Propagación in vitro de Pinus caribaea var. caribaea por … · 2018-12-17 · RESUMEN Con el...

TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO ACADÉMICO DE MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Propagación in vitro de Pinus caribaea var. caribaea por organogénesis

Autora: Ing. Maité Chávez Milián

Tutor: Dr. C. Manuel de Feria Silva

Consultante: Dr. C. Raúl Barbón Rodríguez

Santa Clara, CUBA

2010

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RESUMEN

Con el objetivo de desarrollar la organogénesis de Pinus caribaea var. caribaea como una

alternativa para su propagación, se realizaron experimentos para establecer in vitro brotes

obtenidos de plantas donantes cultivadas en casa de cultivo, determinar el efecto del 6-

BAP y agentes gelificantes en la fase de multiplicación y definir la influencia de las

concentraciones de sacarosa y nutrientes inorgánicos en el desarrollo de las plantas

obtenidas in vitro. Los resultados demostraron que se logró establecer in vitro brotes

apicales obtenidos de plantas donantes cultivadas en casa de cultivo y se definieron las

características que debe tener este tipo de brote. En la fase de multiplicación, el 6-BAP

influyó en el desarrollo de las plantas in vitro, con una concentración de 6,66 µM se

lograron los mejores resultados en cuanto al número (6,75) y longitud de los brotes por

plantas (2,70 cm), con un coeficiente de multiplicación de 2,38. Se demostró que el agente

gelificante y su concentración, fueron factores que influyeron en el desarrollo in vitro de las

plantas en la fase de multiplicación, con 4,0 g.L-1 de Gelrite se obtuvo el mayor coeficiente

de multiplicación (2,87). Al incrementar la concentración de sacarosa a 60 g.L-1 en el último

subcultivo de la fase de multiplicación, se produjeron plantas con un color verde más

intenso, acículas más desarrolladas y diferenciadas, y el olor característico de los aceites

esenciales que se puede percibir al macerar tejido de árboles adultos, estos cambios, le

confirieron a estas plantas mejores características para ser subcultivadas a la fase de

enraizamiento. Al reducir la concentración de nutrientes inorgánicos en el medio de cultivo

de enraizamiento, se lograron los mayores porcentajes de residuos en la paredes celulares

de los tallos. Con 50% de nutrientes inorgánicos, se logró el mayor porcentaje de residuos

acumulados en la pared celular (47,95%) y con ello plantas con una mayor diferenciación

celular.

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ÍNDICE

Página

1. INTRODUCCIÓN 1

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4

2.1 Generalidades sobre el cultivo 4

2.1.1 Origen y distribución 4

2.1.2 Clasificación taxonómica 5

2.1.3 Características botánicas 6

2.1.4 Importancia económica 7

2.2 Propagación en forestales 7

2.3 Propagación in vitro 10

2.3.1 Regeneración de plantas por organogénesis 11

2.3.1.1 Establecimiento in vitro 13

2.3.1.2 Multiplicación in vitro 14

2.3.1.2.1 Etapa de elongación 16

2.3.1.3 Fase de enraizamiento 18

2.3.1.4 Fase de aclimatización 25

3. MATERIALES Y MÉTODOS 28

3.1 Fase de establecimiento 28

3.1.1 Selección del tipo de brote 29

3.1.2 Efecto del 6-BAP 30

3.2 Fase de Multiplicación 31


3.2.2 Efecto de diferentes agentes gelificantes y su concentración 32

3.2.3 Efecto de diferentes concentraciones de Gelrite 33

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3.2.4 Efecto de la sacarosa 33

3.3 Fase de enraizamiento 34

3.3.1 Efecto de diferentes concentraciones de AIB 34

3.3.2 Efecto de la concentración de nutrientes inorgánicos 35

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 38

4.1 Fase de establecimiento 38

4.1.1 Selección del tipo de brote 38


4.2 Fase de Multiplicación 43


4.2.2 Efecto de diferentes agentes gelificantes y su concentración 45

4.2.3 Efecto de diferentes concentraciones de Gelrite 48

4.2.4 Efecto de la sacarosa 50

4.3 Fase de enraizamiento 53

4.3.1 Efecto de diferentes concentraciones de AIB 53

4.3.2 Efecto de la concentración de nutrientes inorgánicos 56

5. CONCLUSIONES 61

6. RECOMENDACIONES 62

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 63

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Introducción _________________________________________________________________________

Tesis de Maestría 1

1. INTRODUCCIÓN

Pinus caribaea Morelet var. caribaea Barret y Golfari, es una variedad endémica de

la región occidental de Cuba, específicamente de la provincia de Pinar del Río y

del municipio especial Isla de la Juventud. Es la principal especie de pino plantada

en el país. Sin embargo, por el declinar marcado de sus plantaciones debido a la

deforestación, está clasificada como una variedad vulnerable en la lista roja

publicada por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza y los

Recursos Naturales (IUCN, 2010).

Económicamente resulta importante para la producción de madera y resina,

aunque se han desarrollado metodologías para la obtención de cera conífera,

pasta clorofila-caroteno y residuo forrajero a partir del empleo del follaje después

de la tala (Díaz et al., 2007).

La Empresa Forestal, en Cuba, propaga el pino de manera tradicional a partir de la

siembra de posturas obtenidas de semillas seleccionadas, pero este sistema no

garantiza la demanda del país (Cantillo et al., 2006 a), y no siempre se logra un

desarrollo homogéneo y con calidad de muchos de los árboles plantados. Una

alternativa que podría contribuir a solucionar esta problemática, es el empleo del

cultivo in vitro de órganos y tejidos vegetales. En Cuba, existen algunas

investigaciones sobre el tema en el género Pinus (Cantillo et al., 2006 a,b), pero no

se han desarrollado protocolos que se apliquen comercialmente para la

propagación in vitro de ninguna de las especies de pinos sembradas en el país.

A nivel mundial, la mayoría de los trabajos realizados para la propagación in vitro

del género Pinus, han utilizado embriones cigóticos inmaduros y maduros como

material vegetal inicial (Nehra et al., 2005; Lelu et al., 2006; Pullman y Skryabina,

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Introducción _________________________________________________________________________


2007), a partir de los cuales, se han regenerado plantas por organogénesis (Tang

et al., 2004; Tang y Newton, 2005) y embriogénesis somática (Nehra et al., 2005;

Vales et al., 2007).

La regeneración de plantas por organogénesis, ha sido un método que ha

demostrado ser eficiente en la propagación comercial de muchas especies

vegetales (Zhang et al., 2006). Sin embargo, el establecimiento in vitro de brotes

apicales de pino, ha sido una alternativa poco abordada. Fundamentalmente

porque la respuesta in vitro del material vegetal depende en muchos casos del

genotipo, la edad en campo y las características de las plantas donantes (Li et al.,

2010). Por otra parte, los coeficientes de multiplicación y los porcentajes de

formación de raíces in vitro que se han obtenido para muchas especies, han sido

bajos (Oliveira et al., 2003; Stojicic y Budimir, 2004).

Desarrollar la propagación in vitro por organogénesis a partir de plantas donantes

obtenidas de semillas, permitirá mantener la diversidad biológica de P. caribaea

var. caribaea fruto de muchos de años de evolución, moldeada por los procesos

naturales y cada vez más, por la influencia del ser humano y multiplicar los nuevos

clones de esta variedad, obtenidos mediante trabajos de selección y mejoramiento

genético durante más de 40 años, los cuales presentan incrementos de hasta 30%

en la producción de madera y rinden entre 20-40% más de oleorresinas que los

árboles originales (Pérez, 2008, comunicación personal).

Atendiendo a la problemática abordada y los antecedentes presentados, se planteó

como hipótesis de trabajo la siguiente:

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Introducción _________________________________________________________________________


“Es posible a partir de brotes obtenidos de plantas donantes cultivadas en casas

de cultivo, desarrollar la organogénesis de Pinus caribaea var. caribaea como una

alternativa para su propagación”.

Objetivos:

1. Lograr el establecimiento in vitro de brotes obtenidos de plantas donantes

cultivadas en casa de cultivo.

2. Determinar el efecto de las concentraciones de 6-BAP y agentes gelificantes

en la multiplicación in vitro de esta variedad.

3. Definir la influencia de las concentraciones de sacarosa y nutrientes

inorgánicos en el desarrollo de las plantas obtenidas in vitro.

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Revisión Bibliográfica _________________________________________________________________________


2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Generalidades sobre el cultivo

2.1.1 Origen y distribución

Pinus caribaea Morelet var. caribaea Barret y Golfari, es una variedad endémica

del oeste de Cuba (específicamente de la provincia de Pinar del Río y el municipio

especial Isla de la Juventud), es la principal especie de pino plantada en el país,

fundamentalmente sobre suelos arenosos y latosólicos (García et al., 2009).

La figura 1 muestra, según García et al. (2009), ocho de las zonas de distribución

natural más importantes de la variedad en la provincia de Pinar del Río.

Figura 1. Zonas de distribución natural de Pinus caribaea var. caribaea en el 2009

en la provincia de Pinar del Río.

Esta limitada y escasa área de distribución natural comprende sólo 811 ha, que

también comparte con le especie Pinus tropicalis.

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Es de destacar las afectaciones que han sufrido las áreas con poblaciones

naturales de esta variedad, provocadas fundamentalmente por factores como: los

incendios naturales o artificiales y el aprovechamiento maderero, convirtiéndose

los incendios forestales en el principal enemigo de estas poblaciones (García et al.,

2009), por lo que sería recomendable redoblar los esfuerzos en aras de conservar

todo el fondo genético y poner en práctica acciones que contribuyan de manera

sustancial a su conservación, por la importancia particular que tiene para la

variedad continuar habitando en estos sitios.

Por todo lo explicado anteriormente, a finales del 2006 la variedad fue clasificada

como vulnerable en la lista roja publicada por la Unión Internacional para la

Conservación de la Naturaleza y los Recursos Naturales (IUCN, 2010).

2.1.2 Clasificación taxonómica

En 1851 el naturalista francés Pierre Marie Arthur Morelet clasificó esta especie de

pino como Pinus caribaea. Barrett y Golfari (1962), teniendo en cuenta el gran

interés que había despertado la especie en los planes de reforestación de

numerosos países del hemisferio sur, hicieron un minucioso estudio de la misma y

llegaron a la conclusión de que existían suficientes razones para considerar las

poblaciones geográficamente aisladas de Pinus caribaea Morelet como entidades

diferentes, aunque no merezcan el rango específico. Por lo tanto, se subdividió a

la especie en tres variedades: P. caribaea Morelet var. caribaea Barrett y Golfari,

de Cuba (típica); P. caribaea Morelet var. hondurensis Barrett y Golfari, de

Centroamérica (Pino de Honduras); y P. caribaea Morelet var. bahamensis Barrett

y Golfari, de las Islas Bahamas (Pino de Bahamas).

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Desde el punto de vista taxonómico la variedad cubana está clasificada de la

siguiente forma:

Reino: Plantae División: Tracheophyta Clase: Coniferopsida Orden: Coniferales Familia: Pinaceae Género: Pinus Especie: caribaea Nombre binomial Pinus caribaea Nombre científico Pinus caribaea Morelet var. caribaea Barrett y Golfari Nombre común Pino macho

2.1.3 Características botánicas

Según Dobler y Torres (1995) y Betancourt (1999), las características botánicas de

esta variedad son las siguientes:

Las hojas están comúnmente en grupos de dos a tres por fascículo, raramente

cuatro, de 15 a 25 cm de largo, de 0,1 a 0,13 cm de espesor, agudas, con bandas

estomáticas en todas las caras, de tres a seis canales resiníferos internos,

hipodermis biforme con tres a cinco hileras; vainas de 1,0 a 1,3 cm de largo,

castañas a negruzcas cuando adultas.

