gracilis y P. trichophorum, mientras que el período mayor (0,495
μm) sólo se encontró en P. trichophorum.
Figura 14: Reflectancia de la superficie corrugada que separa dos medios con índices de refracción de 1,33 y 1,5 con incidencia normal. La barra de la
derecha indica la escala de valores de reflectancia.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 287 ‐
Teniendo en cuenta la definición de R, los valores mayores que 1 representan
un conjunto de parámetros (profundidad y longitud de onda) para los que la
reflectancia de la estructura periódica es mayor que la interfaz plana. En los tres
primeros períodos considerados (Figuras 14A ‐ 14C), se puede observar que dentro de
la región UV (゜<380 nm) hay un rango de valores h/d para el que la reflectancia de la
red sinusoidal es mayor que la de la interfaz plana. Si se aumenta aún más el período
(d = 0,495μm) la región de alta reflectancia se mueve hacia la región roja del espectro
(datos no mostrados), hasta que otra región de alta reflectancia aparece (Figura 14D).
Estos resultados sugieren que para los tamaños de período típicos que se encuentran
en la película de E. gracilis y P. trichophorum, el patrón sinusoidal aumenta la
reflectancia UV y por lo tanto, menos radiación UV penetra en las células.
En el caso de P. trichophorum (incolora), un aumento de la reflectancia
implicaría necesariamente una reducción de la transmitancia. Sin embargo, también
resulta interesante investigar si los pigmentos presentes en E. gracilis contribuyen a su
protección contra la radiación UV ya que en este caso, el grado de absorción de la
célula también podría ser un mecanismo de protección. En la figura 15 se muestran las
absorbancias normalizadas para los tres valores de período más pequeños
considerados en la figura 14. En este caso, el índice de refracción que representa el
interior de la célula es n2 = 1,5 + i 0,1; mientras que el resto de los parámetros se
mantienen como los de la figura 14. En estos gráficos, los valores inferiores a 1
representan un grado de absorción inferior al de la interfaz plana entre los mismos dos
medios. Se observa que en los tres casos (figuras 15A‐15C) hay regiones para las cuales
la absorción es menor que la correspondiente a una interfaz plana. La reflectancia en
estas regiones también es más alta que la de una interfaz plana (datos no mostrados).
Esto sugiere que el perfil sinusoidal de la película contribuye a disminuir la absorción
de la radiación UV y por lo tanto, proporciona un mecanismo de protección para las
células frente a la radiación UV.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis
‐ 288 ‐
Figura 15: Absorbancias de la
superficie corrugada que separa
dos medios con índices de
refracción de 1,33 y 1,5 con
incidencia normal para los tres
períodos más pequeños
considerados (0,23 µm; 0,276 µm
y 0,315 µm). La barra de la
derecha indica la escala de
valores de absorbancia.
En la especie incolora (índice de refracción real), la reflectancia en el UV es
mayor que la de una interfaz plana para un amplio rango de parámetros. En la especie
pigmentada (índice de refracción complejo) el medio celular absorbe menos radiación
UV cuando la película posee un perfil corrugado y, al mismo tiempo, la reflectancia se
incrementa. Este comportamiento podría explicar por qué E. gracilis y P. trichophorum
tuvieron mayor viabilidad al ser expuestas a la radiación UV, mientras que la mayoría
de las células de M. megalopsis no resultaron viables luego del ensayo.
Los resultados obtenidos sugieren que las primeras barreras de la célula
podrían desempeñar un papel importante en la protección contra la radiación UV. Por
otra parte, la profundidad y el periodo parecen ser parámetros críticos para obtener el
rendimiento deseado de la respuesta electromagnética. Sin embargo, aún hay varios
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 289 ‐
aspectos que deben ser investigados. Por un lado, para simplificar el modelo y el
tratamiento electromagnético, se consideró un perfil sinusoidal de la rejilla, sin
embargo, se ha observado en las imágenes de corte transversales que los perfiles no
son exactamente sinusoidales, y también varían de una muestra a otra. Dado que la
respuesta electromagnética depende de la geometría de la rejilla, los cálculos de
reflectancia que tengan en cuenta una representación más exacta del perfil real,
podrían proporcionar una visión más detallada del problema. Otro aspecto que se
podría mejorar es la determinación de las partes real e imaginaria de los valores de
índice de refracción. Aunque nuestras estimaciones se basan en los componentes
químicos, las células no son homogéneas y por lo tanto el índice de refracción varía de
un punto a otro y el modelo simplificado utilizado aquí no tiene en cuenta estas
heterogeneidades. Otros métodos esencialmente numéricos tales como FDTD (Finite‐
difference time‐domain, Taflove y Hagness, 2005) o un método de simulación fotónica
(Dolinko y Skigin, 2013) podría dar cuenta de esta falta de homogeneidad.