La corteza de los árboles jóvenes es grisácea, rugosa y resquebrajada en surcos

más o menos profundos; en los adultos se puede mantener esta característica o

bien formar placas grandes de color castaño, con fisuras poco profundas,

descascarándose en finas láminas.

Las características generales de la madera son: textura media, grano típicamente

recto, con albura poco diferenciable del duramen. La madera recién aserrada tiene

un lustre medio y es grasienta al tacto, en consonancia con la cantidad de resina

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que posea. Esta madera presenta anillos visibles, diferenciándose notablemente la

madera tardía de la temprana.

La flor es monoica. Las flores masculinas en amentos tienen de 2,0 a 3,0 cm de

longitud; las flores femeninas (estróbilos) son reflejos. Las flores masculinas

abundan más en las ramas bajas, las femeninas en la parte superior del árbol.

Las flores femeninas se transforman en conos (frutos), que son ligeramente

asimétricos, de 12 a 15 cm de longitud y entre 1,3 y 4,0 cm de diámetro; cónicos

cuando están cerrados, oblongos cuando abiertos. Los conos permanecen en el

árbol, si no se tumban, durante un año o más después de la diseminación de las

semillas. Los frutos contienen un promedio de entre 60 y 75 semillas. Las semillas

son de 0,6 cm de largo, 0,3 cm de ancho y 0,2 cm de espesor, angostamente

ovoides y triangulares, de color gris moteado a pardo claro. Las semillas contienen

de cuatro a ocho cotiledones.

2.1.4 Importancia económica

Económicamente resulta importante por su producción de madera y resina, aunque

se han desarrollado metodologías para la obtención de cera conífera, pasta

clorofila-caroteno y residuo forrajero a partir del empleo del follaje después de la

tala (Díaz et al., 2007).

2.2 Propagación en forestales

La clonación o propagación vegetativa de árboles ha sido una herramienta útil en

el mejoramiento forestal tradicional, y según Gronroos (1987), prometía ser la base

de la revolución en lo concerniente a la producción forestal.

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Si bien, la mejora genética clásica involucró selecciones, cruzamientos y pruebas

genéticas (de familias, híbridos o clones). Según López (2000), a corto plazo con

los nuevos avances en el campo de la biotecnología vegetal (organogénesis,

embriogénesis somática, mapeo de genes, selección asistida por marcadores

moleculares e ingeniería genética), sería posible incrementar aun más la

productividad y la competitividad que demandaba el mercado regional e

internacional al mejorar significativamente la homogeneidad de las plantaciones e

incrementar los rendimientos.

La aplicación de las técnicas de propagación vegetativa para la industria forestal es

importante porque permite aumentar el número de hectáreas plantadas con

material genético superior. Esto implica incrementar el rendimiento por hectárea de

plantación y mejorar así la rentabilidad del proceso (Niella y Rocha, 2004). En el

ámbito forestal, la mayor parte de los métodos de cultivo de tejidos han sido

utilizados para producir árboles directamente para reforestación, pero estas

técnicas son también un requisito básico para la producción de árboles

genéticamente modificados (Yanchuk, 2001). Las técnicas de cultivo de tejidos

comúnmente utilizadas en especies leñosas se basan en la regeneración de

plantas por organogénesis y embriogénesis somática. Estas técnicas permiten

obtener distintas respuestas, existiendo diferencias en función del genotipo, incluso

dentro de una misma especie.

En la propagación in vitro de pino por organogénesis, se han utilizado brotes

juveniles de 0,5 a 1,0 cm de longitud que son cultivados en medios de cultivo para

promover la brotación lateral a partir de yemas pre-formadas. Estos nuevos brotes

obtenidos pueden continuar siendo multiplicados y enraizados para lograr la

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formación de una planta normal (Niella y Rocha, 2004). La micropropagación tiene

el potencial de multiplicar rápidamente genotipos de alto valor para la

reforestación. Según Nandwani et al. (2001), estudios relacionados con la

regeneración de especies coníferas a partir de brotes adventicios habían permitido

obtener importantes progresos.

La embriogénesis somática es una técnica que utiliza embriones inmaduros

extraídos de las semillas (Lelu et al., 2006; Pullman y Skryabina, 2007) que son

cultivados en medios de cultivo específicos para obtener embriones somáticos.

Esto permite acelerar el proceso de multiplicación dado que no existe la etapa de

enraizamiento posterior como en el caso de organogénesis o multiplicación axilar.

Con la regeneración de plantas por embriogénesis somática se habilita también la

posibilidad de encapsular los embriones somáticos dando lugar a las semillas

artificiales, con las consecuencias positivas que esto significa para el

mantenimiento, transporte del material genético, automatización y mecanización de

los diferentes procesos.

Los tejidos embriogénicos obtenidos pueden ser crioconservados en nitrógeno

líquido a -196°C y ser guardados indefinidamente hasta su nueva utilización.

Simultáneamente el material vegetal crioconservado puede ser sometido a

ensayos clonales a campo. Luego de la evaluación en campo, los clones

superiores pueden recuperarse de los tanques de crioconservación y ser utilizados

para la producción de plántulas clonales de alto valor genético (Park, 2002; Niella y

Rocha, 2004; Pullmann et al., 2005).

La aplicación de estas técnicas a escala comercial está limitada a pocas coníferas,

en la última década han existido avances en la mayoría de las especies forestales

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de interés, y ya es una tecnología disponible para algunas especies del género

Pinus (Klimaszewska et al., 2007). Sin embargo, los gastos de desarrollo de tales

tecnologías de cultivo de tejido avanzadas son altos comparado con los de

macropropagación, lo que no la convierte en una tecnología disponible para todos

(Yanchuk, 2001).

2.3 Propagación in vitro

La propagación in vitro en coníferas se logrado por organogénesis y embriogénesis

somática. En el caso de la organogénesis, a través de la brotación de yemas

axilares y la inducción de yemas adventicias. La primera emplea ápices, yemas

laterales y microestacas. La inducción de yemas adventicias se produce sobre el

explante, previa formación de callo, a partir de meristemos preexistentes o tejido no

meristemático. Estas yemas se originan de una o varias células cuando se cultivan

con concentraciones elevadas de citoquininas. En la embriogénesis somática se

pueden emplear como explante embriones cigóticos maduros e inmaduros, que en

la mayoría de los casos se originan en forma indirecta a partir de callos

embriogénicos, o bien, directamente desde el explante (Echenique et al., 2004).

A nivel mundial, la mayoría de los trabajos realizados para la propagación in vitro

del género Pinus, han utilizado embriones cigóticos inmaduros y maduros como

material vegetal inicial (Nehra et al., 2005; Lelu et al., 2006; Pullman y Skryabina,

2007), a partir de los cuales, se han regenerado plantas por organogénesis (Tang

et al., 2004; Tang y Newton, 2005) y embriogénesis somática (Nehra et al., 2005;

Vales et al., 2007).

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En pino, la embriogénesis somática ha sido el método de regeneración de plantas

más estudiado y desarrollado (Pullman et al., 2005; Salanova et al., 2007;

Klimaszewska et al., 2007). Sin embargo, se ha descrito que en ocasiones se limita

la formación del callo y se producen pocos embriones somáticos por gramo de

masa fresca (Lelu et al., 2006; Maruyama et al., 2007). Estos autores explicaron,

que entre otras razones, estos resultados se deben a la influencia del genotipo, la

composición del medio de cultivo y al difícil control del desarrollo uniforme de todas

semillas en un lote de conos.

Además, para aplicar con fines comerciales la regeneración de plantas por

embriogénesis somática a partir de embriones cigóticos es necesario haber

desarrollado programas de mejoramiento genético a partir de pruebas de

progenies, realizar selecciones genéticas y luego establecer huertos para producir

las semillas de las plantas mejoradas genéticamente (Klimaszewska et al., 2007).

En este sentido, en Cuba este programa aun no está disponible y se están

estableciendo los huertos semilleros de segunda generación a partir de plantas de

P. caribaea var. caribaea seleccionadas de las mejores combinaciones y de los

individuos más sobresalientes en cada familia (Pérez, 2008, comunicación

personal).

2.3.1 Regeneración de plantas por organogénesis

Los órganos como tallos, raíces y flores son inducidos a partir de una célula o

grupo de células, que según las condiciones de cultivo, tienen la propiedad de

mantenerse en activa división. Esta totipotencia de las células somáticas puede

regenerar brotes, raíces y flores. La regeneración comprende diferentes fases:

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adquisición de competencia, inducción, y realización (De Klerk, 2002). En la

primera fase las células no responden al estímulo organogénico, pero adquieren la

competencia durante la desdiferenciación; en la fase de inducción, las células son

receptivas al estímulo morfogenético y hay una relación directa entre el tipo,

concentración y combinación de reguladores del crecimiento adicionados al medio

de cultivo y el órgano a desarrollar; y en la fase de realización la célula sufre las

sucesivas divisiones (Echenique et al., 2004). La organogénesis se caracteriza por

la formación de un primordio unipolar a partir de una yema con el subsecuente

desarrollo de este en un brote vegetativo, existiendo siempre una conexión entre

los nuevos brotes y el tejido paterno.

Se reconocen cinco fases:

Fase 0: Preparativa: se selecciona la planta madre y se le realizan tratamientos

fitosanitarios, con el objetivo de mejorar la eficiencia en la implantación y el

desarrollo posterior de los cultivos in vitro.

Fase I: Establecimiento in vitro: el objetivo de esta fase es establecer cultivos

asépticos y viables con los cuales iniciar el proceso de propagación.

Fase II: Multiplicación in vitro: aquí se garantiza la propagación de los brotes y la

estabilidad genética de las plantas producidas. Se realiza el escalado.

Fase III: Enraizamiento: Puede ser in vitro o ex vitro y es donde se preparan las

plantas para su transferencia al suelo.

Fase IV: Aclimatización: es la fase final del proceso y por lo tanto, su meta es

lograr plantas listas para el transplante definitivo a campo.

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2.3.1.1 Establecimiento in vitro

La propagación in vitro a partir de árboles adultos siempre ha sido difícil debido a

problemas tales como el establecimiento de cultivos asépticos (severa

contaminación microbiana), la influencia de la época del año en la respuesta in

vitro, o a la acumulación de determinados metabolitos secundarios que provocan

fenolización (Agrawal et al., 2002).

Según Korban y Sul (2007), en algunas especies de coníferas las plantas

obtenidas de semillas pueden servir como plantas madres en casas de cultivo y ser

fuentes de material vegetal, si se mantienen y crecen bien, ya que proporcionan

gran cantidad de nuevos brotes como material vegetal para establecer in vitro.

En varias especies e híbridos del género Larix, un árbol conífero que se caracteriza

por su rápido crecimiento, Ewald (2007) empleó plantas de semilleros para obtener

los brotes que finalmente estableció in vitro.

Este autor también demostró que fue posible establecer plantas in vitro a partir de

árboles adultos pero al final del invierno ya que por la pérdida de las agujas en esa

época del año se facilitó y fue más efectiva la desinfección del material vegetal.

Entre los reguladores del crecimiento en plantas, las citoquininas han sido las que

mejores respuestas han permitido obtener durante el establecimiento in vitro de

muchas especies vegetales. En árboles adultos de Holarrhena antidysenterica,

Kumar et al. (2005) estudiaron el efecto de varias citoquininas en el

establecimiento in vitro de los brotes y las mejores respuestas las lograron con 6-

BAP.

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2.3.1.2 Multiplicación in vitro

Según Bonga y Von Aderkas (1992), en algunas coníferas, la regeneración de

plantas por organogénesis a partir de yemas axilares, fue eficaz. En años más

recientes se ha podido desarrollar este proceso incluso a partir de árboles adultos

(De Diego et al., 2008), pero en general, a lo largo de los años se ha observado

que no ha ocurrido así con la mayoría de las especies coníferas y en la práctica,

con el empleo de este método de regeneración, no se ha podido llegar a una etapa

de aplicación (Bonga et al., 2010).

La regeneración de plantas por organogénesis, ha sido un método que ha

demostrado ser eficiente en la propagación comercial de muchas especies

vegetales. Sin embargo, en Cuba, con respecto al género Pinus existen pocas

investigaciones sobre el tema (Cantillo et al., 2006 a,b) y no se han desarrollado

protocolos que se apliquen comercialmente para la propagación in vitro de ninguna

de las especies de pino plantadas en el país.

Esto se debe fundamentalmente, a que la respuesta in vitro del material vegetal

durante el proceso de propagación in vitro, depende en muchos casos del

genotipo, de la edad en campo y las características de las plantas donantes, y a

que los coeficientes de multiplicación y los porcentajes de formación de raíces in

vitro que se han obtenidos para muchas especies, han sido bajos.

Existen numerosas investigaciones que refieren la regeneración de plantas de pino

por organogénesis, pero a partir de embriones cigóticos (Tang et al., 2004; Tang y

Newton, 2005; Alonso et al., 2006). Sin embargo, el empleo de explantes tales

como brotes apicales, yemas axilares, acículas, etc., para el establecimiento in

vitro de plantas de pino han sido alternativas menos estudiadas. Por lo tanto,

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pocos trabajos describen resultados en la fase de multiplicación a partir de haber

establecido in vitro estos tipos de explantes.

Las citoquininas son reguladores del crecimiento muy eficaces para estimular la

iniciación directa o indirecta de brotes in vitro (van Staden et al., 2008). Según

estos autores, sus efectos en el cultivo de tejidos y órganos pueden variar según el

tipo de citoquinina, la concentración empleada en el medio de cultivo, si el material

vegetal a establecer in vitro se obtiene de tejido juvenil o tejido adulto, puede variar

además en función de la especie vegetal y del método de regeneración de plantas

empleado.

Según van Staden et al. (2008), cuando se utilizan altas concentraciones de

citoquininas en la fase de multiplicación, los brotes que se producen reducen su

desarrollo en longitud. Autores como Kumar et al. (2005), estudiaron el efecto de

varias citoquininas en la multiplicación in vitro de brotes apicales obtenidos de

árboles adultos de Holarrhena antidisentérica y las mejores respuestas las lograron

con 6-BAP.

Estos autores, al evaluar el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP,

comprobaron que al igual que en muchas otras especies, las respuestas in vitro

para la mayoría de las variables evaluadas dependieron de las concentraciones

estudiadas.

Una determinada concentración de Agar puede ser considerada inadecuada si no

ayuda al desarrollo in vitro de los brotes o si favorece la aparición de plantas con

síntomas de hiperhidricidad. (Thorpe et al., 2008). Estos autores plantean que la

hiperhidricidad se puede reducir si se incrementa la concentración de Agar en el

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medio de cultivo, pero este incremento, regularmente está acompañado de una

disminución en el desarrollo y crecimiento de las plantas in vitro.

No obstante, se ha demostrado que existen diferencias en la composición y

características de cada uno de estos compuesto, por ejemplo, el Gelrite como

producto comercial está libre de impurezas orgánicas que si se encuentran en el

Agar (Thorpe et al., 2008) y tiene entre otras ventajas para la propagación in vitro

de plantas a gran escala, que su costo por litro es menor al del Agar y se emplea

en menor concentración que este, además, produce un gel más claro que el Agar y

con ello permite detectar más fácil cualquier contaminación microbiana.

2.3.1.2.1 Etapa de elongación

Muchos estudios en la propagación in vitro por organogénesis en el género Pinus

mencionan el desarrollo de esta etapa dentro del proceso y es que para lograr la

iniciación y crecimiento de brotes vigorosos para enraizar y aclimatizar existen tres

pasos necesarios:

a) Estimular de la división celular.

b) Desarrollar los brotes.

c) Lograr el crecimiento de los brotes.

Esta tricotomía es necesaria mencionarla dado que los tratamientos que estimulan

la división celular son antagonistas con los que provocan el crecimiento y

desarrollo. Lo mismo sucede durante el enraizamiento; aquí también los

tratamientos que estimulan la división celular en la base de los tallos son opuestos

a los que producen el crecimiento de las raíces in vitro (Amerson et al., 1982).

Existen varios factores que tienen un papel determinante en esta etapa:

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• Tipo de explante inicial

Con respecto al tamaño de brote que se utiliza para iniciar la etapa de elongación,

Coke (1996); Frampton et al. (1998) y Mathur et al. (2001) coinciden en que es

necesario partir de brotes que tengan un tamaño mayor a 0,5 cm. Otros autores en

trabajos más recientes sugieren utilizar brotes mayores de 2,0 cm para iniciar la

etapa de elongación (Prehn et al., 2003; Zhang et al., 2006); y esto permitirá la

obtención de brotes con mayor desarrollo en longitud para enraizar, en menor

tiempo.

Mathur et al. (2001) explican que cultivar grupos de brotes en lugar de brotes

individuales actúa en detrimento del desarrollo en longitud de los brotes.

• Tipos y concentración de nutrientes inorgánicos

Según Gamborg et al. (1976) el medio de cultivo basal es uno de los factores más

importantes que determinan el éxito del cultivo in vitro. Muchos de los medios de

cultivo utilizados en Pinus spp., han sido creados para otras especies, incluso

angiospermas, como el MS (Murashige y Skoog, 1962), el SH (Schenk y

Hildebrandt, 1972), el DCR (Gupta y Durzan, 1985) y el LP (Aitken Christie et al.,

1986). También se han utilizado esos medios de cultivo basales con distintas

concentraciones de nutrientes; y a partir de experimentos se han seleccionado los

medios de cultivo que mejores respuestas han dado. En la actualidad, uno de los

medios de cultivo basales más utilizado en pino es el Westvaco (WV5) descrito por

Coke (1996), con buenos resultados en el cultivo de tejidos in vitro, con una mejor

combinación de nutrientes inorgánicos, apropiada fuente de carbohidratos,

reguladores de crecimiento y carbón activado.

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• Reguladores del crecimiento

No es común encontrarlos en el medio de elongación; sin embargo, Tang et al.

(1998) suplementa el medio de cultivo con 0.5 mg.L-1 de ácido 3-indolbutírico (AIB)

y 1 mg.L-1 de ácido giberélico (AG3) obteniendo en seis semanas brotes de Pinus

taeda de 1,0 cm para enraizar in vitro. Con estos brotes obtuvo el 46% de

enraizamiento. La adición de auxinas al medio de elongación podría generar un

brote con mayor potencial de enraizamiento en la siguiente fase por inducir la

formación de raíces adventicias; además junto con el AG3 podría favorecer la

elongación de brotes ya que actúan en el alargamiento celular.

2.3.1.3 Fase de enraizamiento

• Enraizamiento in vitro

El enraizamiento de brotes de gimnospermas en condiciones in vitro, es

ampliamente reconocido como difícil de lograr (Nandwani et al., 2001;

Schestibratov et al., 2003; Parasharami et al., 2003; Prehn et al., 2003; Zhang et

al., 2006). Es un proceso lento; debido a que los brotes de la mayoría de las

coníferas, especialmente Pinus spp. enraízan a partir de un callo o tejido cicatricial

o directamente del tejido vascular, después de un tratamiento con auxinas.

El enraizamiento directo pocas veces se produce espontáneamente (Stojicic y

Budimir, 2004). Las raíces se generan siempre a partir de tejido meristemático, ya

sea por fuera de los conductos resiníferos en el enraizamiento directo, o por el

tejido meristemático que rodea el callo, en el indirecto. El cultivo in vitro no impide

la iniciación radicular en coníferas; los tratamientos con auxinas usualmente tienen

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un efecto positivo en el enraizamiento; es más rápido, más sincronizado y resulta

en más raíces por brote; pero la elongación radicular es severamente inhibida.

Algunos autores afirman que el desarrollo de raíces in vitro usualmente aumenta la

supervivencia al transplante dado que las raíces funcionales generan un balance

hídrico favorable. Estas raíces compensarían la pérdida de agua causada por

estomas no funcionales, y facilitarían la absorción de nutrientes. Una buena

respuesta y un aumento en la masa seca de estas plantas enraizadas in vitro

pueden favorecer una mejor toma de nutrientes. Sin embargo la presencia de raíces

durante el cultivo in vitro no siempre mejoraría el éxito al trasplante (Seelye et al.,

2003).

• Enraizamiento ex vitro

Un rápido enraizamiento mejoraría la calidad de las plantas, incluso es probable

que las plantas con un buen sistema radicular y una vigorosa conexión vascular

tengan una mayor tasa de crecimiento inicial en la fase de aclimatización. La

mayor parte de la bibliografía consultada cita el enraizamiento ex vitro de estacas

de Pinus taeda vía macropropagación, con distintos porcentajes de éxito en

función de la técnica empleada. Todos los trabajos mencionan la aplicación de un

tratamiento inductivo corto con auxinas en distintas concentraciones. Es importante

mencionar que entre los factores que podrían afectar el enraizamiento se

encuentran los siguientes:

• Tipo y concentración de la auxina

Durante estudios realizados para la formación de raíces in vitro, se demostró que

es fuertemente dependiente del tipo de auxina utilizada y su concentración. Varias

combinaciones, concentraciones y duración de tratamientos con auxinas han sido

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probadas con diferentes porcentajes de éxito. Las auxinas más utilizadas son el

AIB y el ANA para las distintas especies del género Pinus spp. (Kalia et al., 2007).

En los trabajos que utilizan ANA, las concentraciones oscilan desde 0,1 a 20 mg.L-1

desde minutos hasta varias horas (Nandwani et al., 2001) o tratamientos continuos

con concentraciones desde 0,01 mg.L-1 a 0,5 mg.L-1 de ANA pero generalmente

combinado con AIB en concentraciones de 1,0 a 20 mg.L-1 (Schestibratov et al.,

2003; Prehn et al., 2003), aunque son numerosos los trabajos que utilizan

solamente AIB para obtener mejores resultados en concentraciones que varían de

0,1 a 1000 mg.L-1 (Tang y Ouyang, 2000; Parasharami et al., 2003; Zhang et al.,

2006).

El ácido 3-indolacético (AIA) es la auxina menos potente siendo necesaria su

adición en concentraciones superiores a 5,0 mg.L-1, debiéndose su baja actividad a

la degradación que la luz produce de la misma.

Los resultados son variables, y mayormente se refieren a enraizamiento in vitro

con pulsos de auxinas seguidos de un periodo de elongación de raíces in vitro sin

reguladores, logrando porcentajes de supervivencia entre 0,0 y 90% en función del

tratamiento y la especie. Se observa en muchos de estos trabajos que los

porcentajes de enraizamiento pueden ser muy bajos o casi nulos si no se encuentra

la concentración óptima del regulador de crecimiento para la especie o variedad con

que se trabaja.