Los euglenoideos se encuentran en la base del árbol evolutivo de los eucariotas
y se estima que se originaron hace unos 1.400 a 1.200 millones de años atrás, por lo
que su aparición ocurrió poco después de que se formara la capa de ozono que data de
hace unos 1.600 a 1.400 millones de años. En particular la especie P. trichophorum
suele aparecer en los árboles evolutivos del grupo como la especie más ancestral
(Preisfeld et al., 2000; Heyden et al., 2004; Marin et al., 2003; Nudelman et al., 2003),
que además se caracteriza por ser una especie incolora y metabólica. La rigidez
observable en algunas especies de euglenoideos, como Monomorphyna sp., se debe a
la fusión de bandas peliculares y es un carácter que ha aparecido,
independientemente, muchas veces a partir de un ancestro con movimiento
metabólico (Leander et al., 2001). La presencia de películas rígidas en euglenoideos
autótrofos sería un mecanismo para impedir la metabolia, y se presume que la
plasticidad en algunas células, como es el caso de E. gracilis, es una propiedad
prescindible en especies capaces de fotosintetizar, mientras que ésta sería necesaria
para las especies de nutrición heterótrofa (Leander et al., 2001).
Si consideramos entonces a P. trichophorum (incolora y metabólica) como la
especie más ancestral y a M. megalopsis (fotosintética y rígida) como la especie menos
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 290 ‐
ancestral, la presencia de películas con patrones periódicos que resultaron protectoras
para dos de las especies en estudio (P. trichophorum y E. gracilis) podría ser un
carácter adaptativo para poder soportar las condiciones atmosféricas existentes en el
momento en que se originaron.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 291 ‐
5.CONCLUSIONES
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis ‐ 292 ‐
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E.gracilis ‐ 293 ‐
Los resultados obtenidos en esta sección muestran que el perfil que presenta la
película de E. gracilis podría contribuir a aumentar la reflectancia de la radiación UV y a
disminuir su absorbancia debido al patrón de estriación que se asemeja a una red de
difracción. Esto llevaría a disminuir la penetración de la radiación UV en el interior de
la célula, minimizando los daños y aumentando en consecuencia la supervivencia de
aquellas que poseen este patrón.
Este estudio permitió detectar propiedades ópticas en las películas de las
especies E. gracilis y P. trychophorum, las cuales podrían resultar de interés en el
campo de la biomimética y biorreplicación. Se podrían reproducir las estructuras de las
películas analizadas para cumplir con la función de protección frente a la radiación UV.
Capítulo 4‐ Estudios sobre la respuesta electromagnética de la película de E. gracilis
‐ 294 ‐
CAPITULOVConclusiones finales
Capítulo 5‐ Conclusiones finales
‐ 297 ‐
Las conclusiones que derivan de este trabajo de tesis son las siguientes:
Las cepas de E. gracilis pigmentadas, al ser cultivadas en medio rico en materia
orgánica, muestran un mayor rendimiento en cuanto a la producción de biomasa,
que las cepas blanqueadas.
Las cepas de E. gracilis fotosintéticas, en fase estacionaria de crecimiento,
resultaron potenciales productoras de polifenoles al ser cultivadas en medio rico
en materia orgánica.
Los extractos etanólicos de las cepas fotosintéticas en fase estacionaria
mostraron actividad atrapante de radicales libres e inhibieron el crecimiento de
raíces de trigo. Esta capacidad puede estar relacionada con la presencia de
polifenoles como los flavonoides o taninos, detectados en los extractos de estas
cepas.