• Formas de aplicación de la auxina

Al comparar tratamientos de enraizamiento por pulsos o continuos, debe medirse

no solo el porcentaje de enraizamiento sino también el tiempo requerido para

enraizar. Los resultados con exposición continua varían entre 20% y 47% de

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enraizamiento en 12 semanas en un medio de cultivo con la mitad de los nutrientes

inorgánicos GD o DCR con 0,1 mg.L-1 de 6-BAP y 0,1 mg.L-1 de ANA o 2,0 mg.L-1

de AIB. En contraste, un tratamiento en forma de pulso con el mismo medio de

cultivo con 0,1 mg.L-1 de 6-BAP y 0,5 mg.L-1 de ANA durante seis a trece días

hasta el subcultivo en un medio de cultivo sin reguladores del crecimiento, produjo

un 85% de enraizamiento. El enraizamiento posterior a un pulso se completa en

cinco o seis semanas, por lo que el proceso completo requiere entre seis y ocho

semanas. En general los tratamientos por pulso brindan un mayor porcentaje de

enraizamiento en un período más corto de tiempo (Mathur et al., 2001).

Tratamientos cortos (10-30 minutos) con altas concentraciones de AIB (200 mg.L-1)

han sido suficientes para inducir la formación de raíces. La respuesta declina

rápidamente con un tiempo de exposición más prolongado a la mencionada

concentración, causando daños a los tejidos e inhibiendo el enraizamiento.

Una incubación prolongada en un medio de cultivo rico en auxinas puede causar

una callosidad excesiva, iniciación radicular retardada o una inhibición de la

elongación de las raíces iniciadas (Selby et al., 1991).

• Número de subcultivos

Se ha demostrado que la formación de raíces puede declinar con los subcultivos

sucesivos que han sufrido los brotes antes de su enraizamiento. Sin embargo, la

formación de raíces adventicias sería mas difícil de lograr de tejidos maduros que

de tejidos juveniles; y las condiciones in vitro probadas para diferentes especies

leñosas serían mas favorables para enraizar brotes maduros que las condiciones

ex vitro. Esto se debe a la posibilidad de rejuvenecer el tejido maduro a través de

sucesivos subcultivos en medios de cultivo apropiados, que inducen

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progresivamente a un aumento del potencial de formación de raíces adventicias

(Parasharami et al., 2003).

• Tipo de brote

Manteniendo todos los parámetros iguales, el tamaño del brote tiene una marcada

influencia en el enraizamiento. Los brotes mas largos enraízan mejor que los

brotes cortos, por lo que se recomiendan los mayores a 1,5 cm para enraizar. Sin

embargo, Coke (1996) demuestra que para realizar el enraizamiento ex vitro, son

necesarios brotes de longitud mayor a 4,0 cm, es decir, de mayor tamaño que el

requerido para enraizar en laboratorio.

• Concentración de las sales

Las etapas de inducción y crecimiento radicular se realizan, según la bibliografía,

en medios de cultivo con la concentración de nutrientes inorgánicos reducidos a la

mitad y cuando las raíces alcanzan los 0,5 cm de longitud ya están preparadas

para su trasplante a la fase de aclimatización (Mathur et al., 2001; Nandwani et al.,

2001; Parasharami et al., 2003).

• Influencia de la sacarosa

En las plantas, los carbohidratos tienen varias funciones esenciales. Ellos

constituyen sustratos para la respiración, juegan un importante papel en la vía de

síntesis de muchos compuestos, son elementos básicos de las macromoléculas y

controlan además, otros muchos procesos relacionados con el desarrollo de las

plantas (Gibson, 2000; Smeekens, 2000).

La sacarosa probablemente ha sido la fuente de carbohidratos más utilizada en el

cultivo in vitro de tejidos vegetales y numerosos estudios la han señalado como la

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fuente de carbono óptima (Alkhateeb, 2001). No obstante, no se debe olvidar que

existen enzimas invertasas que son liberadas al medio de cultivo por las plantas

cultivadas in vitro y que actúan en la hidrólisis de la sacarosa dando lugar a la

glucosa y la fructosa (Thorpe et al., 2008), con lo cual, es importante tener en

cuenta que las plantas in vitro dispondrán para su desarrollo no sólo de la

sacarosa, sino también de sus dos monosacáridos constituyentes.

Se conoce que los azúcares intervienen en diferentes procesos morfogenéticos,

una de las funciones más interesante se ha descrito en el desarrollo de las semillas

(Calamar y De Klerk, 2002). Otros estudios han demostrado que la glucosa se ha

asociado con la división celular y la sacarosa con la acumulación de sustancias de

reservas (Weber et al., 1998) y la inducción de la floración (Hong et al., 2006).

La capacidad de las plantas para metabolizar los diferentes tipos de carbohidratos

es diferente (Alkhateeb, 2008). Se ha descrito por algunos investigadores, que la

respuesta in vitro de los cultivos a diferentes tipos y concentraciones de

carbohidratos parece ser, en cierta medida, genotipo dependiente (Cuenca y

Vieitez, 2000) y se han realizado estudios para definir estas posibles

dependencias.

Se conoce que las altas concentraciones de sacarosa (>6.0%) en el medio de

cultivo han sido capaz de reducir la capacidad fotosintética de las plantas (Arigita

et al., 2002). También se ha descrito que estas altas concentraciones pueden

reprimir la expresión de genes y reducir el contenido de clorofila, afectar el Ciclo de

Calvin, así como reducir la actividad Rubisco y la concentración de Rubisco, lo que

conlleva a bajas tasas fotosintéticas (Premkumar et al., 2002; Sinha et al., 2002).

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Diferentes estudios han demostrado que existen efectos opuestos al aplicar

sacarosa al medio de cultivo ya que en algunos casos hay una respuesta favorable

y en otros se produce una inhibición del crecimiento (Van et al., 2001). A pesar de

que se ha examinado el efecto regulador de los azúcares, en particular, el papel de

la sacarosa en el desarrollo de la latencia, en la formación de órganos de

almacenamiento y la maduración de embriones somáticos, su papel como

molécula reguladora aun no ha sido totalmente dilucidado (Calamar y De Klerk,

2002).

Con relación a la acción de la sacarosa en la formación de órganos adventicios se

han realizado pocos estudios (Calamar y De Klerk, 2002). Según Warren et al.

(1994) la sacarosa incrementó la regeneración de tejido vascular en Lactuca sativa

(Lechuga), mientras que, en Malus domestica (Manzano), Pawlicki y Welander,

(1995) demostraron que el tipo de azúcar influyó en la formación de raíces.

Varios han sido los estudios encaminados a comprender mejor la respuesta de

diferentes especies coníferas para formar raíces in vitro. La adición al medio de

cultivo de auxinas, por lo general, en forma de AIB o ANA, ha sido una práctica

general para inducir la formación de raíces in vitro en coníferas (Niemi et al., 2002).

Sin embargo, se conoce que el éxito final de esta fase del proceso de propagación

in vitro, no solo depende de la adición al medio de cultivo de determinadas

concentraciones de auxinas. Por ejemplo, es importante tener en cuenta el efecto

que pueden ejercer las altas concentraciones de citoquininas (0.5-10 mg.L-1)

empleadas durante la fase de multiplicación, pues pueden inhibir o retrazar la

formación de raíces y también limitar los efectos estimuladores de las auxinas en

esta fase del proceso (Ben-Jaacov et al., 1991).

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En ocasiones, ha sido necesario realizar más de un subcultivo en medio de cultivo

libre de citoquininas, hasta que las concentraciones endógenas de este regulador

del crecimiento se han reducido lo suficiente en el tejido de la planta (van Staden et

al., 2008).

Otro elemento que se ha demostrado que es importante evaluar, está relacionado

con la influencia de la concentración de sacarosa, pues influye en la calidad

funcional de las plantas cuando estas son transferidas a condiciones ex vitro para

su aclimatización (Fuentes et al., 2005).

Se conoce que los carbohidratos juegan un papel importante en el cultivo in vitro

como fuentes de energía y carbono, así como agentes osmóticos, pero también,

están vinculados con la diferenciación de los elementos del xilema y floema

(Thorpe et al., 2008).

Ha sido descrito que al aumentar la concentración de sacarosa en el medio de

cultivo se incrementa el porcentaje de materia seca en las plantas (Kubota et al.,

2002; Shim et al., 2003). Lo anterior se debe, a que al aumentar el contenido de

sacarosa, el potencial osmótico del medio de cultivo disminuye (Cárdenas y

Villegas, 2002), se limita la absorción de agua, pero se favorece la asimilación de

sacarosa y con ello el incremento de materia seca.

Este incremento en el porcentaje de materia seca, está asociado al desarrollo de

los tejidos vasculares de las plantas, en particular con el proceso de lignificación.

2.3.1.4 Fase de aclimatización

Manipulando el ambiente in vitro las hojas, con mayor resistencia al estrés hídrico y

competentes fotosintéticos, pueden desarrollarse en el laboratorio, en una

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preaclimatización, preparando las plantas para la transferencia fuera del

laboratorio. Las raíces formadas in vitro pueden favorecer el crecimiento inicial ex

vitro; aunque la tasa de crecimiento óptima no ocurrirá hasta que las nuevas hojas

y raíces se desarrollen en el ambiente ex vitro (Seelye et al., 2003).

La aclimatización induce cambios morfológicos, anatómicos y fisiológicos que

hacen a la planta parecerse a una planta normal. Esta etapa es casi siempre

estresante y suele asociarse a la muerte de las plantas, generalmente por fuerte

deshidratación. En angiospermas la principal causa de muerte al transferir las

plantas a condiciones no estériles es la cutícula reducida y una pobre regulación

estomática ante la perdida de agua. Sin embargo, en algunas gimnospermas como

el género Pinus la regulación cuticular y estomática ante la pérdida de agua es

relativamente normal.

De esto se desprende que son otros los factores que producen la muerte de las

gimnospermas durante la fase de aclimatización. Se le ha prestado atención a la

morfología, anatomía interna y fisiología de las plantas obtenidas in vitro,

concluyendo que para lograr el éxito en la supervivencia y el crecimiento hay

características a tener en cuenta, como la longitud del brote; la calidad de los

brotes y la morfología del sistema radicular. Lo interesante es determinar la

morfología de plántula óptima y su relación con la supervivencia y crecimiento.

Para Pinus taeda, la calidad del brote es mucho más importante en la

supervivencia, que el número de raíces. En P. caribaea var. hondurensis x P.

tecunumanii, Haines et al. (2000), encontraron que porcentaje de enraizamiento y

número de raíces por planta estuvo relacionado con el genotipo; mientras que,

dentro de los parámetros morfológicos, la longitud de acículas primarias fue el

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mejor indicador. Estos autores concluyeron, que los brotes con mayor

enraizamiento, fueron aquellos que presentaron acículas primarias mayores a 2,5

cm de longitud, con el ápice activo y un diámetro basal mayor a 0,1 cm.

Existe poca información en relación al crecimiento en suelo de plántulas de

coníferas originadas in vitro, dado que muy pocas especies tuvieron éxito en este

sentido.

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Materiales y Métodos ________________________________________________________________________________________


3. MATERIALES Y MÉTODOS

El presente trabajo se desarrolló en el Instituto de Biotecnología de las Plantas de

la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas entre los años 2008 y 2010.

3.1 Fase de establecimiento

Condiciones generales

Brotes de P. caribaea var. caribaea con aproximadamente 3,0 cm de longitud

fueron cortados en horas tempranas de la mañana y se colocaron en 200 mL de

una solución estéril de ácido cítrico con una concentración de 500 mg.L-1. En el

laboratorio, los brotes fueron lavados con detergente comercial (2,0 g.L-1) y agua

común, el enjuague se realizó también con una solución de ácido cítrico similar a la

descrita anteriormente. Como agente desinfectante se empleó el Hipoclorito de

sodio al 2,0% y los brotes se expusieron a su acción durante 20 minutos en un

agitador orbital a una velocidad constante de 180 rpm.

Trascurrido este tiempo, se realizaron en una cabina de flujo laminar tres

enjuagues con la solución de ácido cítrico y antes de ser colocados los brotes en

contacto con el medio de cultivo en los tubos de ensayo, se eliminó la parte de la

base que se afectó por la acción del Hipoclorito de sodio.

El medio de cultivo basal estuvo compuesto por los nutrientes inorgánicos

propuestos por Coke (1996), los cuales se conocen comercialmente como

Westvaco (WV5) según la presentación comercial del catalogo Duchefa (2008),

este medio de cultivo también incluyó en su formulación inicial 1,0 g.L-1 de mio-

inositol y 0,4 mg.L-1 de tiamina y le fueron adicionados 0,6 mg.L-1 de tiamina para

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completar a 1,0 mg.L-1 la concentración de este compuesto, 1,0 g.L-1 de L-

glutamina, 3,0 g.L-1 de carbón activado, 20 g.L-1 de sacarosa y 2,5 g.L-1 de Gelrite

con pH ajustado a 5,8 antes del proceso de esterilización.

Se dosificaron 10 mL de medio de cultivo por tubo de ensayo y se esterilizaron

durante 15 minutos en autoclave a 1,2 kg.cm-2 de presión y 121°C. Los

experimentos fueron repetidos tres veces en el tiempo. La temperatura de la

cámara de crecimiento fue de 28 ± 2,0°C, con una densidad de flujo de fotones

fotosintéticos que osciló entre 38 y 47,5 µmol.m-2.s-1.

Para el procesamiento estadístico de todos los resultados se empleó el Statistical

Package for the Social Sciences (SPSS) para Windows versión 18.0. En cada

experimento se especificó el tipo de análisis y las pruebas aplicadas.

3.1.1 Selección del tipo de brote

Con el objetivo de lograr el establecimiento in vitro de P. caribaea var. caribaea, se

evaluó la respuesta in vitro de cuatro tipos de brotes que fueron cortados de las

plantas donantes con diferentes tiempos (días) de brotados, los cuales presentaron

diferentes características morfológicas (Figura 2).

El brote tipo (A) se caracterizó por tener un color verde más intenso, mayor número

de acículas y una menor distancia de inserción al tallo entre las acículas (Figura 2).

Los brotes tipo (A1) y (A2) tenían el mismo origen que el tipo (A), pero con 28 y 35

días de brotados en la planta donante, mientras que, el brote tipo (B) en

comparación con los anteriores, presentó un color verde menos intenso, un menor

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número de acículas en igual longitud del tallo y por consiguiente una mayor

separación entre las acículas.

Figura 2. Características morfológicas de los diferentes tipos de brotes de P. caribaea var. caribaea utilizados como material vegetal de partida para el establecimiento in vitro de esta variedad.

En este experimento, se colocaron 30 brotes por tratamiento y al medio de cultivo

basal descrito anteriormente se le adicionaron 4,44 µM de 6-BAP, a los 30 días de

cultivo se evaluó, el número de brotes vivos y el número de brotes sin afectaciones

por necrosis.

Por no cumplirse los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza de los

datos se aplicó de Mann Whitney.

3.1.2 Efecto del 6-BAP

Este experimento tuvo como objetivo evaluar la influencia de diferentes

concentraciones de 6-BAP en la respuesta in vitro de los brotes durante la fase de

establecimiento.

Los tratamientos fueron 0,0; 2,22; 4,44; 6,66 y 8,88 µM de 6-BAP y se colocaron un

total de 30 brotes por tratamiento.

((AA)) ((AA11)) ((AA22)) 20 días 28 días 35 días

((BB)) 20 días

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Las evaluaciones se realizaron a los 30 días de cultivo y se determinó la longitud

de los brotes (cm) y el número de brotes desarrollados.

Como brotes desarrollados se consideraron aquellos que presentaron cambio en

su longitud, engrosaron o desarrollaron sus yemas axilares.

Para la comparación de la longitud media de los brotes se realizó un análisis de

varianza simple y se empleó la prueba de Tukey.

El número de brotes desarrollados se expresó en porcentaje y en este caso, para

el procesamiento estadístico de los resultados por no existir normalidad de los

datos se empleó la prueba de Kruskal Wallis y la comparación entre parejas de

grupo se realizó con prueba de Student Newman Keuls (SNK).

3.2 Fase de Multiplicación

Condiciones generales

Como material vegetal para iniciar los estudios en esta fase del proceso, se

emplearon plantas con 30 días de establecidas in vitro. El medio de cultivo basal

fue similar al descrito para la fase de establecimiento, pero con 30 g.L-1 de

sacarosa, en todos los tratamientos se colocaron 60 plantas y se consideró cada

planta como una réplica.

Se dosificaron 30 mL de medio de cultivo por frasco y se esterilizaron durante 20

minutos en autoclave a 1,2 kg.cm-2 de presión y 121°C. Los experimentos fueron

repetidos tres veces en el tiempo, se colocaron tres plantas por frasco de cultivo y

la temperatura de la cámara de crecimiento fue de 28 ± 2,0°C, con una densidad

de flujo de fotones fotosintéticos que osciló entre 38 y 47,5 µmol.m-2.s-1.

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Este experimento tuvo como objetivo determinar la influencia de diferentes

concentraciones de 6-BAP en la multiplicación in vitro de las plantas. Los

tratamientos fueron 0,0; 2,22; 4,44; 6,66 y 8,88 µM de 6-BAP.

Las evaluaciones se realizaron a los 35 días de cultivo y se determinó en cada

tratamiento, el número de brotes por planta, la longitud de los brotes (cm), la

longitud de la planta principal (cm) y se determinó el coeficiente de multiplicación.

Para la comparación de las medias se realizó un análisis de varianza simple y se

empleó la prueba de Tukey.

3.2.2 Efecto de diferentes agentes gelificantes y su concentración

Con el objetivo de evaluar la incidencia de dos agentes gelificantes y diferentes

concentraciones de estos en el desarrollo y respuesta in vitro de plantas de pino,

se estudiaron tres concentraciones de Gelrite (Duchefa Biochemie) (2,5; 3,0 y 3,5

g.L-1) y tres de Agar E (BIOCEN) (4,3; 4,8 y 5,3 g.L-1).

El medio de cultivo fue similar al utilizado en el acápite anterior y a los 35 días de

cultivo se evaluó en cada tratamiento, el número de plantas con necrosis total y

parcial y se determinó el coeficiente de multiplicación.

Por no existir normalidad de los datos en el caso del número de plantas

necrosadas, se empleó la prueba de Kruskal Wallis. La comparación entre parejas

de grupo, se realizó con la prueba de Student Newman Keuls (SNK).

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3.2.3 Efecto de diferentes concentraciones de Gelrite

Teniendo en cuenta que el costo por litro del Gelrite es menor al del Agar, que se

emplea en menor concentración y que además produce un gel más claro y con ello

permite detectar más fácil la contaminación microbiana. El siguiente experimento

tuvo como objetivo evaluar el efecto de cinco concentraciones de Gelrite en la

respuesta in vitro y desarrollo de las plantas de pino.

El medio de cultivo fue similar al empleado en el acápite anterior y los tratamientos

fueron 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 y 4,5 g.L-1. Después de 35 días de cultivo se evaluó en

cada tratamiento, el número de plantas con necrosis total y parcial, la masa fresca

y seca de 30 plantas por tratamiento y se determinó además el coeficiente de

multiplicación.

Por no existir normalidad de los datos en el caso de los porcentajes de materia

seca, se empleó la prueba de Kruskal Wallis. La comparación entre parejas de

grupo, se realizó con la prueba de Student Newman Keuls (SNK).

3.2.4 Efecto de la sacarosa

Este experimento tuvo como objetivo, evaluar en el subcultivo previo a la fase de

enraizamiento, la influencia de diferentes concentraciones de sacarosa (30; 40; 50

y 60 g.L-1) en las características morfológicas de las plantas obtenidas en un medio

de cultivo que fue similar al utilizado en el experimento anterior, pero sin

adicionarle 6-BAP y con 3,5 g.L-1 de Gelrite.

Las evaluaciones se realizaron a los 35 días de cultivo y se determinó en cada

tratamiento, el número de plantas que por sus características morfológicas podían

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ser subcultivadas a la fase de enraizamiento, el número de nuevos brotes que por

su desarrollo en longitud y grosor del tallo, no debían ser transferidos a la fase de

enraizamiento y se determinó el porcentaje de materia seca de 30 plantas.

Para el procesamiento estadístico de los resultados, por no existir normalidad de

los datos se empleó la prueba de Kruskal Wallis. La comparación entre parejas de

grupo, se realizó con la prueba de Student Newman Keuls (SNK).

3.3 Fase de enraizamiento

3.3.1 Efecto de diferentes concentraciones de AIB

Con el objetivo de lograr la formación de raíces in vitro, se obtuvieron plantas con

30 y 60 g.L-1 de sacarosa en un medio de cultivo similar al descrito para el

experimento anterior y a los 35 días de cultivo, antes de realizar el subcultivo a la

fase de enraizamiento, se evaluó la longitud de las plantas y se determinó el

porcentaje de materia seca de 30 plantas obtenidas con cada concentración de

sacarosa.

Para analizar los porcentajes de materia seca se realizó un análisis de varianza

simple, por cumplirse con los supuestos de normalidad y homogeneidad de los

datos.

El resto de las plantas se subcultivaron a un medio de cultivo de enraizamiento

compuesto por los nutrientes inorgánicos WV5 a los cuales le fueron adicionados

0,6 mg.L-1 de tiamina para completar a 1,0 mg.L-1 la concentración de este

compuesto, 1,0 g.L-1 de L-glutamina, 3,0 g.L-1 de carbón activado, 30 g.L-1 de

sacarosa y 3,5 g.L-1 de Gelrite con pH ajustado a 5,8 antes de realizar el proceso

de esterilización.

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Los tratamientos de AIB estudiados fueron: 0,0; 4,90; 9,80; 14,70 µM y después de

30 días de cultivo, se evaluó para cada tratamiento, el número de plantas con

raíces, el número de raíces por planta, la longitud de las raíces y la longitud de las

plantas.

En el caso de la longitud de las plantas, por existir normalidad, pero no

homogeneidad de los datos, se aplicó la prueba de comparación de medias C de

Dunnett.

3.3.2 Efecto de la concentración de nutrientes inorgánicos

Este experimento tuvo como objetivo, determinar la influencia de dos

concentraciones de nutrientes inorgánicos (50 y 100% de WV5) en la respuesta in

vitro de las plantas en la fase de enraizamiento. Al igual que en el experimento

anterior, como material vegetal se emplearon plantas obtenidas in vitro con dos

concentraciones de sacarosa (30 y 60 g.L-1) en el subcultivo previo. En el caso del

tratamiento con 50% de WV5, fue necesario adicionar 500 mg.L-1 de mio-inositol y

0,8 mg.L-1 de tiamina para completar a 1,0 g.L-1 y 1,0 mg.L-1 respectivamente la

concentración de ambos compuestos. De esta forma, ambos tratamientos, solo

presentaron diferencias en la concentración de los nutrientes inorgánicos.

Después de 30 días de cultivo se evaluó en cada tratamiento, el número de plantas

con raíces, el número de raíces por planta, la longitud de las raíces, la presencia

de lignina a partir de visualizar las deposiciones de este compuesto en las paredes

celulares, así como la cuantificación del contenido de lignina en las bases de

segmentos de tallos (1,0 cm de longitud) de 18 plantas seleccionadas al azar.