Han sido detectados otros metabolitos secundarios, que serían eficaces en el
tratamiento de enfermedades cardiovasculares, cardenólidos (en las fases
exponenciales de todas las cepas) y triterpenos (en las fases exponenciales de
las cepas blanqueadas).
Las cepas de E. gracilis blanqueadas resultaron las mejores productoras de
paramilon, cuando se las cultivó en medio mineral con exceso de acetato.
La cepa con mejor rendimiento en la producción de paramilon resultó ser la
UTEX‐h, cuando fue cultivada en un medio mineral con exceso de acetato, por lo
que sería la cepa a seleccionar para la producción de este polisacárido.
La mayor producción de paramilon en medio mineral con exceso de acetato se ve
acompañada de una mayor actividad de la enzima isocitrato liasa, la cual le
permite a las células incrementar sus niveles de paramilon, manteniendo altos
los niveles lipídicos y proteicos.
En las cepas fotosintéticas el exceso de acetato provoca una disminución en el
contenido de pigmentos y en el tamaño de los cloroplastos, así como un
aumento en el desarrollo de las mitocondrias, lo que indicaría un
desplazamiento hacia un metabolismo heterotrófico.
Capítulo 5‐ Conclusiones finales ‐ 298 ‐
Mediante una modificación química del paramilon puede obtenerse un producto
con propiedades antivirales (ensayada in vitro), aunque la derivatización
realizada en este trabajo mostró un bajo rendimiento.
La inclusión de paramilon en la dieta de C. quadricarinatus puede mejorar la
respuesta inmune de la especie sin afectar su crecimiento.
El paramilon tiene un efecto protector e inmunoestimulante de los efectores
humorales (sistema ProPO) en los animales que reciben este polisacárido como
suplemento alimentario.
La película de E. gracilis presenta un patrón regular con propiedades ópticas. Este
patrón, que se asemeja a una red de difracción, aumenta la reflectancia de la
radiación UV y contribuye a disminuir su absorbancia, resultando, por lo tanto
un elemento protector frente a la radiación UV. La menor penetración de
radiación UV en el interior de la célula, minimizaría los daños aumentando en
consecuencia la supervivencia de las mismas.
Por las características ópticas detectadas en E. gracilis y P. trichophorum frente a
la radiación UV, la estructura de sus películas podrían ser utilizada como modelo
para la producción de nuevos materiales con estas propiedades.
A partir de los resultados del presente trabajo, investigaciones adicionales deberían
centrarse en los siguientes aspectos:
Caracterizar los compuestos químicos de interés, detectados en el cribado
químico y evaluar su actividad biológica mediante pruebas específicas.
Estudiar la relación estructura‐actividad del paramilon derivatizado, así como
otros mecanismos de derivatización, para producir compuestos con mayores
rendimientos y que por lo tanto muestren una mejor relación costo‐beneficio.
Estudiar los mecanismos de acción antiviral del paramilon derivatizado.
Evaluar el rendimiento en términos de crecimiento, supervivencia, fisiología e
inmunología de especies de interés comercial (como C. quadricarinatus u otros
crustáceos) al aplicar paramilon en el alimento a lo largo de todo el ciclo de
cultivo.
Capítulo 5‐ Conclusiones finales
‐ 299 ‐
Evaluar el papel del paramilon en la absorción de nutrientes cuando se lo aplica
como suplemento alimenticio.
Evaluar la especie E. gracilis como suplemento alimentario con efectos
inmunoestimulantes, ya que es productora de una gran cantidad de paramilon y
niveles protéicos elevados.
Incorporar la determinación de otros parámetros, indicadores inmunológicos
(proceso hematopoyético, producción de aglutinantes, fagocitosis y adhesión
celular) para evaluar la eficiencia del paramilon como inmunoestimulante en
crustáceos.
Evaluar la respuesta de la película de E. gracilis mejorando la determinación de
las partes reales e imaginarias de los valores de índice de refracción y
considerando las heterogeneidades que presentan las células.
Reproducir las características estructurales esenciales de la película de E. gracilis
para poder replicar la funcionalidad de esta estructura biológica con propiedades
electromagnéticas.
Capítulo 5‐ Conclusiones finales
‐ 300 ‐
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