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Para evaluar las deposiciones de lignina, se efectuaron cortes de secciones del

tallo de una misma planta en la base del tallo, aproximadamente a 0,5 cm de la

base y a 1,0 cm de la base. Estas secciones fueron teñidas con una solución de

Fluoroglucina al 1,0% (p/v) en etanol al 70%, durante 5,0 min. Según la técnica

descrita por Southerton y Deverall, (1990). Se adicionaron dos gotas de ácido

clorhídrico (HCl) concentrado a cada sección del tallo y después de un minuto se

enjuagaron y se les colocó un cubreobjeto para ser observadas con un microscopio

Olympus (400x). Ante la presencia de lignina se observaron áreas de color

rojo/rosado según fue descrito por Gahan (1984). Las observaciones fueron

fotografiadas inmediatamente.

Para evaluar el contenido de lignina, se utilizó el protocolo descrito por Kirk y Obst,

(1988). Este protocolo consistió en procesar las muestras inmediatamente después

de colectadas y homogenizarlas al macerarlas en un mortero y pistilo preenfriados

utilizando nitrógeno líquido. Después de ser extraídas cuatro veces en metanol, las

muestras fueron secadas en campana. Se tomaron 200 mg y se hidrolizaron en 4,0

mL de H2SO4 al 72% (v/v) a una temperatura de 30°C durante 1,0 h. El hidrolizado

fue diluido en 112 mL de agua y mantenido en autoclave durante 1,0 h a 121°C. La

solución final se dejó sedimentar, luego se retiró el mayor contenido posible de

agua con ayuda de una micropipeta de 5,0 mL sin extraer sedimento, las muestras

fueron secadas en una estufa a 60°C durante ocho horas y el residuo sólido se

pesó. El contenido de lignina se expresó como porcentaje de residuos de la pared

celular respecto al peso inicial (200 mg). Por no cumplirse los supuestos de

normalidad y homogeneidad de los datos, estos se procesaron directamente al

aplicar la prueba de Mann Whitney, después de haber generado hasta 10 000

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muestras con distribución similar a la real mediante técnicas de Monte Carlo, para

estimar de esta forma la significación con el 99,0% de confianza.

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Resultados y Discusión _________________________________________________________________________________________


4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Fase de establecimiento

4.1.1 Selección del tipo de brote

Los mejores resultados después de 30 días de cultivo se lograron con los brotes

clasificados como tipo (B), con el mayor porcentaje de supervivencia y el mayor

porcentaje de brotes sin afectaciones por necrosis (Figura 3).

55,6b

60b

88,9 a90 a

0

20

40

60

80

100

Supervivencia Brotes sin necrosisVariables evaluadas

Por

cent

aje

(%)

Tipo (A2)

Tipo (B)

Barras con letras distintas para una misma variable difieren significativamente

para p<0,05 según la prueba de Mann Whitney. (n=30)

Figura 3. Respuesta in vitro de dos tipos de brote de P. caribaea var. caribaea a los 30 días de cultivo en la fase de establecimiento.

Los brotes clasificados como tipo (A) y (A1), cortados de las plantas donantes con 20 y

28 días de brotados respectivamente, a los pocos días de colocados en contacto con el

medio de cultivo, comenzaron a presentar afectaciones por necrosis, estas afectaciones

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se incrementaron paulatinamente hasta observarse una necrosis total en estos dos

tipos de brotes (Figura 4).

Figura 4. Manifestación de las afectaciones por necrosis que se presentó en los brotes de P. caribaea var. caribaea clasificados como tipo (A) y A(1) durante la fase de establecimiento in vitro.

Sin embargo, el brote tipo (A2), de similar origen que los anteriores (A y A1), pero

cortado de las plantas donantes a los 35 días de brotado, tuvo una mejor respuesta

durante la fase de establecimiento (Figura 3).

Esta respuesta diferente, pudo estar relacionada con el grado de desarrollo y las

características morfológicas que presentaron estos brotes (tipo A2), pues a pesar de

tener el mismo origen, el hecho de ser cortados con diferentes tiempos de brotados,

hizo que presentaran diferencias en su desarrollo.

A partir de este resultado, los brotes tipo (A) y tipo (B) se dejaron crecer en las plantas

donantes en la casa de cultivo y se observó que después de 90 días, los brotes tipo (A)

presentaron crecimiento plagiotrópico, es decir, crecimiento horizontal, típico de una

rama de un árbol de pino. Mientra que, los brotes tipo (B) presentaron crecimiento

ortotrópico, es decir, crecimiento vertical, típico de un brote apical que se convertirá en

el tallo principal.

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Las coníferas son plantas que se caracterizan por presentar tanto crecimiento

plagiotrópico como ortotrópico (Carneros, 2009) este autor planteó que si se obtienen

plantas a partir de yemas que dan lugar a ramas con crecimiento plagiotrópico, estas

plantas pueden demorar hasta dos años en recuperar la condición de crecimiento

ortotrópico y eso afectaría el normal desarrollo de las plantaciones en campo.

Según Korban y Sul (2007), en algunas especies de coníferas las plantas obtenidas de

semillas pueden servir como plantas madres en casas de cultivo y ser fuentes de

material vegetal, si se mantienen y crecen bien, ya que proporcionan gran cantidad de

nuevos brotes como material vegetal para establecer in vitro.

En varias especies e híbridos del género Larix, un árbol conífero que se caracteriza por

su rápido crecimiento, Ewald (2007) empleó plantas de semilleros para obtener los

brotes que finalmente estableció in vitro.

Establecer brotes apicales de P. caribaea var. caribaea a partir de plantas obtenidas de

semillas, permitirá mantener la diversidad biológica fruto de muchos de años de

evolución, moldeada por los procesos naturales y cada vez más, por la influencia del

ser humano.

A partir de estos resultados, se decidió solo establecer in vitro brotes apicales que a los

20 días de brotados de las plantas donantes en la casa de cultivo, presentaron

características morfológicas similares a las descritas en el acápite 3.1.1 para el brote

tipo (B).


Después de 30 días de cultivo, el mejor resultado en cuanto al desarrollo en longitud de

los brotes se alcanzó en los tratamientos con 6,66 y 8,88 µM de 6-BAP (Figura 5).

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2,33bc

2,26cd

2,15d

2,58a 2,44

ab

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Concentraciones de 6-BAP (uM)

Long

itud

(cm

)

0,0 2,22 4,44 6,66 8,88

Barras con letras distintas difieren significativamente

para p<0,05 según la prueba de Tukey. (n=30)

Figura. 5 Longitud promedio (cm) de los brotes de P. caribaea var. caribaea establecidos in vitro después de 30 días de cultivo con diferentes concentraciones de 6-BAP en el medio de cultivo.

Durante la fase de establecimiento, independientemente de la concentración de 6-BAP,

no se observó la brotación de yemas axilares. Sin embargo, fue en el tratamiento con

6.66 µM de 6-BAP donde se obtuvo el mayor porcentaje de brotes con yemas axilares

desarrolladas (Figura 6).

Entre los reguladores del crecimiento en plantas, las citoquininas han sido las que

mejores respuestas han permitido obtener durante la fase de establecimiento in vitro de

muchas especies vegetales (Kumar et al., 2005). Estos autores, estudiaron el efecto de

varias citoquininas en el establecimiento in vitro de brotes de Holarrhena

antidysenterica y las mejores respuestas las lograron cuando emplearon 6-BAP como

regulador del crecimiento. Al evaluar además, el efecto de diferentes concentraciones

de 6-BAP comprobaron que al igual que en muchas otras especies, las respuestas in

vitro para la mayoría de las variables evaluadas dependieron de las concentraciones

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estudiadas. En la figura 7 se pueden observar brotes apicales tipo (B) después de 30

días de cultivo en la fase de establecimiento in vitro con yemas axilares desarrolladas,

respuesta importante para el posterior desarrollo de nuevos brotes durante la fase de

multiplicación.

46,6b

23,3c

50b

70a

46,6b

01020304050607080

Concentraciones de 6-BAP (uM)

Bro

tes

con

yem

as

desa

rrol

lada

s (%

)

0,0 2,22 4,44 6,66 8,88


para p<0,05 según la prueba de SNK. (n=30)

Figura 6. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP en el porcentaje de brotes de P. caribaea var. caribaea que presentaron yemas axilares desarrolladas después de 30 días de cultivo en la fase de establecimiento in vitro.

Figura 7. Brotes de P. caribaea var. caribaea después de 30 días de cultivo en la fase de establecimiento in vitro con una concentración de 6,66 µM de 6-BAP, obsérvese la presencia de yemas axilares desarrolladas.

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En el presente estudio, permitió definir las características morfológicas que deben tener

los brotes apicales de P. caribaea var. caribaea obtenidos a partir de plantas donantes

producidas por semillas, para ser establecidos in vitro y además, se determinó la

concentración de 6-BAP que permitió un mejor desarrollo in vitro de estos brotes.

4.2 Fase de Multiplicación


Al evaluar la respuesta in vitro de las plantas cultivadas bajo la acción de diferentes

concentraciones de 6-BAP en el medio de cultivo, se determinó, que al igual que en la

fase de establecimiento in vitro, con 6,66 µM de este regulador del crecimiento se

lograron los mejores resultados, en este caso, en cuanto al mayor número y longitud

promedio de brotes por planta (Tabla 1). Estos resultados, también permitieron obtener

con esa concentración (6,66 µM) el mejor coeficiente de multiplicación (Figura 8).

Tabla 1. Respuesta in vitro de brotes de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación en presencia de diferentes concentraciones de 6-BAP en el medio de cultivo.

Tratamientos (µM de 6-BAP)

Longitud promedio planta principal (cm)

No. promedio de brotes por planta

Longitud promedio brotes por planta(cm)

0,00 6,4 a 2,25 e 1,1 d 2,22 6,2 a 3,00 d 1,3 d 4,44 5,7 b 4,50 c 1,9 c 6,66 5,1 c 6,75 a 2,7 a 8,88 5,4 bc 5,25 b 2,2 b

Medias identificadas con letras distintas en una misma columna difieren significativamente para p<0,05 según la prueba de Tukey. (n=60)

Como se puede observar en la tabla 1, con 6,66 µM de 6-BAP se logró la menor

longitud promedio de la planta principal. Desde el punto de vista fisiológico, esta

respuesta puede estar relacionada con la reducción de la dominancia apical que según

van Staden et al. (2008), se produce al adicionar determinadas concentraciones de

citoquininas al medio de cultivo.

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1,181,35

1,832,03

2,38

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Concentraciones de 6-BAP

Coe

ficie

nte

de

0,0 2,22 4,44 6,66 8,88

Figura 8. Coeficiente de multiplicación de plantas in vitro de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación con diferentes concentración de 6.BAP.

Esta concentración de 6,66 µM de 6-BAP, también estimuló el desarrollo de un mayor

número de yemas axilares (Figura 9B) y en consecuencia los nutrientes asimilados

fueron empleados para el desarrollo de toda la planta, incluyendo los nuevos brotes, lo

cual pudo influir en el desarrollo en longitud de la planta principal.

Figura 9. Desarrollo in vitro de las plantas de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación. A) Con 4,44 µM de 6-BAP, B) Con 6,66 µM de 6-BAP, C) Con 8,88 µM de 6-BAP.

Las citoquininas son reguladores del crecimiento muy eficaces para estimular la

iniciación directa o indirecta de brotes in vitro (van Staden et al., 2008). Según estos

autores, sus efectos en el cultivo de tejidos y órganos pueden variar de acuerdo al tipo

de citoquinina, la concentración empleada en el medio de cultivo, si el material vegetal a

CA B

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establecer in vitro se obtiene de tejido juvenil o tejido adulto, puede variar además en

función de la especie vegetal y del método empleado para la regeneración de plantas.

Según van Staden et al. (2008), cuando se utilizan altas concentraciones de

citoquininas en la fase de multiplicación, los brotes que se producen reducen su

desarrollo en longitud. Autores como Kumar et al. (2005), estudiaron el efecto de varias

citoquininas en la multiplicación in vitro de brotes apicales de Holarrhena antidisentérica

y las mejores respuestas las lograron con 6-BAP.

En el presente estudio, las plantas in vitro de pino, tuvieron una respuesta fisiológica

acorde con los resultados obtenidos por otros autores y explicados anteriormente, pues

en función de la concentración de 6-BAP, varió el crecimiento en longitud de la planta

principal, el número de brotes que se produjeron por planta, así como la longitud de

dichos brotes. Por todos los resultados descritos anteriormente, se seleccionó la

concentración de 6,66 µM de 6-BAP como la concentración que mejores resultados

permitió obtener en la multiplicación in vitro de plantas de P. caribaea var. caribaea.

4.2.2 Efecto de diferentes agentes gelificantes y su concentración

Se observó que el agente gelificante empleado en el medio de cultivo influyó en la

respuesta in vitro de las plantas de pino, pues independientemente de la concentración,

con Gelrite como agente gelificante se lograron los mejores resultados en cuanto al

coeficiente de multiplicación y el menor número de plantas necrosadas (Tabla 2).

No obstante, al evaluar la respuesta in vitro de las plantas obtenidas con diferentes

tratamientos de Gelrite, se observó que con 3,5 g.L-1 se lograron los mejores resultados

en las variables evaluadas con respecto al resto de los tratamientos y sólo el 6,6% de

las plantas sufrieron afectaciones por necrosis. La respuesta in vitro y desarrollo de las

plantas en el tratamiento con 3,5 g.L-1 de Gelrite, se pueden observar en la figura 10.

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Tabla 2. Respuesta in vitro de brotes de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación cuando se emplearon diferentes tipos y concentraciones de agentes gelificantes.

Gelificante (g.L-1)

No. de plantas necrosadas

Coeficiente Multiplicación

Gelrite (2,5) 9 c 1,87 Gelrite (3,0) 8 c 1,91 Gelrite (3,5) 4 d 2,28 Agar (4,3) 13 b 1,20 Agar (4,8) 23 a 1,08 Agar (5,3) 23 a 0,86

Medias identificadas con letras distintas en una misma columna difieren significativamente para p<0,05 según la prueba de SNK. (n=60)

Figura 10. Desarrollo in vitro de las plantas de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación con diferentes concentraciones de Gelrite, A) 2,5 g.L-1, B) 3,0 g.L-1, C) 3,5 g.L-1. El tratamiento con 2,5 g.L-1 de Gelrite, además de presentar 15% de plantas con

necrosis total, siete plantas presentaron necrosis parcial, lo que representó el 11,6% del

total de plantas evaluadas en el tratamiento.

En el caso de los tratamientos con Agar, con las mayores concentraciones (4,8 y 5,3

g.L-1) se obtuvo un 38,3% de plantas in vitro que presentaron afectación por necrosis,

daño que se inició en la zona apical de la planta (Figura 11) y se extendió

progresivamente hasta provocar la muerte.

A B C

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Figura 11. Evolución de las afectaciones por necrosis que sufrieron las plantas in vitro de P. caribaea var. caribaea en fase de multiplicación con Agar como agente gelificante.

Una determinada concentración de Agar puede ser considerada inadecuada si no

ayuda al desarrollo in vitro de los brotes o si favorece la aparición de plantas con

síntomas de hiperhidricidad. (Thorpe et al., 2008). Estos autores plantearon que la

hiperhidricidad se puede reducir al incrementar la concentración de Agar en el medio de

cultivo, pero este incremento, regularmente está acompañado de una disminución en el

desarrollo y crecimiento de las plantas in vitro.

Resultados similares se obtuvieron en el presente trabajo, pues al incrementarse la

concentración de Agar en el medio de cultivo se produjo un incremento en el número de

brotes necrosados y una disminución en el coeficiente de multiplicación.

Owens y Wozniak (1991) observaron grandes diferencias en el número de brotes

obtenidos in vitro en dependencia del agente gelificante empleado. Ellos encontraron

que la disponibilidad de agua, determinada por el potencial de la matriz de cada gel, fue

el factor que más influyó en ese resultado y demostraron que cuando igualaron los

potenciales de la matriz de los diferentes agentes gelificantes al utilizar diferentes

concentraciones de cada uno ellos (Bacto agar 0,7%, Agarose 0,46%, Phytagar 0,62%

y Gelrite 0,12%), obtuvieron la misma respuesta in vitro.

No obstante, se ha demostrado que existen diferencias en la composición y

características de cada uno de estos compuesto, por ejemplo, el Gelrite como producto

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comercial está libre de impurezas orgánicas que si se encuentran en el Agar (Thorpe et

al., 2008). Según estos autores, el Gelrite tiene entre otras ventajas para la propagación

in vitro de plantas a gran escala, que su costo por litro es menor al del Agar y se emplea

en menor concentración que este, además, produce un gel más claro y con ello permite

detectar más fácil cualquier contaminación microbiana.

4.2.3 Efecto de diferentes concentraciones de Gelrite

Se observó que para el coeficiente de multiplicación los mejores resultados se lograron

en el tratamiento con 4,0 g.L-1 de Gelrite (Figura 12).

1,771,98

2,22

2,87

2,13

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Concentraciones de Gelrite (g.L-1)

Coe

ficie

nte

de m

ultip

licac

ión

2,5 3 3,5 4 4,5

Figura 12. Coeficiente de multiplicación de plantas in vitro de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación con diferentes concentraciones de Gelrite en el medio de cultivo.

También en el tratamiento con 4,0 g.L-1 de Gelrite se obtuvo el menor porcentaje de

materia seca (Figura 13). Sin embargo, al analizar los resultados en su conjunto, se

puede concluir que el contenido de materia seca disminuyó en la medida que se

incrementó coeficiente de multiplicación. Este resultado está relacionado con el hecho

de que el incremento del coeficiente de multiplicación se debe a la presencia de un

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mayor número de nuevos brotes, y por consiguiente menor diferenciación de las

diferentes estructuras de la planta y con ello un menor porcentaje de materia seca.

21,82a

19,86b

14,59d

13,49d

16,53c

0

5

10

15

20

25

Concentraciones de Gelrite (g.L-1)

Mater

ia Sec

a (%)

2,5 3 3,5 4 4,5

Barras con letras distintas difieren significativamente para p<0,05 según la prueba de SNK. (n=30)

Figura 13. Porcentaje de materia seca de plantas de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo en fase de multiplicación con diferentes concentraciones de Gelrite.

Con relación al porcentaje de brotes necrosados, los mayores porcentajes se

produjeron en los tratamientos con 2,5 y 3,0 g.L-1 de Gelrite, con 11,6% y 10,0%

respectivamente. También en el tratamiento con 2,5 g.L-1 de Gelrite, se observaron

otras tres plantas (5,0%) que presentaron necrosis parcial.

A partir de estos resultados, se seleccionó como agente gelificante a emplear en la fase

de multiplicación, el Gelrite, a una concentración de 4,0 g.L-1.

4.2.4 Efecto de la sacarosa.

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Los mejores resultados se alcanzaron al añadir al medio de cultivo con 50 y 60 g.L-1 de

sacarosa, con la menor formación de brotes nuevos, los mayores porcentajes de

plantas para enraizar (Tabla 3) y los mayores porcentajes de materia seca por planta

(Figura 14).

Tabla 3. Respuesta in vitro de P. caribaea var. caribaea después de 35 días de cultivo con diferentes concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo.

Sacarosa (g.L-1)

Plantas para enraizar (%)

Medias de rango

Plantas que no podían ser enraizadas (%)

Medias de rango

30 44,13 21,25 c 55,87 58,80 a 40 56,69 36,05 b 43,31 44,45 b 50 68,18 48,65 a 31,82 32,60 bc 60 75,90 56,05 a 24,10 26,15 c

Porcentajes identificados con letras distintas en una misma columna difieren significativamente para p<0,05 según la prueba de SNK. (n=60)

17.37b

19.45a

14,50c11,93

d

0

5

10

15

20

25

30 40 50 60

Concentraciones de sacarosa (g.L-1)

Mat

eria

sec

a (%

)


para p<0,05 según la prueba de SNK. (n=30)

Figura 14. Porcentaje de materia seca de plantas de P. caribaea var. caribaea obtenidas in vitro después de 35 días de cultivo con diferentes concentraciones de sacarosa.

Con 30 g.L-1 de sacarosa las plantas presentaron mayor formación de nuevos brotes

(Figura 15A), respuesta típica de las plantas en la fase de multiplicación. Al incrementar

la concentración de sacarosa a 40 g.L-1 se observó una disminución en la formación de

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nuevos brotes (Figura 15B), estos alcanzaron un mayor desarrollo en longitud, lo cual

favoreció el número de plantas que pudieron subcultivarse a la fase de enraizamiento,

pero como se puede observar, fueron brotes similares en sus características

morfológicas a los obtenidos con 30 g.L-1 de sacarosa.

Figura 15. Características morfológicas de las plantas de P. caribaea var. caribaea obtenidas in vitro después de 35 días de cultivo con diferentes concentraciones de sacarosa. A) 30 g.L-1, B) 40 g.L-1, C) 50 g.L-1, D) 60 g.L-1.

Con 50 g.L-1 de sacarosa, las plantas presentaron un menor número de brotes nuevos,

similar desarrollo en longitud de la planta principal con respecto a los restantes

tratamientos y mayor grosor del tallo (Figura 15C), características deseadas para

subcultivar plantas a la fase de enraizamiento. No obstante, fue en el tratamiento con

60 g.L-1 de sacarosa, donde se obtuvieron plantas con acículas más desarrolladas y

diferenciadas (Figura 15D), muy similares a las acículas que desarrollan las plantas de

esta variedad en condiciones naturales, estas plantas presentaron además, un color

verde más intenso y el olor característico de los aceites esenciales que se puede

percibir al macerar tejido de árboles adultos, lo cual no ocurrió con las plantas de los

restantes tratamientos. Este aspecto puede ser un posible indicador de un mayor grado

de diferenciación de los diferentes tejidos y estructuras vasculares de estas plantas,

incluyendo los canales resiníferos.

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Se conoce que los carbohidratos juegan un papel importante en el cultivo in vitro como

fuentes de energía y carbono, así como agentes osmóticos, pero también, están

vinculados con la diferenciación de los elementos del xilema y floema (Thorpe et al.,

2008).

Ha sido descrito que al aumentar la concentración de sacarosa en el medio de cultivo

se incrementa el porcentaje de materia seca en las plantas (Kubota et al., 2002; Shim et

al., 2003). Lo anterior se debe, a que al aumentar el contenido de sacarosa, el potencial

osmótico del medio de cultivo disminuye (Cárdenas y Villegas, 2002), se limita la

absorción de agua, pero se favorece la asimilación de sacarosa y con ello el incremento

de materia seca.

Según Fuentes et al. (2005), se ha demostrado que la concentración de sacarosa

influye en la calidad funcional de las plantas cuando estas son transferidas a

condiciones ex vitro para su aclimatización.

Estos autores describieron que la ausencia de sacarosa en el medio de cultivo favoreció

una mayor actividad fotosintética de plantas de Cocos nucifera (Cocotero) en respuesta

al incremento de la intensidad luminosa y el CO2, en comparación con plantas

cultivadas con altas concentraciones de sacarosa (90 g.L-1).

Sin embargo, esa mayor actividad fotosintética in vitro no fue suficiente para la

supervivencia y crecimiento de las plantas en la fase de aclimatización.

Al analizar las plantas obtenidas en ausencia de sacarosa, estos autores observaron

que no tenían formado su esqueleto de carbono, ni habían acumulado sustancia de

reserva en sus hojas, y aunque tenían hojas y raíces desarrolladas, el contenido de

carotenoides era bajo y eso contribuyó a su alta susceptibilidad cuando fueron

transferidas a condiciones ex vitro con alta intensidad luminosa.

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Fuentes et al. (2005), también describieron que con bajas concentraciones de sacarosa

(22,5 g.L-1), las plantas respondieron mejor durante la fase de aclimatización, pero el

resultado tampoco fue satisfactorio.

A pesar de que con altas concentraciones de sacarosa (90 g.L-1) obtuvieron un efecto

negativo en la actividad fotosintética, Fuentes et al. (2005), observaron que esta

concentración de sacarosa promovió la formación de raíces, así como la supervivencia

y crecimiento de las plantas en condiciones ex vitro.

Resultó significativo que cuando emplearon una concentración intermedia (45 g.L-1), las

plantas presentaron similares contenidos de clorofila y carotenoides que los retoños de

árboles cultivados en campo. Además, las plantas mostraron eficacia en el transporte

de electrones del fotosistema II y una buena respuesta de la fijación de CO2 y al

aumento de la intensidad luminosa.

Por todo lo anterior, las plantas cultivadas con concentraciones intermedias de

sacarosa (45 g.L-1) presentaron la mayor supervivencia, actividad fotosintética y un

crecimiento más rápido en condiciones ex vitro, con el mejor rendimiento en campo

entre todos los tratamientos.

4.3 Fase de enraizamiento

4.3.1 Efecto de diferentes concentraciones de AIB

Las plantas obtenidas con 30 y 60 g.L-1 de sacarosa en el subcultivo previo al

enraizamiento, presentaron características morfológicas similares a las descritas para

estos mismos tratamientos en el acápite 4.2.5.

Las plantas obtenidas con 60 g.L-1 presentaron mayor porcentaje de materia seca

(Figura 16) y mayor desarrollo en longitud, 6,12 cm por 5,23 cm las plantas obtenidas

con 30 g.L-1.

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18,95 a

11,60b

0

5

10

15

20

25

30 60

Concentraciones de sacarosa (g.L-1)

Mat

eria

sec

a (%

)

Barras con letras distintas difieren significativamente para p<0,05 según un análisis de varianza simple. (n=30)

Figura 16. Porcentaje de materia seca obtenido en plantas de P. caribaea var. caribaea con diferentes concentraciones de sacarosa en el subcultivo previo a la fase de enraizamiento.

Después de 30 días de cultivo en la fase de enraizamiento, no se logró en ninguno de

los tratamientos evaluados, la formación de raíces in vitro. El género Pinus ha sido

reconocido como recalcitrante con relación a la formación de raíces in vitro y varios

autores han descrito que el porcentaje de plantas in vitro que forman raíces es bajo

(Stojicic y Budimir, 2004).

Tampoco se observaron diferencias estadísticas en la longitud de las plantas al

subcultivar las plantas obtenidas con 30 g.L-1 de sacarosa, a un medio de cultivo de

enraizamiento con diferentes concentraciones de AIB. Sin embargo, esta variable

(longitud de la planta) si presentó diferencias al combinar plantas que fueron obtenidas

con 60 g.L-1 de sacarosa, con diferentes concentraciones de AIB (Figura 17).

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6,04b

6,21b

6,79a

7,49a

0

5

10

0 4,9 9,8 14,7

Concentraciones de AIB (uM)

Long

itud

de la

pl

anta

(cm

)

Barras con letras distintas difieren significativamente para p<0,05 según la prueba C de Dunnett.

Figura 17. Longitud promedio de plantas de P. caribaea var. caribaea obtenidas después de 30 días de cultivo en la fase de enraizamiento con diferentes concentraciones de AIB.

Varios han sido los estudios encaminados a comprender mejor la respuesta de

diferentes especies coníferas para formar raíces in vitro. La adición de auxinas, por lo

general, en forma de AIB o ANA, ha sido una práctica general para inducir la formación

de raíces in vitro en coníferas (Niemi et al., 2002; Zhang et al., 2006; Kalia et al., 2007).

Sin embargo, el éxito final de esta fase del proceso de propagación in vitro, no solo

depende de la adición al medio de cultivo de determinadas concentraciones de auxinas.

Por ejemplo, es importante tener en cuenta el efecto que pueden ejercer las altas

concentraciones de citoquininas (0,5-10 mg.L-1) empleadas durante la fase de

multiplicación, pues pueden inhibir o retrazar la formación de raíces y limitar los efectos

estimuladores de las auxinas en esta fase del proceso (Ben-Jaacov et al., 1991).

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En ocasiones, antes de colocar las plantas a un medio de cultivo de enraizamiento, ha

sido necesario realizar más de un subcultivo en medio de cultivo libre de citoquininas,

hasta que las concentraciones endógenas de este regulador del crecimiento, se han

reducido lo suficiente en el tejido de la planta (van Staden et al., 2008).

4.3.2 Efecto de la concentración de nutrientes inorgánicos

Al estudiar la posible influencia de diferentes concentraciones de nutrientes inorgánicos

en la fase de enraizamiento, se observó que después de 30 días de cultivo tampoco se

logró la formación de raíces in vitro. Sin embargo, en la figura 18A se puede observar

que las plantas que se obtuvieron con 60 g.L-1 de sacarosa en el subcultivo previo a la

fase de enraizamiento presentaron una mayor deposición de lignina teniendo en cuenta

la intensidad de la coloración rojo/rosado en la zona de los haces vasculares, según fue

descrito por Gahan (1984).

No obstante, al realizar un análisis por separado, se pudo observar que

independientemente del origen del material vegetal (concentración de sacarosa en el

subcultivo previo), la concentración de nutrientes inorgánicos en el medio de cultivo de

enraizamiento también influyó en la acumulación de lignina en las paredes celulares de

los segmentos de tallos de 1,0 cm de longitud cortados de las bases de las plantas de

P. caribaea var. caribaea (Figura 19).

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Leyenda: A) Secciones de tallos de plantas obtenidas con 60 g.L-1 de sacarosa en el subcultivo previo a la fase de enraizamiento.

B) Secciones de tallos de plantas obtenidas con 30 g.L-1 de sacarosa en el subcultivo previo a la fase de enraizamiento. Figura 18. Deposiciones de lignina en las paredes celulares de tallos de plantas in vitro de P. caribaea var. caribaea obtenidas después de 30 días de cultivo con diferentes concentraciones de nutrientes inorgánicos en la fase de enraizamiento.

Secciones de los tallos (a 1.0 cm de la base)

Secciones de los tallos (a 0.5 cm de la base)

Secciones de la base de los tallos

WV5 al 100% WV5 al 50% WV5 al 100% WV5 al 50%

A B

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47,95a

38,68b

0

10

20

30

40

50

60

WV5 al 50% WV5 al 100%

Res

iduo

s de

la p

ared

ce

lula

r (%

)

27,53a

13,58b

0

10

20

30

40

50

60

WV5 al 50% WV5 al 100%

Res

iduo

s de

la p

ared

ce

lula

r (%

)


para p<0,05 según la prueba de Mann Whitney. (n=18) Figura 19. Porcentaje de residuos de la pared celular en plantas in vitro de P. caribaea var. caribaea obtenidas con diferentes concentraciones de nutrientes inorgánicos. A) Plantas obtenidas en el subcultivo previo con 60 g.L-1 de sacarosa. B) Plantas obtenidas en el subcultivo previo con 30 g.L-1 de sacarosa.

A

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En muchos sistemas de cultivo de tejidos, la formación de lignina, se ha estimulado por

un cambio en los reguladores del crecimiento (Pauwels et al. 2008), por elicitores

fúngicos (Lange et al. 1995), por estrés hídrico (Tsutsumi y Sakai 1993) y también, por

el empleo de diferentes concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo (Nose et al.

1995).

Autores como Thorpe et al. (2008) explicaron que con el empleo de elevadas

concentraciones de sacarosa (>6.0%) en el medio de cultivo se acumularon grandes

cantidades de lignina y como se conoce la presencia de mayor o menor contenido de

lignina en plantas cultivadas in vitro, ha sido un indicador del grado de diferenciación de

los tejidos vasculares y de la madurez de las plantas (Yamamoto, 1998).

Los mayores porcentajes de residuos de la pared celular (contenido de lignina)

determinados en los segmentos de los tallos de las plantas obtenidas con 60 g.L-1 de

sacarosa en el subcultivo previo a la fase de enraizamiento y colocadas en un medio de

cultivo de enraizamiento con 50% de reducción de los nutrientes inorgánicos WV5,

confirman la influencia de ambos factores en la diferenciación y madurez de los tejidos

vegetales, en particular de los elementos vasculares, zona en la cual se acumuló la

lignina.

A partir de los resultados obtenidos se confirmó que la concentración de sacarosa en el

medio de cultivo, es uno de los factores a tener en cuenta en el acondicionamiento de

las plantas para la fase final del proceso de propagación in vitro, porque favoreció en

las plantas el desarrollo de características morfológicas que le confirieron un mayor

grado de diferenciación y madurez fisiológica, con lo cual, están mejor preparadas para

lograr la formación de raíces in vitro.

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Los resultados obtenidos constituyen elementos fundamentales en la concepción de

nuevas estrategias de investigación con la finalidad de lograr en Pinus caribaea var.

caribaea, la formación de raíces in vitro.

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Conclusiones ________________________________________________________________________________________


5. CONCLUSIONES

1. Se logró establecer in vitro brotes apicales a partir de plantas donantes

cultivadas en casa de cultivo y se definieron las características que debe

tener este tipo de brote.

2. El 6-BAP influyó en el desarrollo de las plantas in vitro en la fase de

multiplicación, con una concentración de 6,66 µM se lograron los mejores

resultados en cuanto al número y longitud de los brotes por plantas y el

coeficiente de multiplicación.

3. Se demostró que el agente gelificante y su concentración, fueron factores

que influyeron en el desarrollo y la respuesta in vitro de las plantas en la

fase de multiplicación. Con 4,0 g.L-1 de Gelrite se obtuvo el mayor

coeficiente de multiplicación.

4. Se observó que al incrementar la concentración de sacarosa en el último

subcultivo de la fase de multiplicación, se produjeron cambios en el

desarrollo morfológico de las plantas, los cuales, le confirieron mejores

características para ser subcultivadas a la fase de enraizamiento.

5. Se determinó que al reducir la concentración de nutrientes inorgánicos en la

fase de enraizamiento, aumentó la acumulación de lignina en los tallos, con

una mayor diferenciación celular de las plantas.

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Recomendaciones ________________________________________________________________________________________


6. RECOMENDACIONES

1. Realizar estudios para la caracterización histológica de los diferentes tipos

de brotes obtenidos de las plantas donantes.

2. Determinar la influencia de concentraciones de sacarosa superiores a 60

g.L-1, en las características morfológicas de las plantas obtenidas en el

subcultivo previo a la fase de enraizamiento.

3. Realizar otros estudios que permitan mejorar las respuestas morfogenéticas

de las plantas P. caribaea var. caribaea en la fase de enraizamiento.

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Referencias Bibliográficas __________________________________________________________________________


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Propagación in vitro de Pinus caribaea var. caribaea por … · 2018-12-17 · RESUMEN Con el...

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